A kvercetin micellás készítménye megakadályozza a ciszplatin nefrotoxicitását

további információ:ali.ma@wecistanche.com

Alfredo G. Casanova, Marta Prieto, Clara I. Colino és társai.

Az antioxidáns flavonoidkvercetinkimutatták, hogy megakadályozzanefrotoxicitásállatmodellekben és klinikai vizsgálatokban, ezért nagyon ígéretes profilaktikus jelölt a fejlesztés alatt.kvercetinAz oldhatóság nagyon alacsony, ami hátráltatja a klinikai alkalmazást. E munka célja az volt, hogy patkányokon tanulmányozza a Pluronic F{0}}kapszulázott micelláris készítmény biológiai hozzáférhetőségét és nefroprotektív hatékonyságát.kvercetin(P-kvercetin), javított vízoldhatósággal. P- intraperitoneális beadásakvercetina plazmakoncentráció és a biohasznosulás növekedéséhez vezetkvercetina természetes ekvimoláris adagolásához képestkvercetin. Ráadásul P-kvercetinmegőrzi az általános nefroprotektív tulajdonságait, és még kismértékben javít néhány vesefunkciós paramétert a természeteshez képestkvercetin. Konkrétan P-kvercetincsökkentette a plazma kreatinin (3,4±0,5-ről 1,2±0,3 mg/dL-re) és a karbamidszint (490,9±43,8-ról 184,1±-re) 50,1 mg/dl) és a kreatinin-clearance csökkenése ({{20}},08±0,02-ről 0,58±0,19 ml/perc-re), amelyet a nefrotoxikus kemoterápiás gyógyszer, a ciszplatin okoz, és javította a tubuluskárosodás szövettani bizonyítékait. Ez az új készítmény fokozott kinetikai és biofarmakon tulajdonságokkal lehetővé teszi a további kutatásokatkvercetinmint nefroprotektív szerek jelöltje alacsonyabb dózisokban és a klinikai felhasználásra orientált beadási módokon.

Kulcsszavak:ciszplatin;nefrotoxicitás; flavonoid;kvercetin; nephroprotection; biológiai hozzáférhetőség;vese;micellák; oldhatóság; megfogalmazása

Megelőzésenefrotoxicitás

Kattintson a Cistanche para que sirve vesebetegségre

1. Bemutatkozás

Drognefrotoxicitáskomoly egészségügyi és gazdasági probléma [1,2], az intenzív osztályokon leggyakrabban használt 100 gyógyszer 25 százaléka nefrotoxikus [3], ésnefrotoxicitásszintén fontos oka a jelöltek lemorzsolódásának a gyógyszerkutatási folyamat során 4]. A ciszplatin egy platina alapú daganatellenes szer, amelyet gyakran használnak sokféle szilárd rosszindulatú daganat kezelésére [5,6]. A betegek közel 30 százaléka mutat rá bizonyítékotnefrotoxicitása ciszplatin beadását követő első tíz napban, ami jelentősen korlátozza az adagolást és a terápiás hatékonyságot [5-8]. Akut ciszplatinnefrotoxicitástubulopathiát okoz, amely a proximális tubulus hámsejtjeiben a plazmakoncentrációhoz [9-1l] való 5-szeres felhalmozódásából ered, és kisebb mértékben a distalis tubulusban [12,13 ].

A ciszplatin tubulopathia elektrolitikus zavarokkal jár (főleg hypomagnesemia és hypokalaemia) ésakutvesesérülés(AKI). Az AKI egy gyakori szindróma, amelyet a glomeruláris filtrációs ráta (GFR) hirtelen csökkenése, súlyos azotemia és gyakran oliguria vagy anuria jellemez [7,14]. Ezenkívül az endothel diszfunkció, amely növeli a vese vaszkuláris rezisztenciáját és rontja az autoregulációt, szintén hozzájárul a ciszplatin által kiváltott AKI-hoz[9]. Általában az AKI visszafordítható állapot, amely ennek ellenére jelentős hatással van a betegek kimenetelére, beleértve a megnövekedett kórházi mortalitást (az esetek több mint 50 százaléka a kritikus állapotú betegek körében), az elhúzódó kórházi kezelést, az egészségügyi többletköltségeket és a középső és hosszú távú forgatókönyvek, megnövekedett a kialakulásának kockázatakrónikus vesebetegségvalamint az általános és kardiovaszkuláris morbimortalitás [7,14]. Szubcelluláris és molekuláris szinten a ciszplatin tubuláris citotoxicitását a mitokondriális károsodás okozza, amely korlátozza a légzést, oxidatív stresszt okoz, valamint apoptotikus és nekrotikus sejthalált, valamint káros gyulladásos választ idéz elő [13, 15, 16]. Az oxidatív stresszt a ciszplatin citotoxicitásának központi mechanizmusaként ismerik el ésnefrotoxicitás[12,13,15-17], ami a reaktív oxigénfajták fokozott termeléséből és a meggyengült endogén antioxidáns enzim gátból ered [5,7,18].

