Pentraxin{0}}közvetített komplementaktiváció a vese ischaemia/reperfúziós sérülés sertésmodelljében

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Chiara Divella et al

ABSZTRAKT

A pentraxinok evolúciósan konzervált mintázatfelismerő molekulák családja, amelyek kulcsszerepet játszanak a veleszületett immunitásban és a gyulladásban, például a kórokozók opszonizációjában bakteriális és vírusos fertőzések során. Különösen a hosszú Pentraxin 3 (PTX3) kimutatták, hogy szabályozza a vaszkuláris és szöveti gyulladás számos aspektusát a szilárd szervátültetés során.

Vizsgálatunk a PTX3 szerepét vizsgálta a komplement aktiváció lehetséges modulátoraként a vese ischaemia/reperfúziós (I/R) károsodásának sertésmodelljében. Kimutattuk, hogy az I/R sérülések által kiváltott korai PTX3 lerakódások peritubuláris és glomeruláris kapilláris szinten. A konfokális lézeres pásztázó mikroszkóppal kimutatták, hogy a PTX3 lerakódások együtt lokalizálódnak a CD31 plusz endoteliális sejtekkel. Ezenkívül a PTX3 összefüggésbe hozható a beszűrődő makrofágokkal (CD163), dendritikus sejtekkel (SWC3a) és miofibroblasztokkal (FSP1). Különösen a komplement klasszikus (C1q közvetítette) és lektin (MBL által közvetített) útvonalának PTX{10}}közvetített aktiválását mutattuk ki. Érdekes módon a PTX3 lerakódások a terminális komplement komplex (C5b-9) aktiválásával együtt lokalizálódnak az endothel sejteken, ami azt jelzi, hogy a PTX3- által közvetített komplement aktiváció főként a vese érrendszerében történt. Összefoglalva, ezek az adatok azt mutatják, hogy a PTX3 potenciális terápiás célpont lehet a komplement által kiváltott I/R sérülés megelőzésére.

Levelezés:Giuseppe Castellano

Kulcsszavak:ischaemia/reperfúziós sérülés, komplement rendszer, pentraxin 3,vese, klasszikus út

A Cistanche tubulosa megelőzi a vesebetegséget, kattintson ide a mintaért

BEVEZETÉS

Az ischaemia-reperfúziós (I/R) sérülés az akut betegség fő okavesesérüléstranszplantáció után, és a komplementrendszer jelentős aktiválódása jellemzi [1, 2]. Ebben a forgatókönyvben az endoteliális sejtek (EC) kritikus szerepet játszanak az I/R utáni maladaptív helyreállításban, ami korai fibrózishoz vezet az endothel-mezenchimális átmenet (EndMT) révén [3]. A reperfúziós fázisban a Complement immunológiai és gyulladásos folyamatokat irányít, hozzájárulva különféle immun- és gyulladásos betegségekhez [2–5]. A veleszületett immunrendszer humorális karjának további lényeges összetevőit a pentraxinok képviselik, amelyekről úgy gondolják, hogy kulcsszerepet játszanak az érbiológiában [6].

A pentraxinok multimer oldható fehérjék családja [6], amelyeket szerkezetük alapján rövid és hosszú családokba sorolnak [7]. Ezek az evolúciósan konzervált fehérjék akut fázisú effektorok, amelyek szenzorként szolgálnak a gyulladás kiváltására és a fertőzés során a plazma gyors növekedésére [8]. A hosszú pentraxin 3 (PTX3) egy oldható mintázatfelismerő molekula, amely kulcsfontosságú a veleszületett immunvédelemben, és aktiválhatja a komplementrendszert [9–11].

Különösen a PTX3 indukálta klasszikus és lektin útvonal aktivációját a C1q, MBL, Ficolin-2 kötődésével, és képes befolyásolni az alternatív útvonalat a CFH-n keresztül [10–12].

Ellentétben a véráramban lévő más máj által termelt pentraxinokkal (pl. CRP), a PTX3 felszabadulhat a gyulladás helyén belüli rezidens sejtekből, például mononukleáris fagocitákból, dendritikus sejtekből, fibroblasztokból és parakrin módon ható EC-ből [9]. [13]. A PTX3 kész formában is tárolódik a neutrofilekben, specifikus granulátumokban lokalizálódik, és a mikrobiális csoportok felismerésére válaszul választódik ki [14]. EC-ben a PTX3 expresszióját könnyen indukálja a TNF- és IL-1, átmenetet biztosítva a nyugalmi, gyulladásgátló fenotípusból a prokoaguláns és proinflammatorikus állapotba, ezáltal erősen szabályozva a mikrovaszkuláris funkciót [7, 8 ]. Emiatt a PTX3 szinteket a következőképpen írták lekrónikusvesebetegség, a PTX3 fehérjeszintjének növekedése összefüggést mutatott a GFR csökkenésével és a kardiovaszkuláris szövődményekkel, azonban még mindig keveset tudunk a PTX3 szerepéről a korai körülmények között, mint I/R-indukált akut.vesesérülés [15, 16].

