A Lentinula Edodes és a Pleurotus Ostreatus ehető gombák vizes kivonatainak proteóma elemzése és in vitro vírusellenes, rákellenes és antioxidáns kapacitása

További részletekért forduljontina.xiang@wecistanche.com

Absztrakt: Ebben a vizsgálatban a Pleurotus ostreatus (laskagomba) és a Lentinula edodes (shiitake gomba) ehető gombák vizes kivonatait vizsgáltuk. A proteomanalízist LC-Triple TOF-MS segítségével végeztük, és 753 fehérje expresszióját mutatta ki a Pleurotus ostreatus és 432 fehérjét a Lentinula edodes. Bioaktív peptidek: Rab GDP disszociáció-gátlót, szuperoxid-diszmutázt, tioredoxin-reduktázt, szerin-proteinázt és lektint azonosítottak mindkét gombában. A kivonatok ígéretes bioaktív vegyületeket is tartalmaztak, beleértve a fenolokat,flavonoidok, vitaminok és aminosavak. A kivonatok ígéretesnek bizonyultakvírusellenes tevékenységek, a Pleurotus ostreatus adenovírus (Ad7) elleni szelektivitási indexe (SI) 4,5, a herpes simplex-II (HSV{4}}) elleni Lentinula edodes esetében pedig enyhe aktivitással. A kivonatok nem voltak citotoxikusak a normál humán perifériás vér mononukleáris sejtjeire (PBMC). Éppen ellenkezőleg, mérsékelt citotoxicitást mutattak különböző rákos sejtvonalakkal szemben. Ezenkívül az antioxidáns aktivitást DPPH segítségével értékeltékradikális elpusztítás, ABTS gyökkation-fogó és ORAC vizsgálatok. A két kivonat potenciált mutatottantioxidáns tevékenység, a Pleurotus ostreatus esetében tapasztalt maximális aktivitással (IC50 ug/mL)=39,46 ± 1,27 a DPPH esetében; 11,22±1,81 az ABTS esetében; és 21,40±2,20 az ORAC vizsgálatokhoz. Ez a tanulmány ösztönzi e gombák alkalmazását az orvostudományban, tekintettel a normál PBMC-kre gyakorolt ​​alacsony citotoxicitásukra, szemben a vírusellenes, daganatellenes és antioxidáns képességükkel.

Kulcsszavak: fehérrothadás gomba; Pleurotus ostreatus; Lentinula edodes; shiitake; antioxidáns; daganatellenes; vírusellenes

1. Bemutatkozás

A gombáknak nagy kilátásai vannak az orvostudományban és a táplálkozási termelésben. Amellett, hogy jó érzékszervi tulajdonságokkal és magas tápértékkel rendelkezik, sok gombáról a jelentések szerint számtalan farmakológiai aktivitás is van [1-3]. A legszélesebb körben termesztett gombák közé tartozik a Lentinula edodes (shiitake gomba) és a Pleurotus ostreatus (laskagomba). A shiitake a második helyen áll az Agaricus bisporus után, mint a világon a legtöbbet fogyasztott ehető gomba [4]. Ez a gomba ígéretes antibakteriális, gombaellenes, vírusellenes, májvédő, antihiperglikémiás és immunmoduláló hatással rendelkezik [5-7]. Gazdag bioaktív molekulákban, amelyek közül a legtöbbet tanulmányozott "lentinan", egy baktériumok, vírusok és daganatok elleni hatású poliszacharid, a "lentinán" mellett, amely a dyslipidaemia és a hiperglikémia kezelésében mutatott segítséget [8]. A Pleurotus ostreatus, a Pleurotus nemzetség legelterjedtebb faja [9], más néven laskagomba, fabontó, és széles körű biológiai aktivitással rendelkezik [10]. Más terápiás gombákkal összehasonlítva a laskagomba egyre népszerűbb egészségfejlesztő [11]. A laskagombákban található nagyszámú tápláló összetevő, például lektinek, poliszacharidok, vitaminok és ásványi anyagok jelenléte lehetővé teszi, hogy potenciális rákellenes szerekkel rendelkezzenek,antioxidáns, antidiabetikus, antimikrobiális és antihiperkoleszterinémiás tulajdonságok [12,13]. Más ehető gombákkal összehasonlítva az osztrigának és a shiitake gombának rövid a növekedési ideje, és egész évben betakarítható 14. Könnyű termesztésük és tesztelésük, magas tápértékük és ígéretes gyógyászati ​​előnyeik következtében ezek a gombák óriási potenciállal rendelkeznek. az élelmiszer- és gyógyszeriparban [4,15]. A magasabb Basidiomycetes valóban ígéretes többfunkciós táplálékforrás lehet.

Számos bioaktív vegyület, köztük cukrok, fiziológiailag aktív fehérjék, telítetlen zsírsavak, fenolok (fenolsavak és polifenolok), flavonoidok, terpenoidok, glikoproteinek, poliketidek, szteroidok és alkaloidok találhatók ebben a két gombában [16,17]. Ezek a vegyületek egyedül vagy szinergetikusan fejtik ki e gombák széles körű farmakológiai hatását. A shiitake és a laskagomba antibakteriális, vírusellenes, vérnyomáscsökkentő, immunmoduláló és antioxidáns hatással rendelkezik [1,18,19]. Seo et al. [20] összefoglalta a gomba biomolekulák vírusellenes aktivitásának mechanizmusait, jelezve, hogy a vírusfertőzés csökkenése főként a vírus gazdasejtekbe történő felvételének, replikációjának, valamint fehérje- és enzimszintézisének megzavarásán túlmenően a gazdaszervezet immunválasza [21]. Az antioxidánsok fontos molekulák a reaktív oxigénfajták ellen, amelyek számos egészségügyi probléma hátterében állnak. Mivel sok vörös zászlót tűztek ki a szintetikus antioxidánsok használata ellen, a természetesek tanulmányozása kötelezővé vált [22]. Ezeknek a gombatermékeknek a daganatellenes hatása olyan biomolekulákkal volt kapcsolatos, mint a glükánok, ergoszterol, proteoglikánok és aminosavak (arginin és glutamin)[23]. A hatás mögött meghúzódó feltételezett mechanizmus magában foglalhatja a T-limfociták stimulálását, a neovaszkularizáció elnyomását és a rákos sejthalál indukálását, a rákos sejtek elleni immunválasz kiváltása mellett [24,25].

