A kemoterápiás nyugalmi funkciót magában foglaló fényérzékeny pro-drog nanoszerelvények fokozzák a rák immunterápiáját

Absztrakt

Az immunterápia hatékony terápiákkal, például kemoterápiával és fotodinamikus terápiával kombinálva sikeres stratégia a daganatellenes immunválasz aktiválására a jobb rákellenes kezelés érdekében. A multifunkcionális biológiailag lebontható, biokompatibilis, alacsony toxikus, de rendkívül hatékony és klinikailag hozzáférhető transzformált nano-immunstimulánsok kifejlesztése azonban továbbra is kihívást jelent, és nagy kereslet van rá. Itt bemutatunk és megtervezünk egy új, hordozómentes fotokemoterápiás nano-prodrugot, a COS-BA/Ce6 NP-t, három többfunkciós komponens, önösszeálló természetes kis molekulájú betulinsav (BA), egy vízoldható kitozán-oligoszacharid (COS) kombinálásával. és egy alacsony toxikus fényérzékenyítő klór-e6 (Ce6), amely fokozza az immunadjuváns anti-PD-L1-mediált rák immunterápia daganatellenes hatékonyságát. Megmutatjuk, hogy a tervezett nanodrugok intelligens és jellegzetes „nyugalmi” jellemzőt tartalmaztak a kemoterápiás hatásban, a kívánt alacsonyabb citotoxicitás mellett, és számos kedvező terápiás tulajdonsággal rendelkeznek, beleértve a Ce6 csökkentett energiaréséből adódó jobb 1 O2 képződést, pH-érzékenységet, jó biológiai lebonthatóságot és biokompatibilitás, amely rendkívül hatékony, szinergikus fotokemoterápiát biztosít. Ezenkívül az anti-PD-L1 terápiával kombinálva mind a nano-összeállításon alapuló kemoterápia, mind a kemoterápia/fotodinamikus terápia (PDT) hatékonyan aktiválhatja a daganatellenes immunitást primer vagy távoli daganatok kezelésekor, potenciálisan vonzó lehetőségeket nyitva a klinikai immunterápia számára.

A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei

KULCSSZAVAK

Rák immunterápia; Nano-immunstimulánsok; Kemoterápiás nyugalmi állapot; Pro-drog; Önszerelés; Természetes kis molekula; Betulinsav; Fotodinamikus terápia

1. Bemutatkozás

A rák immunterápiája, mint például a PD-L1-et vagy CTLA-t-4 alkalmazó immunkontroll-blokkolási stratégia a rák leküzdésére a gazdaszervezet immunrendszerének aktiválásával, kétségtelenül forradalmasította a rákkezelést1,2. Sajnos a gyenge immunválasz és a nem hatékony terápiás hatások nagymértékben korlátozták klinikai kilátásait3,4. A közelmúltban végzett tanulmányok kimutatták, hogy az immunterápia más módszerekkel, például a kemoterápiával5, a fotodinamikus terápiával (PDT)6, a fototermikus terápiával (PTT)7 és a sugárterápiával8 kombinálva hatékonyan kiválthatja a daganatellenes immunogenitást azáltal, hogy a rákos sejteket immunogén sejthalálra készteti. ICD)9, amely arra utal, hogy az immunmoduláció képes aktiválni a tumorellenes immunválaszokat. Az immunterápiás stratégiák ezen szinergikus kombinációin alapuló számos innovatív nanoanyag-konstrukció jelentősen javította a rákellenes aktivitást, beleértve a szervetlen10, polimer11 és biomimetikus12 nanorészecskéket (NP-ket). A multifunkcionális biológiailag lebontható, biokompatibilis, alacsony toxicitású, de rendkívül hatékony és klinikailag hozzáférhető transzformált nano-immunstimulánsok kifejlesztése azonban továbbra is nagy kihívás és óriási kereslet. A természetes biológiai anyagok, mint a nukleinsavak13, fehérjék12, peptidek14,15 és kis molekulájú természetes termékek16,17 eredendő előnyeik (pl. biokompatibilitás, nem toxicitás) miatt jelentős kutatási érdeklődést váltottak ki az orvosi alkalmazásokban. Különösen az utóbbi években fedezték fel egymást követően az önszerveződő funkcióval rendelkező rákellenes bioaktív terpenoid természetes kis molekulákat (NSM-eket)18,19. Például a betulinsav (BA), az ergoszterol (ET) és az abietinsav (AA) önmagukban is összeállhat mikron- vagy nanoszerkezetű részecskékre. Ezek az NSM-ek vonzó építőelemek a szinergikus kemoterápia és a PDT daganatellenes szerek kifejlesztéséhez. Bebizonyosodott, hogy jelentős előnyökkel járnak az egyszerű nanogyártás, a jobb biokompatibilitás és a biológiai lebonthatóság, az alacsonyabb toxicitás és a májkárosodás csökkentése, valamint a tumorellenes terápia nagy szinergizmusa20e23. Ez ígéretes alternatívákat kínál a szinergikus immunterápia klinikailag elérhető, lefordítható nano-immunstimulánsainak kifejlesztéséhez. Azonban ezen NSM-ek általában erősebb lipofilitása nem hatékony celluláris endocitózishoz vezetett, ami gyengítette rákellenes aktivitásukat és korlátozta klinikai értéküket a rák kezelésében24. Az általánosan jelentett nanokompozitokhoz hasonlóan a megfelelő NSM nano-készítmények elősegítették a sejtfelvételt a kemoterápiás hatások fokozása érdekében, de akaratlanul is növelték a normál sejtekkel szembeni nem specifikus citotoxicitás kockázatát22. Ezért érdemes alaposan átgondolni, hogyan lehet maximalizálni a terpenoid NSM nano-ágensek rákellenes hatását, miközben minimalizálni kell a normál szövetekre gyakorolt ​​toxicitását, mint a szinergikus immunterápia folyamatának kulcsfontosságú kérdését.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

A pro-drog stratégiákat széles körben alkalmazták a lipofil kismolekulák sejtfelvételének javítására a hidrofilitás növelésével25. Általában az amfifil gyógyszerek különösen nagyobb sejtfelvételi hatékonysággal rendelkeznek, mint a hidrofil vagy lipofil gyógyszerek26. Minél magasabb a celluláris fagocitózis, annál jobb a terápiás hatékonyság24. Így az amfifil terpenoid NSM-ek pro-drog molekulák kifejlesztése potenciális módszer lehet terápiás hatásuk maximalizálására. Ezen túlmenően, az ingerekre érzékeny nanodrugok a specifikus tumor mikrokörnyezetére (pl. sav, redox válaszkészség) nagy ígéretet jelentenek a gyógyszerfelszabadulás szabályozásában, ami előnyös a kemoterápiás gyógyszerek citotoxicitásának visszaszorításában27, 28. Mindeközben a szupramolekuláris koasszemble (pl. reprecipitációs megközelítés) hatékony stratégia volt a vízben jól oldódó, hordozómentes nanodrugok előállítására22, 29, amely várhatóan némileg csökkenti az amfifil NSM-ek fagocitózis-hatékonyságát, ezáltal gyengíti a pre- tervezett citotoxicitás. Feltételezzük, hogy az ingerekre reagáló és teljesen hidrofil nanodrugokat az amfifil NSM-ek prodrugja alapján fejlesztették tovább, és hatékonyan képesek elnyomni a normál sejtek nem specifikus citotoxicitását, miközben serkentik az erősen toxikus amfifil NSM-ek tumorsejtekbe való felszabadulását, elősegítve azok nyugalmi állapotát a normál szövetekben és aktiváció a tumor helyén. Fontos a megfelelő vízoldható és ingerekre reagáló prekurzor kiválasztása a terpenoid NSM-ek módosításához amfifil pro-drog molekulák előállításához. A kitozán-oligoszacharidok (COS), mint a kitozán lebomlott termékei évek óta nemcsak jó vízoldékonysággal és bőséges eOH oreNH2-csoporttal rendelkeznek, amelyek jó pH-választ eredményeznek, hanem jótékony daganatellenes hatással is rendelkeznek azáltal, hogy az aktivitás szabályozásán keresztül fokozzák a gazdaszervezet immunfunkcióját. immunsejtek, például monocita makrofágok és limfociták30,31. Ezek garantálják az ingerekre reagáló cél nano immunstimulánsok létrehozásának óriási lehetőségét a szinergikus immunterápia számára.

Itt, a fenti megfontolások alapján, kísérleti tervünkben a betulinsav (BA) pentaciklusos triterpén NSM-jét használjuk erős rákellenes szerként32, a COS-t pedig egy amfifil COS-BA molekula szintézisére vezették be a kemoterápiás hatás javítása érdekében. A klór e6 (Ce6), egy széles körben alkalmazott fényérzékenyítő, nagyon alacsony/nem sötét toxicitású33, egy teljesen vízoldható hordozómentes fényérzékeny prodrug COS-BA/Ce6 NP megalkotására alkalmazták közvetlen ko-összeállítási stratégia alkalmazásával. A COS-BA/Ce6 NP-k két terápiás módot, a kemoterápiát és a fotodinamikus terápiát (PDT) kombinálták, amelyek hatékonyan növelhetik a tumor eredetű antigének T-sejtek számára történő bemutatását, robusztus immunológiai válaszokat generálva egy immunadjuváns anti-PD-L1 segítségével. nagyon hatékony és szinergikus daganatellenes kemoterápia/PDT/immunterápia előidézésére (1. séma). A módosított COS-BA/Ce6 NP-k intelligens nyugalmi funkciót mutattak, alattomos kemoterápiás hatásokkal, azaz a nem besugárzott, együtt összeállított NP-k jelentős mértékben gátolták az in vitro citotoxicitást az amfifil COS-BA-hoz képest, akár rák, akár normál sejtek ellen. A jellegzetes pH-érzékeny viselkedésnek tulajdonítható, hogy in vivo alacsony toxicitást és biológiai biztonságot nyújt a normál szövetek számára, de erősen toxikus a daganatszövetre, mivel a hiperaktív COS-BA stimuláló felszabadulását a gyengén savas tumor mikrokörnyezetében magyarázza34. Legjobb tudomásunk szerint jelenleg még mindig ritkán számolnak be a tervezett nanogyógyszerekről, amelyek ezt a kemoterápiás nyugalmi funkciót hordozzák. Eközben a nanodrug számos kedvező terápiás tulajdonsággal rendelkezik, mint például a Ce6 energiarésének (DEST) csökkentésével javított 1 O2 képződés, a gyors biológiai anyagcsere és a fokozott tumor felhalmozódás, ami a kemoterápia és a PDT kezelés hatékony és biztonságos daganatellenes kombinációjához vezetett. Ennél is fontosabb, hogy mind az NP-alapú kemoterápia, mind a kemoterápiás/PDT rendszerek hatékonyan aktiválhatják a daganatellenes immunitást azáltal, hogy elősegítik a TNF-a-t és IFN-g-t termelő CD8þ T-sejtek proliferációját primer vagy távoli daganatokban. Javasolt biológiailag lebomló, biokompatibilis, egyedülállóan nyugalmi állapotú, biológiailag biztonságos és rendkívül hatékony fotokemoterápiás nano-gyógyszerünk jelentős szisztémás immunterápiás válaszokat ér el, vonzó klinikai alkalmazási lehetőségeket nyitva a távoli vagy metasztatikus rákterápia kezelésében.

1. séma A PDT és az együtt összeállított COS-BA/Ce6 NP-k kemoterápiája felerősítette az anti-PD-L1-et, hogy szisztémás tumorellenes immunterápiát indukáljon. A vízoldható COS bevezetése hatékonyan fokozhatja a BA (félkardként ábrázolt) kemoterápiás aktivitását, ami hiperaktív COS-BA amfifil prodrugot (hosszú kardot) eredményez. A Ce6 fényérzékenyítő szerrel (hüvely) együtt összeszerelve a héjszerkezetű és pH-érzékeny nanoszerelvények intelligens és jellegzetes „nyugalmi” funkcióval rendelkeztek, gátolva a normál szövetekre gyakorolt ​​kemoterápiás toxicitást. De amint megérkezik és a savas (Hþ) tumor mikrokörnyezet stimulálja, a rendkívül aktív amfifil prodrug, a COS-BA felszabadul, ami jelentős kemoterápiát eredményez. Ezen túlmenően, a megszerkesztett társszerelvények kiváló PDT aktivitást mutattak, fokozott szingulett oxigén (1 O2) képződéssel, amelyet a Ce6 szingulett és triplett gerjesztett állapota (DEST) közötti csökkentett energiarés indukált. Egy anti-PD-L1 ellenőrzőpont blokáddal kombinálva a tumorhoz kapcsolódó antigének felszabadulása a kemoterápia/PDT kezelés után hatékonyan aktiválhatja a szisztémás daganatellenes immunválaszt a távoli rák immunterápiájában.