Hatékony profilaktikus intézkedések a ciszplatin számáranefrotoxicitáskielégítetlen klinikai igényt jelent farmakotoxikológiai profiljának javítására és hasznosságának maximalizálására. A meglévő megelőző stratégiák, beleértve az intenzív hidratálást is, csak korlátozott védelmet mutattak [6,19]. A nefroprotektív szerek együttes alkalmazásán alapuló új stratégiák kidolgozás alatt állnak. A nefroprotektív szerek jelöltjei közé tartoznak a magnéziumkészítmények |6,9 és a legkiemelkedőbb a különféle antioxidánsok [6,20,21]. A flavonoidok a zöldségekből, gyümölcsökből, diófélékből és borból származó nefroprotektív polifenol termékek családja, amelyek erős antioxidáns tulajdonságokkal rendelkeznek [22].kvercetinegy jellemző flavonoid, amely számos jótékony hatást fejt ki [23,24], beleértve a reaktív oxigénfajták megkötését, a vérlemezke-aktiváció elnyomását, az endothel védelmét, a gyulladás modulálását, az apoptózis gátlását, a tumorszuppressziót és a vesevédelmet. Együttes beadásakvercetina ciszplatin terápia mellett állati tumormodellben nefrovédelmet biztosít anélkül, hogy megzavarná a daganatellenes hatást |25,26]. Valójában egy frissített metaanalízis azonosítottakvercetinnagyon ígéretes jelölt neuroprotektorként a további klinikai fejlesztéshez [21]. Következetesen egy közelmúltban végzett klinikai tanulmány védő hatásáról számolt bekvercetinkontrasztanyag-indukált nephropathiára (CIN) [27].

Erős korlátozás a lehetséges alkalmazására vonatkozóankvercetin(általánosan a flavonoidokon osztoznak) a kémiai szerkezetéből és részegységeiből adódó alacsony vízoldhatósága, amely csökkenti a vékonybélben való felszívódását, és ezáltal biológiai hozzáférhetőségét és hatékonyságát [23, 24, 28]. Érdekes módon a lipofób glükóz-kvercetina konjugátumok (glükozidok) lényegesen jobban biológiailag hozzáférhetőek, mint a lipofil aglikonok, mivel ez utóbbiak kevésbé oldódnak a bél lumenében [24]. Valójában,kvercetina hagymából származó glükozidok a legmagasabb felszívódási arányt mutatják, és fokozza az étkezési zsírtkvercetinaglikon felszívódása a vékonybélben [29]. A nagyon alacsony vízoldhatóságakvercetinnemcsak a gyakorlati beadási módok (azaz orális, intravaszkuláris) klinikai alkalmazását akadályozza meg, hanem a preklinikai kutatást is korlátozza. Mindazonáltal állatmodellekben alternatív utak (azaz intraperitoneális) gyógyszerszuszpenziókkal használhatók a koncepció bizonyítására [25,26].

kvercetinúj, javított vízoldhatóságú hordozóanyagokat tartalmazó készítményeket fejlesztettek ki, amelyek orvosbiológiai tulajdonságait tesztelni kell. A pluronic poloxamerek a hordozóanyagok egy osztálya, amelyek vízben oldhatatlan vegyületeket tartalmaznak és fokozzák azok felszívódását, mivel vizes környezetben micellát képeznek [30]. Itt azt feltételeztük, hogy egy micellás készítmény akvercetina korábban leírt Pluronic F127-tel kapszulázva [31] megőrizné a természetes nefroprotektív tulajdonságait.kvercetinmiközben továbbfejlesztett biofarmakon jellemzőket kínál a kezeléshez, a kiszereléshez és a beadáshoz.