A proteomika a biokutatás, különösen a mezőgazdasági kutatás egyik értékes eszközeként bizonyult [26]. Lindequist et al. [27] volt az első csoport, amely rávilágított a proteomika alkalmazásának fontosságára az ehető gombák kutatásában. Hangsúlyozták az "omika" alkalmazásának szükségességét a gombák bioaktív molekuláinak tanulmányozására. A proteomikát alig alkalmazták ehető gombák kutatásában a patogén gombákkal szemben [28]. Ennek megfelelően a tanulmány célja a két ehető gomba, a Pleurotus ostreatus és a Lentinula edodes proteomjának elemzése és potenciáljuk vizsgálata volt.vírusellenes, daganatellenes és antioxidáns hatású.

2. Eredmények

2.1.Proteom1e elemzés

A proteomanalízist LC-Triple TOF-MS analízissel végeztük, téves felfedezési arány (FDR) mellett.<5% and="" a"95%="" confidence="" of="" identification".="" for="" p.ostreatus,="" a="" total="" of="" 753="" proteins="" were="" identified,34="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" a="" total="" of="" 432="" proteins="" were="" detected="" in="" ledodes,="" 48="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" the="" recorded="" accession="" numbers="" of="" the="" proteins="" are="" included="" in="" tables="" s1="" and="" s2="" for="" p.="" ostreatus="" and="" l.edodes,="" respectively.="" in="" tables="" s1="" and="" s2,="" the="" ms-triple="" tof="" data="" were="" analyzed="" by="" proteinpilot="" with="" the="" paragon="" algorithm.="" proteins="" were="" identified="" with="" peptides="" that="" gave="" more="" than="" a="" 95%="" confidence="" of="" identification.="" bioactive="" proteins:="" rab="" gdp="" dissociation="" inhibitor,="" superoxide="" dismutase,="" thioredoxin="" reductase,="" serine="" proteinase,="" and="" lectin,="" were="" expressed="" in="" both="" p.ostreatus="" and="" l.edodes="" extracts="" [29-35].="" p.="" ostreatus="" also="" expressed="" osteolysis="" and="" pleurotolysin,="" whereas="" latch="" pin="" and="" valosin-containing="" protein="" were="" expressed="" by="" l.edodes.="" lc-triple="" tof-ms="" spectra="" of="" the="" mushroom="" extracts="" analyzed="" by="" analyst="" tf1.7.1="" (sciex="" software)="" are="" shown="" in="">

2.2. Összes bioaktív vegyület Összes tartalom

A teljes tartalom értékelésénél ez magában foglalta az összes szénhidrát, fehérje, fenol és flavonoid értékelését. A P. ostreatus kivonat csaknem háromszor annyi szénhidrátot és kétszer annyi fehérjét tartalmazott a L. edodes kivonatban; ennek ellenére több flavonoidot mutattak ki a L.edodes kivonatban, mint a P. ostreatus kivonatban (1. táblázat).

2.3. Fenol és flavonoid molekulák

Mindkét gombakivonat katechint tartalmazott (26,48 perces retenciós idővel detektáltuk). A P.ostreatus emellett tartalmazta a kaempferolt és az apigenint (59,13 perc, illetve 59,56 perc retenciós idővel), míg a L.edodes kvercetint is tartalmazott (retenciós idő=56.86 perc; 2. táblázat; ábra). S1).

2.4.Vitaminok

A vízben és zsírban oldódó vitamin tartalmat HPLC-vel határoztuk meg (3. táblázat, S2 és S3 ábra). Mindkét gomba gazdag C-vitaminban, kimutatható mennyiségű B3-, B6- és D-vitaminnal. A két gomba között nem volt szignifikáns különbség a bennük lévő vitaminok mennyiségében. A B1-, B2-, B9-, A- és E-vitamin viszont mindkét gombában nem volt kimutatható.

2.5. Aminosavak elemzése

Az aminosav-analízishez Sykam aminosav-analizátort használtunk. Az összes aminosavtartalom 5,14 és 4,35 volt a P.ostreatus és L.edodes esetében, a 4. táblázat szerint, és a két gomba gazdag glutaminsavban. Míg a prolin jelentős koncentrációban (0,57 g/100 g fehérje) volt kimutatható a P. ostreatus kivonatban, addig a L. edodes kivonatban nem volt kimutatható. Hisztidint és aszparaginsavat egyik gombában sem mutattak ki.

2.6. Biológiai tevékenységek

2.6.1.Vírusellenes tevékenység

Az antivirális aktivitást két vírus ellen értékelték: adenovírus és herpes simplex-II. Amint az 5. táblázatban látható, a P. ostreatus kivonat hatékony antivirális aktivitást mutatott az adenovírussal szemben, szelektivitási indexe 4,5. A P. ostreatus kivonat herpes simplex-II ellen és a L. edodes kivonat mindkét vírus ellen is ígéretes vírusellenes hatást mutatott ki. Az S4 és S5 ábrák a dózis-hatás görbéket mutatják.

2.6.2. Citotoxikus aktivitás normál humán PBMC-k ellen

Minimális citotoxicitást (IC50 ug/ml; 66,41 ± 3,7 és 82,81 ± 2,72, P. ostreatus és L. edodes) regisztráltak normál humán PBMC-kkel szemben.

A rákos sejtvonalak ellen

Különféle rákos sejtvonalakat használtak ebben a tesztben, beleértve a prosztatarákot (DU{0}} és PC3); hepatocelluláris karcinóma (HepG2); kolorektális karcinóma (Colo-205); vakbél karcinóma (LS-513); méhnyakrák (HeLa); és mell adenokarcinóma (MDA-MB-231 és MCF-7). Pozitív kontrollként a doxorubicint használták (az életképesség 53%-os csökkenését okozta HepG2-ben; 44%-ra MDA-MB-231; 39%-ra PC3-ban; 35%-ra DU-145-ban; 29%-ra MCF-ben -7: 25 százalék LS-513; 23 százalék HeLa-ban és 19 százalék Colo-205 sejtekben). A 2. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy a Ledodes és P. ostreatus kivonat körülbelül 20-kal csökkentette a vizsgált LS-513, HepG2, DU-145 és PC-3 rákos sejtvonalak életképességét. százalék .