2. Anyagok és módszerek

2.1. A COS-BA szintézise

Betulinsav (40 mg, 0,1 mmol), EDC (38 mg, 0,2 mmol) és NHS (17 mg, 0,15 mmol) 3 ml N,N-dimetil-formamidban (DMF) oldottuk. Szobahőmérsékleten 3 0 perces keverés után óvatosan cseppenként 96 mg COS vizes oldatot (1 ml) csepegtettünk az elegyhez, és 24 órán át kevertük. Ezután a reakcióelegyet CH2Cl2-vel hígítjuk, és többször extraháljuk. A CH 2CI 2 réteget bepároljuk, és szilikagél oszlopon tisztítjuk. Az el nem reagált BA-t kezdetben petroléter:aceton (5:1, v/v) eleggyel eltávolítottuk, majd 3:1-re változtattuk, így fehér COS-BA-t kaptunk (kitermelés: 42%), ahol a COS-t dimerként azonosították. n Z 2). 1H-NMR (4{66}}{{7{74}}} MHz, CDC13) d: 8,98 (1H, s, BA-28O]CeNH), 4,73 (1H, s, H -29a), 4,60 (1H, s, H-29b), 3,18 (1H, dd, JZ 4,8, 10,8 Hz, H-3), 2,95e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, s, CH3eCOS), 0,76 (3H, s, H{61}}), 0,83 (3H, s, H{65}}), 0,90 (3H, s, H{ 0,97 (3H, s, H{73}}), 0,98 (3H, s, H{77}}), 1,70 (3H, s, H{81}}). 13C-NMR (100 MHz, CDC13) d: 179,18 (CO, COS), 156,43 (C{89}}), 150,97 (C{92}}), 109,03 (C{95}}), 78,74, 77,04 , 69,32, 69,22, 65,25, 58,14, 55,62, 55,21, 53,65, 53,22, 50,52, 45,96, 44,32, 44,11, 41,85, 44,11, 41,85, 38.3.58, 38.3.58 04, 36,39, 35,31, 34,21, 31,81, 31,54, 31,17, 30,28 , 29,09, 27,80, 27,22, 25,74, 25,53, 20,91, 19,48, 18,12, 16,02, 15,87, 15,17, 14,65, 14,62. ESIeMS m/z: 814,5871 [M‒6H] (C44H72N2O12).

2.2. COS-BA/Ce6 NP-k előállítása

A közösen összeállított COS-BA/Ce6 NP-ket egylépéses újrakicsapásos módszerrel állítottuk elő. Általában először 5 ml Ce6 (33 mmol/l) és 40 ml COS-BA (33 mmol/L) DMSO oldatot kevertek össze. Ezt követően a keveréket gyorsan 1 ml vízbe fecskendezték, amely 10 ml NaOH-t (50 mmol/L) tartalmazott ultrahangos kezelés mellett (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, Kína). 10 perces ultrahangos kezelés után a COS-BA/Ce6 NP-ket 13, 000 fordulat/perc (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, Kína) 25 perces centrifugálással kaptuk. Más, eltérő COS-BA/Ce6 arányú készítményeket ugyanezzel az eljárással állítottunk elő állandó 3:1 NaOH/Ce6 mólarány mellett.

2.3. Sejtvonalak

A humán MCF-7, HepG2, LO2 és egér 4T1, L929 sejtvonalakat az Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS, CAS (Kína) biztosítja. Az MCF-7, HepG2 és LO2 10% borjúmagzati szérumot (FBS, Gibco) és 1% penicillin-sztreptomicin antibiotikumot (Life Technology, USA) tartalmazó DMEM táptalajban tenyésztettük 37 °C-on. A 4T1-et és az L929-et RMPI-1640 médium a fentiekkel megegyező arányban.

2.4. A sejtfelvétel és az endocitikus útvonalak vizsgálata

A sejtfelvétel vizsgálatához a 4T1 vagy LO2 sejteket szabad Ce6 vagy COS-BA/Ce6 NP-kkel inkubáltuk (Ce6 ekvivalens koncentrációja: 1,7 mg/ml, COS-BA: 19,5 mg/mL, BA: 10 .8 mg/mL) különböző időpontokban. Mosás, rögzítés és DIPA (#D9542, Sigma) festés után a sejteket fluoreszcens inverz mikroszkóppal (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, Kína) leképeztük. A fluoreszcencia intenzitását áramlási citometriával határoztuk meg a Guava EasyCyte mini rendszerrel (Merck Millipore, Németország). A felvétel hatékonyságának számszerűsítésére a BA és a COS-BA sejtekben történő felhalmozódását HPLC-vel (Agilent 1200, USA) mértük. A 4T1 sejteket jellemzően szabad COS-BA-val vagy BA-val (egyenértékű BA: 25 mg/ml) kezeltük 0,5 és 3 órán keresztül. PBS-sel történő mosás után a sejtpelleteket összegyűjtöttük, és ultrahangos homogenizálásnak vetették alá (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, Kína) a sejtlízis céljából. Ezután a COS-BA-t vagy a BA-t kloroformmal extraháltuk HPLC analízishez a minták liofilizálása után. A mozgófázis víz (0,2%-os foszforsav) és acetonitril volt 1,0 ml/perc áramlási sebesség mellett, és a megfelelő térfogatarányok 60:40 és 15:85 (v/v) voltak a COS-BA és BA elemzéséhez. . A detektálási hullámhossz 213 nm volt. A COS-BA/Ce6 NP-k endocitikus útvonalainak vizsgálatához a 4T1 sejteket 6-lyuklemezekre oltottuk, és 24 órán át inkubáltuk, majd 30 percig különféle endocitózisgátlókkal, köztük mikropinocitózis-gátlóval [50 mmol/l, előkezelték őket. , etil-izopropil-amilorid (EIPA) (#N132356, Aladdin)], klatrin által közvetített endocitózis-gátló [20 mmol/L, klórpromazin (#C7010, Solarbio)], caveolae által közvetített endocitózis-gátló [25 mmol/L, nystatin ( #IN0260, Solarbio)] és lizoszómás savanyodást gátló [50 mmol/L, klorokin-foszfát (#C9720, Solarbio)]35. Ezután a sejteket tovább tenyésztettük 2 ml COS-BA/Ce6 NP-vel (Ce6: 1,7 mg/ml, COS-BA: 19,5 mg/ml) 2 órán keresztül, és FIM-mel (UP Optotech) leképeztük. Az endocitikus inhibitor nélkül 37 C-on inkubált sejteket kontrollként és alacsony hőmérsékletű inkubációra (4 C) állítottuk be az energiafüggő endocitózis értékelésére. Eközben a sejtek átlagos fluoreszcencia intenzitását áramlási citometriával is meghatároztuk.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Citotoxicitási vizsgálat

A 4T1 sejteket egy 96-lyukú lemezre oltottuk. Ezután a sejteket különböző koncentrációjú COS-BA NP-kkel kezeltük 24 órán keresztül. Ezután 10 ml MTT (#M158055, Aladdin) festéket (5 mg/ml) adtunk a lyukba, és további 4 órán át inkubáltuk, majd 150 ml DMSO-t adtunk hozzá a formazán kristályok feloldásához. . Mindegyik lyuk abszorbanciáját 492 nm-en mikrolemez-leolvasóval rögzítettük. A besugárzott csoport esetében a sejteket 4 órán át gyógyszerekkel kezeltük, majd 10 percig 675  10 nm-es fénnyel besugároztuk, és további 20 órán át inkubáltuk. A COS-BA/Ce6 NP-k citotoxicitása (1 mg/ml Ce6 11,5 mg/ml COS-BA-nak és 6,4 mg/ml BA-nak felel meg) más sejtekkel szemben (MCF-7, HepG2, LO2 és L929) ugyanazzal az MTT-teszttel, csak más táptalajjal határozták meg. Eközben a kombinációs indexet a CompuSyn 2.0 szoftver számította ki Chou Talalay tételszámítással36.

2.6. Állatmodellek

Minden kísérleti eljárást a Harbin Medical University Animal Care and Use Committee által jóváhagyott protokollok szerint hajtottak végre. A 4T1 sejteket RMPI-1640 tápközegben szuszpendáltuk, és szubkután injektáltuk minden nőstény BALB/c egér (18e22 g, 6e7 hetes) jobb hátába.

2.7. In/ex vivo fluoreszcens képalkotás

200 ml COS-BA/Ce6 NPs 5%-os glükózoldatot (ekvivalens Ce6: 0,35 mg/ml, COS-BA: 4,02 mg/ml) injektáltunk a farokvénán keresztül daganatos egerekbe. Ezt követően a tumorhelyek előre meghatározott időpontban történő fluoreszcens leképezését egy AniView 100/600 többmodell in vivo állati képalkotó rendszerrel (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Kína) 630 nm-es gerjesztéssel végeztük. 24 órával az injekció beadása után a főbb szerveket (szív, máj, lép, tüdő és vese) és a daganatot összegyűjtöttük ex vivo fluoreszcens képalkotáshoz. Emellett értékeltük a tumorok és a főbb szervek ex vivo fluoreszcencia képét különböző időpontokban a Ce6 vagy COS-BA/Ce6 NP intravénás injekciója után.

2.8. In vivo kemoterápia/PDT

A 4T1-hordozó egereket (75e100 mm3) véletlenszerűen hat csoportra osztjuk (n Z 5): 1) 5%-os glükózoldat; 2) Ce6; 3) Ce6 besugárzással; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, ahol BA: 22,3 mg/kg); 5) COS-BA/Ce6 NP-k; 6) COS-BA/Ce6 NP-k besugárzással. Mindegyik csoportban az egereket 200 ml COS-BA/Ce6 NP-vel (egyenértékű Ce6: 3,5 mg/testtömeg kg) fecskendezzük be a farokvénán keresztül a 0., 2. és 4. napon. A besugárzott csoportok esetében 4 órával Minden beadás után az összes egeret elaltattuk izofluránnal, és a tumor helyeit 675  10 nm (150 mW/cm2) fénnyel sugároztuk be 15 percig. Az egerek tumortérfogatát és testtömegét is minden második napon rögzítjük. A tumor térfogatát a következő képlettel számítjuk ki: VZ szélesség2 hosszúság/2. 14 napos kezelés után a daganatokat kivágtuk és súlyoztuk, hogy kiszámítsuk a tumorgátlási arányt (TIR) ​​az általánosan használt egyenlettel: TIRZ (1 minta/kontroll) 100%. Ahol a minta és a kontroll az egyes kezelt csoportok átlagos tumortömege, illetve az 5%-os vizes glükóz oldatos csoport átlagos tumortömege volt.