A PTX3 szerepe a vesegyulladásos betegségekben bivalens, egyrészt a fehérje aktiválhatja a klasszikus és lektin útvonalakat, elősegítve a kezdeti gyulladást és sérülést [10–12]. Másrészt a PTX3 N-terminális doménje a komplementaktivációt befolyásolta, hogy a leukocita toborzást gyengítette, és gátolta az intersticiális fibrózist akut vesekárosodásban, elősegítve a szövetek helyreállítását [17–20].

A komplement kulcsfontosságú szerepet játszik az I/R sérülés által kiváltott akut patofiziológiájábanvesesérülés[21, 22]. A vese I/R sérülésének sertésmodelljében bemutattuk a komplement rendszer aktiválásának kulcsfontosságú szerepét az EndMT és a korai fibrózis indukálásában, mind a klasszikus, mind a lektin útvonalak bevonásával [23]. Ezenkívül kimutattuk, hogy ezeknek a komplementpályáknak a rekombináns C1-INH (rhC1INH) általi terápiás gátlása jelentős mértékben csökkentette a komplement lerakódást, csökkentve a beszűrődő gyulladásos sejtek felszaporodását és a tubulointersticiális károsodást [23]. Ezeket az eredményeket Delpech PO és munkatársai is megerősítették [24]; a C1q, MASP és C4d glomeruláris és tubuláris lerakódás szignifikáns modulációját értékelték 30 perccel a reperfúziót követően, ami azt jelzi, hogy a C1-INH központi szerepet játszik a klasszikus és lektin útvonalak ellensúlyozásában.

Ebben a tanulmányban a PTX3 lehetséges szerepét vizsgáltuk a korai komplement aktiváció közvetítésében vese I/R sérülésekben, jellemezve a PTX3 különböző sejtforrásait.

EREDMÉNYEK

Az I/R sérülés sertésmodelljében a PTX3-at endothel sejtek és immuninfiltráló sejtek expresszálják

Először is megvizsgáltuk a PTX3 jelenlétét meleg I/R által kiváltott vesekárosodás sertésmodelljében. Nagyon korlátozott PTX3-lerakódásokat figyeltünk meg a normál szövetekben (1A ábra). Az I/R sérülés a PTX3 diffúz lerakódását okozta már 15 perccel a reperfúziót követően (1B. ábra, 1C. ábra) a tubulointerstitialis területen (1E. ábra), a peritubuláris kapillárisokban (1D. ábra; nyíl) és a glomeruláris szinteken (1D. ábra). A PTX3 lerakódások még 1 órával a reperfúzió után is kimutathatók voltak a peritubuláris kapillárisok szintjén (1G. ábra). Korábbi munkánkban [23] kimutattuk, hogy az I/R sérülés fő jellemzői a tubuláris epiteliális sejt apoptózisa és a beszűrődő gyulladásos sejtek, például monociták, dendritikus sejtek és limfociták toborzása. Mindazonáltal rutin szövettani kiértékeléssel (1. kiegészítő ábra) kimutattuk, hogy 30 perces meleg iszkémia, majd 15 perces reperfúzió által kiváltott korai tubulus interstitialis károsodás, amelyet a bazálishoz képest nagyobb kapilláris pangás és a vesetubulus epitélium fokális citoplazmatikus vakuolációja jellemez. állapot.

A PTX3 lerakódások sejtes lokalizációjának további jellemzésére és a gyulladásos válasz és sérülés modulációjában kifejtett potenciális hatásának értékelésére kettős immunfestést és konfokális mikroszkópos elemzést végeztünk. A PTX3 fehérje expresszióját a legtöbb EC-ben peritubuláris (2A ábra) és glomeruláris (2B ábra) kapilláris szinten észlelték, 15 perccel a reperfúzió után.

