A Phoenix Dactylifera L. magkivonat antioxidáns hatást fejt ki és gyengíti a melanogenezist

Huey-Chun Huang1 , Shr-Shiuan Wang2, Tsang-Chi Tsai3, Wang-Ping Ko3 és Tsong-Min Chang2,*

Absztrakt:Háttér: A Phoenix dactylifera magkivonat bőrápoló hatásmechanizmusát soha nem vizsgálták. Módszerek: A P. dactylifera L. magjait ultrahangos extrakcióval extraháltuk. A kivonat antioxidáns tulajdonságait a 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) és a 2,2'-azino-di-(3-etilbenztiazolin-szulfonsav) (ABTS plus ) határozták meg. vizsgálatok és tisztító módszerek. Vizsgálták a teljes fenoltartalmat, a redukáló kapacitást, a vas (II) ion kelátképző és az intracelluláris reaktív oxigénfajták (ROS) megkötő kapacitását is. A P. dactylifera L. magkivonat melanogenezisre gyakorolt ​​hatását spektrofotometriásan értékeltük gomba tirozináz aktivitási vizsgálattal, intracelluláris tirozináz aktivitás és melanintartalom meghatározásával. A melanogenezishez kapcsolódó fehérjék expressziós szintjét Western blottal elemeztük. Eredmények: Az eredmények azt mutatták, hogy a P.dactylifera L.A magkivonat látszólagos antioxidáns kapacitást fejtett ki, és jelentősen csökkentette az intracelluláris ROS-tartalmat {{0}},245 és 0,49 (mg/ml) koncentrációban. Ezenkívül a kivonat csökkentette a melanocortin 1 receptor (MC1R), a mikroftalmia-asszociált transzkripciós faktor (MITF), a tirozináz, a tirozinázzal rokon fehérje-1 (TRP1) és a tirozinázzal rokon fehérje-2 expresszióját ( TRP2), és gátolta a melanogenezist a B16F10 sejtekben. Következtetések: Eredményeink azt mutatták, hogy a P. dactylifera L. magkivonat gyengítette a melanogenezist B16F10 sejtekben a protein kináz A (PKA) jelátviteli útvonalak leszabályozásával. Ezért a kivonat bőrfehérítő szerként használható bőrápoló termékekben.

Kulcsszavak: Phoenix dactylifera;tirozináz; melanin; ROS; PKA

cistanche pharma specialegyfajta bőrfehérítő szer.

1. Bemutatkozás

Az antioxidánsokat széles körben alkalmazzák az oxidatív stresszel kapcsolatos rendellenességek megelőzésére vagy kezelésére a kozmetikai és bőrgyógyászati ​​területeken. Az elmúlt néhány évtizedben az antioxidánsokat a kozmetikai iparban is alkalmazták a bőr öregedésének megelőzésére vagy késleltetésére. Beszámoltak arról, hogy a szabad gyökök és a reaktív oxigénfajták (ROS) számos betegséggel járnak együtt, mint például az öregedés és az életkorral összefüggő betegségek [1]. Érdekes módon az UV-sugárzás okozta stressz és a ROS által okozott szabad gyökök bőrkárosodások fontos szerepet játszanak a bőr fotoöregedési folyamatában [2,3]. A jelentések szerint az antioxidánsok megzavarják az oxidációs folyamatot a szabad gyökök és a ROS megkötésével vagy az oxidációs katalitikus fémek kelátképzésével [4]. Ezért drámaian megnőtt az antioxidánsok vagy antioxidáns táplálék-kiegészítők alkalmazása az oxidatív stressz vagy az oxidatív stressz által kiváltott károsodások csökkentésére a szervezetben [5,6]. Egyes kémiai antioxidánsokról, köztük a nátrium-aszkorbátról, a terc-butil-hidroxi-anizolról (BHA), a nátrium-eritorbátról és a terc-butil-hidroxitoluolról (BHT) azonban kimutatták, hogy elősegítik az emberi egészségre gyakorolt ​​rákkeltő hatásokat [7]. Ezért az elmúlt évtizedekben a növényi eredetű természetes antioxidánsokkal kapcsolatos tanulmányok gyors növekedése következett be. Fontos, hogy azt találták, hogy a ROS szintjének növekedése felgyorsíthatja a bőr pigmentációját. A melanocitákból és keratinocitákból származó ROS-ok közül a nitrogén-monoxid, az NO, serkenti a melaninszintézist azáltal, hogy fokozza a tirozináz és a tirozinázzal rokon protein 1 (TRP1) fehérje expressziós szintjét [8,9]. A ROS melanintermelésre gyakorolt ​​hatását különféle antioxidánsok, például N-acetil-cisztein felhasználásával tanulmányozták az UVB-indukált melanocita-stimuláló hormon (-MSH) hatásának megszüntetésére [10].

A melanint a melanociták termelik és választják ki, amelyek a bőr epidermisz bazális rétegében oszlanak el [11]. A melanogenezis folyamatának első két lépése emberben az L-tirozin hidroxilezése 3-4-dihidroxi-fenilalaninná (L-DOPA) és az L-DOPA o-dopakinonná történő oxidációja. A tirozináz (EC 1.14.18.1) egy sebességkorlátozó enzim, amely a melanogenezis során mind az első két reakciót katalizálja [12]. A melanin létfontosságú szerepet játszik a bőr védelmében a napfény ultraibolya (UV) károsodásával szemben, valamint felelős a haj, a bőr és a szem színéért. Beszámoltak arról, hogy különböző bőrgyógyászati ​​rendellenességek, például öregségi foltok, melasma, poszt-gyulladásos melanoderma, szeplők és aktinikus károsodások, amelyek az epidermális melanin túlzott felhalmozódásából erednek [13]. A melaninszintézis gátlóit egyre gyakrabban alkalmazzák bőrápoló termékekben a bőr hiperpigmentációs rendellenességeinek kezelésére vagy megelőzésére [14,15]. Ezenkívül antioxidánsokat, például arbutint vagy kojsavat [16] alkalmaztak a hiperpigmentáció kezelésére [17]. Az utóbbi időben a kozmetikai termékek nagy részét a bőrfehérítő kozmetikumok teszik ki. Nemcsak a sötét bőrű nők használják széles körben ezeket a bőrfehérítő termékeket, hanem azok is, akik igyekeznek megbirkózni az UV-fény, terhesség vagy életkor növekedése miatti sötét foltokkal a bőrükön.

