A phloretin elnyomja az ideggyulladást az autofágia által közvetített Nrf2 aktiválással a makrofágokban

Kapcsolatba lépni:tina.xiang@wecistanche.com

Absztrakt

Háttér: A makrofágok kettős szerepet játszanak az ideggyulladásos betegségekben, például a sclerosis multiplexben (MS). Részt vesznek a lézió kialakulásában és progressziójában, de elősegíthetik a feloldódást isgyulladásés a sérült szövetek helyreállítása. Ebben a tanulmányban azt vizsgáljuk, hogy és hogyanfloretinAz almában és az eperben bőségesen jelen lévő flavonoid csökkenti a makrofágok gyulladásos fenotípusát és elnyomjaideggyulladás.

Mód: Az egér csontvelőből származó makrofágok transzkripciós változásait phloretin expozíció hatására bulk RNS szekvenálással értékeltük. A gyulladással, az oxidatív stresszválaszsal és az autofágiával kapcsolatos mögöttes útvonalakat kvantitatív PCR-rel, fluoreszcens és abszorbanciavizsgálatokkal, a nukleáris faktor eritroid 2-kapcsolódó 2-es faktorral (Nrf2) knockout egerekkel, Western blot-tal és immunfluoreszcenciával validáltuk. A kísérleti autoimmun encephalomyelitis (EAE) modellt a phloretin neuroinflammációra kifejtett hatásának vizsgálatára in vivo és a mögöttes mechanizmusok megerősítésére használták.

Eredmények: Kimutattuk, hogy a phloretin csökkenti a makrofágok gyulladásos fenotípusát, és jelentősen elnyomja a neuroinflammációt EAE-ben. A Phloretin a Nr2 jelátviteli útvonal aktiválásával közvetíti hatását. A Nrf2 aktivációt az autofágia 5'AMP-aktivált protein kináz (AMPK)-függő aktiválásának és az ezt követő kelch-szerű ECH-asszociált protein 1 (Keap1) degradációnak tulajdonították.

Következtetések: Ez a tanulmány jövőbeli perspektívákat nyit a phloretin számára, mint az ideggyulladásos betegségek, például az SM terápiás stratégiája számára.

Próba regisztráció: Nem alkalmazható.

Kulcsszavak: floretin, makrofágok, ideggyulladás, szklerózis multiplex, autoimmunitás

Kattintson ide további információkért

Háttér

Az aktív sclerosis multiplex (MS) elváltozásokat számos lézió jellemzimakrofágok[1-5]. A korai tanulmányok kimutatták, hogy a makrofágok gyulladást elősegítő fenotípust vesznek fel az SM-léziókban, ezáltal elősegítveideggyulladás, demyelinizáció és neurodegeneráció. A betegséget elősegítő effektor funkciók közé tartozik a központi idegrendszerből (CNS) származó antigének bemutatása az autoreaktív T-sejteknek, valamint a gyulladásos mediátorok, például a gyulladást elősegítő citokinek, a reaktív oxigénfajták (ROS) és a nitrogén-monoxid (NO) termelődése. 6,7]. A közelmúltban azt találták, hogy a makrofágok az SM-léziókban is hasznos funkciót töltenek be, mivel fenotípusukat olyanra alakíthatják át, amely jellemzően az immunszuppresszióval és a központi idegrendszer helyreállításával jár. Ezt a protektív fenotípust a pro-inflammatorikus mediátorok csökkent termelése, a gyulladásgátló mediátorok és növekedési faktorok termelődése, valamint az antioxidáns utak, például a nukleáris faktor eritroid 2-kapcsolódó 2-es faktor (Nrf2) aktiválása jellemzi. [8-14]. Mivel a makrofágok gyulladásos állapotát összefüggésbe hozták az SM progressziójával és a krónikus aktív elváltozások kialakulásával, a makrofágok jótékony fenotípushoz való eljuttatása ígéretes stratégiának tekinthető az SM progressziójának korlátozására [15].

Az étrend-összetevők elősegítik a makrofágok működését és a neuroinflammációt [16]. Különösen a flavonoidok családjáról egyre gyakrabban ismerik fel, hogy olyan ígéretes vegyületeket tartalmaznak, amelyek befolyásolják a patogén útvonalakat és módosítják az immunsejtek, például a makrofágok fenotípusát[17,18]. A flavonoidok az egyik legnagyobb fitotápanyag-családot alkotják, amely több mint 8000, változatos bioaktivitású fenolos vegyületet tartalmaz. A flavonoidok családjának számos tagja gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatást fejt ki a makrofágokon [19-21]. A flavonoid phloretin a dihidrokalkonok tagja, és megtalálható az általánosan fogyasztott gyümölcsökben, például az almában és az eperben. A phloretinről ismert, hogy immunmoduláló tulajdonságokkal rendelkezik, és antioxidáns tulajdonságai miatt széles körben használják bőrápolásban [22-24]. Ezenkívül a phloretin egy glükóz transzporter (GLUT) inhibitor, amely hatással van a makrofágok fenotípusára, mivel a makrofágok aktivációját a GLUT táplálja [25, 26]. Összességében ezek a jellemzők a phloretint ígéretes vegyületté teszik a makrofágok fenotípusának és az ideggyulladásnak a modulálására. Ebben a tanulmányban bemutatjuk, hogy a phloretin a makrofágokat kevésbé gyulladásos fenotípus felé tereli, és enyhíti a neuroinflammációt a kísérleti autoimmun encephalomyelitis (EAE) modellben. RNS szekvenálás és funkcionális kísérletek azonosították az Nrf2 útvonalat, mint a phloretin által indukált védő makrofág fenotípus csomópontját és mozgatórugóját. Az autofágiás gépezet AMPK-függő aktiválódása és az ezt követő SQSTMl/p62--mediált (a továbbiakban p62) Keapl lebomlása, egy adapter, amely elősegíti a proteaszómális Nrf2 lebomlását, a makrofágok Nrf2 aktivációjának hátterében áll. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a phloretin potenciálisan felhasználható neurogyulladásos rendellenességek terápiás stratégiáiban.