2.9. In vivo kemoterápia/PDT/immunterápia

A COS-BA/Ce6 NP-k immunterápiával kombinált potenciáljának bemutatására a kétoldali tumormodellt 4T1 sejtek szubkután injektálásával a bal és jobb oldali szárnyakba terveztük. Amikor a daganatok megközelítették a 75e100 mm3-t, az egereket öt csoportra osztották. (1) ellenőrzés; (2) COS-BA/Ce6 NP-k (COS-BAZ 40,2 mg/kg, ahol BAZ 22,3 mg/kg); (3) COS-BA/Ce6 NPs þ fény; (4) COS-BA/Ce6 NP-k þ anti-PDL1; (5) COS-BA/Ce6 NP-k þ anti-PD-L1 þ fény. A 0. napon 200 ml 5%-os glükózoldatot (1. csoport) vagy COS-BA/Ce6 NP-ket (Ce6 Z 3,5 mg/kg) (2., 3., 4., 5. csoport) intravénásán injektáltunk egerekbe. Az injekció beadása után 4 órával a 3. és 4. csoport jobb daganatait 15 percig besugároztuk. Az egereket izofluránnal érzéstelenítettük, és az egyik oldalukra tekertük, hogy elkerüljük a bal oldali daganatok feltárását. Ezután anti-PD-L1 antitestet (BioXcell, termékszám: BE0101, klónszám: 10F.9G2) intravénásan injektáltunk a 4. és 5. csoportba tartozó egerekbe a 2., 4. és 6. napon (15 mg egérenként injekciónként). Az egyes daganatok hosszát és szélességét minden második napon ellenőriztük. 14 napos kezelés után az egerek vérszérumát összegyűjtöttük az interferon-gamma (IFN-g) (#KMC4021) és a tumornekrózis faktor (TNF-a) (#BMS607-3) ELISA teszt (eBioscience) segítségével. ). A daganatokat összegyűjtöttük, disszociáltuk, vörösvérsejt-lízis pufferrel kezeltük, és PBS-sel mostuk centrifugálással. Ezután a sejtszuszpenziót anti-CD3-FITC-vel (#MA1-10187, 145-2C11 klón, eBioscience) és anti-CD8a-PE-vel (#12-0081-85) festették, klón 53-6.7, eBioscience). Ezt követően a citotoxikus T-limfocita (CTL) infiltrációt a jobb és a bal tumorokban különböző kezelések után áramlási citometriával értékeltük.

3. Eredmények és megbeszélés

3.1. COS-BA/Ce6 NP-k szintézise, ​​előállítása és jellemzése

Ebben a tanulmányban egy új, vízben oldódó kitozán-oligoszacharidon (COS) alapuló kis molekulájú COS-BA prodrugot tervezünk, amely növelheti a pentaciklusos triterpén-betulinsav (BA) kemoterápiás aktivitását azáltal, hogy javítja a sejtfelvételt a hidrofilitás növelése révén. Az itt alkalmazott COS-t (polimerizációs fok, DP: 2e6) a korábban leírt módszerünkkel állítottuk elő30. Ezután a COS-BA-t dehidratációs kondenzációs reakcióval szintetizálták. A COS főkomponens-analízisével kombinálva a COS-BA kémiai szerkezetét diszachariddal (DP:2) módosított BA-nak tartották (S1. ábra alátámasztó információ), amit1H-NMR, 13C-NMR és ESIeMS igazolt. (Támogató információ: S2eS4. ábra). A reprezentatív 1H-NMR analízise a COS különálló protonjelét 2,64e3,93 ppm körül és a BA C]CH2 csúcsait (4,60, 4,73 ppm) mutatja, ami a COS-BA sikeres szintézisét mutatja (1A. ábra). A COS-BA/Ce6 NP-k összeillesztett szinergista daganatellenes reagenseinek előállításához sokoldalú újrakicsapási megközelítést alkalmaztunk egy rendkívül hatékony Ce6 fényérzékenyítővel együttműködve. A kezdeti mólarány megváltoztatásával mindkét COS-BA/Ce6 együttes összeállítású készítmény modulált méretű gömb alakú nanostruktúrákat hozhat létre (1B. ábra és S5. ábra). A COS-BA/Ce6 különböző bemeneti arányai között a COS-BA/Ce6 NP-k hidrofil átmérője közel 200e300 nm volt negatív z-potenciál mellett. Tekintettel arra, hogy a 8:1 arányban elkészített NP-k alacsonyabb polidiszperzitási indexet (PDI, 0,143) mutattak viszonylag kisebb méret mellett (249 nm), megfelelő mennyiségű COS-BA kemoterápiás szerre is szükség volt a kombinatorikus kezeléshez. Ezért a következő vizsgálathoz a COS-BA/Ce6 (8:1) készítményeit választottuk. Ezen optimalizálás során a COS-BA/Ce6 NP-k szűk méreteloszlást (1C. ábra) és jó vízoldhatóságot mutattak, ami kolloid jellegét jelzi (1D. ábra). A sikeres együttes összeszerelés mögött meghúzódó okok feltárása érdekében a szabad COS-BA elsődleges önszerveződési viselkedését pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) vizsgáltuk (1E. ábra), ami arra utalt, hogy a COS-BA rendkívül egyenletes nano-maximumokat képezhet. w168 nm-es gömb, ami arra utal, hogy a COS kémiai módosítása nem változtatja meg magának a BA-nak az önszerveződő képességét (S6 ábra alátámasztó információ). Ez az a tulajdonság, amely végül indukálja a társszerelvények sikeres felépítését. Nevezetesen, a transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) igazolt szilárd nanoszerkezeten kívül a COS-BA/Ce6 NP-k különálló héjszerkezet-mentes COS-BA NP-ket mutattak, és az átlagos héjvastagság körülbelül 2,35 nm volt. A másik fizikai-kémiai jellemzést az 1F. ábra foglalja össze. Emellett a COS-BA/Ce6 NP-k 5,38 mV negatív z-potenciált és w249 nm hidrodinamikai méretet mutattak, ami nagyobb, mint a SEM-ből (w182 nm). Ezzel egyidejűleg a Ce6 töltési és kapszulázási hatékonysága 8,1, illetve 96% volt, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) meghatározva. Ezenkívül az FT-IR adatok (1G. ábra) tovább erősítették ezt az összeállítást, mivel a COS-BA/Ce6 NP-k a Ce6 jellegzetes C]N, CeN és C]CH csúcsait mutatták, amelyek 1633, 1078 és 633 cm 1 -nél jelentek meg. , ill.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

3.2. Együtt szerelt mechanizmus és a héjszerkezet kialakulása

Ezt követően, hogy jobban megértsük az összeszerelési mechanizmust, először az NP-k elsődleges képződési folyamatát vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy a COS-BA és a Ce6 együttes összeillesztése spontán lehet, mert ez a két faj gömb alakú nanoszerkezetet is alkothat, még akkor is, ha ultrahangos kezelés nélkül (S7 ábra). Ennek oka lehet a negatív Gibbs-szabadenergia-változás (DG). ) közös összeállításokban37. Ez a spontán összeállítás a COS-BA és a Ce6 közötti erősebb intermolekuláris kölcsönhatásra is utalt. Általában a szupramolekuláris ön- (vagy társ-) szerelvényekben az intermolekuláris kölcsönhatások nem kovalens p-p-halmozódás, hidrogénkötés és van der Waals erők 38, 39. Ehhez az elemzéshez megvizsgáltuk a COS-BA/Ce6 NP-k UV-abszorpcióját (1H és F ábra), ami vöröseltolódású Soret (410 nm) és Qy (667 nm) sávra utalt a szabad Ce6 (405, illetve 665 nm). Mindeközben a COS-BA szignifikáns vöröseltolódásos karakterisztikus abszorpciója is megtalálható, ami a COS-BA és a Ce640 közötti lehetséges intermolekuláris pp halmozódásra utal. Ezenkívül a felületaktív nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS, 0,2 tömeg/térfogat%-os) való inkubálás után (S8 ábra alátámasztó információ) a COS-BA/Ce6 NP-k újonnan kék eltolódású Qy-sávot mutattak 641 nm-en, és drámaian helyreállított fluoreszcenciát mutattak. hogy a hidrofób kölcsönhatások is hozzájárultak az együttálláshoz28. Mivel ezek az asszociatív nemkovalens kölcsönhatások, a ko-összeállítások figyelemreméltó fluoreszcencia-kioltást (98,2%) mutattak vízben (1. ábra). Összességében ésszerű azt hinni, hogy a p‒p halmozás és a hidrofób kölcsönhatások lehetnek a fő hajtóerői a társszerelvények felépítésében. Ezt követően az összeszerelési folyamat intuitívabb megjelenítése és a héjszerkezetű NP-k kialakulásának hátterében álló okok feltárása érdekében egy egyszerűsített molekuláris dinamikai (MD) szimulációs modellt hajtottunk végre, amely 16 optimalizált COS-BA molekulát és további két Ce6-ot tartalmazott egy vizesdobozban. . Kezdetben kiértékeltük a COS-BA önszerelvények lehetséges kölcsönhatását/kötését a szimulációs idő 5 ns-án belül (2A. ábra és S9. ábra). Azt találtuk, hogy a COS-frakcióban található számos intramolekuláris hidrogénkötés kivételével több pár intermolekuláris H-kötés is megfigyelhető a COS-BA között (2B. ábra és alátámasztó információ: S10. ábra), ami azt jelzi, hogy a hidrogénkötés lehet egy a COS-BA NP-k kialakulásának fő hajtóereje. Különösen érdekes, hogy a COS-BA önszerelvényekben az összes COS-BA molekula látszólag szimmetrikus szerkezetet alkot (2C. ábra). Ez a lenyűgöző jelenség motivált bennünket, hogy feltárjuk e tulajdonság és a héjszerkezetű COSBA NP-k kialakulása közötti lehetséges kapcsolatot. Ezután megpróbáltuk bővíteni a doboz egységeit. Meglepő módon a COS-BA molekulákból álló, összekapcsolt dobozok szabályos módon voltak elrendezve, ami "ortogonális" üreges hálózati struktúrákat eredményezett (S11 ábra). Ennél is fontosabb, hogy véletlenszerűen kiszámítottuk a héjmolekulák vastagságát, és azt találtuk, hogy összhangban vannak a TEM-mel (w2,35 nm) (2D. ábra). Ez az üreges hálózati struktúrák kialakítására való hajlam felelős lehet a héjszerkezetű NP-k kialakulásáért. Ennek az ötletnek a tesztelésére a COS-BA/Ce6 társszerelvények MD struktúráját szimulálták (2E ábra és támogató információk S12 ábra). A COS-BA önszerelvényekhez hasonlóan nagyszámú intramolekuláris és intermolekuláris H-kötést is találtak a társszerelvényekben (2F ábra és kiegészítő információk S13 ábra). Ezenkívül a COS-BA C]C és a Ce6 aromás gyűrűje közötti lehetséges pp-halmozást figyelték meg a társszerelvényekben (2G. ábra), ami összhangban van a korábbi UV-vizsgálatok adataival. A dobozok számának bővítése után hasonló üreges hálózati struktúrák továbbra is megtalálhatók, csak csökkentett szabályossággal és ortogonalitással (Támogató információ S14. ábra). Ez lehet az oka annak, hogy a COS-BA/Ce6 NP-k morfológiája nem egységes a COSBA NP-ekhez képest. Ezenkívül a molekuláris héj-réteg távolság is közel van az NP-k héjvastagságához (w2,35 nm), amint azt a TEM segítségével látjuk (2H ábra). Összességében azt feltételeztük, hogy a héjszerkezetű COS-BA/Ce6 NP-k vagy COS-BA NP-k kialakulása nagyrészt a molekulák ezen tendenciájának tulajdonítható, hogy üreges héjhálózati struktúrákká gyűljenek össze.

1. ábra Kitozán oligoszacharidokkal módosított betulinsav (COS-BA) prodrug által közvetített COS-BA/Ce6 NP-k előállítása és jellemzése. (A) A COS-BA1H-NMR felerősített kulcspozíciói. (B) Különféle COS-BA/Ce6 arányú, együtt összeállított COS-BA/Ce6 NP-k készítése. (C) A COS-BA/Ce6 NP-k méret szerinti eloszlása ​​COS-BA és Ce6 (mólarány, 8:1) építőelemként történő felhasználásával. (D) Az együtt-összeállítások vízoldhatósága és Tyndall-hatása kolloid jelleget jelez. (E) SEM és TEM képek ingyenes COS-BA önszerelvényekről és együtt összeszerelt COS-BA/Ce6 NP-kről. (F) A COS-BA/Ce6 NP-k fizikai-kémiai tulajdonságainak összefoglalása. (G) FT-IR spektrumok, (H) UV Vis spektrumok és (I) fluoreszcencia emissziós spektrumok a szabad Ce6, COS-BA és az együtt összeállított COS-BA/Ce6 NP-k vízben.