Megelőzninefrotoxicitás:kvercetin

2. Eredmények

Biohasznosulási és veseprotekciós vizsgálatot végeztek az új micelláris formulávalkvercetinPluronic F127[31-be zárva, és hagyományos természetes készítményünkkelkvercetin|25,26|(lásd alább, Anyagok és módszerek). Míg ez utóbbi tenzoaktív anyagot tartalmazó szuszpenzió volt, az előbbi sóoldat volt, extra adalékok nélkül. Hagyományos összetételünk a természeteskvercetincsak kísérleti célokra alkalmas, mozdulatlan állapotban kicsapódott, és nehezebb volt kezelni és beadni. Ezzel szemben a micellás készítmény oldatként viselkedett, és nem okozott használati kellemetlenségeket.

2.1.Bioaoilability tanulmány

Az összehasonlító biológiai hozzáférhetőség módszereként az evolúciókvercetinA (Q) plazmakoncentrációt egyetlen intraperitoneális természetes és P-bolus után vizsgálták.kvercetin(PQ). Az 1. ábra az átlagot mutatjakvercetinadag beadása után kapott plazmaszintgörbékkvercetinvagy P-kvercetin. A Q és PQ csoportban megfigyelt maximális gyógyszerkoncentráció (Cmax) 1,14±1,28 ug/ml, illetve 8,90±4,62 ug/ml volt, azaz 7.{9}}-szeres növekedés a P- esetében.kvercetin, ami azt jelzi, hogy a micelláris készítmény növelte a gyógyszer felszívódását.

1. ábra: A kvercetin plazmakoncentrációjának alakulása ekvimoláris P-kvercetin és természetes kvercetin egyetlen bólus intraperitoneális beadása után.

Az értékeket az átlag ± standard hibájaként (SEM) fejezzük ki (n=5 csoportonként). *p<0.05;><0.01;><0.001 vs.qgroup.="">kvercetin(50mg/kg, ip.);PQ:100mg/kg.pP-kvercetin(50 mg/kg-ot tartalmazkvercetin).

1. táblázat: Farmakokinetikai paraméterek P-kvercetin és természetes kvercetin intraperitoneális beadása után (n=5 csoportonként).

K: kvercetin(50 mg/kg, ip; PQ: P-kvercetin(100 mg/kg, ip).AUCo24: részleges görbe alatti terület; AUCo: a teljes görbe alatti terület; MRT: átlagos tartózkodási idő; t1/2: eliminációs felezési idő; X: terminális fázis meredeksége.

Az 1. táblázat a modelltől független farmakokinetikai paramétereket mutatja bekvercetinpatkányokban egyszeri bólus adag természeteskvercetinvagy P-kvercetin. A Cmax eléréséig eltelt idő 15 percről nőtt (a természeteskvercetin) 1 óráig (P kvercetin esetén). Ez a késés a folyamatos kiadásnak tudható bekvercetina micellás készítményből. A patkányok teljes flavonoid-expozíciója szignifikánsan magasabb volt a P-kvercetin, amint azt a görbe alatti nagyobb terület (AUC) mutatja, ami 302,5 százalékkal magasabb biológiai hozzáférhetőséget jelent. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a micelláris készítmény nagyobb oldhatósága fokozza annak felszívódását.

2.2. Nephroprotectioe hatékonysági vizsgálat 2.2.1. Fiziológiai állapot

Amint azt a testtömeg alakulása bizonyítja (2a. ábra), az általános egészségi állapot romlott a ciszplatinnal végzett kezelés után a kontroll állatokhoz képest. Sem természeteskvercetinsem P-kvercetinjelentősen módosította a ciszplatin hatását. Azonban mindkettőkvercetinkezelések szinte teljesen megakadályozták a növekedést avesea ciszplatin által kiváltott testtömeg arány (2b. ábra), egy olyan paraméter, amelyről ismert, hogy korrelál a kopás mértékével.nefrotoxicitás[32].

2. ábra Az általános egészségi állapot alakulása. (a) A testtömeg százalékos változása a kísérlet során; (b) a vese/testtömeg arány a 9. napon.