Mód

Antitestek és kémiai reagensek

Phloretin(Sigma Aldrich) 50 mM KOH-ban 15 mM törzsoldattá oldottuk, és -20 fokon tároltuk. További hígításokat végeztünk RPMI1640 (Gibco) tápközegben. Az in vivo kezeléshez a phloretint 1 N NaOH-ban oldottuk, majd a pH-t 1 N sósavval 7,2-re állítottuk vissza, és az oldatot fiziológiás vízzel tovább hígítottuk 50 mg/kg koncentráció eléréséig. A BML-t-275 (1 μM, Santa Cruz Biotechnology) 1 órával a phloretin-kezelés előtt adták hozzá az AMPK aktiválásának gátlására. Bafilomycin A1 (BAF, 0,1 μM, InvivoGen) 2 órával az összegyűjtés előtt adtuk hozzá az autofagoszómák és lizoszómák fúziójának blokkolására. Lipopoliszacharidot (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) használtunk a sejtek gyulladásos fenotipizálásának stimulálására. A forbol 12-mirisztát 13- acetátot (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) használtuk a ROS termelés indukálására. A Western blothoz a következő antitesteket használtuk: egér anti- -aktin (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), egér anti-GAPDH (1:{{29) }};AB_2537659, Invitrogen), nyúl anti-AMPK (1:1000;5831S, Cell Signalling Technology), nyúl anti-foszforilált AMPK (1:1000; 2535S, Cell Signaling Technology), nyúl anti-LC3 (1:1000;L7543, Sigma-Aldrich), nyúl anti-p62 (1:1000; 23214, Cell Signaling Technology). Az immunfluoreszcenciához a következő antitesteket használtuk: patkány anti-CD3 (1:150; MCA500G, Bio-Rad), patkány anti-F4/80 (1:100; MCA497G, Bio-Rad), nyúl anti-LC3 (1:1000) ;L7543, Sigma-Aldrich), nyúl anti-p62 (1:500;23214, Cell Signaling Technology), nyúl anti-Keap1 (1:500;60027-1-Ig, Proteintech Europa), nyúl anti-TMEM119(1) :100, ab209064, Abcam). A megfelelő másodlagos antitesteket az Invitrogentől vásároltuk.

Egerek

A vad típusú (WT) C57BL/6JOlaHsd egereket az Envigo-tól vásároltuk. Az állatokat rendszeres táplálékkal etették, és a Hasselt Egyetem Orvosbiológiai Kutatóintézetének állatkertjében helyezték el. Minden kísérletet az intézményi irányelvek szerint végeztek, és a Hasselt Egyetem állatkísérletek etikai bizottsága hagyta jóvá.

Sejttenyésztés

Csontvelő eredetűmakrofágok(BMDM-eket) WT és Nrf2 knockout (KO) C57BL/6JOlaHsd egerekből izoláltuk, amelyeket az Envigo-tól vásároltunk, és a RIEN BRC biztosította egy MTA szerint Prof S. Kerdine-Römernek [27,28]. A BMDM-eket a korábban leírtak szerint kaptuk [29]. Röviden, a 12-hetes WT és Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd egerek sípcsont- és femorális csontvelősejtjeit 10- cm-es Petri-lemezeken tenyésztettük 10×106 sejt/koncentrációban. lemez, RPMI1640 táptalajban, kiegészítve 10 százalék borjúmagzati szérummal (FCS, Gibco), 50 U/ml penicillinnel (Invitro-gen), 50 U/ml sztreptomicinnel (Invitrogen) és 15 százalék L929-kondicionált táptalajjal (LCM) ). A differenciálódás után a BMDM-eket 37 fokban leválasztottuk 10 mM EDTA-val PBS-ben (Gibco), és tenyésztettük (0,5×10 fokos sejt/ml) RPM1640-ben, kiegészítve 10% FCS-sel, 50E/ml penicillinnel, 50E/ml sztreptomicinnel és 5% LCM-mel. 37 °C, 5 százalék CO2). A mikroglia tenyészeteket posztnatális P1-3 C57BL/6/OlaHsd kölykök agyából izoláltuk. Az agytörzs, a plexus érhártya és az agyhártya eltávolítása után az agyat mechanikusan disszociáltuk, és 15 percig enzimatikusan emésztettük 1× tripszinnel (Gibco) 37 fokon. Ezt követően a sejtszuszpenziót DMEM-be, egy magas glükóztartalmú táptalajba (Sigma) oltottuk ki, amelyet 30% LCM-mel, 10% FCS-sel, 50 U/ml penicillinnel és 50 U/ml sztreptomicinnel egészítettünk ki T75 tenyésztőlombikban. Két-három nappal később teljes táptalajcserét hajtottak végre. A vegyes glia tenyészeteket 6-7 nap elteltével felráztuk (230 ford./perc, 3 óra, 37 fok), hogy tiszta mikroglia tenyészeteket kapjunk.