A melanogenezist számos tényező szabályozza. Például a tirozinázzal rokon fehérje-1 (TRP1), a mikroftalmia-asszociált transzkripciós faktor (MITF) és a tirozinázzal rokon fehérje-2 (TRP2) szabályozza a melanintermelést [18–20. ]. A melanocortin 1 receptor (MC1R) az -MSH által kiváltott melaninszintézisben is kiemelkedő szerepet játszik [21]. Számos jelátviteli út vesz részt a melanintermelésben. A melanintermelést szabályozó különböző jelátviteli utak közül a ciklikus AMP (cAMP) által közvetített protein kináz A (PKA) aktiváció kritikus szerepet játszik a melanogenezis szabályozásában [22]. A cAM-PKA jelátviteli útvonalon a cAMP indukálja a PKA aktiválását [23], amit a cAMP válaszelem-kötő fehérje (CREB) foszforilációja követ. A CREB egy intracelluláris transzkripciós faktor, amely serkenti a microphthalmia faktor (MITF) gén expresszióját, amely fontos a melanogenezisben. A MITF egy transzkripciós faktor, amely a melanogén tirozináz, TRP1 és TRP2 gének promoterrégióihoz kötődik, fokozva azok expresszióját [24,25]. Ezt követően az intracelluláris melanintartalom növekszik [26]. Beszámoltak arról, hogy az -MSH növeli a cAMP szintjét, és általában a CREB foszforilációjának aktiválására, majd az MITF fehérjeszintek fokozására alkalmazzák [27].

A MITF expresszióját számos jelátviteli útvonal szabályozza. A c-Jun N-terminális kináz (JNK) és a p38 mitogén által aktivált protein kináz (MAPK) részt vesz a MITF expresszió aktiválásában és az ennek következtében megnövekedett tirozináz expresszióban. Az extracelluláris reszponzív kináz (ERK) aktivációs jelek szintén növelik a CREB foszforilációját és az ezt követő MITF expressziót, ami modulálja a melanin szintézist [28,29]. Ezért számos bőrfehérítő szerről számoltak be, hogy gátolja az MITF transzkripciós aktivitását azáltal, hogy csökkenti a tirozináz, a TRP1 és a TRP2 fehérje expressziós szintjét a p38MAPK által közvetített MITF foszforiláció leszabályozása révén. Ezen túlmenően az ERK-útvonalról leírták, hogy részt vesz a MITF szabályozásában a melanogenezis során [30,31]. Az ERK aktiválása foszforilálja a MITF-et, ami az MITF lebomlásához vezet, ami a melanintartalom csökkenését eredményezi [32,33].

Az oxidatív stressz lehet a ROS túltermelés vagy a csökkent antioxidáns védelem eredménye [1]. A természetes antioxidánsok felkutatása és alkalmazása továbbra is számos kutatócsoport fókuszában marad világszerte. Az utóbbi időben egyre nagyobb érdeklődés mutatkozik a fitokemikáliák, például a természetes antioxidánsok és a különböző természetes forrásokból származó fenolos vegyületek kutatása és fejlesztése iránt, amelyek táplálékként, öregedésgátló kozmetikumokként és gyógyászati ​​termékekként használhatók [34]. A Phoenix dactylifera L. a Közel-Keleten és Észak-Afrikában termesztett egyik fő gyümölcsnövény [35,36]. Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy a P. dactylifera L. gyümölcsei antioxidáns, szabadgyök-fogó, antimikrobiális és gyulladásgátló hatást mutatnak [37,38]. A P. dactylifera L. funkcionális hatása nemcsak magukra a gyümölcsökre korlátozódik, hanem magjaira is, amelyek a gyümölcsök egyfajta melléktermékei [39,40]. A P. dactylifera L. magkivonat antioxidáns tulajdonságainak köszönhetően az oxidatív stressz ellen ható antioxidáns anyagok forrásaként szolgálhat [41–43]. Kevés tanulmányt végeztek azonban a P. dactylifera L. magvak kozmetikai termékek fejlesztésére való felhasználásával kapcsolatban. Ezeket a magokat általában hulladékként dobják ki, de funkcionális kozmetikai összetevőként fontosságukat itt kiemeljük. A mai napig nem érkezett jelentés a P. dactylifera L. magkivonat hatásmechanizmusáról a bőrápoló kozmetikumok területén, vagy a magkivonat melanintermelésre gyakorolt ​​hatásairól. Jelen tanulmány célja a P. dactylifera L. magkivonat melanogenezis gátló potenciáljának meghatározása volt a kozmetikai iparban.