Az értékeket átlag ± SEM (n=3-5 csoportonként) fejezzük ki. *p<><0.01;><0.001vs.controlgroup.><0.05;><0.01 vs.="" cp="" group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,="" i.p.)on="" day="">

CP plusz Q:kvercetin(50 mg/kg, ip) 9 napig és ciszplatin (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon; CP plusz PQ:P-kvercetin(100 mg/kg, ip) 9 napig és ciszplatin (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon.

2.2.2.A vesefunkció és a veseszövetek értékelése

A nemzetközi kritériumok szerint az AKI-t a plazma kreatinin-koncentrációjának (Crp) [33-35] emelkedése alapján határozzák meg és diagnosztizálják, amely a glomeruláris filtrációs ráta (GFR) helyettesítő markere. Más paramétereket, például a plazma karbamidkoncentrációját is gyakran azotémia indikátorként értékelik [36-38]. A Crp és a plazma karbamidszintjének növekedése a csökkent GFR és AKI jele. Vizsgálatunkban a ciszplatin súlyosan károsította a veseműködést, és ez a hatás részben javultkvercetin. P-kvercetinvalamivel merészebb aktivitást mutatott, mint a természeteskvercetin, amit az enyhébb károsodás és a jobb felépülési profil jelez (3. ábra). A ciszplatin (CP) csoport patkányai nyilvánvaló AKI-n estek át, mivel plazma kreatinin- és karbamidszintjük progresszív és szignifikáns növekedését tapasztalták a kontrollokhoz képest (3a, b ábra). Ezek a paraméterek a CP plusz Q és a CP plusz PQ csoportokban is növekedtek, de lényegesen kisebb mértékben. A CP plusz Q és a CP plusz PQ csoportok közötti különbségek nem voltak statisztikailag szignifikánsak, azonban a P-vel kezelt patkányokkvercetinvalamivel alacsonyabb kreatinin- és karbamidszintet mutattak, mint a természetesekkel kezeltekkvercetin. A kreatinin-clearance (ClCr) egy standard módszer a GFR mérésére ]39,40]. A Cr-adatokkal összhangban a ciszplatin mélyreható visszaesést idézett elő, amelyet részben enyhítettkvercetin(3c. ábra). Ebben az esetben azonban észrevehető különbség volt a P-kvercetin és a természetes kvercetin között, az előbbi lényegesen hatékonyabban javítja és gyorsítja a gyógyulást. Megjegyzendő, hogy a Clcr és a Crpl fordítottan arányos módon viselkednek, ami csak állandósult állapotban nyilvánvaló. Az AKI során azonban a vesefunkció folyamatosan és gyorsan változik, ami ennek a kapcsolatnak a enyhe szétválását eredményezi.

3. ábra A veseparaméterek alakulása.

a)plazma kreatinin-koncentrációja;b)plazmakarbamid-koncentrációja;c) kreatinin-clearance; d) proteinuria; és (e)KIM{0}} vizeletkiválasztás.

Az értékek átlag±SEM(n=3-5 csoportonként) formájában vannak kifejezve. *p<><><0.001 vs=""><0.05;><0.01vs.cp group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,i.p.)on="" day="">

CP plusz Q:kvercetin(50 mg/kg, ip) 9 napig és ciszplatin (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon; CP plusz PQ:P-kvercetin(100 mg/kg, ip.) 9 napig és ciszplatin (6,5 mg/kg, ip.) a 3. napon.KIM-1:vesesérülésmolekula 1.

A proteinuriát gyakran mérik a vesepatológia összefüggésében is. A mögöttes károsodási mintázattól függően a proteinuria glomeruláris eredetű lehet (azaz a glomeruláris filtrációs gát fokozott permeabilitása) vagy, mint a ciszplatin esetében.nefrotoxicitás[13], ez a tubuláris sérülés miatti hibás tubuláris reabszorpcióból eredhet. A proteinuria nem szignifikáns növekedését észlelték a CP és a CP-Q csoportban (bár az utóbbiban kevésbé kifejezett) a 7. napon, amely a 9. napon normalizálódott. Hasonlóképpen, a tubuláris károsodás biomarkerének vizelettel történő kiválasztása (pl.vesesérülésmolekula 1; A KIM-1)[41,42]-t jelentősen növelte a ciszplatin, és ezt a növekedést mindkét formája csökkentette.kvercetinbár P-kvercetinismét valamivel hatékonyabb volt.