Jól ismert, hogy az I/R sérülést a veleszületett és adaptív immunválaszok fokozott aktiválódása jellemzi, beleértve a gyulladásos sejtek bejutását a beteg szervbe, ami tovább súlyosbítja az immunsejteken és a komplementrendszeren keresztüli sérülést [25]. Sertésmodellünkben már 15 perccel a reperfúzió után is megfigyeltünk egy nagyrészt makrofágokból és dendrites sejtekből álló sűrű gyulladásos infiltrátumot a tubulus-intersticiális területen. Azt találtuk, hogy mindkét antigénprezentáló sejtet fokozott PTX3-expresszió jellemezte a T0-hoz képest, mivel megnövekedett számú CD163 plusz /PTX3 plus (2E, 2F, 2K ábra) és SWC3a plus /PTX3 plus (2G, 2H, 2L ábra) sejtek a tubulusok intersticiális szintjén a T15-nél.

A PTX3 expresszió hozzájárulhat az EndMT-hez I/R sérülésben

Korábbi megfigyeléseink során kimutattuk, hogy az I/R sérülés felelős az EndMT-ért [26, 27], amelyet az jellemez, hogy az EC egy mezenchimális fenotípust szerzett meg specifikus endoteliális markerek elvesztésével és a mezenchimális markerek, például a fibroblaszt-specifikus markerek növekedésével. protein 1 (FSP-1), neuronális cadherin (N-cadherin) és alfa-simaizom aktin (alfa-SMA). Így megvizsgáltuk, hogy az EC általi PTX3 expresszió befolyásolhatja-e ezt a folyamatot. Ahogy az várható volt, amikor az alfa-SMA expressziót, mint az aktivált myofibroblaszt markereit vizsgáltuk, nem találtunk semmilyen kolokalizációt az alfa-SMA és a PTX3 között (2C, 2D ábra). Éppen ellenkezőleg, a tubulointersticiális FSP1 plusz /PTX3 plusz myofibroblasztok növekedését figyeltük meg a megfigyelési időszak során (2K–2M ábra).

A PTX3 lerakódások a komplementrendszer aktiválásával járnak

Végül megvizsgáltuk, hogy a PTX3 lerakódások összefüggésben vannak-e a komplement aktiválásával. Valójában a pentraxin család többi komponenséhez hasonlóan a PTX3 is szabályozhatja a klasszikus komplement-útvonal aktiválását [7]. A PTX3 és a komplement aktiváció közötti kapcsolat meghatározásához kettős jelölésű immunfluoreszcenciát végeztünk a PTX3 és a terminális expressziójának értékelésére. Komplement komplex, C5b-9, egy C9-neoepitóp elleni antitest felhasználásával. Megfigyeltük a PTX3 és a C5b{12}} lerakódások jelentős együttes lokalizációját (3A. és 3B. ábra). A komplement terminális komplex a peritubuláris szinten, valamint a peritubuláris kapillárisokban, valamint az endothel sejtrétegben lokalizálódott, amint azt korábban bemutattuk [23, 28]. Mivel a PTX3 képes aktiválni a komplement rendszert a klasszikus és lektin útvonalon keresztül, értékeltük a C1q és az MBL lerakódását a vese parenchymában. Érdekes módon a C1q (3E, 3F ábra) és MBL (3C, 3D ábra) lerakódások főként az intersticiális és kapilláris szinten (3C-3F. ábra) voltak megtalálhatók, amint azt korábban leírtuk [23], és PTX3 lerakódásokkal kolokalizálták.

A C1-inhibitor megzavarja a PTX3 kötődését az endotélsejteken

Korábbi munkánkban [23] kimutattuk, hogy a C1-inhibitor beadása a komplement lerakódásának jelentős csökkenéséhez vezetett, csökkentve a beszűrődő gyulladásos sejtek felszaporodását és a tubulointersticiális károsodást. Ezért megvizsgáltuk a PTX3 expresszió szintjét rhC1-INH-val kezelt állatokban. Azt találtuk, hogy a C1-inhibitor infúziója 15 perccel a reperfúziót követően csökkentette a PTX3 lerakódásokat a peritubuláris kapillárisokban és az intersticiális szinten (4A. ábra).