A P. dactylifera L. magkivonat melanogenezisre gyakorolt ​​gátló hatásának hátterében álló mechanizmusokat még nem vizsgálták. Jelen tanulmány célja a P. dactylifera L. magkivonat melanogenezisre gyakorolt ​​antioxidáns tulajdonságainak és lehetséges hatásmechanizmusainak vizsgálata volt a MAPK és PKA jelátviteli útvonalak MITF transzkripciós szabályozóinak és regulátorainak foszforilációjának vizsgálatával.

friss ciszterna

2. Anyagok és módszerek

2.1. Vegyszerek és reagensek

A vizsgálathoz használt kémiai reagenseket a Sigma-Aldrich Chemical Co.-tól (St. Louis, MS, USA) vásároltuk. Az antitestek a Santa Cruz Biotech-től (Santa Cruz, CA, USA), az ECL-reagens pedig a Millipore-tól (Billerica, MA, USA) származott.

2.2. A P. dactylifera magkivonat készítése és kinyerése

A szárított P. dactylifera L. gyümölcsöket 2019-ben szedték be a szaúd-arábiai Medina City hagyományos üzleteiből. A P. dactylifera L. magvakat teljesen megmostuk, napfénynek kitettük, egy napig levegőn szárítottuk, majd kemencében 80 ◦C-on 2 órán át szárítottuk. A dehidratált magokat finom porrá (#50 mesh) porrá porítottuk egy speciális malomban (Retsch Ultra Centrifugal Mill and Sieving Machine, Type ZM1, Haan, Németország). A port lezárt üvegpalackba gyűjtöttük, és felhasználásig 25 ◦C-on tároltuk. Porított, szárított P. dactylifera L. magport (2 g) 10 ml desztillált vizet tartalmazó extrakciós főzőpohárba helyeztünk. Ezt követően az ultrahangos extrakciót az ULTRAsonikTM 57H modellel (250 W, C és A Sales Industrial Supplies, Yucaipa, CA, USA) végeztük. A működési frekvencia 45 kHz volt 30 percig. Az extrakció után a mintákat 4500 fordulat/perc sebességgel 50 percig 25 °C-on centrifugáltuk Eppendorf Centrifuge 5810 R készülékkel (Hamburg, Németország). A felülúszókat összegyűjtöttük, és nejlonszűrőn (pórusméret: 0,45 μm) szűrtük, majd a szűrletet 9,8 mg/ml-re koncentráltuk.

2.3. A P. dactylifera magkivonat és a ferulinsav ultra-teljesítményű folyadékkromatográfiás (UPLC) elemzése

A P. dactylifera magkivonatot egy ACQUITY UPLC H osztály segítségével elemeztük fotodiódasoros detektorral (Waters, Milford, MA, USA). Az oszlop egy ACQUITY UPLC BEH C18 oszlop volt, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm. Az A mozgófázis 0,5%-os ecetsav, a B mozgófázis pedig acetonitril volt. A 0 és 5 perces időpontokban az A/B százalékaránya 95/5 volt; 20 percig az A/B százalékaránya 5/95 volt; a 21. és 25. percben az A/B százalékaránya 95/5 volt. Pozitív standardként ferulinsavat (1 ppm) használtunk.

2.4. DPPH Scavenging Activity Assay

Ebben a vizsgálatban a C-vitamint ({0}},5 mg/ml) és a BHA-t (0,1 mg/ml) használtuk antioxidáns standardként. A P. dactylifera L. magkivonatot különböző koncentrációkban (0.0049, 0,0245 és 0,049 mg/ml) 2,9 ml DPPH (60 μM) oldathoz adtuk. A magkivonat antioxidáns komponensei hidrogént adhatnak a DPPH-nak, és a DPPH-t redukált formává alakíthatják. Az ebből eredő abszorbancia csökkenést 517 nm-en UV-Vis spektrofotométerrel rögzítettük [44].

2.5. ABTS plus Scavenging Capacity Assay

A P. dactylifera L. magkivonat ABTS plusz tisztító kapacitását a C-vitamin ({{0}},9 mg/ml) és a BHA ({{10}}) értékével hasonlították össze. 9 mg/ml). Ehhez a vizsgálathoz ABTS plust használtunk. A kationt először úgy állítottuk elő, hogy az ABTS-oldatot (7 mM) kálium-perszulfáttal (2,45 mM) reagáltattuk, és az elegyet használat előtt legalább 6 órán át sötétben állni hagytuk. Az abszorbanciát 734 nm-en mértük 1 0 perccel, miután a magkivonat különböző koncentrációit (0,0098, 0,049 és 0,098 mg/ml) összekevertük 1 ml ABTS plusz oldattal [45].

2.6. Az összes fenoltartalom meghatározása

A teljes fenoltartalmat Folin–Ciocalteu reagenssel [46] határoztuk meg, és pozitív standardként gallussavat (2 ug/ml) használtunk. A P. dactylifera L. magkivonat (0.0196, 0.098 és 0,196 mg/ml) különböző koncentrációit állítottuk elő 80%-os metanolban; 100 μl kivonatot töltöttünk egy kémcsőbe, majd hozzáadtunk 0,5 ml Folin–Ciocalteu reagenst (előzőleg ionmentes vízzel 10-szeresére hígítva), és összekevertük. Az elegyet szobahőmérsékleten 5 percig állni hagyjuk; 1,5 ml 20%-os nátrium-karbonátot adunk hozzá. 2 órás szobahőmérsékleten való állás után az abszorbanciát 760 nm-en olvastuk le UV-Vis spektrofotométerrel.