RNS szekvenálás

A sejteket előkezeltük phloretinnel (50 μM) 20 órán át, és LPS-stimuláltam (100 ng/ml) 6 órán át. A sejtlízist Qiazol Lysis reagens (Qiagen) alkalmazásával végeztük. Az RNS-t az RNeasy mini kit (Qiagen) segítségével extraháltuk a sejtekből. A mintákat ezután a Genomics Core Leuven (Belgium) dolgozta fel. A könyvtár-előkészítést a Lexogen QuantSeq készletével végeztük az Illumina-kompatibilis könyvtárak létrehozásához. A könyvtárakat az Illumina HiSeq4000 szekvenáló rendszeren szekvenáltuk. Az illesztés-tudatos igazítás a STAR v2.6.1b-vel[30] történt. A leolvasások számszerűsítését génenként a HT-seq Count v2.7.14-gyel végeztük. A számlálás alapú differenciális expressziós analízist az R-alapú (The R Foundation for Statistical Computing, Bécs, Ausztria) DESeq2 bioconductor csomaggal végeztük. A differenciálisan expresszált gének listáját az ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Kvantitatív reverz transzkripciós PCR

A sejteket 20 órán át előkezeltük phloretinnel (5{8}} μM), és 6 órán át LPS-sel stimuláltuk (100 ng/ml). A lízist Qiazol Lysis reagenssel (Qiagen) végeztük. Az RNS-t az RNeasy mini kit (Qiagen) segítségével extraháltuk. Az RNS-koncentrációt és -minőséget Nano-drop spektrofotométerrel (Isogen Life Science) határoztuk meg. A cDNS-szintézist a Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) segítségével végeztük a gyártó utasításai szerint. A qPCR-t StepOne-Plus" Real-Time PCR rendszeren (Applied Biosystems) végeztük, SYBR zöld keverékkel, amely 1 × SYBR greent (Applied Biosystems), 0,3 μM primereket (Integrated DNA Technologies), 12,5 ng cDNS-t és nukleázmentes vizet tartalmazott. A génexpresszió mennyiségi meghatározására összehasonlító Ct módszert alkalmaztunk, az adatokat a legstabilabb referenciagénekre, a ciklin A-ra és a hipoxantin-foszforiboziltranszferáz 1-re normalizáltuk.

Reaktív oxigénfajták meghatározása

A sejteket 2 órán át phloretinnel (50 uM) előkezeltük. Ezt követően a sejteket PMA-val stimuláltuk (15 perc, 100 ng/ml), és a ROS termelést mértük a fluoreszcens szondával, 2',7'-diklór-dihidrofluoreszcein-diacetáttal 10 μM PBS-ben 30 percig. A fluoreszcenciát a fluoreszcens FLUOstar optima mikrolemez-leolvasóval (BMG Labtech, Ortenberg, Németország) mértük (gerjesztés: 495 nm, emisszió: 529 nm).

A nitrogén-monoxid mérése

A sejteket 2 órán keresztül előkezeltük phloretinnel (50 μM). Ezt követően a sejteket LPS-sel stimuláltuk (24 óra, 100 ng/ml). Az NO-t közvetetten a Griess-reagens nitritmérő készlettel (Abcam) követtük. Röviden, a nitrát szulfanilamiddal és N-(1-naftil)etilén-diamin-dihidrokloriddal reagál, így rózsaszínű azofestéket képez. Ennek az azo-származéknak az abszorbanciáját ezután 540 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval (iMark, Bio-Rad).

Western blot

A sejteket phloretinnel (5{{10}} μM) és LPS-sel (100 ng/ml) kezeltük 1 vagy 24 órán keresztül, hogy meghatározzuk az AMPK aktivációt, illetve a p62, LC3 és Keapl fehérjeszinteket. A sejteket RIPA-pufferrel (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% nátrium-dezoxikolát, 1% SDS, 50 mM Tris) lizáltuk, és nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel választottuk el. A géleket PVDF-membránra (VWR) vittük át, és a blotokat 1 órán át blokkoltuk 0,1 százalék Tween{20}}-t (TBS-T) tartalmazó, 5 százalékos szarvasmarha-szérumalbuminban, Tris-pufferelt sóoldatban. A membránokat egy éjszakán át 4 °C-on vizsgáltuk elsődleges antitestekkel, mostuk TBS-T-vel, és inkubáltuk a megfelelő másodlagos torma-peroxidázzal jelölt antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten (RT). Az immunreaktív jeleket fokozott kemilumineszcenciával (ECL Plus, Thermo Fisher) Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences) segítségével. A sávok sűrűségét ImageJ segítségével határoztuk meg.