Leukémia és limfóma sejtvonalak ellen

A P.ostreatus és L.edodes gombakivonatokat leukémia (CCR-CEM, NB-4, THP-1) és limfóma (U937) sejtek elleni citotoxicitásra tesztelték. A doxorubicin volt a pozitív standard, ami 29 százalékra, 25,5 százalékra, 20,3 százalékra, 19,1 százalékra csökkentette a sejtek életképességét az U937, NB4, CCRF-CEM és THIP1 sejtekben. Az L.edodes kivonat 66,02%-ra csökkentette a THP1 sejtek életképességét, míg a P. ostreatus kivonat 70,64%-ra csökkentette a CCRF-CEM sejtek életképességét (3. ábra).

2.6.3. Antioxidáns aktivitás

Az antioxidáns hatás eredményeit a három értékelési módszerrel, nevezetesen a DPPH-val vizsgáltukradikális elpusztításA 6. táblázatban és az S6a,b ábrán láthatók az ABTS gyökkation-fogó és ORAC vizsgálatok, összehasonlítva az antioxidáns standarddal, a Trolox-szal. Az eredmények azt mutatják, hogy a P. ostreatus kivonat erősebb antioxidáns kapacitással rendelkezik, mint a L. edodes kivonat, amint azt a három használt antioxidáns vizsgálat is jelzi. A 4. ábra az ORAC vizsgálatban a kivonatok által kiváltott fluoreszcein jelgyengülést mutatja.

3. Megbeszélés

A fehérrothadás gombák felkeltették a tudományos közösség érdeklődését gyógyászati ​​tulajdonságaik miatt, amelyek közé tartozik az immunrendszer modulációja, a hipoglikémiás és antitrombotikus aktivitás, valamint a vérnyomáscsökkentő, gyulladáscsökkentő, antimikrobiális és daganatellenes tulajdonságaik, valamint a vér koleszterinszintjét csökkentő képességük. 24, 36-38]. A két fehérrothadás gomba, a P. ostreatus és a L.edodes a két legtöbbet fogyasztott ehető gomba számos országban [39]. Ez a két gomba bioaktív fehérjék sokaságát állítja elő, és jelenleg a proteomanalízis a leghatékonyabb fehérjeprofil-alkotási eszköz [40]. A jelenlegi tanulmányban a proteomanalízis kimutatta a bioaktív fehérjék, köztük a Rab GDP disszociáció-gátló, a tioredoxin-reduktáz, a szerin proteináz, a szuperoxid-diszmutáz és a lektin expresszióját a két tesztgombában. A Rab GDP disszociáció-gátló (Rab GDI) szabályozza a Rab GTPázok működését, amelyek kulcsszerepet játszanak a tumorsejtek membránforgalmában. Ennek megfelelően a Rab GDI alkalmazása ígéretes rákellenes stratégia [29].

A szerin proteináz hozzájárul avírusellenesehető gombák aktivitása [30,31]. Ezenkívül Yap és mtsai. (2018) a szerin proteináz erős szelektív citotoxicitásáról számolt be egy emberi emlő-adenokarcinóma sejtvonallal (MCF7) szemben, és azt javasolta, hogy a mechanizmus magában foglalja mind a külső, mind a belső sejthalál mechanizmusainak együttműködő hatását, a kaszpáz stimuláción kívül{{ 4}} és -9, valamint a Bcl-2 gátlása [41].

A bevitelantioxidánsokegy kedvező profilaktikus stratégia a reaktív oxigénfajták (ROS) által közvetített patofiziológia ellen [22]. Eredményeink az antioxidáns védekező rendszer enzimeinek Pleurotus ostreatus és Lentinula edodes általi expresszióját mutatják. Ezen enzimek közé tartozik a szuperoxid-diszmutáz, a kataláz és a glutation-peroxidáz, amelyek ellensúlyozzák a ROS termelését [32]. A szuperoxid-diszmutáz abból indul ki, hogy a szuperoxidot hidrogén-peroxiddá alakítja, amelyet viszont a kataláz és a glutation-peroxidáz vízzé alakít [33].

A két gombában lektin expresszióját is kimutatták. Sok kutató számolt be a lektin rendkívül változatos biológiai profiljáról, amely számos tevékenységet magában foglal, beleértve a gyulladáscsökkentő, antidepresszáns, fogamzásgátló és értágító hatásokat [34, 35, 42]. A lektinek szénhidrátkötő fehérjék, amelyek számos sejtfunkcióval rendelkeznek, beleértve a tumornövekedés in vitro és in vivo elnyomását a tumorsejt membránokhoz vagy receptoraihoz való szelektív kötődésen keresztül, ami a protein kinázok aktiválódását vagy az interleukin termelésen keresztül az immunválasz modulációját eredményezi. [43]. Ezenkívül a gomba lektinek szerepet játszanak a különböző sejthalál utak kiváltásában is, beleértve az apoptózist, a nekrózist és/vagy az autofágiát [42].

Adataink az osteolysis és a pleurotolizin expresszióját mutatják Pleurotus ostreatusban. Ezek pórusképző fehérjék, amelyek rendkívül szelektív rákellenes hatással rendelkeznek [44,45]. Az osztreolizin egy 15 kDa-os citolitikus fehérje, amely szubmikromoláris koncentrációban képes vörösvértesteket és más sejteket permeabilizálni. Kolloid ozmotikus mechanizmuson keresztül fejti ki hatását, és széles membránpórusok kialakulását idézi elő |46,47I. Nimri et al. rekombináns pleurotolizint termelt, amely erős daganatellenes hatással rendelkezik humán és egér vastagbéltumorsejtek ellen [48].

L.edodes-ben valosin tartalmú fehérje és reteszelőcsap expresszálódott. Valozin tartalmú fehérjéről korábban beszámoltakantioxidánsolyan tulajdonságok, amelyek segíthetnek olyan idegrendszeri szindrómák esetén, mint az Alzheimer-kór, a laterális szklerózis és a demencia [49-51]. A latcripin potenciális rákellenes szer [50]. Riaz Ud Din és munkatársai (2020) az emlőrák sejtvonalakkal szembeni reteszelőcsap rákellenes mechanizmusát vizsgálták. Beszámoltak arról, hogy sejthalált, valamint autofágiát indukál, a migrációt és inváziót gátló hatása mellett [52].