2.7. Csökkentő kapacitás meghatározása

Ebben a vizsgálatban pozitív standardként C-vitamint ({0}}.008 mg/ml) vagy BHA-t (4,8 mg/ml) használtunk. A magkivonat redukálóképességét Oyaizu [47] által leírt módszer szerint határoztuk meg. Különféle koncentrációjú P. dactylifera L. magkivonatot (0.0073, 0,036, 0,073 mg/ml) összekevertünk foszfát pufferrel (2,5 ml, 0,2 M, pH 6,6). ) és kálium-ferricianid [K3Fe (CN)6] (2,5 ml, 1 tömeg/térfogat%). Az elegyet 50 °C-on 20 percig inkubáltuk. Az elegyhez triklór-ecetsavat (2,5 ml, 10 tömeg/térfogat%) adtunk, majd 10 percig 1000 × g-vel centrifugáltuk. Az oldat felső rétegét (2,5 ml) összekeverjük desztillált vízzel (2,5 ml) és FeCl3-mal (0,5 ml, 0,1 tömeg/térfogat%), és megmérjük az abszorbanciát 700 nm-en.

2.8. A vas(II)-ion kelátképző kapacitásának mérése

A P. dactylifera L. magkivonat, EDTA (0.02, 0.04 és {) Fe2 plus -ion kelátképző képességének mérésére {10}}.08 mg/ml) volt pozitív standard. A magkivonat különböző koncentrációit (0,0196, 0,098 és 0,196 mg/ml) adtuk FeCl2-oldathoz (0,05 ml, 1 mM). A reakcióelegyet ferrozinnal (0,1 ml, 1 mM) reagáltattuk, majd metanollal 1 ml-re határoztuk meg és 25 °C-on 10 percig inkubáltuk. A reakcióelegy abszorbanciáját 562 nm-en mértük [48].

2.9. Sejtéletképességi vizsgálat

A sejtek életképességi vizsgálatát MTT módszerrel végeztük [49]. A sejteket különböző koncentrációjú P. dactylifera L. magkivonatnak (0.049, 0,245 és 0,49 mg/ml) 24 órán át 37 ◦C-on tesszük ki. és 5% CO2-t párásított inkubátorban, és az MTT-oldatot adtuk a lyukakba. Az MTT oldhatatlan származékát etanol-DMSO-val (1:1 keverék oldat) szolubilizáltuk. A lyukak abszorbanciáját 570 nm-en mikrolemez-leolvasóval mértük. A B16F10 sejteket (BCRC60031) a tajvani Hsinchu város Bioresource Collection and Research Center-től (BCRC) szereztük be. A sejteket DMEM-ben (Hyclone, Logan, UT, USA) tartottuk, 10% magzati szarvasmarha-szérummal és 1% antibiotikummal kiegészítve. Ezenkívül a P. dactylifera L. magnak a B16F10 sejtek életképességére gyakorolt ​​hatását a tripánkék kizárási vizsgálati módszerrel is értékeltük. A magkivonattal végzett kezelés után a sejteket tripszinnel kezeltük és centrifugáltuk, hogy összegyűjtsük a pelletet. A sejtpelletet 300 μl DMEM sejttenyésztő tápközegben újraszuszpendáltuk. A sejtszuszpenzió kis alikvot részét (20 μL) óvatosan összekeverjük 10 µl tripánkékkel (4 százalék PBS-ben). A sejtszámot mikroszkóp alatt hemocitométerrel megszámoltuk (az életképtelen sejtek kékek voltak, az életképes sejtek pedig nem festettek).

2.10. A gomba tirozináz aktivitásának mérése

A gomba tirozináz oldatát (10 μL, 200 egység) egy 96-lyukú mikrolemezre adtuk. A reakcióelegy foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) (50 mM, pH 6,8) oldott 5 mM L-DOPA-t és P. dactylifera L. magkivonatot (0.049, 0,245) tartalmazott. és 0,49 mg/ml), kojsav (200 mM; 0,03 mg/ml) vagy arbutin (2 mM; 0,54 mg/ml). A vizsgálati keveréket 37 °C-on 30 percig inkubáltuk, és a képződött dopakróm abszorbanciáját 490 nm-en mértük. A gomba tirozináz aktivitásának mérését a korábban leírtak szerint végeztük [50].

2.11. A melanintartalom meghatározása

A B16F10 sejteket -MSH-val (100 nM) kezeltük 24 órán át, majd P. dactylifera L. magkivonattal (0,0245-0,147 mg/ml) kezeltük. vagy arbutint (0,54 mg/ml) további 24 órán át. A kezelés után a sejtpelleteket NaOH oldatban (1 N) 60 ◦C-on 60 percig szolubilizáltuk. A melanintartalmat 405 nm-en detektáltuk, ahogy azt korábban Tsuboi is leírta [51].

A Cistanche gátolja a melanintermelést.

2.12. Az intracelluláris tirozináz aktivitás mérése

Az intracelluláris tirozináz aktivitást a korábban leírtak szerint határoztuk meg [52]. A sejteket -MSH-val (100 nM) 24 órán át, majd P. dactylifera L. magkivonattal (0.0245-0,147 mg) kezeltük. /ml) vagy arbutin (0,54 mg/ml) 24 órán át. A kezelés után a sejtkivonatokat (100 μL) frissen készített L-DOPA oldattal (0,1 százalék PBS-ben) kevertük össze, és 37 ◦C-on inkubáltuk, majd 490 nm-en mértük az abszorbanciát.