Ezen túlmenően annak a hipotézisnek a alátámasztására, hogy az rhC1-INH-val kezelt állatokban a PTX3 lerakódások csökkenése az endothel károsodás gátlásával függ össze, in vitro kísérleteket végeztünk, és értékeltük az rhC1-INH és PTX3 kötődését tenyésztett EC normál körülmények között vagy celluláris stressz jelenlétében (4B. ábra). A FACS elemzés kimutatta, hogy normál körülmények között az EC nem köti meg az rhC1-INH-t és a PTX3-at sem. Korábbi tanulmányunkkal [26] összhangban az rhC1-INH fokozott sejtkötődését figyeltük meg a H2O2-stimulált EC-n az alapállapotokhoz képest. Ezenkívül az rhC{11}}INH hiányában a PTX3 megköti az aktivált EC-t. Érdekes módon, amikor a H2O2-aktivált EC-t PTX3-mal és rhC1-INH-val inkubáltuk, azt tapasztaltuk, hogy a C1INH képes volt megvédeni az EC-t a PTX3 kötődés blokkolásakor.

VITA

Ebben a tanulmányban bemutattuk a PTX3 lerakódását a vese I/R sérülésének korai szakaszában, és annak lehetséges hozzájárulását az EndMT kialakulásához. Érdekes módon azt találtuk, hogy a PTX3-mediált komplementaktiváció főként az érrendszerben történik, együtt lokalizálva a C1q-vel és az MBL-lel, a komplement kaszkád klasszikus és lektin útvonalának felismerő molekuláival.

Az I/R sérülés markáns gyulladásos választ vált ki, amelyet komplement aktiváció, oxigénmentes gyökök és proinflammatorikus citokintermelés jellemez, ami a vaszkuláris endotélium és a perifériás leukociták aktiválódását eredményezi [29, 30]. Az I/R sérülés során a komplement aktiváció komplement komponensek lerakódásához vezet a sérült és diszfunkcionális EC felszíni membránján, ezzel egyidejűleg anafilatoxinok termelődése és a gyulladásos folyamat felerősítése [31]. A gyulladás során a PTX3 gyorsan növekszik, és központi szerepet játszhat az endothel válasz modulálásában. Valójában a PTX3 potenciális biomarker a vaszkuláris endoteliális diszfunkció számos betegségben, beleértve a krónikusvesebetegség, preeclampsia és számos érbetegség [7, 16, 17, 32]. Azt is kimutattuk, hogy a PTX3 más vaszkuláris szövődményekben is szerepet játszik, mint például az arteriovenosus fisztula sikertelenségében hemodializált betegeknél [33]. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a PTX3 híd lehet a gyulladásos válasz és az endothel diszfunkció között [34]. Ezekkel a tanulmányokkal összhangban már 15 perccel a reperfúziót követően endothel szinten PTX3 lerakódásokat figyeltünk meg (2A, 2B ábra). Eredményeink azt is kimutatták, hogy az I/R sérülés korai fázisában a PTX3 kolokalizálódott a myofibroblast markerrel, az FSP-1-mal (2I. ábra, 2J), de nem az alfa-SMA-val, amely az aktivált myofibroblaszt által kifejezett marker (2C. 2D). Összességében ezek az adatok arra utalhatnak, hogy az I/R állatokban [26] megfigyelt endothel diszfunkció és az EndMT folyamat [35] először a PTX3-at expresszáló EC-ben fordult elő.

A PTX3 és a gyulladásos sejtek közötti kapcsolat széles körben elismert. Ebben a cikkben kifejezetten a PTX3 inherens hatásaira összpontosítottunk a leukociták intersticiális infiltrációjában, amelyek a PTX3 fő forrásai [36]. Különösen makrofágokat és dendritikus sejteket találtunk 15 perccel a reperfúziót követően, amelyek magasabb szintű PTX3-at expresszáltak (2E-2H ábra). Ezek az adatok összhangban vannak az egyre több bizonyítékkal, amelyek a veleszületett immunitás releváns szerepére utalnak az I/R sérülések korai károsodásának közvetítésében [23]. A komplement korai aktiválása a veseszövetben az I/R sérülést követően számos gyulladásos mediátor termeléséhez vezet, amelyek fokozzák az immunsejtek toborzását [21, 23, 37, 38]. A legújabb tanulmányok a PTX3-at az I/R sérülés által kiváltott gyulladásos választ irányító hálózat egyik fő összetevőjeként azonosították [39]. Az I/R sérülések különböző kísérleti modelljeiben a PTX3 kettős, ellentétes szerepet tölthet be bizonyos szöveteken [40, 41]. A PTX3 korai termelése vesekárosodással jár, mivel az endothel adhéziós molekulák és kemokinek korai expresszióját idézi elő, amelyek felgyorsítják a helyi maladaptív gyulladásos választ.

Éppen ellenkezőleg, a PTX3 elhúzódó lokális termelése megakadályozza a túlzott szervi gyulladást és diszfunkciót [41].