A veseszövet szövettani vizsgálata összhangban volt a biokémiai eredményekkel. A ciszplatinnal kezelt patkányokból származó minták masszív tubuláris nekrózist mutattak ki a külső velő felső sávjában, amelyet némi kérgi érzés kísért, éskvercetincsökkent agykérgi sérülés (4. és 5. ábra). Azoknál a patkányoknál, amelyek csak nefrotoxikus szert kaptak, tubuláris tágulás és elzáródás alakult ki (felhalmozódott hialin anyagként), valamint tubuláris nekrózis, epithelizációval és sejtek elpusztulásával. MindkétkvercetinA kezelések hasonlóan csökkentették a ciszplatin által kiváltott kérgi károsodást, de nem voltak hatással a velővel (4. és 5. ábra).

4. ábra Hematoxilinnel és eozinnal festett veseminták reprezentatív képei.

Fekete nyilak: tubuláris nekrózis és sejthullás; kék nyilak: csőszerű tágulások; zöld nyilak: hialin anyag intratubuláris lerakódásai. CP: ciszplatin (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon;

CP plusz Q:kvercetin(50 mg/kg, ip) 9 napig és ciszplatin (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon; CP plusz PQ:P-kvercetin(100 mg/kg, ip) 9 napig és ciszplatin (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon.

5. ábra A vesekárosodás számszerűsítése.

Az értékeket átlag ± SEM (n =5 kép × 3 patkány csoportonként) formájában fejezzük ki. * p<><0.001 vs.=""><0.05 vs.cp="">

CP: ciszplatin (6,5 mg/kg, ip.) a 3. napon; CP plusz Q:kvercetin(50 mg/kg, ipfor9 nap és ciszplatin (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon; CP plusz PQ:P-kvercetin(100 mg/kg, ip) 9 napig és ciszplatin (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon. AU: tetszőleges egységek.

3. Vita

Eredményeink azt mutatják, hogy egy micellás készítmény akvercetinPluronic F127-tel (P-kvercetin), amely fokozott biofarmakon tulajdonságokkal rendelkezik, növelte ennek az antioxidáns flavonoidnak a biohasznosulását, és megtartotta (vagy kismértékben javította) általános nefroprotektív tulajdonságait a természeteshez képest.kvercetin.

kvercetinÍgéretes jelöltként tartják számon a számos gyógyszer és toxin által okozott vesekárosodás elleni védelemben, beleértve a ciszplatint [25,26], a metotrexátot [43.44], a ciprofloxacint [45], a NaF-ot [46], a HgCl-t [47l] és a kadmiumot. [48]. Bár ezek a vizsgálatok preklinikai hatékonyságot mutattak,kvercetinnem tesztelték hasonló klinikai forgatókönyvekben a formulázási akadályok és az alacsony biológiai hozzáférhetőség miatt, kivéve egy klinikai vizsgálatot, amelybenkvercetinbizonyos védelmet nyújtott a CIN ellen [27]. Mindkét korlátozás a nagyon rossz vízoldhatóság következménye (csupán 0,01 mg/ml, 25 fokon [49]).kvercetin, és alacsony stabilitása miatt (amelyet a hőmérséklet, a pH, a hidroxiláció, az enzimaktivitás és a fémionok befolyásolnak)[28,29,50]. Orálisan beadvakvercetina gyomor tranzitja során a gyomor nagyon alacsony pH-ja (azaz 1,5) miatt nagymértékben lebomlik[50]. A vékonybélben magasabb pH-val (7,5) kémiailag védett, a maradékkvercetincsak minimális mértékben szívódik fel. Ezért a kvercetin biológiai hozzáférhetőségének és biológiai hatékonyságának növelése érdekében új készítményeket fejlesztettek ki, amelyek célja a kvercetin vízoldhatóságának javítása, valamint az aktív részecskék – köztük a liposzómák, nanorészecskék, nanoemulziók és micellák – lebomlás elleni védelme [28].