2.13. Western-blot kísérlet

A sejteket P. dactylifera L. magkivonattal kezeltük ({{0}}.0245, 0.0368, 0). {14}}49 és 0,147 mg/ml) vagy arbutin (0,54 mg/ml), majd PBS-ben lizáltuk, amely nem diétás P-40-et (1 százalék), nátrium-dezoxikolátot (0,5 százalék), nátrium-dodecilt tartalmaz. szulfát (SDS, 0,1%), aprotinin (5 ug/ml), fenil-metil-szulfonil-fluorid (100 ug/ml), pepsztatin A (1 ug/ml) és EDTA (1 mM) 4 °C-on 20 percig. Az összes lizátum mennyiségét mikro BCA kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) segítségével határoztuk meg. A fehérjéket (30 ug) SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel rezolváltuk, és elektroforetikusan átvittük egy polivinilidén-fluorid membránra. A membránt 5 százalék zsírmentes tejben blokkoltuk PBST-ben (PBS 0,05 százalék Tweennel{28}}), és egy éjszakán át 4 ◦C-on inkubáltuk a következő, PBST-ben hígított elsődleges antitestekkel: MITF Ab (1:1000), TRP1 Ab (1:6000), TRP2 Ab (1:1000), MC1R Ab (1:500), GAPDH Ab (1:1500), tirozináz Ab (1:2000), p-p38 Ab (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500) és a CERB Ab (1:200), mind a Santa Cruz Biotech-től (Dallas, TX, USA)). A megkötött antitesteket torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitesttel (Amersham Corp.), majd ECL detektáló rendszerrel (Amersham) mutattuk ki a gyártó utasítása szerint.

2.14. PKA Inhibitor Assay

A sejteket -MSH-val (100 nM) 24 órán át kezeltük, majd 1 órán át 10 μM H89 PKA regulátort adtunk hozzá. A kezelés után P. dactylifera L. magkivonatot (0,147 mg/ml) és H89-et adtunk a sejtekhez, és további 23 órán át inkubáltuk. A melanintartalmat a fent leírtak szerint határoztuk meg.

2.15. Statisztikai analízis

A statisztikai elemzéshez Tukey post hoc tesztjét használtuk, amelyet a mért adatok összehasonlítására használtunk, a Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 22-es verziójával.{1}} statisztikai szoftver (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). * p < 0.05="" volt="" szignifikáns,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p=""><>

3. Eredmények

3.1. A P. dactylifera L. magkivonat UPLC analízise

Az UPLC analízis eredményeit az 1A. és B. ábrák mutatják. Az 1A. ábra a P. dactylifera L. magkivonat és a ferulinsav átfedő csúcsát mutatja 330 nm-en. Az 1B. ábra hasonló pásztázási spektrumokat mutat 220 és 500 nm között a P. dactylifera L. magkivonat és a ferulinsav esetében.

3.2. A P. dactylifera L. magkivonat antioxidáns tulajdonságai

A P. dactylifera L. magkivonat antioxidáns aktivitása in vitro kimutatta az antioxidáns potenciál jelenlétét. A DPPH vizsgálatban C-vitamin ({0}}.05 mM; 0,53 mg/ml) és terc-butil-hidroxi-anizol (BHA) (0) 0,1 mg/ml) pozitív antioxidáns standardként alkalmaztuk. A kivonat DPPH-megkötő képessége 49,97 ± 2,9 százaléka, 81,36 ± 0,56 százaléka és 78,53 ± 3,83 százaléka volt a kontrollénak a 0 kivonatkoncentráció esetén.0{{ 31}}49, 0,0245 és 0,049 (mg/ml). Összehasonlításképpen, a C-vitamin és a BHA megkötő képessége 90,12 ± 0,31 százalék, illetve 90,44 ± 0,49 százalék volt (2A ábra).

Ez az ABTS gyökkation kék színű, és reakcióképes a legtöbb antioxidánssal szemben. A reakció során a kék ABTS gyökkation visszaalakul színtelen, semleges formájába. A reakciót spektrofotometriásan követtük. A kivonat ABTS plusz tisztítókapacitása 5,69 ± 1,36 százaléka, 18,81 ± 0,68 százaléka és 66,82 ± 8,51 százaléka volt a kontrollénak 0 koncentrációnál.0{{16 }}98, 0.{{20}}49, illetve 0,098 mg/ml. Ezzel szemben a C-vitamin (0,9 mg/ml) és a BHA (0,9 mg/ml) ABTS plusz megkötő kapacitása 95,52 ± 0,12 százalék, illetve 40,3 ± 0,83 százalék volt. A 2B. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy a magkivonat jelentős mennyiségű ABTS plusz gyököt megköt.

A P. dactylifera L. magkivonat összes fenoltartalmának meghatározásához gallusavat (2 ug/ml) használtunk pozitív standardként. A 2C. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy a teljes fenoltartalom 0.0196, 0.{{20}}98 és 0. 196 (mg/ml) a kivonat 33,43 ± 2,33 százaléka, 117,22 ± 7,81 százaléka és 195,4 ± 10,91 százaléka volt. A magkivonatok fent említett koncentrációinak galluszsav ekvivalense (GAE) 0.068 ± 0,01, 0,365 ± 0,01 és 0,642 ± 0,03 volt (2C. ábra).

3.3. A P. dactylifera L. magkivonat gátló hatásai a melanogenezisre

A 4A ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy 0,049 mg/ml P. dactylifera L. magkivonatnem fejt ki gátló hatást a gomba tirozináz aktivitására. Másrészt az enzimgátlási százalékok 8,34 ± 2,67 százaléka és 33 ± 2,36 százaléka a kontrollénak a 0,245 és 0,49 mg/ml esetébenP. dactylifera L. magkivonat kezelések, ill. Ezenkívül a kojsav (200 μM; 0.03 mg/ml) és az arbutin (2 mM; 0,54 mg/ml) tirozináz gátlási százaléka ) a kontroll 56,26 ± 5,06 százaléka, illetve 64,56 ± 2,88 százaléka volt (4A. ábra). Így a P. dactylifera L. magkivonat magasabb koncentrációi (0,245 és 0,49 mg/ml) a gomba tirozináz gátló szintjét jelenthetik.