2. ábra (A) COS-BA önszerelvények és (E) együtt összeszerelt COS-BA/Ce6 NP-k szerkezete molekuláris dinamikai (MD) szimuláció után 5 ns-ig 8:1 szerkezeti egység mólarány mellett (COS-BA) /Ce6, a Ce6 terhelési hatékonyság alapján számítva). A vonalmodellt H2O-ra használták, a rúdmodellek pedig COS-BA vagy Ce6 molekulákat képviselnek, ahol a Ce6 C atomjai lilával vannak jelölve. A hidrogénkötés információ a COS-BA molekulák között (B) önszerelvényeiben és (F) COS-BA/Ce6 NP-ek társszerelvényeiben. (C) A COS-BA molekuláris elrendezés látszólag szimmetrikus szerkezete MD szimuláció után. (G) A COS-BA és a Ce6 közötti lehetséges molekuláris kölcsönhatások potenciális pp halmozást mutatnak. A héjmolekulák jelzett vastagsága egy "ortogonális" üreges hálózati struktúrában a (D) szabad COSBA önszerelvények és a (H) COS-BA/Ce6 NP társszerelvények megfelelő MD dobozainak kiterjesztése után.

3.3. A fokozott 1 O2 generáció energiamechanizmusa

Ezt követően DPBF (1,3-difenil-izobenzofurán) szondaként tovább vizsgáltuk a szingulett oxigén (1 O2) képződését, amely a PDT teljesítmény egyik kritikus reaktív oxigénfajtája (ROS). A COS-BA/Ce6 NP-k keverékoldatainak DPBF-fel történő tartós besugárzása után a DPBF UV-abszorpciójának intenzitása csökkent, ami 1 O2-képződést jelez (3A. ábra). A metilénkék (MB) referenciaanyaggal való összehasonlítás után a COS-BA/Ce6 NP-k F ( 1 O2) értékét 0,26-ként számították ki, ami valamivel magasabb, mint a szabad Ce6 (FZ0.19). (3B. ábra). Általában a fotoszenzibilizátorok által elnyelt energia három relaxációs útvonalon megy keresztül, amelyek magukban foglalják a fluoreszcenciát, a fűtőhatást a vibrációs relaxáción keresztül és a ROS-generációt egy rendszerközi kereszteződésen (ISC) keresztül41. A jelentősen kioltott fluoreszcencia-emissziónak megfelelően a COS-BA/Ce6 NP-k sem javítottak semmilyen melegítő hatást a vízben (S15 ábra alátámasztó információ), ami fokozott ISC-folyamatot jelentett a Ce6 és a COS-BA együttes összeszerelése után, ami így vezet a továbbfejlesztett 1 O2 generációhoz. Az ilyen hatás molekuláris mechanizmusának további tisztázása érdekében megkíséreltük optimalizálni és kiszámítani a COS-BA/Ce6 lehetséges egymolekulás modelljét, amely a sűrűségfunkcionális elmélettel (DFT) végzett MD szimulációból nyert potenciális pp halmozásból áll (3C. ábra). . Meglepő módon a COS-BA/Ce6 megfigyelhető vöröseltolódású UV-abszorpciója 581,24 nm, mint a szabad Ce6é (579,30 nm), ami a pp halmozás előfordulását jelzi (3D. ábra). Bár a COS-BA/Ce6 energiaminimalizált geometriája enyhe szerkezeti különbségeket mutatott a bevitt MD konfigurációval, a COS-BA C]C vagy C]O kötései és a Ce6 porfingyűrűje közötti megkülönböztető pstacking továbbra is megfigyelhető volt, ami tovább igazolja, hogy a p‒p feletti halmozás lehetséges. Mindeközben a közelmúltban bebizonyosodott, hogy a p‒p halmozással megnövekedett elektron adományozási hatékonyság elősegítheti az ISC folyamatot42, míg az ISC sebesség (KISC) arányos (1/DEST) 2,43-mal. Vagyis a fényérzékenyítő alacsonyabb energiarés (DEST) fokozza az ISC folyamatot, amely elősegíti a hatékony ROS-generálást. Ezt követően kiszámítjuk a Ce6 és a COS-BA/Ce6 legalacsonyabb gerjesztett szingulett állapotát (S1) és triplett állapotát (T1) (3E. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a COS-BA/Ce6 1,1892 eV-tal csökkent DEST értéket mutatott a szabad Ce6-hoz (1,2001 eV) képest, ami megerősíti a fokozott ISC folyamatot. A DEST csökkentése hasznos az 1 O2 termelésben, amit más nanofotoszenzibilizátoroknál is igazoltak44. Összességében úgy tűnik, hogy a p-stacking csökkenti a Ce6 DEST-értékét a COS-BA-val való együttes összeszerelés után, így jobb 1 O2-generációhoz vezet.

3. ábra A COS-BA/Ce6 NP-k által kiváltott javított 1 O2 képződés energiamechanizmusa. (A) Az 1,3-difenil-izobenzofurán (DPBF) fotodekompozíciójának UV Vis spektrumai COS-BA/Ce6 NP-k hosszan tartó besugárzása után. (B) A DPBF UV-abszorpciós változásainak (DOD) elsőrendű diagramjain az 1 O2 hozamot DMSO-ban készült metilénkéket (MB) (FZ 0.52) használtuk referenciavegyületként. (C) Egy lehetséges egymolekulás COS-BA/Ce6 modell energiaminimalizált szerkezetei oldalról és elölről nézve, amelyet a Ce6 és COS-BA közötti kezdeti molekuláris konfiguráció szerint kaptunk MD szimulációt követően és DFT számításokat követően. (D) A szabad Ce6 és egy optimalizált COS-BA/Ce6 modell előrejelzett UV Vis-abszorpciós spektrumátmenetei (függőleges oszlopok). (E) A legalacsonyabb gerjesztett szingulett állapotuk (S1) és legalacsonyabb triplettállapotuk (T1) számított energiaszintjei [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Ahol a DEST-et ES1 ET1-ként számították ki.

3.4. A kemoterápia nyugalmi jellemzői

Ezt követően a jelen tanulmányban szereplő tervezési koncepció érvényesítése, miszerint az amfifil COS-BA molekula kifejlesztése hatékonyan növelheti a BA terápiás hatását azáltal, hogy javítja a sejtfelvételt a hidrofilitás növelése révén, és közben további ingerekre reagáló és teljesen hidrofil COS-BA/Ce6 konstruál. Az NP-k elősegítették a nyugalmi állapotát a normál szövetekben és az aktiválódást a daganatos helyeken. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez először a COS-BA/Ce6 NP-k gyógyszerkibocsátási viselkedését vizsgáltuk különböző pufferoldatokban (4A. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a COS-BA/Ce6 NP-k pH-érzékeny viselkedést mutattak, és a kumulatív Ce6 felszabadulás 5,6 pH mellett 88%, pH 7,4 mellett 57% volt 24 óra elteltével. Ez a tulajdonság valószínűleg a COS-BA/Ce6 NP-kben a savas Hþ45 bevezetése után létező számos hidrogénkötés megsemmisüléséből fakadt, ami a Ce6 fokozott felszabadulásához vezetett (4B. ábra). Ezt tovább erősítette a COS-BA/Ce6 NP-k szétszerelése, miután közvetlenül savas környezetben inkubáltuk őket (4C. ábra). Ez a pH-érzékeny tulajdonság előnyös lehet egy hatékony daganatellenes terápia szempontjából a gyengén savas tumor mikrokörnyezet miatt34. Eközben a COS-BA/Ce6 NP-k stabilitása jobb volt, mivel nem volt megfigyelhető jelentős méret- vagy PDI-változás a PBS-ben és az 1640-RMPI sejttenyésztő tápközegben 10 napig történő inkubálás után (S16. ábra alátámasztó információ), ami fontos lenne. további orvosbiológiai alkalmazásokban való lehetséges felhasználásuk miatt. Ezt követően további vizsgálatokat végeztünk a szabad lipofil BA (érintkezési szög q: 133,3 ) és az amfifil COS-BA (q: 52 ) citotoxicitásának értékelésével (4D. ábra) standard metil-tiazolil-difenil-tetrazolium-bromid (MTT) assays segítségével. Amint azt előre jeleztük, akár a 4T1 rákos sejtek, akár a normál LO2 hepatociták esetében az egyes COS-nek lényegében nincs rákellenes aktivitása viszonylag alacsony dózisok mellett. Ennek oka lehet, hogy a COS proliferációt gátló hatása csak magas koncentrációban (körülbelül milligramm szinten) aktiválódik az NF-kB jelátviteli útvonal indukálásával30. Míg a COS-BA rendkívül alacsony IC50-értékekkel (6,03 mg/ml 4T1 és 9,92 mg/ml LO2 esetén) jelentősen megnövelt citotoxicitást fejt ki a BA-éhoz (17,63 mg/ml 4T1 és 20,53 mg/ml LO2 esetén) képest. azonos tömegkoncentrációk mellett (4E és J ábra). A kapott eredmények azt sugallták, hogy a vízoldható COS módosítása nagymértékben növeli a lipofil BA sejtfelvételi hatékonyságát, így a COS-BA erős rákellenes aktivitásához vezet. A felvétel hatékonyságának számszerűsítésére a BA vagy COS-BA felhalmozódását a 4T1 sejtekben közvetlenül HPLC-vel határoztuk meg (S17. ábra). Az eredmények egyértelműen alátámasztották, hogy az amfifil COS-BA szignifikánsan magasabb felvételt mutat, mint a szabad BA (körülbelül 3{70}}szerese 3 órás inkubáció után), ami a COS-BA fokozott kemoterápiás aktivitását mutatja. A fenti következtetést tovább támasztotta az amfifil COSBA HepG2 és MCF{74}} rákos sejtekkel szembeni jelentősen megnövekedett citotoxicitása (S18. ábra alátámasztó információ), amelyek jól összhangban vannak a tervezési koncepcióval. A Ce6-tal való együttes összeszerelés után azt találtuk, hogy a besugárzás nélküli COS-BA/Ce6 NP-k a 4T1 rákos sejtekkel szemben az ekvivalens COS-BA-hoz képest figyelemreméltóan gátolt citotoxicitást mutatnak, különösen 11,5 mg/ml-nél, de az alapvető PDT aktivitás nem változott ( 4F ábra). A jelenség teljesebb validálása érdekében tovább vizsgáltuk a COS-BA/Ce6 NP-k in vitro citotoxicitását más rákos sejtekkel szemben, beleértve az MCF{88}}-t és a HepG2-t. Érdekes módon az amfifil COS-BA nagyon erősebb citotoxicitást mutatott MCF-7 sejtekkel szemben (4G. ábra), de a kemoterápiás aktivitás szignifikánsan csökkent a Ce6-tal, azaz a nem besugárzott COS-BA/Ce6 NP-kkel való együttes összeillesztés után. Hasonló eredményeket figyeltek meg a HepG2 sejtekben is, csak enyhe csökkenéssel (4H. ábra). A fenti következtetések további alátámasztására értékeltük a nano-szerelvények és a COS-BA kemoterápiás hatásait normál egér fibroblaszt L929 sejtekkel és humán LO2 hepatocitákkal szemben (4I. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy az összeállított COS-BA/Ce6 NP-k szignifikánsan csökkentették az eredeti, erősen toxikus amfifil hatóanyagot, a COS-BA-t, kiváló biokompatibilitást mutatva. A citotoxicitás elemzésével az amfifil COS-BA IC50-értékei szignifikánsan alacsonyabbak voltak, mint az együtt összeállított COS-BA/Ce6 NP-ké, függetlenül a rákos vagy normál sejtektől (4J. ábra). Ez azt jelenti, hogy a teljesen hidrofil és ingerekre érzékeny nano-koasszerelvények megalkotása hatékonyan elnyomhatja a COS-BA amfifil gyógyszer magas citotoxicitását. Figyelembe véve a jellegzetes pH-érzékeny tulajdonságot, úgy tűnik, hogy a COS-BA/Ce6 NP-k a normál szövetekben alvó állapotúak lesznek, a kívánt alacsony kemoterápiás toxicitás mellett, de aktívak a daganatos szövetekben, mivel serkentik a nagyon toxikus COS-BA felszabadulását a gyengén savas daganatban. mikrokörnyezet. Összességében, ellentétben a fokozott rákellenes hatással rendelkező kemoterápiás reagensek széles körben beszámolt neofunkcionalizálásával22, 23, az amfifil COS-BA által közvetített nanoszerelvények nemcsak intelligens "nyugalmi" jellemzőt mutatnak, alattomos kemoterápiás hatásokkal, hanem megtartják a speciális PDT aktivitást is, ami hatalmas potenciált mutat. az intelligens daganatellenes terápiához.