Immunfluoreszcencia

A gerincvelő kriometszeteit levegőn szárítottuk, és jéghideg acetonban rögzítettük 10 percig - 20 fokon. Az egér BMDM-eket üveg fedőlemezeken tenyésztettük, és jéghideg metanolban fixáltuk 10 percig -20 fokon. A metszeteket és a BMDM-eket 30 percig blokkoltuk Dako protein blokk (Agi-lent) segítségével. Ezt követően egy éjszakán át 4 °C-on elsődleges antitestekkel inkubáltuk őket, mostuk, és a megfelelő másodlagos antitestekkel 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A gerincvelő szövetéről Nikon Eclipse 80i mikroszkóp (10×-es objektív) és NIS segítségével készült képeket. Elements BR 3.10 szoftver (Nikon). A p62-re, LC3-ra és Keapl-re festett BMDM-képek Zeiss LSM 880 konfokális mikroszkóppal készültek, és Airyscan korrekciót végeztek (63× objektív).P62-és LC3- A pozitív pontokat félautomata pontelemző képpel határoztuk meg. Röviden, a kép binárissá tétele és a sejtek kézi szelekciója után a pontokat sejtenként elemeztük. A P62 és Keapl kolokalizációt a CellProfiler szoftverben található kolokalizációs pipeline segítségével végeztük [31 Az ábrákon látható képek digitálisan javítottak.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, terápiás beállítás). Az egereket naponta lemértük és pontoztuk a betegség neurológiai jeleit a gyártó egér EAE pontozási útmutatója szerint:0:nincs klinikai tünet,0.5:a farok hegye ernyedt, 1:ernyedt farok , 1,5: ernyedt farok és hátsó láb gátlása 2: ernyedt farok és a hátsó lábak gyengesége, 2,5: ernyedt farok és a hátsó lábak húzása, 3: ernyedt farok és a hátsó lábak teljes bénulása, 3,5: ernyedt farok és a hátsó lábak teljes bénulása a lábak és az egér nem tudnak helyreállni, ha az oldalára helyezik, 4: a rekeszizom bénulása, 5: az EAE által okozott halál.

Statisztikai analízis

GraphPad Prism-et használtunk az adatok statisztikai elemzésére, amelyek átlag±sem-ként vannak ábrázolva D'Agostino és Pear-son omnibus normalitásteszttel a normál eloszlás tesztelésére. A normál eloszlású adatokhoz kétirányú páratlan Student-féle t-próbát (szükség esetén Welch-korrekcióval) használtunk. A Mann-Whitney analízist használtuk azokhoz az adatokhoz, amelyek nem feleltek meg a normalitásteszten.p-értékek<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Eredmények

A makrofágok phloretin kezelésével kapcsolatos transzkripciós változások

A potenciális gyulladáscsökkentő hatások megállapítása és a makrofágok phloretin kezelésének mögöttes mechanizmusainak azonosítása érdekében tömeges RNS szekvenálást végeztünk (kiegészítő 1. ábra). A floretinnel kezelt aktivált makrofágok útvonalanalízise azt mutatta, hogy a differenciálisan expresszált gének felülreprezentáltak a kanonikus útvonalakbangyulladás, mint például az iNOS(z-score:-2.449), az útdíjszerű receptor(z-score:-2.236), az interferon jelátvitel (z-score:- 2), és az akut fázis válaszútja (z-pontszám:- 1.633) (1A, B ábra). A kanonikus útvonalanalízishez hasonlóan az RNS-seq adatok upstream elemzése azt jósolta, hogy a phloretin csökkentette a kulcsfontosságú gyulladást elősegítő transzkripciós szabályozók aktiválódását, mint például az IRF7 (z-score: 2,229), az IRF1 (z-score:-2). 025) és STAT1(z-pontszám:-2.022)(1D. ábra). A phloretinnel kezelt makrofágok RNS-seq analízise mellett a makrofágok gyulladásos folyamatainak leszabályozása azt mutatta, hogy a phloretin – egyéb útvonalak mellett – erőteljesen aktiválta az Nrf2 útvonalat (z-pontszám: 1,897), amit az Nrf{35}}hoz kapcsolódó felszabályozás bizonyít. gének, mint például a mafG és a proxy (1A, C ábra). Sőt, az Nrf2(NFE2L2) a leginkább aktivált upstream transzkripciós szabályozó (z-score: 2,801), és a ROS-szintek szabályozása az egyik leginkább szabályozott biológiai funkció a floretinnel kezelt BMDM-ekben (z-score: 2,008). )(1D, E ábra). Összességében az eredmények azt mutatják, hogy a phloretin aktiválja az Nrf2-t, és elnyomja a makrofágok gyulladásos fenotípusát.

Az Nrf2 útvonal szabályozza a floretinnel kezelt makrofágok fenotípusát

Ezt követően validáltuk a phloretin gyulladáscsökkentő hatását, és meghatároztuk, hogy az Nrf2-re hatva módosítja-e a makrofágok gyulladásos fenotípusát. Csökkent ROS-szinteket figyeltek meg a phloretinnel kezelt, PMA-val stimulált WT BMDM-ekben (2A. ábra). Ezenkívül a NOS2, I-6, COX2 és I-12 pro-inflammatorikus gének NO-termelésének és mRNS-szintjének csökkenését figyelték meg a floretinnel kezelt, LPS-sel stimulált WT BMDM-ekben (2B. ábra, C). Az Nrf2 kevésbé gyulladásos fenotípus kiváltásában betöltött döntő szerepével összefüggésben adataink azt mutatják, hogy a phloretin aktiválja a HO1 és NQO1 Nrf2-válasz géneket WT-ben, de nem aktiválja az LPS-sel stimulált Nrf2 KO BMDM-eket (2D. ábra). Ezenkívül a phloretin kezelés csökkentette a ROS termelést a WT-ben, de nem a Nrf2 KO BMDM-ekben (2E. ábra). Az antioxidáns válaszok szabályozásán kívül a Nrf2 a jelentések szerint elnyomja a makrofágok gyulladásos fenotípusát [12]. Ez utóbbi alátámasztására a phloretin nem volt képes csökkenteni a NOS2, IL-6, COX2 gyulladást elősegítő gének expresszióját. , és IL-12 aktivált Nrf2-hiányos BMDM-ekben (2F. ábra). Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy az Nrf2 mozgatja a makrofágok floretin által közvetített gyulladásos fenotípus-eltolódását.