A P. ostreatus és L. edodes kivonatokban számos bioaktív vegyület mennyiségét határoztuk meg. A jelenlegi vizsgálatban 19,37 ± 0,39 és 24,14 ± 1.{12}}1 mg/g TPN értékeket mutattak ki a P.ostreatus és L.edodes esetében. Ezek az értékek magasabbak, mint a Rahimah és munkatársai által feljegyzett értékek, akik ammónium- és Shinoda-teszttel határozták meg a P. ostreatus teljes flavonoid tartalmát a kivonat 6,67 mg/g-jában [53]. Ezen túlmenően eredményeink magasabbak, mint Montibus és munkatársai, akik a L edodes kivonatokban a TPC-t Folin-Ciocalteu módszerrel határozták meg, és 0.8-1,5 százalékos száraz tömeget (DW) találtak a sapkákban és 0.{16}}.1 százalék dw a stipesben [54].

A katechint mind a P. ostreatus, mind a L. edodes kivonatban kimutatták. A katechin egy növényi másodlagos fenolos metabolit, amely erős szabadgyökfogó tulajdonságokkal rendelkezik [55]. A L.edodes kivonat flavonoid kvercetint tartalmazott. A kvercetin antioxidáns hatását a glutationszint szabályozása és az antioxidáns enzimek, köztük a glutation-transzferáz és az Aldo-keto-reduktáz termelésének fokozása közvetíti [56]. Ezen túlmenően a kvercetin daganatellenes hatást fejt ki a sejtciklus megszakítása és az apoptózis elősegítése révén [57,58]. Lee et al. beszámoltak arról, hogy a kvercetin sejtleállást okoz a PC3, Du145 és U937 rákos sejtvonalakban [59]. Eredményeink azt is mutatják, hogy a kaempferol és az apigenin megtalálható a P. ostreatusban. A kaempferolnak és az apigeninnek bizonyítottan antioxidáns és antiproliferatív hatása van [60-62]. Mindkét gombakivonatban a glutaminsav a legnagyobb mennyiségben előforduló aminosav. Ugyanebben a szellemben Chirinang és munkatársai a P. ostreatus és a P. major-caju aminosavtartalmát elemezték, és megállapították, hogy a glutaminsav tartalom a legmagasabb, ezt követi az aszparaginsav, majd az arginin [63].

A P. ostreatus és a L. edodes ígéretes vírusellenes aktivitást mutatott az adenovírus és a herpes simplex vírus-II ellen, a P. ostreatus kivonat adenovírus elleni SI-értéke elérte a 4,5-öt. Az SI-t a kivonatok hatékonyságának és biztonságosságának értékelésére használták, mivel ez a citotoxikus és antivirális aktivitás közötti ablakot becsüli meg. Minél nagyobb az SI, annál biztonságosabb és hatékonyabb a vegyület [64,65]. A közelmúltban Urbancikova és munkatársai mutattak be hasonló adatokat, ahol a pleurán (P. ostreatusból izolált oldhatatlan -1,3/1,6-D-glükán) alapú kiegészítők jelentősen lerövidítették a herpes simplex vírus időtartamát. -I tünetek, a légúti tünetek enyhébb súlyosságával, herpes simplex vírus I-pozitív betegekben, mint a placebocsoportban, jelentős mellékhatások nélkül, ami a pleurális esetleges jövőbeni felhasználását javasolja az akut herpes simplex vírus-I kezelésében [66].

A gombák vírusellenes hatása leginkább a vírusfelvétel, a replikáció, az enzimaktivitás és a peptidek működésének zavara, valamint a gazdaszervezet immunrendszerének potencírozása [67]. Seo és Choi (2021) azt javasolta, hogy a P.ostreatus és L.edodes poliszacharid frakciójában található -glükán felelős lehet a herpetikus hatásért a kezelés előtti és utóhatásokon keresztül [20]. A P. ostreatus és L. edodes vizes kivonatának HIV-ellenes hatását a reverz transzkriptáz enzim ubiquitin-szerű fehérje, illetve leptin általi gátlása okozhatja [68,69].

Gombáink vizes kivonatairól kimutatták, hogy körülbelül 20 százalékkal gátolják a vizsgált rákos sejtvonalak életképességét. Hasonló hatást tapasztaltunk a leukémia és limfóma sejtvonalak ellen is, az életképesség 66 százalékra csökkent a L.edodes kivonatnál a THP1 leukémia sejtek ellen, és 70,6 százalékra a P. ostreatus kivonatnál a CCRF-CEM leukémia sejtek ellen. A L.edodes vizes micélium- és termőtest-kivonatairól korábban arról számoltak be, hogy antiproliferatív és apoptotikus hatást fejtenek ki az MCF{7}} mellráksejteken[70]. Az L.edodes etil-acetát-frakciója és -glükánja elsősorban ezekért a hatásokért felelős[71,72]. Ugyanebben az összefüggésben a P. ostreatus kivonat antiproliferatív aktivitást mutatott az MCF-7 és MDA-MB-231 emlő adenokarcinóma sejtek [73] és a 6-kapcsolt glükánok irányában. A kivonat fokozta a természetes gyilkos citotoxicitást az emlő- és tüdőráksejtekkel szemben [74]. Nemrég Jakopovic et al. azt találták, hogy a 6 és 10 gombából álló gyógygombakészítmények, köztük L.edodes és P. ostreatus, jelentős antiproliferatív és pro-apoptotikus hatást mutattak a colorectalis (HCT-116, SW620) tumorsejtvonalakon [75]. Éppen ellenkezőleg, a szerzők észrevették, hogy a humán fibroblaszt sejtvonalra (WI-38) gyakorolt ​​hatás proliferatív, ami azt mutatja, hogy ezek a gombakészítmények specifikusak a tumorsejtvonalakra. Hasonlóképpen minimális citotoxicitást mutattunk ki gombáink által a normál humán PBMC-kkel szemben. Ez a megállapítás is gombáink biztonságos használatára utal.

A gombák citotoxicitását számos molekulának tulajdonítják, beleértve az x- és -glükánokat, fehérjéket, glikoproteineket, zsírsavakat, nukleozid antagonistákat, terpenoidokat és fenolos vegyületeket [76]. Abdalla et al. (2012) azt javasolták, hogy a gombakivonatok az aromatáz aktivitás gátlásával elnyomják a mellráksejtek proliferációját [77]. Imam et al. (2021) egy indol-3-tejsavat izolált a Ledodesből, amely gátolta a tüdő adenokarcinóma sejtek osztódását [78]. Yukawa et al. (2012) azt javasolták, hogy a L edodes micélium közvetlen apoptotikus hatása a HepG2 sejtekre a kaszpáz{10}} és a -8 halálreceptor útvonalak aktiválásán keresztül valósul meg [79]. Wu és munkatársai (2011) tanulmányozták a P. ostreatus fehérjekivonatának citotoxikus hatását humán kolorektális adenokarcinóma (SW480) sejtekre és egy humán monocitás leukémiára, a THP-1(sejtekre), valamint ROS-képződésről, kimerültségről számoltak be. glutation, a mitokondriális membránpotenciál megváltozása és az oligonukleoszomális DNS szétesése, ami az SW480 sejtek apoptózisát eredményezi [80].