4. ábra (A) In vitro Ce6 felszabadulási profilok COS-BA/Ce6 NP-kből PBS-ben (pH 7,4, 6,5 vagy 5,6), amely Tween 80-ot (0,5 % v/v) tartalmaz 37 C. (B) A lehetséges pH-érzékeny mechanizmus, amely Hþ kiváltja az NP-k szétszerelését. (C) A COS-BA/Ce6 NP-k szétszerelése körülbelül pH 4.{45}} vízben végzett közvetlen inkubáció után. (D) A szabad BA, Ce6, COS-BA és COS-BA/Ce6 NP-k érintkezési szöge. (E) A szabad BA, COS és amfifil COS-BA sejt citotoxicitása a reprezentatív rákos 4T1 és normál LO2 sejtek ellen. Az (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 rákos sejtek életképessége szabad COS-BA, COS-BA/Ce6 NP-kkel, besugárzással vagy anélkül, a jelzett egyenértékű COS-BA koncentráció mellett történő inkubálás után 24 órán keresztül. (I) Szabad COS-BA, nem besugárzott COS-BA/Ce6 NP-k sejtcitotoxicitása normál LO2 és L929 sejtekkel szemben. (J) A COS-BA IC50 elemzése a rák és a normál sejtek ellen. Az adatokat SD (n Z 6) átlagban fejezzük ki. *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 és ***P ˂ 0,001 mutatja a szignifikáns különbségeket.

A kemoterápiás nyugalmi jellemző mögött meghúzódó lehetséges okok feltárása érdekében a COS-BA/Ce6 NP-k időfüggő sejtfelvételi viselkedését egymást követően 4T1 rákos sejtekkel való inkubálással értékeltük. Az eredmények azt mutatták, hogy bár a COS-BA/Ce6 NP-k figyelemreméltó fluoreszcencia-kioltást mutattak, a szabad Ce6-hoz képest még mindig fokozott fagocita hatékonyságot mutattak az erősebb citoplazmatikus vörös fluoreszcenciának köszönhetően, amint azt áramlási citometriás kvantitatív analízissel határoztuk meg (5A. ábra). Az NP-k ezen javult celluláris internalizációja az endocitózisnak tulajdonítható21. Összességében azt feltételeztük, hogy bár a vízben jól oldódó COS-BA/Ce6 NP-k (érintkezési szög q: 36,7 ) jobb sejtendocitózist mutattak, mint a lipofil Ce6 (q: 132,6, közel a BA-hoz), csökkent a fagocitózis hatékonysága Az NP-k megjelenhetnek az amfifil COS-BA molekulához képest, így megjelenésük elnyomja a COS-BA/Ce6 NP-k kemoterápiás citotoxicitását. Ez azt jelenti, hogy a sejtfelvétel hatékonysága magasról alacsonyra, mint ilyen szekvencia: amfifil COS-BA, hidrofil COS-BA/Ce6 NP-k, lipofil BA vagy Ce6. Ennél is fontosabb, hogy a sejtes NP-k nem megfelelő szétszerelése lehet egy másik fontos oka a gyengített kemoterápiás hatásnak, ami mind összefügghet a COS-BA/Ce6 NP-k intelligens kemoterápiás nyugalmával. Ezen túlmenően, mivel az NP-k szétszerelését specifikusan a daganatsejtek savas környezetében végezték, a pH-érzékeny tulajdonság bemutatása érdekében további kísérletet tettünk a COS-BA/Ce6 NP-k felvételi hatásainak összehasonlítására normál LO2 sejtekben (5B. ábra). . A COS-BA/Ce6 NP-k azonban nem mutattak szignifikánsan gátolt Ce6 vörös fluoreszcenciát LO2 sejtekben. Ezzel szemben az LO2 felvételi viselkedése hasonló volt a 4T1 rákos sejtekéhez, ami arra utal, hogy a COS-BA/Ce6 NP-k még normál sejtekben is széteshetnek, ami a belső sejten belüli, gyengén savas pH-jú intracelluláris kompartmentek (endoszómák/lizoszómák) következménye lehet. rákos és normál sejteket egyaránt46. Mivel az NP-k sejtfelvétele az endocitózis folyamatától függ, a közvetlen gyógyszeres inkubáció nem feltétlenül emeli ki a COS-BA/Ce6 NP-k pH-érzékenységét sejtszinten. Ennek ellenére a tumor mikrokörnyezete (TME) erősen savas a normál szövetekhez képest47. Az intracelluláris vagy TME-től függetlenül a COS-BA/Ce6 NP-k pH-érzékenyek lehetnek, és szétszerelhetők, hogy kiváltsák a rendkívül toxikus COS-BA felszabadulását. Míg a normál szövetekben a COS-BA/Ce6 NP-ket csak a normál sejtkörnyezetbe való belépés után lehetett szétszedni, csökkentve a COSBA felszabadulásának valószínűségét. Ezért arra következtetünk, hogy a COS-BA/Ce6 NP-kre jellemző kemoterápiás nyugalmi állapot a tumor mikrokörnyezetére érvényes és megbízható, és a jelen tanulmányban szereplő tervezési ötlet megvalósítható.

3.5. A COS-BA/Ce6 NP-k in vitro kemoterápia/PDT rákellenes hatékonysága

Ezenkívül a COS-BA/Ce6 NP-k részletes in vitro kemoterápia/PDT rákellenes hatékonyságának vizsgálata előtt és az endocitózis mechanizmusának további feltárása érdekében megvizsgáljuk a négy fő endocitózis útvonalat megfelelő endocita inhibitorok hozzáadásával, beleértve a klórpromazint (klatrin közvetítette), a klorokin-foszfátot ( lizoszóma-savasodás-gátló), nystatin (caveolae által közvetített) és egy makropinocitózis-gátló EIPA (etil-izopropil-amilorid) (5C. és D. ábra). Megfigyeltük, hogy a nisztatin és a klórpromazin bevezetése hatékonyabban gátolhatja a fagocita hatékonyságot, mint az EIPA és a klorokin-foszfát, szignifikánsan csökkent sejtfluoreszcenciát mutatva a normál 37 C-hoz képest. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a COS-BA/Ce6 NP-ket többféle mechanizmus is internalizálja, főleg a klatrin és a caveolae által közvetített endocitózis utak. Az intermolekuláris kölcsönhatások révén megnövekedett 1 O2 képződése óta a COS-BA/Ce6 NP-k jelentősen megnövekedett intercelluláris ROS hozamot mutatnak, mint a Ce6, amit a DCFH próba erősebb zöld fluoreszcenciája jelez (5E. ábra), ami magasabb fotodinamikai hatékonyságot jelent. Az MTT-vizsgálatok azt mutatják, hogy a besugárzás alatt álló COS-BA/Ce6 NP-k figyelemreméltóan fokozott gátló hatást fejtenek ki a 4T1-sejteken, mint az egyenértékű Ce6-é, míg besugárzás nélkül viszonylag mérsékelt citotoxicitást mutatnak (5F. ábra). Szignifikáns, hogy a Ce6 (0,53 mg/ml) IC50 értéke a COS-BA/Ce6 NP-kben sokkal alacsonyabb volt, mint a szabad Ce6é (1,39 mg/ml) (5G. ábra), ami a PDT jelentősen javult hatékonyságára utal. ezt tökéletesen bizonyítja a COSBA/Ce6 NP-k humán MCF-7 és HepG2 rákos sejtekkel szembeni citotoxicitása (S19. ábra alátámasztó információ). Hasonlóképpen, a szabad Ce6-hoz képest viszonylag alacsonyabb IC25, IC50 és IC75 értékeket figyeltünk meg a társszerelvényekben (5G. ábra). Eközben a Ce6 PDT önmagában és a sötétben végzett NP-k egyszeri kemoterápiájával összehasonlítva a besugárzás alatt álló COS-BA/Ce6 NP-k hatékonyabb kombinált kemoterápiát/PDT-t értek el a fenti három rákos sejttel szemben, szinergizmust mutatva (kombinációs index: CI ˂ 1) ( 5I. ábra). Emellett a kalcein-acetoxi-metil-észterrel (calcein-AM) és propidium-jodiddal (PI) végzett élő/halott sejt fluoreszcenciás kettős festés megerősítette, hogy a COS-BA/Ce6 NP-k hatékonyan képesek sejtapoptózist és sejtnekrózist indukálni, mivel a kezelt sejtek majdnem megfestődtek. vörös PI fluoreszcencia jellel, ha a besugárzás után további 10 óráig tenyésztettük (5H. ábra). Eközben a nem besugárzott COS-BA/Ce6 NP-k (nagyobb dózisú Ce6: 3,2 mg/ml) bizonyos kemoterápiás aktivitással is rendelkeztek, amint azt az AM és PI jelek egyidejűleg látják. A COS-BA/Ce6 NP-k e figyelemreméltóan megnövekedett PDT-aktivitását további 20 órás kezelést követően az AM/PI festés tovább erősítette (S20. ábra alátámasztó információ). Ezen túlmenően, ha nátrium-azidot (SA) és D-mannitot (DM), egy külön speciális 1 O2-t és $OH48-t tartalmazó kioltót adunk a COS-BA/Ce6 NPs-PDT-vel kezelt 4T1 sejtekhez, a nyilvánvalóan megnövekedett sejtéletképesség azt jelentette, hogy Az I. típusú ($OH) és a II. típusú (1 O2) fotoreakciók egyidejűleg mentek végbe a COSBA/Ce6 NPs által közvetített PDT folyamatban (5J. ábra). Ezenkívül a COS-BA/Ce6 NP-k különösen jobb vérkompatibilitást mutatnak, amint azt az elhanyagolható vörösvérsejt-hemolízis jelzi (5K. ábra), ami arra utal, hogy az intravénás adagoláson keresztül alkalmazhatók az orvosbiológiai alkalmazások.

3.6. A COS-BA/Ce6 NP-k in vivo biológiai eloszlása

Ezt követően, az in vivo eloszlási vizsgálat előtt, a következő lépésben felmértük a COS-BA/Ce6 NP-k farmakokinetikáját oly módon, hogy monitoroztuk a vér Ce6-koncentrációját intravénás injekció után ekvivalens Ce6 vagy COS-BA/Ce6 NP-kkel. A vérben lévő Ce6 koncentráció-idő profilok (6A. ábra) és az összehasonlító farmakokinetikai paraméterek (S1 Támogatási Táblázat) egyértelműen alátámasztják, hogy a COS-BA/Ce6 NP-k hosszan tartó keringéssel rendelkeznek a véráramban, ami lehetővé teheti a tumornál nagyobb felhalmozódást. oldalak. Különösen a COS-BA/Ce6 NP-k mutattak gyors vérből való eliminációt 2 órán belül, ami kedvező biológiai lebonthatóságot jelent. Ennek megfelelően ezt követően megvizsgáltuk a COS-BA/Ce6 NP-k in vivo biológiai eloszlását és tumor-akkumulációs képességét (6B. és C. ábra). Az általánosan bejelentett Ce6 nanokompozitokhoz33 hasonlóan a COS-BA/Ce6 NP-k gyorsan eloszlanak az egész testben. Különösen az első 4 órában az összeállítások nyilvánvalóan erősebb fluoreszcens emissziót mutattak a tumor helyén, mint a szabad Ce6, ami arra utal, hogy a COS-BA/Ce6 NP-k jobb retenciós és tumor-célzott felhalmozódási képességet mutatnak, valószínűleg a passzív fokozott permeabilitás-visszatartás (EPR) hatásnak tulajdonítható. amit a nanorészecskék biztosítanak14. 6 órával az injekció beadása után a fluoreszcencia intenzitása a tumor helyén fokozatosan gyorsan csökkent. Nevezetesen, ellentétben az általánosan közölt nanokompozitokkal, amelyeknél a szabad pozitív gyógyszerhez képest jelentősen megnövekedett a tumor felhalmozódása29, a COS-BA/Ce6 NP-k nem mutattak túl jelentős felhalmozódást a tumor helyén 24 órával az injekció beadása után, mint a szabad Ce6 (6C. ábra), ami a kimetszett daganat képalkotása is alátámasztja (6D. és E. ábra). Az NP-k kiváló biológiai lebonthatósága felelős lehet a természetes kis szerves molekulák bejuttatásáért. Ezt más terpenoidok, kis molekula által közvetített nano-szerelvényeknél is megfigyelték49. Emellett a COS-BA/Ce6 NP-k is hasonló szöveti eloszlást mutattak, mint a szabad Ce6 (6E. ábra), és az ex vivo átlagos fluoreszcencia intenzitás általában alacsonyabb volt, mint az in vivo, ami további jó biológiai lebonthatóságot jelent. Ezen túlmenően, figyelembe véve az NP-k és a Ce6 injekció beadása után 2 és 4 órával fennálló közeli fluoreszcenciaszint-különbséget, valamint a kísérleti működőképességet, amely elegendő időközt tesz lehetővé a besugárzáshoz, a beadás utáni 4 órát választottuk a következő PDT-terápia fényidőpontjaként.