A Pluronic F127-et tartalmazó micellás készítményünk növelikvercetinAz oldhatóság tízszeresére nőtt, és in vitro vizsgálatokban jobb oldódási viselkedést mutatott szimulált gyomor- és bélnedvekben, mivel jelentősen csökkenti a részecskék méretét és homogénebb diszperziót eredményez.kvercetina polimer mátrixbanI3l. Ez a készítmény jelentősen megnövelt mennyiséget biztosítkvercetina véráramba, ami a biológiai hozzáférhetőség 3-szeresét eredményezi, ami furcsa módon csak valamivel magasabb nefroprotektív hatást eredményez. Egyetértve, nem figyeltünk meg további nefroprotektív hatást, ha nagyobb dózisban (azaz 100 mg/kg) természetes anyagot használtunk.kvercetinkorábbi kísérleteinkben (nem publikált megfigyeléseink)[25,26]. Ezekben a vizsgálatokban az értelmezésünk az volt, hogy valószínűleg nagyobb dózisú ipkvercetin(i.e., >50 mg/kg) nem eredményezett megnövekedett biológiai hozzáférhetőséget a csökkent oldhatóság miatt, ami nem eredményezett szignifikánsan megnövekedett nettó felszívódást. Ez egybeesett a fel nem szívódott sárga lerakódásokkalkvercetinfeláldozáskor a peritoneális üregben találják. Ezen túlmenően jelenlegi eredményeink azt mutatják, hogy a kvercetin még magasabb plazmakoncentrációi (például a P-kvercetinnel kapottak) csak valamivel nagyobb hatást eredményeznek. MertkvercetinAz eloszlást leegyszerűsített formában egy elsőrendű, kétrekeszes modellel magyarázták [51], úgy tűnik, hogy a célsejtekhez való hozzáférés a fő kompartmentből (vagyis a véráramból) nem jelent korlátot. Így az ok, amiért a maximális nefroprotektív hatást a természetes kvercetin alacsonyabb plazmakoncentrációival csaknem eléri, továbbra is megfoghatatlan.

Ennek gyakorlati következményei vannak a továbbfejlesztésre nézvekvercetinprofilaktikus nephroprotectorként. Először is, ezek az eredmények lehetőséget adnak annak tanulmányozására, hogy az alacsonyabb adagolási rendek hasonlóan hatékonyak-e, mint a P-biohasznosulás bőséges feleslege.kvercetinfeláldozható a terápiás hatás elvesztése nélkül, de maximalizálja a biztonsági profilt. Másodszor, most megnyílt a lehetőség az orális adagolásra, amelyet ennek ellenére tesztelni kell az új készítményhez. A peritoneális üregből való felszívódás elkerüli a szájüregi úton fellépő akadályokat. Feltételezhető, hogy a nagyobb oldhatóság a bél lumenében megnövekedett és megnövekedettkvercetinbiológiai hozzáférhetőség a terápiás ablakon belül. Harmadszor, az intravénás beadási mód most reális alternatíva lehet minimális toxicitás mellett, amely elkerülné a felszívódási akadályokat. Eddig kísérleti injekciós készítményekkvercetinoldószerként dimetil-szulfoxidot (DMSO) használt [51].

A ciszplatinról ismert, hogy a koncentrációtól függően felhalmozódik és károsítja a proximális és disztális tubulusokat, valamint tubulus epiteliális sejt apoptózist és nekrózist indukál [16]. A proximális S3 szegmens a leginkább érintett, bár az S1 és S2 is egyre jobban károsodik a nagyobb dózisok hatására. A tubulussejteken ismert antiapoptotikus tulajdonságaival összhangban [52,53],kvercetincsökkent corticalis tubuláris de-epitelizáció. A mindkét készítménynél tapasztalt azonos hatás megerősíti azt az elképzelést, hogy akvercetineloszlási kinetika avesetelítettek tanulmányunkban. Továbbá avese, kvercetineltérő viselkedést mutat a nefron mentén. Valójában,kvercetinnem volt hatással a külső velőre, ahol a proximális tubulusok S3 szegmense található.kvercetinúgy tűnik, hogy felhalmozódik az S1, S2 vagy a disztális tubulusokban, amelyek a kéreghez közel helyezkednek el. Mert nem ismert, hogyan (azaz melyik transzporterek vagy diffúziós utak) és honnan (pl. luminális vagy bazolaterális oldal)kvercetinhozzáfér a tubuláris sejtekhez, több kutatásra van szükség ezen eltérő hatások magyarázatához.