A PTX3 egy Complement kaszkád modulátor [9, 42]; ez összhangban van a PTX3 pleiotróp tulajdonságaival, ami azt jelzi, hogy a PTX3 kettős szerepet játszik a veleszületett immunválasz modulátoraként vagy erősítőjeként [39]. Kezdetben a PTX3 aktiválja a komplementet a C1q és az MBL megkötésével [43]; azonban a korai fokozott gyulladást a célterületre kell korlátozni. Ezért a PTX3 a H faktor toborzásával vagy az angiogenezis gátlásával szintén csökkentheti a gyulladásos választ és a komplement aktivációt, megóvva a veseparenchymát a gyulladásos károsodástól [43]. Bár rágcsálókban az I/R-ben a komplementaktiváció főként a tubuláris szinten lokalizálódik [44], a reperfúziós fázisban az endotélium a különböző gyulladást elősegítő szerek elsődleges célpontja, beleértve a komplement mediátorokat [2]. Korábban kimutattuk, hogy az I/R sérülés sertésmodelljében, valamint DGF-es betegekben a Komplement rendszer aktiválódása a korai fázisban, a peritubuláris kapillárisokon, az interstitiumon belül és a glomeruláris endotéliumon történik [23]. Adataink a C5b-9 lerakódások egyértelmű együttes lokalizációját mutatták a PTX3-on és az EC-n 15 perccel a reperfúziót követően (3A., 3B. ábra). Ezért úgy tűnik, hogy a vese endotélium a PTX3-mediált komplement aktiváció fő helye az I/R sérülés korai fázisában mind preklinikai, mind klinikai körülmények között.

A pentraxinok kölcsönhatása a C1q-val és a klasszikus Complement útvonal aktiválásában betöltött szerepe jól leírt [45–47]. A veleszületett immunválasz összefüggésében a PTX3 különböző komplement komponenseket köthet, és modulálhatja a komplement aktivációt [43, 48]. A PTX3 C1q kötéssel aktiválja a komplementet [49]. Az állatmodellben elért eredményeink egyértelműen azt mutatták, hogy a PTX3 a C1q-val kölcsönhatásba lépve közvetítheti a klasszikus útvonal aktiválását (3E., 3F. ábra). Ezenkívül a PTX3 a komplement lektin útját is modulálja, amint az a 3C, 3D ábrán látható. Az MBL kollagénszerű doménjén keresztül köti meg a PTX3-at [45], az MBL/PTX3 komplexek pedig C1q-t toboroznak, és kiváltják a C3 és C4 lerakódását a célsejtek felületén.

Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy a PTX3 központi szerepet játszik a közvetítésbenvesekárosodás az I/R sérülésben, aminek fontos következményei lehetnek a vese I/R sérülésének komplement-irányított terápiájában.

Korábbi tanulmányunkban [26] a C1-INH rekombináns formájának felhasználásával vizsgáltuk a komplement szerepét az EK-aktiváció közvetítésében, amely a klasszikus és a lektin komplement útvonalak proteázainak erős inhibitora (C1r, C1s, és MASP2). Ugyanebben az állatmodellben kimutattuk (4A ábra), hogy mindkét út rhC1INH általi terápiás gátlása csökkentette a PTX3 lerakódásokat a peritubuláris kapillárisokban és az intersticiális szinten 15 perccel a reperfúziót követően. Ezek az adatok megerősítették az EC-n végzett in vitro eredményeket (4B. ábra), és arra a hipotézisre vezettek, hogy az rhC1INH megvédheti a sérült EC-t, amikor blokkolja a PTX3 kötődését. Az irodalomban bizonyítékok vannak arra vonatkozóan, hogy a C1-INH endothel adhéziós molekulákhoz kötődik, amelyek aktivált endotéliumon expresszálódnak, amelyeket szelektineknek neveznek, különös tekintettel a P- és E-szelektinekre [50, 51]. Ez az EC-hez való kötődés megzavarhatja az endothel-leukocita kölcsönhatást a gyulladás során, és egy másik fontos gyulladásgátló mechanizmus is [50, 51]. Ezért azt feltételeztük, hogy az rh-C1INH képes megkötni az aktivált EC-t, és közvetíti a komplement aktiváció és a gyulladásos folyamat lokális szabályozását. Korábbi tanulmányainkban kimutattuk a komplement szerepét az I/R sérülésekben és más immunmediált vesebetegségekben [38, 52–54]. A komplement aktiválásának mechanizmusai ebben az állatmodellben jelentős hatással lehetnek az emberi környezetben várható adatok értelmezésére. A komplement aktiválását célzó terápiás beavatkozások sikeres kidolgozásához [36, 54] elengedhetetlen a sertésadatok érvényességének megállapítása a klinikai körülményekhez képest. Mivel ez a kutatás megfigyeléses vizsgálatokra korlátozódik, további kísérletekre van szükség a PTX3 és a Complement közötti összekapcsolt mechanizmusok körülhatárolásához, amelyek új terápiás stratégiákat emelhetnek ki. A fenti eredmények alapján adataink alátámasztják azt a hipotézist, hogy a PTX3 szabályozhatja a komplement által közvetített I/R sérülés több aspektusát, ezáltal potenciális terápiás célpontot jelent.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Vese I/R sérülés sertés modell