Figyelembe véve a 24 órás szabad Ce6-hoz képest nem túl jelentős tumorfelhalmozódást, a COS-BA/Ce6 NP-k fokozott EPR hatásának további validálása érdekében azonnal monitoroztuk a daganatok ex vivo fluoreszcencia képét különböző időpontokban, miután intravénásan adtuk be nanodrugokkal ( 6F és G) ábra). Figyelemre méltó, hogy akár 20 perccel, akár 12 órával az injekció beadása után, a COS-BA/Ce6 NP-k valóban erősebb fluoreszcencia-emissziót mutattak a tumor helyén, mint a szabad Ce6, ami kiváló és fokozott tumorakkumulációs képességet mutatott. Eközben az idő múlásával a tumorszövetben megmaradt fluoreszcencia intenzitás fokozatosan gyengült (6G. ábra), ami teljes mértékben összhangban van az állatok in vivo fluoreszcens képalkotásának eredményeivel. Nyilvánvaló, hogy ez a gyors biológiai anyagcsere és a fokozott tumor felhalmozódás elkerülte a potenciális hosszú távú felhalmozódási toxicitást, garantálva a rendkívül hatékony daganatellenes terápiát jobb biológiai biztonsággal.

5. ábra COS-BA/Ce6 NP-k in vitro rákellenes hatékonysága. Szabad Ce6 vagy COS-BA/Ce6 NP-kben 0,5 és 3 órán keresztül inkubált (A) 4T1 rákos sejtek és (B) LO2 normál sejtek celluláris internalizációja és a fluoreszcencia intenzitás megfelelő áramlási citometriai analízise. (C) A specifikus endocita-útvonal-vizsgálatok felvételgátlása és (D) a sejtek megfelelő fluoreszcencia intenzitása áramlási citometriával mérve COSBA/Ce6 NP-kkel végzett inkubáció után endocitikus inhibitorokkal, köztük klórpromazinnal, klorokinnal, nystatinnal és etil-izopropil-amiloriddal (EIPA). Skálalécek Z 20 mm. (E) Szabad Ce6 vagy COS-BA/Ce6 NP-k által kiváltott sejtes ROS képződés (egyenértékű Ce6: 1,6 mg/ml). Skálalécek Z 20 mm. (F) A 4T1 sejtek életképessége különféle kezelések után 24 órán keresztül. (G) A szabad Ce6 és COS-BA/Ce6 NP-k IC25, IC50, IC75 analízise 4T1, MCF-7 és HepG2 sejtekkel szemben. (H) A COS-BA/Ce6 NP-k (Ce6: 1,6 mg/ml) kalcein-AM/propídium-jodid (PI) élő/halott festése további 10 órás inkubáció után, valamint a nem besugárzott COS- BA/Ce6 NP-k (Ce6: 3,2 mg/ml). Mérlegrudak Z 50 mm. (I) A COS-BA/Ce6 NP-k kombinációs indexe (CI) 4T1, MCF{55}} és HepG2 sejteken, a Chou Talalay-tétel számításával meghatározva. (J) A COS-BA/Ce6 NP-k besugárzása által kiváltott PDT mechanizmusok (I. és II. típusú), amelyeket specifikus 1 O2 és $OH kvencser nátrium-azid (SA) és D-mannit (DM) értékeltek ki. (K) A vörösvérsejtek százalékos hemolízise COS-BA/Ce6 NP-kkel 4 órás inkubáció után. Az adatokat SD (n Z 3) átlagban fejezzük ki. *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 és ***P ˂ 0,001 mutatja a szignifikáns különbségeket.

6. ábra COS-BA/Ce6 NP-k in vivo vérkeringése és biológiai eloszlása. (A) Ce6 koncentráció-idő profilok a vérben ekvivalens Ce6 vagy együtt összeállított COS-BA/Ce6 NP intravénás injekciója után (n Z 3). (B) 4T1 daganatot hordozó egerek teljes test fluoreszcens képei a jelzett gyógyszerek iv. injekciója után különböző időpontokban. (C) Átlagos fluoreszcencia intenzitás, amelyet a (B) pontban szereplő tumorhelyekről kaptunk. (D) Ex vivo fluoreszcencia képek a fenti egerekből 24 órán belül kimetszett daganatokról és főbb szervekről, és a megfelelő (E) fluoreszcencia intenzitású kvantitatív eredmény (n Z 3). (F) Ex vivo fluoreszcenciás képek daganatokról és főbb szervekről különböző időpontokban Ce6 vagy COS-BA/Ce6 NP-k iv. injekciója után, és (G) tumorok megfelelő fluoreszcencia intenzitás elemzése. Az adatokat SD (n Z 3) átlagban fejezzük ki.

3.7. In vivo kemoterápia/PDT kombinatorikus daganatellenes kezelés 

Az egyedülálló nyugalmi jellemzők, a jó biológiai lebonthatóság és a PDT aktivitás motiválta az in vivo kemoterápia/PDT kombinációs daganatellenes terápiát. A 4T1 tumort hordozó egereket véletlenszerűen 6 csoportra osztották, és intravénásan injekciózták be ekvivalens Ce6-tal (3,5 mg/testtömeg-kg) kétnaponta, összesen három dózisban. 4 órával az injekció beadása után a világos csoportokban lévő egerek daganatos helyeit 15 percig besugároztuk (7A. ábra). Eközben a megfelelő tumor térfogatokat vagy testtömegeket minden második napon feljegyeztük. 14 napos kezelés után (7B. ábra) a szabad Ce6 besugárzással és szabad COS-BA-val hatástalan volt a tumorszuppresszióban, valószínűleg a tumorszövetben való korlátozott gyógyszerakkumuláció miatt. Ezzel szemben a COS-BA/Ce6 NP-k besugárzása után a legjelentősebb tumorgátlást figyelték meg, ami igazolja a kemoterápia/PDT kombináció kiváló hatékonyságát. A tumorok átlagos tömege (7D. ábra) és a kimetszett daganatokról készült megfelelő fényképek (7E. ábra) a COS-BA/Ce6 NP-k legjobb daganatellenes hatékonyságát mutatták besugárzás mellett, mivel a kezelt egerek mutatták a legkisebb daganatméretet, mint a többi csoporté. A PDT-vel kezelt COS-BA/Ce6 NP-k átlagos tumorgátlási aránya elérte a 80,3%-ot, ami magasabb, mint a szabad Ce6 PDT-é (42,4%) és a szabad COS-BA-é (38,5%). Nevezetesen, bár a korábbi in vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a fény nélküli COS-BA/Ce6 NP-k a kemoterápiás aktivitás alvó funkcióját mutatták, mégis fokozott daganatellenes hatást fejtenek ki (49,5%) a szabad COS-BA-hoz képest (7D. ábra). Feltételeztük, hogy két lehetséges ok járul hozzá ehhez az eredményhez, az egyik a COS-BA/Ce6 NP-k nagyobb daganatos felhalmozódása a széles körben közölt EPR hatás miatt. Egy másik tényező a gyengén savas tumor mikrokörnyezet, amely serkentette az erősen toxikus COS-BA felszabadulását. A COS-BA magasabb kritikus micellakoncentrációja (CMC, 187 mg/ml) miatt (S21. ábra alátámasztó információ) monomer állapotban létezhet a daganatos környezetben, így kedvez a nem besugárzott COS- kemoterápia jobb kemoterápiájának. BA/Ce6 NP-k. Emellett a COS-BA/Ce6 NP-k kiváló rákellenes hatékonyságának további igazolására a daganatok hematoxilin és eozin (H&E) festését végeztük (7G. ábra).

7. ábra Hatékonysági vizsgálat szubkután 4T1 xenograft modellel. (A) Az in vivo PDT kezelés sematikus illusztrációja. (B) Tumornövekedési profilok, (C) testtömeg-változások és (D) kimetszett tumortömegek, amelyek tumorgátlási arányt tartalmaznak 4T1--hordozó egerekben különböző kezelések után a jelzett csoportokban (n Z 5 minden csoportban). (E) Képek a kimetszett daganatokról reprezentatív egerekből a kezelés után. (F) Szérum biokémiai elemzés 14 napos COS-BA/Ce6 NP-vel végzett kezelés után. (G) A kimetszett tumorszelvények reprezentatív H&E festése különböző kezelések után. Skálalécek Z 50 mm. (H) TUNEL festés szabad Ce6 és COS-BA/Ce6 NPs PDT-kezelt tumor metszeteken. A Z 20 mm skála **P < 0,01 jelzi a szignifikáns különbségeket.

Az eredmények azt mutatták, hogy a COS-BA/Ce6 NPs-PDT-vel kezelt tumor metszetek súlyos szövetromlást és sejtmaghiányt, míg a többi csoportban mérsékelt szöveti nekrózist figyeltek meg. Ezzel egyidejűleg a szabad Ce6 fénnyel összehasonlítva a besugárzás alatt álló COS-BA/Ce6 NP-k jelentősen megnövelték az erősebb barna nukleáris festődést mutató TUNEL-pozitív sejtek számát (7H. ábra), ami tovább erősíti a kiváló kemoterápia/PDT kombinációs terápiát. Ezen túlmenően a testtömegben semmilyen nyilvánvaló változást nem figyeltek meg minden csoportban (7C. ábra). Még ha a COSBA/Ce6 NP-k vagy a Ce6 könnyű csoportok testtömegében mérsékelt csökkenést tapasztaltak is a beadás során, a testtömegek néhány nap után visszatértek a normális szintre. Nem találtunk nyilvánvaló károsodást vagy gyulladásos elváltozást a kezelések végén kigyűjtött főbb szervekben (S22 ábra alátámasztó információ), mindkettő a COS-BA/Ce6 NP-k alacsony/nincs szisztémás toxicitására és jó biológiai biztonságára utal. Továbbá, bár a COS-BA/Ce6 NP-k főként a májszövetben halmozódnak fel, a megfelelő májfunkciós markerek (ALT, AST és ALP) nem mutattak szignifikáns változást a normál egészséges egerekhez képest (7F. ábra), ami jobb biokompatibilitásra utal. Ezenkívül a vesefunkció markerek (BUN, CRE és UA) és a biokémiai paraméterek (ALB és TBIL) is hasonlónak tűntek a normál egerekhez, ami további jobb biológiai biztonságot jelent. Nyilvánvaló, hogy ez a prodrug szerves kismolekula, COS-BA-közvetítette a COS-BA/Ce6 NP-ket, számos kedvező terápiás tulajdonsággal rendelkezik, amelyek vonzó lehetőségeket nyitnak meg a klinikai orvoslásban.