A Phloretin elősegíti az AMPK aktiválását

A phloretin egy jól definiált GLUT-gátló, és a legújabb tanulmányok rávilágítanak a GLUT által közvetített glükózfelvétel fontosságára a makrofágok aktivációjában [26,32]. Ezért meghatároztuk, hogy a phloretin aktiválhatja-e az AMPK energiaérzékelőt, amely alacsony energia-/glükózszint esetén aktiválódik. Eredményeink azt mutatják, hogy a phloretin kezelés az AMPK foszforilációjához és aktiválásához vezet (3A, B ábra). Ezenkívül az AMPK inhibitor BML-275 hozzáadása nagymértékben megakadályozza az AMPK aktiválódását floretinnel kezelt BMDM-ekben (3A. és B. ábra). Sőt, eredményeink azt mutatják, hogy az AMPK aktiválása elengedhetetlen a floretin ROS-termelésének visszaszorításához, amint azt a floretinnel és AMPK-gátlóval kezelt BMDM-ekben magasabb ROS-szint is mutatja, mint a csak phloretinnel kezelt BMDM-ekben (3C. ábra). Összességében adataink azt sugallják, hogy a phloretin által kiváltott AMPK aktiváció kulcsfontosságú a makrofágok kevésbé gyulladásos fenotípus felé terelésében.

A Phloretin AMPK-függő módon stimulálja az autofágiát

Mivel az AMPK aktiválása összefügg a katabolikus folyamatok aktiválódásával a tápanyaghiány hatására [33], ezt követően azt vizsgáltuk, hogy a phloretin képes-e aktiválni az autofágiát. Az autofágia egy konzervált katabolikus folyamat, amely éhezés és egyéb stresszválaszok hatására indukálódik, és elősegíti az autofagoszómáknak nevezett vezikulákban megkötött intracelluláris rakomány lizoszómális lebomlását. Az RNS-seq analízis az autofágiát az egyik lefelé irányuló biológiai folyamatként jelezte, amely fokozott aktivitást mutat a floretinnel kezelt BMDM-ekben (z-pontszám: 0,779) (4A. ábra). Ezenkívül a phloretinnel és az autofágia gátló bafilomycin Al-lal kezelt BMDM-ek immuncitokémiai elemzése a MAP1LC3/LC3 (mikrotubulus-asszociált protein 1 könnyű lánc 3) és a p62 fokozott felhalmozódását mutatta a bafilomycin A{14}} kezelt BMDM-ekhez képest. 4B-D), ami a phloretin-kezelés hatására megnövekedett autofágiás fluxusra utal [34]. Az autofágia indukálásakor az LC3 az LC3I formából lipidezett LC3I formává alakul, ami korrelál az autofagoszómák számával. Ezzel összhangban a phloretin-stimulált BMDM-ekben magasabb LC3II és p62 fehérjeszinteket határoztunk meg Western blot segítségével (4E, F ábra). Érdekes módon a p62 és LC3II phloretin általi növekedését a BMDM-ek AMPK-gátló BML-275-val történő kezelése megakadályozta (4E-F. ábra). Adataink összességében azt mutatják, hogy a phloretin AMPK-függő módon stimulálja az autofágiát.

A Phloretin aktiválja az Nrf2 útvonalat az autofágia által közvetített Keap1 lebomlással

Adataink azt mutatják, hogy a phloretin aktiválja az Nrf2-t és stimulálja az autofágiát a makrofágokban. Érdekes módon a p62 autofágia receptor versenyezhet az Nrf2-vel a Keapl-hez való kötődésért, amely adapter normál körülmények között elősegíti az Nrf2 ubikvitinációját és lebomlását. A Keap1/Nrf2 p62-közvetített disszociációja ezért megakadályozza az Nrf2 lebomlását, és végül Nrf2 aktivációhoz vezet [35]. Emiatt megállapítottuk, hogy a phloretin elősegíti-e a p62/Keapl kölcsönhatást, ezáltal aktiválva az Nrf2 útvonalat. Itt megmutatjuk, hogy a phloretin aktiválja az Nrf2 útvonalat a p62-közvetített Keapl-lebomláson keresztül a makrofágokban. Nagy felbontású Airyscan kon-fokális mikroszkóppal kombinálva kolokalizációs elemzéssel kimutattuk, hogy a phloretin serkenti a p62 és a Keapl kölcsönhatását, amint azt a kolokalizációs paraméter (Pearson-koefficiens) megnövekedett értéke bizonyítja floretinnel kezelt BMDM-ekben (5A. ábra). , B). Ezen túlmenően, eredményeink azt mutatják, hogy a Keapl alacsonyabb fehérjeszintje van jelen a floretinnel kezelt BMDM-ekben, ami megerősíti a Keapl lebomlását (5C. ábra). Annak igazolására, hogy a lebomlás autofágia-függő, hozzáadtuk az autofágia-gátló bafilomycin A1-et a floretinnel kezelt anyaghoz. BMDM-ek. Érdekes módon ezt a Keapl-csökkenést a bafilomicin Al-kezelés megfordította (5C. ábra). Ezeket az eredményeket Western-blot-vizsgálat erősítette meg, amely a Keapl fehérje szintjének csökkenését mutatta a floretinnel kezelt BMDM-ekben, amit a bafilomicin A1 megakadályozott (5D, E ábra).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), a phloretin csökkentette a betegség súlyosságát (6B. ábra). A floretinnel kezelt állatokban a betegség súlyosságának csökkenése az MHCI gyulladásos gének csökkent expressziójával párhuzamba állítható,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 és CXCL2 a gerincvelőben (6C. ábra). Ezenkívül a floretinnel kezelt állatok gerincvelőjében csökkent mennyiségű F4/80t sejtet találtak (6E, F ábra). Mivel mind az F4/80*mikroglia, mind az F4/80* makrofágok hozzájárulnak az ideggyulladáshoz, a mélyebb elemzés azt mutatta, hogy a phloretin jelentősen csökkentette az F480 és a TMEMl mennyiségét{17}}