A 4B. ábrán az eredmények azt mutatják, hogy csak 0,147 mg/ml P. dactylifera L. magkivonat képes jelentősen csökkenteni a melanintartalmat a B16F10 melanomasejtekben. A kezelés után a B16F10 sejtekben a melanintartalom 80,66 ± 5,43 százaléka volt a kontrollénak. A pozitív standard, az arbutin (0,54 mg/ml) esetében a fennmaradó intracelluláris melanintartalom 61,19 ± 8,17 százaléka volt a kontrollénak. Az eredmények azt mutatták, hogy 0,147 mg/ml P. dactylifera L. magkivonat kisebb hatást mutatott, mint az arbutin. A fennmaradó intracelluláris tirozináz aktivitás értékek 85,1 ± 8,1% és 73,7 ± 11,9% voltak a 0,098 és 0,147 mg/ml P. dactylifera L. magkivonat esetében. A fennmaradó intracelluláris tirozináz aktivitás 64,3 ± 14,9 százaléka volt a kontrollénak, miután a sejteket arbutinnal kezeltük (4C. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a P. dactylifera L. magkivonat magasabb koncentrációi még mindig kisebb gátló hatást mutattak az -MSH-indukált tirozináz aktivitásra B16F10 sejtekben, mint az arbutin.

3.4. A P. dactylifera L. mag kivonat gátolja a melaninogenezisben részt vevő fehérjék expressziós szintjét

Western blotot használtunk a melanogenezishez kapcsolódó fehérjék expressziós szintjének vizsgálatára B16F10 sejtekben (5A. ábra). Az eredmények azt mutatják, hogy a különböző koncentrációjú P. dactylifera L. magkivonattal végzett kezelés az MC1R, MITF, tirozináz, TRP1 és TRP2 szintjének csökkenéséhez vezetett. A kivonat fehérjeexpressziót gátló hatása nyilvánvaló volt {{10}},147 mg/ml koncentrációnál. Az MC1R fehérje expressziós szintjének többszörös változása 0,74 ± 0.02; a MITF esetében {{20}},51 ± 0.03; a tirozináz esetében 0,54 ± 0,26 volt; a TRP-1 esetében 0,57 ± 0,15 volt; a TRP-2 esetében pedig 0,49 ± 0,1 volt (5B. ábra).

A melanogenezishez kapcsolódó jelátviteli fehérjék expressziós szintjét Western-blot segítségével vizsgáltuk (5C. ábra). Az eredmények azt mutatják, hogy 0,147 mg/ml P. dactylifera L. magkivonattal végzett kezelés nyilvánvalóan a p-p38, p-JNK, p-ERK és p-CREB szintjének csökkenéséhez vezetett. A p-p38 fehérje expressziós szintjének többszörös változása 0,88 ± 0,15 volt; p-JNK esetén 0,68 ± 0,39 volt; p-ERK esetén 0,65 ± 0,23 volt; a p-CREB esetében pedig 0.44 ± 0.07 volt (5D. ábra).

3.5. P. dactylifera L. mag kivonat nem befolyásolja a tirozináz, a TRP1, a TRP2 vagy a MITF génexpressziót

A melanogenezishez kapcsolódó fehérjék, például a tirozináz, TRP1, TRP2 és MITF génexpressziós szintjét kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) vizsgáltuk. A tirozináz/GAPDH relatív normalizált expressziós szintjei a 0.0367, 0.049 és 0,147 mg/ml P esetében. dactylifera L. magkivonattal végzett kezelések 3,51 ± 0,52, 2,38 ± 0,24 és 1,64 ± 0,55 voltak. TRP-1/GAPDH esetén a 0.0367, 0.049 és {{4{{43} relatív normalizált kifejezési szintjei }}},147 mg/ml P. dactylifera L. magkivonattal végzett kezelések 1,64 ± 0,2, 1,15 ± 0.02 és 0 voltak. 89 ± 0.07, ill. A TRP-2/GAPDH relatív normalizált expressziós szintjei a következőhöz: 0.0367, 0.049 és 0,147 mg /mL P. dactylifera L. magkivonat 1.08 ± 0,13, 0,85 ± 0,01, illetve 0,7 ± 0,05 volt. A MITF/GAPDH esetében a P. dactylifera L. magkivonattal kezelt 0,0367, 0,049 és 0,147 mg/ml relatív normalizált expressziós szintek 1,48 ± 0,19, 1,03 ± 0,02 és 0,74 ± 0,05 (Figure) 0,05.

4. Megbeszélés

Beszámoltak arról, hogy a melanogenezis növeli a celluláris oxidatív stresszt. Ezenkívül számos antioxidáns, ROS-megkötő, inhibitor-megkötő és inhibitor gátolhatja az UV-közvetített melaninszintézist [54]. Ezért az antioxidánsokat, a ROS-megkötőket és a melanogenezis gátlóit egyre gyakrabban alkalmazzák a bőrfehérítő kozmetikumokban a nemkívánatos bőrhiperpigmentáció megelőzésére [14]. Azt is megállapították, hogy a metallotionein, egy endogén antioxidáns stimulálása elnyomhatja a melanogenezist a melanocitákban [55]. Az emberi bőr gyakran van kitéve környezeti oxidáló szennyező anyagoknak vagy UV-fénynek, és külső környezeti tényezők károsítják. Különösen az UV-besugárzásról számoltak be, hogy ROS képződését váltja ki a bőrben, és elősegíti a sejtmembrán lipidperoxidációját [56]. Az oxidatív stressz ellensúlyozására a bőrt speciális antioxidáns rendszerekkel látják el [57].