Mivel az antioxidánsok nem egyetlen mechanizmuson keresztül hatnak, az antioxidáns kapacitás értékelése általában több módszerrel történik [81]. Ebben a tanulmányban három értékelési módszert alkalmaztak, nevezetesen DPPH, ABTS és ORAC vizsgálatokat. A SET (egy elektrontranszfer) antioxidáns mechanizmust a DPPH vizsgálattal, míg az ABTS és ORAC vizsgálatokat a HAT (hidrogénatom transzfer) reakciókhoz használtuk [81]. Az ORAC vizsgálat pontosabb, pontosabb becsléseket ad, mivel egyetlen kifejezésben egyesíti a gátlási időt és a gátlás mértékét [82]. Míg a foszfomolibdát vizsgálatot általában a teljes antioxidáns kapacitás (TAC) kifejezésére használják, mindhárom módszert alkalmazzák.

ebben a kéziratban a TAC értékeléséről számoltak be. Munteanu és Apetrei (2021) az antioxidáns aktivitás meghatározására használt módszerek áttekintésében az ABTS gyökfogó vizsgálatot "egyszerű és kényelmes módszerként írták le a teljes antioxidáns kapacitás (TAC) mérésére"[83]. Összehasonlító vizsgálatukban Csepregi et al. (2016) a TAC értékelésére használt négy módszert hasonlította össze: Trolox-egyenérték antioxidáns kapacitás (TEAC), vas(III)-redukáló antioxidáns potenciál (FRAP), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) gyökfogó vizsgálat és Folin-Ciocalteu reagens reaktivitás (FCR)[84]. 2013-ban Ou és munkatársai bevezették az ORAC-t, mint a TAC értékelésének új módszerét[85]. Ugyanebben a szellemben Rubio et al. (2016) ) az ORAC-tesztet a TAC meghatározásának közvetlen módszerei közé sorolta a TEAC-val együtt [86]. Az ABTS és ORAC vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a P. ostreatus és L. edode kivonatok antioxidáns kapacitása magasabb, mint a standard antioxidánsé, a Troloxé.

A két gomba antioxidáns hatása számos bioaktív komponens jelenlétének tulajdonítható, többek közöttflavonoidok, fenolok, bioaktív peptidek és C-vitamin[87]. Gaber et al. összehasonlította az ABTS, DPPH, vasredukáló antioxidáns teljesítmény (FRAP) és ORAC teszteket a guava kivonatok antioxidáns kapacitásának felmérésére, és pozitív korrelációról számolt be a négy módszerrel meghatározott antioxidáns képesség, valamint a C-vitamin-tartalom és a TPN között. Másrészt negatív korrelációt észleltek a karotinoidtartalommal [88]. A DPPH(1,1-difenil-2-pikril-hidrazil) egy stabil szabad gyök, amely a nitrogénhíd egyik atomján páratlan vegyértékelektronnal rendelkezik; így a DPPH gyök megkötése a népszerű DPPH antioxidáns vizsgálat alapja[89]. A 2,2'-azino-bisz(3-etilbenzotiazolin-6-szulfonát) gyökkationja (ABTS) elveszti kék színét, ha antioxidánssal redukálják, és a színváltozás spektrofotometriásan számszerűsíthető [90]. Az ORAC assay méri a fluoreszcens próba oxidatív lebomlását a szabad gyökök által, amelyeket az antioxidáns anyag megszakít. Ennek megfelelően minél erősebb az antioxidáns kapacitás, annál rövidebb időre van szükség a fluoreszcencia kioltásához [91]. Továbbá, mivel a vizsgált kivonatok ígéretes antioxidáns hatást mutattak a fent említett módszerekkel tesztelve, megállapítható, hogyszabad gyökfogó. A vizsgált gombák azonban jelentős összes flavonoidot tartalmaztak, és mivel a flavonoidokat a Nrf2 transzkripciós faktor aktiválásával hozták összefüggésbe (2017), ez feltételezhető mechanizmusként hozzáadható [92].

4. Anyagok és módszerek

4.1. Gombafajták előkészítése és szubkultúra

A korábban azonosított P. ostreatus és L. edodes gombákat ívásként és/vagy termőtestként az Agriculture Research Center (Kairó, Egyiptom) kultúragyűjteményéből szereztük be [93,94]. Sebészeti pengék segítségével aszeptikusan vágták le a gyümölcsöt a gomba termőtesteiből történő áttenyésztéshez. A belső micéliumot steril tűk segítségével gyűjtöttük be, és steril Potato Dextrose Agar (PDA) lemezeken (Merck, Darmstadt, Németország)95] továbbtenyésztettük. A gombás ivadékok továbbtenyésztéséhez steril csipesszel szedtük le a magokat, majd aszeptikusan vittük át steril PDA lemezekre, amelyeket ezután 28 fokon 7 napig inkubáltunk, és az egyes törzsek termőtesteit külön mostuk. Mindegyik izolátumot (500 g) 48 órán át szobahőmérsékleten hagytuk levegőn megszáradni, kézzel megőröltük egy konyhai darálóban, és szobahőmérsékleten, jól szellőztetett helyen tároltuk későbbi felhasználás céljából.

4.2. A Pleurotus Ostreatus és Lentinus Edodes vizes extrakciója

Mindegyik izolátum szárított gyümölcsét 500 g-os porrá őrölték háztartási turmixgépben, majd háromszor 7Lof desztillált vízben, szobahőmérsékleten három napig macerálták, ultrahanggal kezelték (ultrahangos tisztító, Anglia, Egyesült Királyság), majd szűrték. A macerálás és a szűrés folyamatát addig ismételtük, amíg a folyadék el nem fogy. A hozam tárolására etanolt használtunk. Az etanol 45 °C-on történő elpárologtatása után mindegyik izolátumból összesen 500 ml-t fagyasztva szárítottunk, így körülbelül 20 g száraz maradékot kaptunk mindegyik kivonatból [96].