makrofágok EAE egerekben (kiegészítő 2. ábra DF), miközben nem szignifikáns tendenciát figyeltek meg az F480 plusz TMEMl19 plusz mikroglia csökkenése felé. Ezzel a megállapítással összhangban a phloretin elnyomta a gyulladásos mediátorok termelődését a mikrogliákban, de ez a szuppresszió kevésbé volt kifejezett a makrofágokhoz képest (2. AC kiegészítő ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az EAE phloretin általi javulása főként makrofágok által vezérelt. A gyulladásos gének expressziójának csökkentése mellett a phloretin növelte a gyulladásgátló és neurotróf faktorok, azaz az IL-4, a CNTF és az IGF-1 expresszióját az EAE állatok gerincvelőjében (6D ábra). ). Ezek az eredmények határozottan azt sugallják, hogy a phloretin csökkenti az EAE betegség súlyosságát azáltal, hogy a makrofágokat a betegség-megoldó fenotípus felé tereli. Korábbi in vitro eredményeinkkel összhangban emelkedett Nrf2 jelátvitelt is kimutattunk a phloretinnel kezelt EAE állatok központi idegrendszerében, amit az Nrf2 és downstream célpontjai, az NQO1 és GPX1 fokozott mRNS expressziója jelez (6G. ábra). Összességében ezek az adatok azt mutatják, hogy a phloretin elnyomja a neuroinflammációt mind profilaktikus, mind terápiás környezetben. Ezen túlmenően eredményeink azt mutatják, hogy a phloretin csökkentheti a neurogyulladást azáltal, hogy elnyomja a makrofágok gyulladásos jellemzőit az Nrf2 aktiválása révén.

Vita

Ebben a tanulmányban bemutatjuk, hogy a phloretin a makrofágokat kevésbé gyulladásos fenotípus felé tereli Nrf{1}}függő módon. Úgy találták, hogy az autofágia AMPK-függő aktiválása és az azt követő Keapl degradáció áll a phloretin általi Nrf2 aktiváció hátterében. Továbbá megerősítjük a phloretin gyulladáscsökkentő hatását egy EAE modellben, ahol csökkenti a betegség súlyosságát és enyhíti a makrofág-függőideggyulladás.

Megmutattuk, hogy a phloretin elnyomja a makrofágok gyulladásos fenotípusát. Ez összhangban van Wei-Tien Chang és munkatársai megállapításaival. akik kimutatták, hogy a phloretin gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkezik egy makrofág sejtvonalban [36]. Bemutatjuk, hogy ennek a fenotípus-eltolódásnak az indukciója az Nrf2-től függ. Az Nrf2 az antioxidatív válaszok fő szabályozója, és aktiválása köztudottan gyulladásgátló fenotípus felé tereli a makrofágokat [1l, 12, 37]. Ezenkívül számos tanulmány megállapította, hogy az Nrf2 aktiválása mérsékli a neurogyulladást és a neurodegenerációt központi idegrendszeri rendellenességekben [{{10] }}]. Azonban, bár eredményeink azt mutatják, hogy az Nrf2 áll a floretinnel kezelt makrofágok fenotípus-eltolódásának hátterében, az RNS-szekvenálási adatok azt mutatták, hogy az Nrf2 aktiválása mellett más útvonalak is felfelé szabályozottak. Különösen a PPAR-útvonal felszabályozása érdekes gyulladásgátló tulajdonságai és az Nrf2-vel való keresztbeszéd miatt [41-45]. Ezen túlmenően, mivel a phloretin egy jól definiált GLUT-gátló, és a glikolízisre való átállás a makrofágok aktiválásának döntő fontosságú metabolikus eseménye, a fenotípus változásait részben a phloretinnek ezekre a glükóz transzporterekre gyakorolt ​​közvetlen metabolikus hatásai is kiválthatják [46,47]. További kutatások szükségesek a PPAR jelentőségének meghatározására a phloretin által kiváltott Nrf2 aktivációban, és hogy a phloretin által kiváltott immunmodulációt milyen mértékben befolyásolják a közvetlen metabolikus változások. Összességében eredményeink egyértelműen azt mutatják, hogy az Nrf2 aktiválása alapvető szerepet játszik a phloretin által közvetített fenotípusváltásban.