A vese I/R sérülésének állatmodelljét a korábban leírtak szerint fejlesztették ki [23]. Az Egészségügyi Minisztérium etikai bizottsága jóváhagyását követően 4-hónapos nőstény nagy fehér sertéseket (n=8, n=4 csoportban, 20 kg) végeztünk kísérleti nyílt műtéti eljárás általános érzéstelenítésben. Az állatok 24 órán keresztül koplaltak az érzéstelenítés megkezdése előtt. Az elektrokardiogramot, a szívfrekvenciát, az oxigén hemoglobin telítettségét, a légúti gáz összetételét, a légzésszámot, a légzési térfogatot, a légúti nyomást, a szisztolés artériás vérnyomást és a központi vénás nyomást folyamatosan monitorozták és automatikusan rögzítették (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinki, Finnország) . A bal veseartériát és a vénát izoláltuk, és egy érhurkot helyeztünk a veseartéria köré derékszögű szorítóval. Az ischaemia (T0) előtt vesebiopsziát végeztek. Ezután az érhurok meghúzásával az ischaemiás fázist indukáltuk (30 perc). A reperfúzió után 15, 30 és 60 perccel több biopsziát végeztünk; az állatokat a műtét után 24 órával leöltük. Minden biopsziás minta egy részét azonnal lefagyasztottuk optimális vágási hőmérsékleten (Tissuetek, Pittsburgh, PA) és folyékony nitrogénben tároltuk. Egy másik részt pufferolt formalinban (4%) fixáltunk 12 órán át, és standard eljárásokkal paraffinba ágyaztuk.

Mikroszkópos vizsgálat

A vesebiopsziákból származó, paraffinba ágyazott vesemintákat használtuk a hagyományos szövettani festéshez (H&E, periodic acid-Schiff). A képeket az Aperio ScanScope CS2 eszköz szerezte be (Aperio Technologies, Vista, CA, USA). A tubulus-intersticiális és glomeruláris elváltozásokat kvalitatív elemzéssel értékelte két megfigyelő (CD, MR), akik nem voltak tisztában az eredettel

Antitestek

A tanulmányban használt elsődleges antitestek a következő antigéneket ismerték fel: PTX3 (MNB4: közvetlen a PTX3 N-terminális doménje ellen, Exira Life Sciences In., Larsen, Svájc); CD163 (monociták/makrofágok, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (dendritikus sejtek, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (fibroblasztspecifikus protein 1, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság); alfa-simaizom aktin (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, USA); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Egyesült Királyság); MBL (3E7: közvetlen az MBL szénhidrátfelismerő tartománya ellen, Hycult biotechnology, Uden, Hollandia) és C9 neoantigén (aE11, Hycult biotechnology). A keresztreaktivitást úgy validáltuk, hogy a specifikus antitesteket felhasználásuk előtt előinkubáltuk az előállításukra használt humán peptidekkel. Az előinkubálás megszüntette a sertésszövet specifikus festődését.

Szöveti immunfluoreszcencia és konfokális lézer pásztázó mikroszkóp

A PTX3 jel jellemzését és lokalizációját OCT tápközegben (Tissue-Tek) tartalmazó fagyasztott szöveten vizsgáltuk. A lemezeket 5%-os nyúlszérummal 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A lemezeket ezután 1 órán át szobahőmérsékleten specifikus antitestekkel inkubáltuk. Három PBS-mosás után a lemezeket a megfelelő másodlagos antitestekkel (Alexa Flour 488 és 555, Molecular Probes, Eugene, OR) inkubáltuk. Az összes metszetet TO-PRO-3 (Molecular Probes) ellenfestéssel festettük meg. A negatív kontrollokat irreleváns antitestekkel készítettük. A metszeteket Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Németország) konfokális lézer-pásztázó mikroszkóppal elemeztük. A beszivárgó sejtek számát metszetenként legalább 10 nagyteljesítményű (x630) mezőben mérte két független megfigyelő, akik nem vették észre a tárgylemezek eredetét. A végső számok a két mérték átlagai voltak. A megfigyelők közötti variabilitás egyetlen esetben sem volt nagyobb 20 százaléknál.