4.3. Proteomikai elemzés

A proteomikai analízist a Children's Cancer Hospital Egypt 57,357 (CCHE), Kairó, Egyiptom proteomikai és metabolomikai osztályán végezték. Körülbelül 600 uL 8 M karbamid 500 mM Tris-ben (pH8,5) és 60 uL komplett ultraproteázokban (Roche) (Mannheim, Németország) minden mintához hozzáadtuk, majd a mintákat erőteljesen ráztuk, és 10,000 fordulat/perc mellett 30 percig centrifugáltuk. A felülúszókat összegyűjtöttük, és a frakciókat (1 ug/10 μL) NanoLC rendszerrel injektáltuk. A tömegspektrometriás tripla TOF rendszert (Sciex TripleTOF 5600 plus, AB SCIEX, Concord) folyadékkromatográfiával (LC) (3 um, ChromXP C18 CL, 120 A, 150 × 0,3 mm) kapcsoltuk össze, amely egy Eksigent nanoLC400 automatikus mintavevőből állt. egy Ekspert nanoLC425 szivattyú, 10 μl/perc áramlási sebességgel 55 percig, minden mintához [97]. Az adatok elemzését a ProteinPilot (5.0.1.0,4895 verzió) és a Paragon Algorithm (5.0.1.0,4874 verzió) segítségével végeztük. A fehérjeszekvenciákat a Swiss-Prot és a TrEMBL adatbázis szekvenciáihoz igazították (Pleurotus sp., amely 14 792 bejegyzést tartalmaz a P. ostreatusra, és Lentinula sp., amely 12 603 bejegyzést tartalmaz az L. edodes számára)[98]. A gombafajok között általánosan azonosított fehérjéket a Venny2.1.0.BioinfoGP szoftverrel [99] (Kingston upon Hull, Anglia, Egyesült Királyság) szemléltettük.

4.4. Bioaktív vegyületek jellemzése

Amint arról korábban beszámoltunk, a teljes oldható szénhidrát tartalmat fenol-kénsav technikával határoztuk meg [100]. Az adatokat átlag ± standard deviáció (SD) formában adjuk meg, és a kísérleteket három párhuzamosban végeztük.

A teljes fenoltartalmat (TPC) és az összes flavonoid tartalmat (TFC) Ryan és mtsai. [101]. A mintákat 20 mg/ml koncentrációban készítettük vízben. Gallusavat (1 mg/ml törzsoldatot) állítottunk elő metanolban. Rutint (1 mg/ml törzsoldat) állítottunk elő metanolban. Galluszsav standardokat és mintákat pipettáztunk a lemez lyukaiba hat ismétlésben, és 630 nm-en mértük. A 10 rutin standard és minta mindegyikét hat ismétlésben 420 nm-en mértük.

Az összes fenol és flavonoid HPLC analízisét Singh és munkatársai módszere szerint végeztük. [102]. Mindegyik mintát és 10 különböző standard oldatot metanolban oldottunk, és 0,22 um-es fecskendőszűrővel szűrtük, majd minden mintából 100 µl-t és standardokból 10 µl-t injektáltunk be egy HPLC oszlopon, Waters 2690 Alliance HPLC. Waters 996 fotodiódasoros detektorral felszerelt rendszer. C18 oszlop Inertsil ODS3: 4,6 × 250 mm, 5 um; mozgófázis: puffer (0,1% foszforsav vízben); A metanolos elúciós mód gradiens volt, 1 ml/perc áramlási sebességgel 280 nm hullámhosszon.

A vízben oldódó vitaminok elemzéséhez a vizsgált gombakivonatok (50 mg/ml), referencia standardok (10 mg 10 ml 0,05 M nátrium-hidroxidban) a hét vízben oldódó vitamin (tiamin-HCl, aszkorbinsav, riboflavin, nikotinsav, nikotinamid, piridoxin-HCl és folsav)[103], valamint a zsírban oldódó vitaminok, oldatok (50 mg/ml) a három gombakivonatból és standard oldatot készítettünk metanolban három zsírvitaminból: E, D3 és A, 806,2, 114 és 400 NE/ml koncentrációban. Az oldatokat ezután 100 ug/ml-re hígítottuk, 0,22 um-es fecskendőszűrővel szűrtük, és 100 µl-t injektáltunk egy Waters 2690 Alliance HPLC rendszerű HPLC oszlopra (Milford, CT, USA), amely Waters 996 fotodiódasoros detektorral volt felszerelve. Oszlop Inertsil ODS 3∶4,6×250 mm, 5 μm; mozgófázis: puffer (0,85 g hexán-szulfonsav-nátriumsó 1000 ml vízben, és a pH-t ortofoszforsavval 3-ra állítottuk be); A metanol elúció gradiens volt, 1 ml/perc áramlási sebességgel, 210 nm hullámhosszon [104].

4.5. Fehérje- és aminosav-elemzés

A gombakivonatok aminosav-összetételét Sykam Amino Acid Analyzer (Sykam GmbH, Németország) segítségével határoztuk meg, amely S 2100 oldószeradagoló rendszerrel volt felszerelve (kvaterner szivattyú, áramlási tartomány: {{). 24}}.01-10.00 ml/perc és maximális nyomás 400 bar-ig), automatikus mintavevő, S5200, aminosav reakció modul, S4300 (beépített kettős szűrővel fotométer 570 nm-en), és egy hűtött reagensrendező, S4130. Mindegyik gombakivonat egy grammját összekeverjük 5 ml hexánnal, és 24 órán át hagyjuk macerálni, majd a keveréket Whatman No. 1 szűrőpapír. A maradékot 10 ml 6 N HCl-t tartalmazó kémcsőbe helyeztük, és kemencében 110 fokon 24 órán át inkubáltuk. Az inkubálás után szűrést végeztünk Whatman 2. sz. 1 szűrőpapír, majd bepárlás rotációs bepárlóban. A maradékot teljesen feloldottuk 2 ml hígítópufferben (trinátrium-citrát-dehidrát 0,06 M, citromsav 0,03 M, fenol 0,02 M, tiodiglikol 1,4 százalék, HCL 32 százalék), amelyet ugyanabban a pufferben 1000--szeresére hígítottunk. majd egy ammóniaszűrő oszlopra (LCA, K04/Na, 4,6×100 mm, Sykam GmbH, Erasing, Németország) töltöttük, amely automatikus aminosav-analizátorral (Sykam) van felszerelve [105].