Eredményeink azt mutatják, hogy a phloretin általi Nrf2 aktivációt az AMPK aktiválása közvetíti. Az AMPK döntő szerepet játszik a sejtenergia-homeosztázis helyreállításában olyan stresszek esetén, amelyek kimerítik az ATP-t, ami megnövekedett ADP:ATP arányt eredményez, ezáltal bekapcsolja az ATP-t termelő alternatív katabolikus utakat, miközben kikapcsolja az ATP-t fogyasztó anabolikus utakat [48]. Ennek megfelelően a phloretin egy jól bevált GLUT-gátló, és csökkenti a celluláris glükózszintet [49-51]. Számos tanulmány kimutatta, hogy az AMPK aktiválása a makrofágokban immunszuppresszív fenotípust indukál, ami megerősíti eredményeinket, amelyek azt mutatják, hogy az AMPK aktiválása elengedhetetlen a floretin számára a gyulladás csökkentésében [52,53]. Adataink összhangban vannak azokkal a korábbi tanulmányokkal is, amelyekben a phloretinről kimutatták, hogy aktiválja az AMPK-t más sejttípusokban, beleértve a zsírsejteket és az endotélsejteket [50, 54-56]. A Phloretin indirekt módon aktiválhatja az AMPK-t az AMP növelésével és az ATP-szint csökkentésével, mivel az AMP és az ATP alloszterikusan stimulálja vagy gátolja az AMPK aktiválását [48, 57]. Mindazonáltal, a CaMKK, amely egy kináz az AMPK-tól felfelé, elősegítheti az AMPK aktiválódását válaszul a megnövekedett celluláris Ca2 plusz szintre, anélkül, hogy az AMP/ATP szintek megváltozna [58]. Ezen túlmenően, tekintettel az AMPK és az up-stream útvonalak közötti kölcsönhatás széles hálózatára, további kutatásokra van szükség a phloretin által kiváltott AMPK aktiváció mögöttes mechanizmusának tisztázására.

Adataink arra utalnak, hogy a phloretin által közvetített AMPK aktiváció serkenti az autofágiát a makrofágokban. Mint fentebb említettük, az AMPK aktiválása egy önvédelmi folyamat, amelynek célja a sejt energiaegyensúlyának helyreállítása [48]. Bár egyetlen tanulmány sem igazolta, hogy a phloretin képes volt stimulálni a makrofágok fenotípusát az autofágia elősegítésével, néhány tanulmány ennek ellenére kimutatta a phloretin hatását a rákos sejtekben és májsejtekben az autofágia útvonalakra [59-61]. Ezenkívül különböző tanulmányok azt mutatják, hogy az AMPK aktiválásának downstream katabolikus folyamatai aktiválhatják az autofágiát [60, 62, 63]. Érdekes módon a glükóz éhezésre adott válaszként az AMPK által közvetített autofágiát a fontos autofágia iniciátor unc-51 foszforilációja indukálja, mint az autofágiát aktiváló kináz [64,65]. Ezzel kapcsolatban azt feltételezzük, hogy az AMPK stimulálja az autofágiát, hogy helyreállítsa az ATP-t a sejtkomponensekből, válaszul a floretin által kiváltott glükóz kimerülésre. A glükózéhezés azonban AMPK-független módon is aktiválhatja az autofágiát [66-68]. Ezért további kutatásokra van szükség annak meghatározására, hogy a floretin általi autofágia aktiválása részben az AMPK-tól függetlenül is megtörténik-e.

A legújabb tanulmányok kimutatták az autofágia fontosságát a funkcionális makrofág fenotípus irányításában. Ebben az összefüggésben a makrofágokban az autofágia diszregulációja különösen az atherosclerosis és a neurológiai betegségek kialakulásához kapcsolódik [69-72]. Itt a phloretin-kezelés, az autofágia-indukció és a Nrf2 aktiválása között mutatunk be kapcsolatot azzal, hogy bemutatjuk, hogy a phloretin elősegíti az Nrf2 aktiválódását a Keap1 p62-közvetített lebomlásával. Egészen a közelmúltig a p62 puncta növekedését a csökkent autofágia jelének tekintették, mivel a p62 lebomlik az autofagoszómákban az autofágia aktiválásakor [34]. Ezzel összefüggésben a p62 felhalmozódását összefüggésbe hozták az ateroszklerotikus léziókban fellépő autofágia diszfunkcióval [73]. Ezt az elképzelést azonban az elmúlt években megkérdőjelezték, és jelenleg úgy gondolják, hogy a p62 szükséges az autofagoszómák kialakulásához, és hogy a p62-szint emelkedése az LC3Il puncta növekedésével párhuzamosan az autofágia indukciójának jele lehet [74]. Ezért a phloretin AMPK-aktiváló képességével és az autofágia aktiválásában betöltött ismert szerepével együtt eredményeink arra utalnak, hogy a bafilomycin A1 kezelés hatására a P62 és LC3 felhalmozódása floretin-stimulált makrofágokban a megnövekedett autofág fluxusnak köszönhető, nem pedig a károsodásnak. autofágia. Érdekes módon Lee Y et al. a közelmúltban kimutatták, hogy az Nrf2 aktiválása mellett a p62 Keapl-hez való kötődése is részt vesz az autofagoszóma kialakulásában, ami arra utal, hogy a phloretin által közvetített autofágia aktiváció közvetlenül kapcsolódik egyrészt a megnövekedett p62-aktivitáshoz, másrészt a Keapl-p62 interakcióhoz is. 75]. A Keapl a Cullin{27}}alapú ubiquitin ligáz adaptere, amely homeosztatikus körülmények között homodimert képez az Nrf2-vel, elősegítve ezzel az Nrf2 ubikvitinációját és a proteaszómális lebomlását [76]. A Keapl-Nrf2 komplex felbomlása az Nrf2 stabilizálódásához és a sejtmagba való transzlokációjához vezet [77, 78]. Jól dokumentált, hogy ennek a komplexnek a felbomlása vagy a Keapl cisztein-maradékok elektrofil molekulák általi módosítása, a kis molekulák és a Keapl közötti közvetlen kölcsönhatás, vagy a p62- által közvetített Keapl-lebomlás révén következik be [35]. Ying Y és munkatársai a phloretin és a Keapl közvetlen kölcsönhatását javasolják in silico kísérletek alapján, ami aztán a Nrf2 útvonal aktiválásához vezet egy kardiomiocita sejtvonalban [79]. Itt létrehoztunk egy további autofágiával kapcsolatos mechanizmust, amellyel a phloretin aktiválja az Nrf2-t.