A P. dactylifera L. magkivonat antioxidáns aktivitásának tisztázására a DPPH és ABTS plusz gyökfogó aktivitást, a kivonat összes fenoltartalmát, redukálóképességét és fémion-kelátképző képességét a korábban leírtak szerint határoztuk meg [47,48]. A P. dactylifera L. magkivonat jelentős antioxidáns hatást fejtett ki az összes fent említett analitikai vizsgálatban. Az eredmények a P. dactylifera L. magkivonat antioxidáns potenciálját mutatták különböző tartományokban, eltérő hatékonysággal. A 2A ábrán látható magkivonat DPPH-megkötő aktivitása eltér a 2B. ábrán látható ABTS plus-tól, ami az antioxidáns-gyök kölcsönhatások eltérő mechanizmusaiból származhatott. Ezenkívül a magkivonatban lévő antioxidáns komponensek közötti reakciók sztöchiometriája változhat, ami különbséget eredményez a szabadgyök-fogó képességben [58]. A P. dactylifera L. magkivonatban található potenciális antioxidánsok egy Fe3 plusz/ferricianid komplexet ferro formává alakíthattak, és a redukáló kapacitás a 2D ábrán látható magkivonat antioxidáns aktivitásának indikátoraként szolgált. Azt találták, hogy a kojinsav [59] tirozináz inhibitorként működik, mivel a kojinsav fémkelátképzőként működik a rézionok kelátképzésében, és gátolja ezen ionok bejutását a tirozináz aktív helyére. Ezért a magkivonatban lévő antioxidánsok oldhatatlan fémkomplexeket képezhetnek vasionokkal, majd gátolják a fémionok és a lipidek közötti kölcsönhatást. A magkivonat nagyobb fémion-kelátképző képessége jelezte potenciális antioxidáns aktivitását és a tirozináz aktivitás lehetséges gátló hatását (2E. ábra).

Az intracelluláris ROS vizsgálatának elve az, hogy a DCFH-DA átdiffundál a sejtmembránon, és az észteráz enzimatikusan DCFH-vá hidrolizálódik; majd a DCFH reakcióba lép a ROS-szal (például H2O2) DCF-et eredményezve. A DCF gyors növekedése a DCFH intracelluláris gyökök általi oxidációját jelezte [60]. A bőrfehérítő hatású antioxidánsok újszerű kutatásának ötlete abban a hipotézisben rejlik, hogy az UV-sugárzásból származó oxidatív stressz hozzájárulhat a melaninszintézis stimulálásához. Beszámoltak arról, hogy az UV-besugárzás ROS-t termel a bőrszövetekben, amely a tirozináz aktiválásával melanintermelést indukálhat [61]. Ezenkívül arról számoltak be, hogy számos bőrfehérítő ágens gátolja a melanogenezist azáltal, hogy a tirozináz aktív helyén lévő rézionokkal vagy o-kinonokkal kölcsönhatásba lép, hogy blokkolja a melanin szintézisútjában lévő intermedierek polimerizációját [62]. Ezenkívül a C-vitamin vagy az E-vitamin csökkentheti a már meglévő melanin részecskék oxidációját. Ezért ezeket a vitaminokat széles körben alkalmazzák bőrfehérítő termékekben [63]. Érdekes módon eredményeink igazolták a P. dactylifera L. magkivonat antioxidáns tulajdonságait, ami arra utal, hogy a P. dactylifera L. magkivonata bőrfehérítő összetevőként működhet a kozmetikumokban.

Az MTT-teszt egy jól ismert kolorimetriás vizsgálat, amely a celluláris NADH/NADPH-függő oxidoreduktáz enzimek aktivitását méri, amelyek az MTT-t lila színű formazánfestékekké redukálják. Ez a vizsgálat alkalmazható gyógyászati ​​szerek és toxikus anyagok lehetséges citotoxicitásának vizsgálatára, mivel ezek a szerek fokozzák vagy gátolják a sejtek életképességét. A 3A. ábrán látható eredmények összhangban voltak a 3B. ábrán látható tripánkék kizárási vizsgálat eredményeivel, ami azt jelzi, hogy a P. dactylifera L. magkivonat nem volt citotoxikus hatással a B16F10 melanomasejtek életképességére.

A gomba tirozinázt általában célenzimként használják a melanogenezis potenciális gátlóinak szűrésére. Először azt találták, hogy a P. dactylifera L. magkivonat dózistartománya ({0}}.049-0,49 mg/ml) gátolja a gomba tirozináz aktivitását. A 4A. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy a magkivonat kisebb gátló hatást mutatott a gomba tirozináz aktivitására, mint a kojsav. A tirozináz fő szerepet játszik a melanogenezis út első két lépésében. A P. dactylifera L. magkivonat melanintermelésre gyakorolt ​​valódi gátló hatásának tisztázására meghatároztuk a B16F10 melanintartalmat és az intracelluláris tirozináz aktivitást. A 4B. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a P. dactylifera L. magkivonat magasabb koncentrációja nyilvánvalóan gátló hatást fejtett ki a melaninképződésre. Az adatok azt mutatták, hogy a P. dactylifera L. magkivonat valóban blokkolja a melanogenezist a melanomasejtekben. Ezzel a 4C. ábrán látható eredmények összhangban voltak a 4B. ábrán látható eredményekkel. A fent említett sejtkísérletekben -MSH-t alkalmaztak induktorként a melaninszintézis stimulálására. Az -MSH-ról azt írták, hogy megköti a melanocortin 1 receptort (MC1R) és aktiválja az intracelluláris adenilát-ciklázt, amely az ATP-t cAMP-vé katalizálja, és aktiválja a cAMP-függő PKA-t. Az 5A. ábrán látható eredmények azt mutatták, hogy a P. dactylifera L. magkivonat gátolta az MC1R expresszióját, ezáltal blokkolva az -MSH által közvetített intracelluláris cAMP-upreguláció által kiváltott melanintermelést. Ezenkívül a cAMP-közvetített PKA jelátviteli út inaktiválódott, és a melanogenezis gátolt. A következtetés megerősítésére elvégeztük a PKA inhibitor kísérleteket, és a 4D ábrán látható adatok azt mutatják, hogy a P. dactylifera L. magkivonat (0,147 mg/ml) gátló hatását a B16F10 sejtek melanogenezisére a H{{ elnyomta. 24}}kezelés. A H89 (N-[2-p-bróm-cinnamilamino-etil]-5-izokinolinszulfonamid) a PKA szelektív és hatékony inhibitora. Az eredmények azt mutatják, hogy a cAMP-közvetített PKA jelátvitelt a P. dactylifera L. magkivonat befolyásolta.