3.8. Kombinált kemoterápia/PDT és anti-PD-L1 blokád tumorellenes immunitása

A közelmúltban számos innovatív tanulmány kimutatta, hogy a rák immunterápia és más kezelési módok kombinációja hatékonyan képes előidézni a tumorspecifikus immunválaszokat az elsődleges vagy távoli daganatok eliminálására1. A COS-BA/Ce6 NP-k egyedülálló kemoterápiás nyugalmi funkciója és kiváló kemoterápia/PDT daganatellenes hatékonysága felbuzdulva azon tűnődünk, vajon ez is kiválthat-e immunológiai válaszokat egy immunadjuváns anti-PD-L1 segítségével, hogy rendkívül hatékony daganatellenes terápiát eredményezzen. . Kezelhet-e olyan távoli daganatokat, amelyek nem kezelhetők közvetlenül PDT-kezeléssel, ezáltal alternatív stratégiát biztosítva a klinikai rákellenes alkalmazásokhoz? Ennek a hipotézisnek a tesztelésére ebben a tanulmányban egy „két tumor” modellt állítottunk fel, és a 8A. ábrán részletes kísérleti eljárásokat mutattunk be. Jellemzően két 4T1 daganatot oltottak be mindkét egér bal és jobb oldalára. Tekintettel arra, hogy az anti-PD-L1 önmagában nem rendelkezik feltűnő immunterápiás hatással50, a kísérleteket 5 csoportra osztották, köztük egy kezeletlen csoportot, COS-BA/Ce6 NP-ket, COS-BA/Ce6 NP-ket anti-PD-L1-el, COS- BA/Ce6 NP-k fénnyel, COS-BA/Ce6 NP-k fénnyel és anti-PD-L1. Az NP-k egyszeri iv. injekciója (Ce6: 3,5 mg/kg) után a jobb oldali daganatokat (primer tumor) a világos csoportokban 15 percig besugároztuk a PDT/kemoterápia immunológiai hatásainak értékelésére, míg a bal oldali daganatokat (távoli daganatok) minden kezelés nélküli csoportban egyéni kemoterápiára kerültek kiválasztásra. Ezt követően a 2., 4. és 6. napon az immuncsoportba tartozó egereket intravénásán anti-PD-L1 antitesttel injektáltuk (15 mg egérenként injekciónként), összesen három dózisban. Szignifikáns, hogy a PDT-kezeléstől függetlenül a COS-BA/Ce6 NP-k és az anti-PD-L1 hatékonyan gátolhatják az elsődleges tumor progresszióját (8B. ábra). A megfelelő átlagos tumorgátlási arány külön-külön elérte a 86,7%-ot (besugárzás) és 76,5%-ot (besugárzás nélkül), ami sokkal magasabb, mint az egyéni kemoterápia (5,7%) vagy a kemoterápia/PDT (27,4%) kezelés (8C. ábra) . A kimetszett daganatokról (8D. ábra) és a 4T{57}}hordozó egerekről (Támogató információ: S23. ábra) készült fényképek 14 napos kezelés után szintén vizuálisan alátámasztották a fenti következtetést. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy mind az NP-alapú kemoterápia, mind a kemoterápia/PDT hatékonyan aktiválhatja a daganatellenes immunitást. Mindeközben a legszembetűnőbb, hogy az anti-PD-L1 blokád plusz az NP-k is figyelemreméltó tumorgátló hatást fejtettek ki a nem besugárzott távoli (bal oldali) daganatoknál (8E. és F. ábra), általában erősebben, mint a COS-BA/Ce6 NP-k önmagukban. Ezt a kezelés után a megfelelő kimetszett daganatok és egérképek is megerősítik (8D. ábra és S23. ábra), tovább bizonyítva a COS-BA/Ce6 NP-k által kiváltott hatékony daganatellenes immunválaszt.

Ennek a hatékony daganatellenes immunválasznak a teljes feltárása érdekében a CD8+ citotoxikus T-limfocitákat (CTL-eket), amelyek a rák immunterápia kritikus immuncitái4, tovább értékelték a jobb vagy bal oldali daganatok immunsejtjeinek elemzésével 14 napos kezelés után. Azt találtuk, hogy a COS-BA/Ce6 NP-k és az anti-PD-L1 PDT-kezeléssel vagy anélkül erőteljes CD8þ CTL-infiltrációt indukáltak az elsődleges daganatokban (8H. és J. ábra). A CD8þ CTL-infiltráció akár 11,3%-os volt a COS-BA/Ce6 NP-alapú kemoterápia/PDT plusz anti-PD-L1 kezelés után, valamivel magasabb, mint a COS-BA/Ce6 NP-k plusz anti-PD-L1 (9,63%), és sokkal magasabb, mint a többi csoportban, ahol nincs anti-PD-L1, beleértve a COS-BA/Ce6 NP-alapú kemoterápiát (5,12%) vagy a kemoterápiát/PDT-t önmagában (4,07%). Hasonlóképpen, a nem immuncsoportokhoz képest szignifikánsan megnövekedett CTL-infiltrációt figyeltek meg az egerek bal (távoli) daganataiban is COS-BA/Ce6 NP-k és antiPD-L1 PDT-kezeléssel vagy anélkül történő beadása után (8I. és K. ábra). ami a kemoterápia vagy a kemoterápia/PDT kombinációs terápia által kiváltott rendkívül hatékony immunválaszokat jelenti. Eközben az anti-PD-L1 bevezetése után mind a COS-BA/Ce6-alapú kemoterápia, mind a kemoterápia/PDT több citokin erőteljes termeléséhez vezetett, amelyek kulcsszerepet játszanak a CTL-8 citotoxikus funkcióinak szabályozásában, beleértve a tumort is. nekrózis faktor-alfa (TNF-a) (8L. ábra) és interferon-gamma (IFN-g) (8M. ábra) az egerek szérummintáiban 14 napos kezelés után, ami tovább támasztja, hogy hatékony daganatellenes immunválaszok voltak. Emellett a különböző kezelési csoportokban nem figyeltek meg nyilvánvaló testtömeg-változásokat (8N. ábra), ami a kombinált kemoterápia/PDT/immunoterápia kedvező biológiai biztonságát jelzi. Összességében azt találtuk, hogy bár a fénnyel kezelt anti-PD-L1 plusz COSBA/Ce6 NP-k valamivel magasabb tumorgátlási arányt mutattak (86,7%), mint a nem besugárzott csoport (76,5%) a megfelelő daganatokkal szemben. A PDT hatására (8B-D. ábra) nem volt szignifikáns különbség a bal oldali daganatok terápiás hatásában sem PDT jelenlétében (77,8%), sem hiányában (78,4%) (8E-G ábra). Feltételezéseink szerint a következő lehetséges okok vezethetnek ehhez a jelenséghez. Először is, az anti-PD-L1 ellenőrzőpont blokád immunológiai hatásait fokozó kemoterápia vagy PDT mechanizmusa tekintetében a felhalmozódó vizsgálatok kimutatták, hogy ezek a kezelési módok akut gyulladást válthatnak ki a daganat területén, ezáltal növelve a tumorhoz kapcsolódó antigének megjelenését a T-ben. sejteket, így a rákos sejteket ICD8,9-re indukálják. Az ICD-n átesett tumorsejtek az „esz meg” jeleket azáltal, hogy a kalretikulint (CRT) kiteszik az immunogén haldokló daganatsejtek felületére, a „veszély” jeleket pedig a nagy mobilitású csoportdoboz 1 (HMGB1) felszabadításával, elősegítve a dendrites sejtek aktiválódását. a CTL-ek aktiválására, amelyek aktivitását az anti-PD-L1 fokozhatja, így jelentősen javult a rákellenes immunterápia51.

8. ábra COS-BA/Ce6 NP-alapú kemoterápia/PDT plusz checkpoint blokád anti-PD-L1 immunterápia daganatellenes hatása. (A) A CNP-alapú kemoterápia/PDT sematikus illusztrációja anti-PD-L1 terápiával. (BeD) (B) A tumornövekedési profilok, (C) átlagos tumortömegek és (D) reprezentatív egerekből kimetszett daganatok képei primer (jobb) tumorokra vonatkozóan, különböző, 14 napos kezelések után, amint azt jelezték. (EeG) (E) A tumornövekedési görbék, (F) átlagos tumortömeg és (G) a kimetszett daganatok képei nem besugárzott távoli (bal oldali) daganatok esetén, különböző kezelések után, amint jeleztük. (H) A CD8þ T-sejtek populációit a jobb oldali tumorokban és (J) a CTL-infiltráció százalékos arányát áramlási citometriával kvantitatívan detektáltuk 14 napos kezelés után. (I, K) A CD8þ T-sejtek populációit a bal oldali daganatokban a 14. napon kvantitatívan detektáltuk áramlási citometriával (n Z 3). Citokinek szekréciója a szérumban 14 napos kezelés után, beleértve az (L) IFN-g-t és (M) TNF-a-t, ELISA vizsgálattal mérve (n Z 3). (N) Az egerek testtömegének változásai a különböző kezelések során. *P < 0.05, **P < 0,01 és ***P < 0,001 mutatja a szignifikáns különbségeket.

Másodszor, ebben a munkában a COS-BA/Ce6 NP-k egyszerre oszlanak el a bal és a jobb oldali daganatokon, mind a bal kemoterápia, mind a jobb oldali kemoterápia/PDT hatalmas potenciállal rendelkezik az ICD-n áteső tumorsejtek indukálására. Eközben a COS-BA/Ce6 NP-ket csak egy adagban adják be, az immunterápia főként három adag anti-PD-L1-től függ, legyen szó kemoterápiáról vagy kemoterápiáról/PDT-ről, ezek csak primerek. A terápiás különbségek a tumorsejtek ICD kiváltásában az egyéni kemoterápia és a kombinált kemoterápia/PDT kezelések között nem feltétlenül szembetűnőek. A CD8þ CTL-ek százalékos aránya a bal oldalon (8I. és K. ábra) és a jobb oldali daganatokban (8H. és J. ábra) szintén alátámasztotta a fenti spekulációt, a CD8þ CTL-ek között nem figyeltek meg szignifikáns különbséget PDT jelenlétében vagy hiányában. Ezért a COS-BA/Ce6 NP-k és az anti-PD-L1 besugárzással vagy anélkül hasonló rákellenes hatást értek el a bal oldali daganatokkal szemben. Továbbá, mivel a 4T1 sejtek alacsony szintű PD-L152-t expresszálnak, az anti-PD-L1 önmagában széles körben bebizonyosodott, hogy bármilyen szembetűnő immunterápiás hatással bír a 4T1 emlőrákokra53,54. Annak ellenére, hogy a COS-BA/Ce6 NP-k által közvetített ICD-hatások további vizsgálatot igényelnek, a bemutatott eredmények azt mutatták, hogy a COS-BA/Ce6 NP-k figyelemreméltóan fokozott immunválaszt érnek el az anti-PD-L1 segítségével. Összességében úgy tűnik, hogy a COS-BA/Ce6 NP-k valóban potencírozták az anti-PD-L1 rák immunterápiáját, nem csak egy kombinált terápiát. Bár az anti-PD-L1 plusz COS-BA/Ce6 NP-k PDT-kezeléssel vagy anélkül nem mutattak szignifikáns különbséget a terápiás hatások között, mindkettő nyilvánvalóan fokozott daganatellenes hatékonyságot mutatott egy adag COS-BA/Ce6 NP-hez képest. Ez azt jelenti, hogy még fénykezelés nélkül is, az antiPD-L1 immunadjuváns bevezetése után a tumormaradványok immunogenitása a COS-BA/Ce6 NPs kemoterápia után fokozható, ami figyelemre méltó szisztémás daganatellenes immunválaszokat eredményez, így hatékony szuppresszióhoz vezet. primer vagy távoli daganatok esetén. Így lehetővé kell tenni a primer és metasztatikus daganatok eliminálását a klinikai rákellenes immunterápia során, ismételt NP-kezelésekkel. Nyilvánvaló, hogy ezek az eredmények együttesen bizonyítják a COS-BA/Ce6 NP-k által kiváltott rendkívül hatékony és szinergista tumorellenes immunválaszokat PD-L1-ellenes blokáddal kombinálva, akár önmagában, akár kemoterápiával/PDT-vel kombinálva.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

4. Konklúziók

Összefoglalva, céltudatosan terveztünk, szintetizáltunk és fejlesztettünk ki egy biokompatibilis, biológiailag lebomló, alacsony toxicitású, de rendkívül hatékony és klinikailag elérhető transzformált fotokemoterápiás nano-prodrug COS-BA/Ce6 NP-t három többfunkciós komponens, önösszeállítású, természetes kis molekulájú betulinsav kombinálásával. (BA), egy vízben oldódó COS és egy alacsony toxikus fényérzékenyítő Ce6 a kombinált kemoterápia/PDT számára. Ezt követően rendkívül hatékony és szinergista tumorellenes immunválaszt vált ki anti-PD-L1 blokáddal kombinálva, akár önmagában, akár kemoterápiával/PDT-vel kombinálva. Pontosabban megmutatjuk, hogy az üreges hálózati molekuláris elrendezés elősegítheti a héjszerkezetű nanorészecskék kialakulását. A vízoldható COS módosításai nagymértékben fokozhatják a lipofil természetes kismolekulák rákellenes aktivitását egy amfifil prodrug létrehozásával. Azt is megmutatjuk, hogy a kapott nanodrugok számos kedvező terápiás tulajdonságot mutattak, különösen egy intelligens "nyugalmi" funkciót, alattomos kemoterápiás hatásokkal. A jellegzetes pH-érzékenységgel kombinálva ezek az összeállítások alacsony toxicitást és biológiai biztonságot nyújtanak normál szövetekkel szemben, de erősen mérgezőek a daganatos szövetekre. A továbbfejlesztett 1 O2 generációval, a jó biológiai lebonthatósággal és biokompatibilitással együtt, amelyek mindegyike hozzájárult a rendkívül hatékony, szinergikus és biztonságos rákellenes kemoterápia/PDT/immunterápia kialakításához. Különösen a PDT-kezelés nélküli egyéni kemoterápia aktiválhatja a szisztémás daganatellenes immunválaszokat, vonzó lehetőségeket nyitva a klinikailag szinergikus rákellenes kemoterápiás immunterápia számára. Összességében ez a munka ígéretes betekintést nyújt a természetes multifunkcionális, nagy bioaktív és alacsony toxikus nano-immunstimulánsok kifejlesztéséhez a klinikai immunterápia számára.