Az EAE modell segítségével megállapítottuk, hogy a phloretin in vivo enyhíti az ideggyulladást. Adataink erősen arra utalnak, hogy a phloretin javítja az EAE-t azáltal, hogy elnyomja a makrofágok által közvetített gyulladásos választ, és aktiválja az Nrf2 útvonalat. Más betegségmodellekben a phloretin neuroprotektív és immunmoduláló tulajdonságokat is kifejt. A phloretinről azt találták, hogy aktiválja az Nrf2 útvonalat az agyban agyi ischaemia esetén, és csökkenti az amiloid béta felhalmozódását patkány Alzheimer-kór modellben [80-84]. A phloretin más immunsejtekre is hatással lehet in vivo, mivel erről a vegyületről kimutatták, hogy gátolja a T-sejtek és a dendritesejt-aktivációt in vitro [85, 86]. Tekintettel arra, hogy az EAE modellben a neuroinflammáció nem tisztán makrofágfüggő, érdekes lenne annak meghatározása, hogy az ideggyulladás csökkenését milyen mértékben közvetítik más immunsejtek. Ezzel kapcsolatban, bár adataink azt sugallják, hogy az EAE javulását főként makrofágok vezérlik, és kevésbé függ a mikroglia modulációtól, további kísérletekre van szükség annak tisztázására, hogy a phloretin milyen mértékben befolyásolja a mikrogliát neurogyulladásos betegségekben. Eredményeink összességében azt mutatják, hogy a phloretin csökkenti a neurogyulladást azáltal, hogy befolyásolja a makrofágok fenotípusát, megmutatva a phloretin terápiás potenciálját az ideggyulladásos betegségekben.

Következtetések

Vizsgálatunk azt mutatja, hogy a phloretin egy erős immunmoduláló szer, amely modulálja a makrofágok gyulladásos tulajdonságait neuroinflammatorikus betegségekben. Az AMPK-függő autofágia aktiváció és az azt követő Keapl degradáció által közvetített Nrf2 útvonal aktivációját megállapították ennek a fenotípus-eltolódásnak az előmozdítására. Ennélfogva a phloretin egy ígéretes természetben előforduló szer, amely felhasználható az ideggyulladásos betegségek, például az SM gyulladásos terhének csökkentésére.

Hivatkozások

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY és mások. A dihidromiricetin javítja a habsejtek képződését az LXRalpha-ABCA1/ABCG1-dependens koleszterin-kiáramlás révén a makrofágokban. Biomed Pharmacother. 2018;101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q és munkatársai. Az antocianinok koleszterin kiáramlást indukálnak az egér peritoneális makrofágjaiból: a peroxiszóma proliferátor által aktivált receptor {gamma}-máj X receptor {alfa}-ABCA1 útvonal szerepe. J Biol Chem. 2005;280(44):36792–801. https://doi.org/10.{11}}/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. A kvercetin fokozza az ABCA1 expresszióját és a koleszterin kiáramlását az ap38-függő útvonalon keresztül a makrofágokban. J Lipid Res. 2012;53(9):1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. A habos fagociták élettana sclerosis multiplexben. Acta Neuropathol Commun. 2018;6(1):124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Makrofág alcsoportok és mikroglia sclerosis multiplexben. Acta Neuropathol. 2014;128(2):191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Sclerosis multiplex: mechanizmusok és immunterápia. Idegsejt. 2018;97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j. neuron.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S és mások. A sztearoil-CoA-deszaturáz-1 rontja a makrofágok és mikrogliák reparatív tulajdonságait az agyban. J Exp Med. 2020; 217 (5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. A mielin-fagocitáló makrofágok modulálják az autoreaktív T-sejtek proliferációját. J Neurogyulladás. 2011;8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA et al. A mielin eredetű lipidek a máj X receptor aktiválásával modulálják a makrofágok aktivitását. PLoS One. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T és társai. A mielin megváltoztatja a makrofágok gyulladásos fenotípusát a PPAR-ok aktiválásával. Acta Neuropathol Commun. 2013;1(1):43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.