4.6. Sejtkultúrák

A méhnyakrák (HeLa), az akut monocitás leukémia (Thpl), a vastagbélrák (Colo{0}}) és a cecum carcinoma (LS-513) sejteket Roswell Park Memorial Institute (RPMI) táptalajban (Lonza, Köln, Németország) kiegészítve 100 mg/ml sztreptomicinnel, 100 egység/ml penicillinnel és 10% hővel inaktivált borjúmagzatszérummal. Egyéb sejtvonalak: humán leukémia (CCRF-CEM); akut promielocitás leukémia (NB-4); humán limfóma (U937); prosztatarák (DU-145 és PC3); hepatocelluláris karcinóma (HepG2); mell adenokarcinóma (MCF-7 és MDA-MB-231); Vero; és Hep-2 sejteket Dulbecco's Modified Eagle Mediumon (DMEM; Invitrogen, California, USA) továbbtenyésztettük, és az inkubálást 37 fokos hőmérsékleten, párásított atmoszférában, 5 százalékos CO2-tartalom mellett végeztük. A sejtvonalakat a Nawah Scientific Inc.-től (Mokatam, Kairó, Egyiptom), míg a primer perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) és a normál emberi sejteket (ATCC PCS-800-011TM) a Viscera-tól (Kairó, Egyiptom) szereztük be. Ezt a munkát az Ain Shams Egyetem Gyógyszerésztudományi Karának Etikai Kutatási Bizottsága hagyta jóvá (294. számú jóváhagyás).

4.7.Irális aktivitás

Vírusellenes aktivitástesztelték a 7-es típusú adenovírus (Ad7) és a II-es típusú herpes simplex vírus (HSV-2) ellen (Nawah Scientific, Mokattam, Egyiptom). A vírusellenes aktivitást a korábban leírtak szerint értékelték [106]. Vero és Hep{5}} sejteket oltottunk be egy 96-lyuk tenyésztőlemezre 2×10* sejt/lyuk sűrűséggel egy nappal a fertőzés előtt. A sejttenyésztő tápközeget (4.6. szakasz) másnap eltávolítottuk, és foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS) használtunk a sejtek mosására. A humán adenovírus és a II-es típusú herpes simplex vírus fertőzőképességét a sulforhodamine B(SRB) módszerrel határoztuk meg, amely a citopátiás hatásokat (CPE) monitorozta, és kiszámította a sejtek életképességének százalékos arányát [107]. A vírusellenes aktivitást a gombakivonatok vírusos CPE-gátló képessége alapján számítottuk ki, ahol az 50 százalékos citotoxikus koncentrációt (CC5o) és az 50 százalékos gátló koncentrációt (IC50) GraphPad PRISM szoftverrel (Graph-Pad Software, San Diego) határoztuk meg. , CA, USA). A szelektivitási indexet (SD) Dogan és mtsai. [108] az (1) egyenlet szerint szelektivitási index (SI)=CC50/IC50

4.8. Citotoxicitás PBMC-k ellen MTT Assay alkalmazásával

A citotoxicitást az MTT teszttel (109】) határoztuk meg. A sejtszuszpenziók alikvotjait (100 μl) (sejtsűrűség 1.2-1.8 × 10* sejt/lyuk) 96-lyukú lemezekre szélesztettük, komplett táptalajt adtunk hozzá, és a sejteket 24 órán át inkubáltuk. Ezután a sejteket gombakivonatok sorozathígításaival kezeltük 48 órán keresztül. MTT-oldatot (5 mg/ml) PBS-ben adtunk a lyukakba, és 4 órán át inkubáltuk, majd az abszorbanciát 570 nm-en olvastuk le mikrolemez-leolvasóval. A kezeletlen sejteket negatív kontrollként, a doxorubicinnel kezelt sejteket (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Németország) pedig pozitív kontrollként használtuk.

4.9. A citotoxikus aktivitás értékelése SRB-vel a rákos sejtvonalak ellen

Prosztatarák elleni citotoxicitás (DU{{0}} és PC3); hepatocelluláris karcinóma (HepG2); kolorektális karcinóma (Colo-205); vakbél karcinóma (LS-513); méhnyakrák (HeLa); és mell adenokarcinóma (MDA-MB-231 és MCF-7) sejtvonalakat szulforodamin B (SRB) kolorimetriás vizsgálattal értékelték ki [110]. A komplett tápközegben (4.6) lévő sejtszuszpenziókat 96-lyukú lemezeken 24 órán át inkubáltuk. Ezután különböző koncentrációkban (0-100 ug/ml komplett tápközegben) gombakivonatot adtunk hozzá, és 72 órán át inkubáltuk. A kezeletlen sejteket negatív kontrollként, a doxorubicinnel kezelt sejteket pedig pozitív kontrollként használtuk.

4.10. A leukémia és limfóma sejtvonalak életképessége WST-1 vizsgálattal

A humán leukémia (CCRF-CEM), az akut promielocitás leukémia (NB4), az akut monocitás leukémia (THP1) és a humán limfóma (U937) elleni citotoxicitást vízben oldódó tetrazólium só (WST-1) vizsgálattal határozták meg, Abcamkit segítségével. ab155902 WST-1 Cell Proliferation Reagent, Egyesült Királyság). A sejtszuszpenziókat 24 órán át inkubáltuk, majd különböző koncentrációjú (0-100 ug/ml komplett tápközegben) gombakivonattal kezeltük 48 órán át. A sejteket ezután 10 μL WST{13}} reagenssel kezeltük 1 órán át, és az A450-et mikrolemez-leolvasóval olvastuk le [111]. A kezeletlen sejteket negatív kontrollként, a doxorubicinnel kezelt sejteket (Sigma-Aldrich, Németország) pedig pozitív kontrollként használtuk.

4.11.Antioxidáns aktivitás

4.11.1. DPPH gyökfogó tevékenység

A DPPH gyökfogó vizsgálatot Lu és munkatársai módszere szerint hajtottuk végre. [112]. A DPPH színben bekövetkező csökkenést 540 nm-en mértük.Antioxidáns aktivitásgátlási százalékként fejeztük ki a kalibrációs görbére (R2=0.9903) való hivatkozással. Az adatok átlag ± SD a (2) egyenlet szerint: (Antioxidáns aktivitás százalékos=[(abs-blank-abs-sample)/abs-blank]×100)

(2) ahol az abs-vak és az abs-minta a vakminta, illetve a minta abszorbanciájára utal. Megbecsülték a szabad gyökök felének gátlásához szükséges mintakoncentrációt (IC50).