A tirozináz, a TRP1 és a TRP2 a három fő enzim, amelyek szabályozzák a melaninszintézist az emlőssejtekben [64]. Ezenkívül a MITF a tirozináz, a TRP1 és a TRP2 fő transzkripciós szabályozója, és a melanociták pigmentációjának legfontosabb szabályozója [65]. Az 5A. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy a P. dactylifera L. magkivonat csökkentette ezeknek a melanogenezissel rokon fehérjéknek a fehérjeexpressziós szintjét, gátolta a tirozináz aktivitást és csökkentette a melanintartalmat a B16F10 sejtekben.

Ebben a vizsgálatban a P. dactylifera L. magkivonat elnyomta a CREB foszforilációt és a PKA aktivációt. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a cAMP-PKA útvonal felelős lehet a P. dactylifera L. magkivonat által kiváltott anti-melanogenezisért (5C. ábra).

A MAPK-król beszámoltak arról, hogy modulálják a melanogenezist [66]. A MAPK család háromféle protein kinázt tartalmaz, beleértve az extracelluláris reszponzív kinázt (ERK), a c-Jun N-terminális kinázt (JNK) és a p38 MAPK-t. A p38 MAPK képes aktiválni a cAMP válaszelem-kötő fehérjét (a CREB és a CREB aktiválja a MITF expressziót, ami pozitívan járul hozzá a melanin szintézishez [67]. Az 5C. ábra eredményei bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a P. dactylifera L. mag kivonata inaktiválhatja a CREB-t, A JNK és a p38 viszont gátolja a MITF expresszióját (5A. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a. dactylifera L. magkivonat által kiváltott antimelanogén hatást a PKA útvonalak leszabályozása közvetítheti. Ezen túlmenően az UV fény besugárzás is szerepet játszik számos bőrbetegség, köztük a hámlás, ráncosodás és hiperpigmentáció kiváltásában kiemelkedő szerepet játszik [68] Az eredmények arra utalnak, hogy a P. dactylifera L. magkivonat csökkentette a melanintermelést, ami az intracelluláris ROS kimerülésének tudható be.

A P. dactylifera L. magkivonat celluláris melanintermelésre gyakorolt ​​hatásának felmérésére meghatároztuk az -MSH-val és P. dactylifera L. magkivonattal kezelt B16F10 sejtekben az mRNS szinteket. Az -MSH-val kezelt sejtekben a vártnak megfelelően megnövekedett MITF, tirozináz, TRP-1 és TRP-2 szintje volt. Érdekes módon a P. dactylifera L. magkivonattal kezelt sejtek csökkentik ezeknek a melanogenezishez kapcsolódó géneknek az mRNS-expresszióját. Az oszlopok között azonban nem volt statisztikailag szignifikáns különbség, ami azt jelezte, hogy a P. dactylifera L. magkivonat nem befolyásolja a MITF, tirozináz, TRP1 és TRP2 génexpressziós szintjét.

Ez a mi termékünk.

További információért kattintson ide.

Beszámoltak arról, hogy a P. dactylifera L. magjában található fő fenolsav a ferulinsav [69]. A ferulinsavról kimutatták, hogy hatékonyan gátolja a melaninszintézist a B16 melanomasejtekben azáltal, hogy dózisfüggő módon gátolja a kazein-kináz 2-indukált tirozináz foszforilációját [70]. Ezek a jelentések alátámasztják az 1. ábrán bemutatott eredményeinket – a P. dactylifera L. vetőmag vizes kivonatában lévő ferulinsav hozzájárult a melanogenezis gátlásához a B16F10 sejtekben. Természetesen a magkivonat egyéb funkcionális összetevőit is meg kell vizsgálni a közeljövőben.

Eredményeink azt mutatták, hogy a P. dactylifera L. magkivonat gátolta a melanogenezist a B16F10 sejtekben a PKA jelátviteli útvonalak leszabályozásával. Így a P. dactylifera L. magkivonat hatékony bőrfehérítő szerként használható.

5. Következtetések

Ez az első jelentés a P. dactylifera L. magvíz kivonat hatásmechanizmusáról a melanin szintézisben. Jelen tanulmány kimutatta a cAMP/PKA/CREB útvonal szerepét a P. dactylifera L. magkivonat depigmentáló hatásában. Eredményeink azt mutatták, hogy a P. dactylifera L. magkivonat gátolta a melanogenezist a B16F10 sejtekben a PKA jelátviteli útvonalak leszabályozásával. Így a P. dactylifera L. magkivonat új bőrgyógyászati ​​antimelanogenezisként és hatékony bőrfehérítő szerként használható fel.