Sejtkultúra és áramlási citometria elemzés

A humán köldökvéna endothel sejteket (HUVEC, EC) az American Type Culture Collection-től (ATCC-LGC Standards, Sesto San Giovanni, Olaszország) vásároltuk. Az EC-t az általuk javasolt EndoGro táptalajban (Merck Millipore, Darmstadt, Németország) termesztették. Az EC-t 1{{10}},000sejt/cm2 sűrűséggel szélesztettük, és H2O2-kezeléssel stimuláltuk (3 százalék, 1 óra). Ezután a bazális és stimulált EC-t kétszer mostuk PBS-sel, majd eltávolítottuk 2 mM PBS-EDTA-val és tripszinnel 0,001×. Ezután a sejteket PBS-ben újraszuszpendáltuk, és PTX3-mal (rekombináns humán PTX3, Sigma-Aldrich, Merck, Németország) (1 ug/ml) és/vagy rhC1-INH-val (Ruconest®, Pharming) (2,5 ug) inkubáltuk. /ml) 60 percig. Háromszori PBS 1X-es mosás után a sejteket áramlási citometriás (FACS) pufferben (foszfáttal pufferolt sóoldat, pH 7,2, 0,2% szarvasmarha szérumalbumin és 0,02% nátrium-azid) újraszuszpendáltuk, és FCR blokkoló reagenssel (Miltenyi Biotec) inkubáltuk. 10 percig szobahőmérsékleten. A blokkolás után az EC-ket nyúl anti-humán C1-INH-val (Prof. M. Daha, University of Leiden, 1//100 hígítás) és/vagy patkány anti-PTX3-mal (MNB4, Exira Life) inkubáltuk. Sciences In., 1/20 hígítás) szobahőmérsékleten 30 percig, majd FACS pufferrel mossuk. Ezután a sejteket kecske anti-nyúl IgG PE-vel (Molecular Probes, 1/100 hígítás) vagy/anti-patkány IgG FITC-vel (Molecular Probes, 1/100 hígítás) szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk, és háromszor mostuk. A sejteket FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) és Kaluza szoftverrel elemeztük. A pozitivitás területét egy izotípus-egyeztetett mAb segítségével határoztuk meg, és összesen 104 eseményt vettünk fel minden mintára. Három független kísérletet végeztünk.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± standard deviáció (SD) formájában mutatjuk be, és adott esetben varianciaanalízissel vagy páros Student t-próbával hasonlítjuk össze. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, ha a p-értékek kisebbek voltak, mint 0.05. Az adatokat a Statview szoftvercsomag (5.0 verzió) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA) segítségével elemeztük. A grafikonokat a GraphPad Prism Software 5 segítségével jelenítettük meg.

Rövidítések

I/R: ischaemia/reperfúzió; EC: endoteliális sejtek; PTX3: pentraxin 3; FSP-1: fibroblaszt-specifikus fehérje 1; N-kadherin: neuronális kadherin; alfa-SMA: alfa-simaizom aktin.

A SZERZŐ HOZZÁJÁRULÁSAI

A CD koordinálta a vizsgálatot, részt vett a vesemetszetek immunjelölésében és konfokális mikroszkópos vizsgálatában, és elkészítette a kéziratot. Az AS és az RF részt vett a tanulmány megtervezésében, hozzájárult az adatok elemzéséhez, in vitro kísérleteket végzett, és kritikusan átdolgozta a kéziratot. Az MR és a GSN kórszövettani képanalízist végzett. LL, FS, AMC elvégezte az ischaemia-reperfúziós sérülés állatmodelljét, és segített a kézirat átdolgozásában. A GL, PD és MB minden sebészeti beavatkozást a sertés modellen végzett, és segített a kézirat átdolgozásában. MRD, P.vdP., C.vK. és FS átdolgozta a kéziratot.