Hivatkozások

1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. A nanoanyag alapú szinergikus kombinált rák immunterápia legújabb eredményei. Chem Soc Rev 2019;48:3771e810.

2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ stb. Nanomedicinán alapuló rák immunterápiák, amelyeket a tumorhoz kapcsolódó makrofágok újraprogramozásával fejlesztettek ki. Nanoscale 2021;13:4705e27.

3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL és mások. A kombinált helyi immunstimuláló radioizotópos terápia és a szisztémás immun-ellenőrzőpont blokád erős daganatellenes válaszokat ad. Nat Biomed Eng 2018;2:611e21.

4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY és mások. A fototermikus-kemoterápiás integrált nanorészecskék tumor mikrokörnyezeti válaszreakcióval fokozták az immunogén sejthalál kiváltását a vastag- és végbélrák hatékony kezelésében. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11:43393e408.

5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K és társai. A peptiddel újraprogramozott kis molekula nanoösszeállítások intracelluláris aggregációja fokozza a rák kemoterápiáját és a kombinatorikus immunterápiát. Acta Pharm Sin B 2021;11:1069e82.

6. Song W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X és mások. Fotodinamikus terápián alapuló fokozott immunterápia primer és tüdőmetasztázis tumor eradikációjára. ACS Nano 2018;12: 1978e89.

7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. A szén nanocsövekkel végzett fototermikus terápia által kiváltott immunológiai válaszok anti-CTLA-4 terápiával kombinálva a rák metasztázisának gátlására. Adv Mater 2014;26:8154e62.

8. He CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR stb. A Core-shell nanoméretű koordinációs polimerek a kemoterápiát és a fotodinamikus terápiát kombinálják, hogy erősítsék az ellenőrzőpont blokád rák immunterápiáját. Nat Commun 2016;7:12499.

9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Immunogenic cell death in cancer and infectious disease. Nat Rev Immunol 2017;17:97e111.

10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH stb. A fukoidán alapú mágneses nanorészecskék és az immunmodulátorok kombinációja fokozza a daganatra lokalizált immunterápiát. Nat Nanotechnol 2018;13:746e54.

11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY és mások. Biológiailag lebomló hipokretin-származék nanovezikula, közel infravörös, fényvezérelt terápiaként a kettős fotoaktív rákképalkotáshoz és -terápiához. Bioanyagok 2018;185:133e41.

12. Spicer CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. A peptid és fehérje nanorészecskék sokoldalú platformokat konjugálnak az orvosbiológiai alkalmazásokhoz. Chem Soc Rev 2018;47:3574e620.

13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL és mások. A nukleinsavak bejuttatására szolgáló nanoanyagok közelmúltbeli fejlődése a rák immunterápiájában. Biomater Sci 2019;7:2640e51.

14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. A sono fotodinamikus rákterápia legújabb eredményei: a kifejlesztett új érzékenyítőktől a nanotechnológián alapuló hatékonyságnövelő stratégiákig. Acta Pharm Sin B 2021;11:2197e219.

15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. Intelligens peptid alapú szupramolekuláris fotodinamikus metallo-nano gyógyszerek, amelyeket többkomponensű koordinációs önszereléssel terveztek. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.

16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. Ön-összeszerelt kis molekulájú természetes termék gél gyógyszerszállításhoz: áttörés a kis molekulájú természetes termékek új alkalmazásában. Acta Pharm Sin B 2020;10: 913e27.

17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB és mások. Egyetlen kis molekulájú nanorészecskék közvetítik a hatékony orális gyógyszerbevitelt. Nano Res 2019;12:2468e76.

18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J és társai. Természetes termék zselátorok és általános módszer ezeknek az élőlényekből való kinyerésére. Nanoscale 2018;10:3639e43.

19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. Önálló, természetes kis molekulájú diterpénsavak kedvező rákellenes hatással és biológiai biztonsággal a szinergikusan megerősített daganatellenes kemoterápiához. J Mater Chem B 2021;9:2674e87.

20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. A természetes aktív kismolekulájú gyógyszerbetöltési folyamat és a rendkívül hatékony szinergikus daganatellenes hatékonyság feltárása. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:6827e39.

21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J és mások. Egyszerű és többfunkciós természetes, önösszeálló szterolok rákellenes aktivitás által közvetített szupramolekuláris fotoszenzibilizátorokkal a fokozott daganatellenes fotodinamikus terápia érdekében. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11: 29498e511.

22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. Fényérzékeny gyógyszerek bioaktív, természetes kis molekulákra hangolt együttese a rendkívül hatékony szinergetikus és fokozott I. típusú fotokemoterápiához. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:43488e500.

23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Nanomedicine-cum-carrier természetes kis termékek együttes összeállításával a szinergikus fokozott daganatellenes szövetek védő hatásával. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:42537e50.

24. Xi JC, Liu HP. Az önszállító amfifil gyógyszerek és vakcinák tervezésének legújabb eredményei. Adv Ther 2019;3:1900107.

25. Zhang RS, Qin XF, Kong FD, Chen PW, Pan GJ. A terápiás entitások sejtfelvételének javítása a sejtmembrán komponenseivel való interakció révén. Drug Deliv 2019;26:328e42.

26. Pujals S, Giralt E. Prolinban gazdag, amfipatikus sejtbehatoló peptidek. Adv Drug Deliv Rev 2008;60:473e84.

27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H és társai. Intelligens mikro-/nanorészecskék az ingerekre reagáló gyógyszer-/génbejuttató rendszerekben. Chem Soc Rev 2016;45: 1457e501.

28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Carrier-free triterpene prodrugs with glutation response and biosafety for synergistic fokozott fotokemoterápia. ACS Appl Mater Interfaces 2021;13:245e56.

29. Li XS, Lee SY, Yoon J. A szupramolekuláris fényérzékenyítők megfiatalítják a fotodinamikus terápiát. Chem Soc Rev 2018;47:1174e88.

30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW és társai. Kitozán oligoszacharidok szerkezeti jellemzése és daganatellenes hatása az ortotopikus májdaganat ellen NF-KB jelátviteli úton. J Funct Foods 2019;57:157e65.

31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY és társai. A kitozán oligoszacharidok apoptózist indukálnak humán vese karcinómában a reaktív oxigén-fajfüggő endoplazmatikus retikulum stressz révén. J Agric Food Chem 2019;67:1691e701.

32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY és mások. Ödémaellenes és antioxidáns kombinációs terápia ischaemiás stroke-hoz gliburiddal töltött betulinsav nanorészecskék segítségével. Theranostics 2019;9: 6991e7002.

33. Liu K, Xing RR, Zou QL, Ma GH, Mo¨hwald H, Yan XH. A fotoszenzibilizátorok egyszerű, peptidre hangolt önösszeállítása a rákellenes fotodinamikus terápia irányába. Angew Chem Int Ed Engl 2016;55:3036e9.

34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y és mások. Tumor mikrokörnyezetre érzékeny alakfordító öncélzó vírus ihlette nanodrug képalkotó irányítású közeli infravörös II fototermális kemoterápiához. ACS Nano 2019;13:12912e28.

35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y és társai. Nanogel hibrid összeállítás exoszóma intracelluláris bejuttatáshoz: hatások az endocitózisra és a fúzióra az exoszóma felszíni polimer technológiájával. Biomater Sci 2020;8:619e30.

36. Chou TC. Elméleti alapok, kísérleti tervezés és a szinergizmus és antagonizmus számítógépes szimulációja gyógyszerkombinációs vizsgálatokban. Pharmacol Rev 2006;58:621e81.

37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z és mások. Hordozómentes, kettős funkciójú nanorudak tiszta gyógyszermolekulák önösszeállításával a szinergikus kemo-fotodinamikus terápiához. Int J Nanomed 2019;14:8665e83.

38. Ma X, Zhao YL. Szupramolekuláris rendszerek orvosbiológiai alkalmazásai, amelyek a gazda-vendég kölcsönhatásokon alapulnak. Chem Rev 2015;115:7794e839.

39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y és mások. Újonnan megtervezett klór-e6 származék nanomérnöki tervezése a laktát-anyagcsere szabályozásán keresztül felerősített fotodinamikus terápiához. Nanoscale 2021;13:11953e62.

40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM és társai. Mitokondriális anyagcsere-szabályozással szabályozható hordozómentes nanodrog a fototermikus terápia érzékenységének felerősítésére. Chem. Commun (Camb) 2021;57:8993e6.

41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y és mások. Könnyű szupramolekuláris megközelítés a nukleinsav által vezérelt aktiválható nanotheranosztikához, amely legyőzi a fotodinamikus terápia hátrányait. ACS Nano 2018; 12:681e8.

2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. Hibrid TiO2-ruténium nano-fényérzékenyítő szinergetikusan termel reaktív oxigénfajtákat mind hipoxiás, mind normoxikus körülmények között. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:10717e20.

43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J és mások. A szingulett-triplet energiarés hangolása: egyedülálló megközelítés az aggregáció által kiváltott emissziós (AIE) jellemzőkkel rendelkező hatékony fényérzékenyítőkre. Chem Sci 2015; 6:5824e30.

44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ és társai. Polimerizáció fokozott fényérzékenység. Chem 2018;4:1937e51.

45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M és társai. Nem fotoreszponzív nanorészecskék fényvezérelt önszerveződése. Nat Chem 2015;7:646e52.

46. ​​Miyazaki M, Yuba E, Hayashi H, Harada A, Kono K. Hialuronsav alapú pH-érzékeny polimerrel módosított liposzómák sejtspecifikus intracelluláris gyógyszerszállítási rendszerekhez. Bioconjug Chem 2018;29:44e55.

47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L és mások. Szelektív képalkotás és rákos sejthalál pH-kapcsolható közeli infravörös fluoreszcenciával és fototermikus hatásokkal. Chem Sci 2016;7:5995e6005.

48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ és mások. Kitozánnal segített multifunkcionális mágneses Fe3O4@SiO2@CS@pyropheophorbide-a fluoreszcens nanorészecskék könnyű szintézise fotodinamikus terápiához. New J Chem 2016;40:8522e34.

49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. Egy biológiailag lebomló és glutationra reagáló urzolsav prodrug által közvetített fényérzékeny nanodrug önszerveződési mechanizmusának és hatékony szinergikus daganatellenes kemofototerápiájának feltárása. Biomater Sci 2021; 9: 3762e75.

50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS és társai. Aptamer-alapú logikai számítási reakció élő sejteken, lehetővé téve a nem antitestes immun-ellenőrzőpont blokád terápiát. J Am Chem Soc 2021;143:8391e401.

51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC és mások. Kialakult daganatok eliminálása nanodisc alapú kombinált kemoimmunterápiával. Sci Adv 2018;4:eaao1736.

52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG és mások. PD-L1 kimutatása tumorokban [(64)Cu]atezolizumab és PET alkalmazásával. Bioconjug Chem 2016;27:2103e10.

53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. A terápiás daganatellenes immunitást checkpoint blokáddal fokozza az ibrutinib, a BTK és az ITK inhibitora. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.

54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q és mások. Nanorészecskék által közvetített belső radioizotópos terápia a tumor érrendszeri permeabilitásának helyi növelésére a szinergikusan javított rákterápiák érdekében. Biomaterials 2019;197:368e79.