4.11.2. ABTS (2,2'-azinobisz-(3-etilbenztiazolin-6-szulfonsav)) gyökkation-fogó tevékenység

A vizsgálatot a korábban leírt 【113】 szerint végeztük. A gombakivonatokat (10 μl 0-100 ug/ml oldatot) 190 μl frissen készített ABTS-sel (Sigma-Aldrich Germany) kevertünk össze 96-lyuklemezeken, és sötétben, szobahőmérsékleten inkubáltuk. 2 óra. Minden mintát négy ismétlésben vizsgáltunk, és az abszorbanciát 734 nm-en mértük. Az antioxidáns aktivitást a gátlás százalékában fejeztük ki (1. egyenlet) a kalibrációs görbe (R2=0.9948) alapján.

4.11.3. Oxigén gyökabszorpciós kapacitás (ORAC) vizsgálat

Az elemzést a korábban meghatározottak szerint [62] végeztük, kisebb módosításokkal. Röviden, 12,5 µl gombakivonatot három párhuzamosban inkubáltunk 75 µl fluoreszceinnel (10 nm) 30 percig 37 °C-on. A fluoreszcencia mérést (485 EX, 520 EM, nm) három cikluson keresztül végeztük (ciklusidő=90 s). Ezt követően 12,5 μL frissen készített 240 mm-es 2,2'-Azobis 2- Azonnal amidinopropán-dihidrokloridot (AAPH) (Ab-cam, Cambridge, Egyesült Királyság) adtunk minden egyes lyukba, és a fluoreszcencia mérést 2,5 órán keresztül folytattuk (85 ciklus, mindegyik 90 másodperc). peroxil-gyök képződése az AAPH lebontásával. Trolox(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilkromán-2-karbonsav), vízben oldódó E-vitamin analóg, pozitív kontrollként szolgált, amely dózisfüggő módon gátolja a fluoreszcein lebomlását Az antioxidáns aktivitást a gátlás százalékában fejeztük ki ((1) egyenlet a kalibrációs görbére (R2= 0.9957) való hivatkozással.

4.12. Statisztikai elemzés

Három párhuzamos kémiai vizsgálatot végeztünk, és az eredményeket átlag ± standard eltérésként fejeztük ki. A statisztikai elemzéseket egyutas ANOVA-val végeztük.

Az átlagok közötti különbségek jelentőségét a Tukey-Kramer többszörös összehasonlítás teszttel értékeltük. A kisebb vagy egyenlő 0,05 p-értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintették. A statisztikai értékelést GraphPad PRISM szoftverrel (Graph-Pad Software, San Diego, CA, USA) határoztuk meg.

5. Következtetések

A P. ostreatus és L.edodes gombák bioaktív vegyületek széles skáláját tartalmazzák. A proteomanalízis több, számos biológiai aktivitással rendelkező bioaktív molekula expresszióját mutatta ki. A gombák vizes kivonata ígéretesvírusellenesA 7-es típusú adenovírus és a II-es típusú herpes simplex vírus elleni aktivitást rákos sejtvonalak ellen mutatták ki, de a normál humán PBMC-k ellen nem. A jelen tanulmány ösztönzi e gombák farmakológiai célú használatát, tekintettel a normál PBMC-kre gyakorolt ​​alacsony citotoxicitásukra, valamint vírus-, daganatellenes és antioxidáns képességeikre.

Hivatkozások

1. Bertéli, MBD; Oliveira Filho, OBQ; Freitas, JDS; Bertolucci, VB; Silva, GR; Gazim, ZC; Lívero, FAR; Lovato, ECW; Valle, JS; Linde, GA; et al. Lentinus crinitus basidiocarp stipe és pileus: Kémiai összetétel, citotoxicitás és antioxidáns aktivitás. Eur. Food Res. Technol. 2021, 247, 1355–1366. [CrossRef]

2. Ragupathi, V.; István, A.; Arivoli, D.; Kumaresan, S. Antibakteriális aktivitás, in vitro antioxidáns potenciál és a Gymnopilus Junius metanolos kivonatának GC-MS jellemzése. Eur. J. Biomed. 2018, 5, 650–657.

3. Atila, F.; Owaid, MN; Shariati, MA Az Agaricus bisporus táplálkozási és orvosi előnyei: Áttekintés. J. Microbiol. Biotechnol. Food Sci. 2017, 7, 281–286. [CrossRef]

4. Gaitán-Hernández, R.; Cortés, GMN A Lentinula edodes ehető és gyógygomba terméshozamának javítása búzaszalmán kiegészített ívás alkalmazásával. Braz. J. Microbiol. 2014, 45, 467–474. [CrossRef] [PubMed]

5. Smânia, A.; Delle Monache, F.; Smânia, E.; Gil, M.; Benchetrit, L.; Cruz, F. A Pycnoporus sanguineus (Fr.) Murr gomba által termelt anyag antibakteriális hatása. J. Ethnopharmacol. 1995, 45, 177–181. [CrossRef]

6. Ishikawa, NK; Kasuya, MCM; Vanetti, MCD Folyékony tápközegben termesztett Lentinula edodes antibakteriális aktivitása. Braz. J. Microbiol. 2001, 32, 206–210. [CrossRef]

7. Hwang, H.-J.; Kim, SW; Lim, J.-M.; Joo, J.-H.; Kim, H.-O.; Kim, H.-M.; Yun, J.-W. A Phellinus baumii gyógygomba által termelt nyers exopoliszacharidok hipoglikémiás hatása streptozotocinnal kiváltott cukorbeteg patkányokban. Life Sci. 2005, 76, 3069–3080. [CrossRef] [PubMed]

8. Hearst, R.; Nelson, D.; McCollum, G.; Millar, Kr. e.; Maeda, Y.; Goldsmith, CE; Rooney, PJ; Loughrey, A.; Rao, J.; Moore, JE A Shiitake (Lentinula edodes) és az Oyster (Pleurotus ostreatus) gombák összetevőinek antibakteriális és gombaellenes tulajdonságainak vizsgálata. Kiegészítés. Ott. Clin. Gyakorlat. 2009, 15, 5–7. [CrossRef]

9. Zervakis, G.; Philippoussis, A.; Ioannidou, S.; Diamantopoulou, P. Micélium növekedési kinetika és optimális hőmérsékleti feltételek ehető gombafajok lignocellulóz alapú szubsztrátokon történő termesztéséhez. Folia Microbiol. 2001, 46, 231–234. [CrossRef]

10. Sánchez, C. Pleurotus ostreatus és más ehető gombák termesztése. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009, 85, 1321–1337. [CrossRef]