A PP, ER, GG, GS és LG kritikusan átdolgozta a kéziratot. A GC új elemző eszközöket biztosított, tervezte és felügyelte a kutatást. A CD, az AS és az RF egyaránt hozzájárultak ehhez a tanulmányhoz. Minden szerző hozzájárult a cikkhez, és jóváhagyta a benyújtott verziót.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetet mondunk Claudia Curcinek, a Sürgősségi és Szervátültetési Osztály Vese-, Dialízis- és Transzplantációs Osztályától.

A Bari Egyetemnek a kiváló technikai segítségért.

ÖSSZEFÉRHETETLENSÉG

A szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenségük.

FINANSZÍROZÁS

Ezt a tanulmányt a Bari Egyetem "Aldo Moro", az olasz egészségügyi minisztérium támogatta (GR 2016- 02362239 "A transzkriptomika – alapú megközelítés a késleltetett graftfunkció prediktív faktorainak és terápiás célpontjainak azonosítására"vesetranszplantációban részesülők", Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD ösztöndíjat kapott ezen a projekten) és Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 "Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori" – AIM{3}}2. tevékenység, amelyet az AS kapott

IRODALOM

1. Bonventre JV, Yang L. Az ischaemiás akut sejtek patofiziológiájavesesérülés. J Clin Invest. 2011; 121:4210–21.

2. Jang HR, Rabb H. A veleszületett immunválasz ischaemiás akutbanvesesérülés. Clin Immunol. 2009; 130:41–50.

3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Kiegészítő: kulcsfontosságú rendszer az immunrendszer felügyeletéhez és a homeosztázishoz. Nat Immunol. 2010; 11:785–97.

4. Thurman JM, Holers VM. Az alternatív komplement útvonal központi szerepe az emberi betegségekben. J Immunol. 2006; 176:1305–10. PMID:16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Inflammaging and Complement System: A Link Between AcuteVeseSérülés és krónikus graftkárosodás. Front Immunol.

2020; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Pentraxins innate immunity: lessons from PTX3. Cell Tissue Res. 2011; 343:237–49.PMID:20683616

7. Cieślik P, Hrycek A. Hosszú pentraxin 3 (PTX3) szerkezetének, hatásmechanizmusának és klinikai vonatkozásainak tükrében. Autoimmunitás. 2012; 45:119–28.PMID:21988562

8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraxin 3 (PTX 3): a gyulladásos válasz endogén modulátora. Közvetítők Inflamm. 2012; 2012:920517.PMID:22577258

9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraxinok a veleszületett immunitás, a gyulladás, a mátrix lerakódás és a női termékenység kereszteződésében. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337–66.115756PMID:15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. A hosszú pentraxin PTX3 mint prototípus humorális mintázatfelismerő receptor: interplay with cellular innate immunity. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. A ficolin-2 és a pentraxin 3 közötti szinergia fokozza a veleszületett immunfelismerést és a komplement lerakódást. J Biol Chem. 2009; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. A PTX3 modulálja a tumor immunoflogózisát mikrokörnyezetben, és prognosztikai tényező a tiszta sejtes vesesejtes karcinómában szenvedő betegek számára. Öregedés (Albany NY). 2020; 12:7585–602.PMID:32345771

13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. A hosszú pentraxin PTX3 döntő fontosságú a szöveti gyulladás után

bél ischaemia és reperfúzió egerekben. Am J Pathol. 2009; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. A humorális mintafelismerő receptor PTX3 neutrofil granulátumokban raktározódik és extracelluláris csapdákban lokalizálódik. J Exp Med. 2007; 204:793–804.PMID:17389238

15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. A plazma pentraxin 3 krónikus betegeknélvesebetegség: összefüggések a vesefunkcióval, a fehérje-energiával, a sorvadással, a szív- és érrendszeri betegségekkel és a mortalitással. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. A pentraxin 3 emelkedett keringési szintje és szöveti expressziója urémiában: az endoteliális diszfunkció tükröződése. PLoS One. 2013; 8: e63493.PMID:23658833

17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Role of the soluble pattern felismerő receptor PTX3 in vascular biology. J Cell Mol Med. 2007; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. A pentraxins PTX3 and SAP innate immunity, Regulation of inflammator and szövet remodelling. J Hepatol. 2016; 64:1416–27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. A pentraxin 3 gátolja az akut vesekárosodás által kiváltott intersticiális fibrózist az IL-6/Stat3 útvonal elnyomásán keresztül. Gyulladás. 2014; 37:1895–901.PMID:24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. A hosszú pentraxin "édes" oldala: hogyan befolyásolja a glikoziláció a PTX3 funkcióit a veleszületett immunitásban és gyulladásban. Front Immunol. 2013; 3:407. PMID:23316195