A mérsékelt kérgi szövet megőrzése csak részben magyarázhatja a hatásátkvercetina vesefunkcióra (azaz a GFR-re). További védelem származhat az érrendszeri hatásokbólkvercetin. Az endothel funkció részt vesz a vese véráramlásának (RBF) és a GFR szabályozásában az afferens és efferens arteriola összehúzódási tónusának modulálásával [54-57]. A ciszplatin endothel diszfunkciót indukál, és vélhetően ez jelentősen hozzájárul a GFR csökkenéséhez, valamint a tubuloglomeruláris visszacsatolási mechanizmusok által kiváltott vese afferens érszűkülethez (amit a tubuláris károsodás aktivál) és a gyulladásos citokinek [13,58]. Valójában az endothel diszfunkció megfordítása széles körben elismert hatáskvercetin(és általában a flavonoidokról)[59-61l, ami megmagyarázhatja, miértkvercetinjavítja az RBF-et (és ezáltal a GFR-t), amint arról korábban beszámoltunk [25]. Ezen túlmenően ezek az endothel-vaszkuláris hatások magyarázatot adhatnak a P- enyhén magasabb hatékonyságára is.kvercetina vesefunkció javítására és a vesefunkció helyreállítására. Valószínűleg nem ésszerűtlen az a feltételezés, hogy a magasabb biológiai hozzáférhetőség merészebb hatással lehet a vérrel közvetlenül érintkező endothel lavóra.

A beadása után megfigyelt hatások egy részekvercetinmetabolitjai hatással lehetnek.kvercetinA bélnyálkahártyában és a májban glükuronidációs, szulfatációs és metilációs reakciók útján metabolizálódik [62], a leggyakrabban előforduló metabolitok a glükuronid metabolitok a véráramban [63]. Kimondottan,kvercetinA -3-bO-glükuronid (Q3GA), egy fő plazma-metabolit, kimutatták, hogy gyulladáscsökkentő és érrendszeri hatást fejt ki mind közvetlenül, mind az aglikon formává történő metabolizáció után [64]. További kutatásokra van szükség ahhoz, hogy megértsük a neuroprotekcióért felelős specifikus metabolitokat, valamint ezek eltérő termelődését és átalakulását a különböző beadási helyekről a végső célpontokká.

Összefoglalva, ez a kezdeti tanulmány megmutatja a P- terápiás potenciálját.kvercetinmint továbbfejlesztett készítmény fokozott biofarmakon és farmakokinetikai tulajdonságokkal, hasznos a további fejlesztéshez és a prospektív klinikai felhasználáshoz a betegségek megelőzésében.nefrotoxicitás.

A kvercetin előnyei a nefrotoxicitásra

4. Anyagok és módszerek

Minden vegyszert és reagenst a Mercktől (Darmstadt, Németország) vásároltunk, kivéve, ha másként jelezzük.

4.1. A micellás készítmény elkészítése (P-kvercetin) és a TermészeteskvercetinFormuláció

kvercetina hidrátot (minimum 95 százalékos tisztaság) az Acros Organics-tól (Madrid, Spanyolország) szerezték be, a Pluronic F127 etilén-oxid-propilén-oxid blokk-kopolimert (átlagos molekulatömeg 12,6 kDa, hidrofil-lipofil egyensúly 22) pedig a BASF (Ludhegshafen) biztosította. Németország). A micellás készítmény előállításához szuperkritikus antiszolvens precipitációs technikát alkalmaztunkkvercetin/Pluronic F127 részecskék (P-kvercetin) a korábban leírtak szerint [31]. Az így kapott Pluronic-kvercetina készítmény relatív összetétele 50 % /50 tömegszázalék Pluronic F127/kvercetin. A természetesértkvercetinkészítmény,kvercetin0,16 százalékos Tween 20-ban sóoldatban felfüggesztették, a korábban leírtak szerint [25,26].

4.2. Állatok és bioetika

Minden eljárást jóváhagyott a Sala-mancai Egyetem Bioetikai Bizottsága és Kasztília és León regionális kormánya, a Mezőgazdasági és Állattenyésztési Minisztérium (kód: 0000037, 2015. július 27.). Az állatok kezelése az Európai Közösség Tanácsának 2010/63/UE irányelve és a kísérleti állatok felhasználására és gondozására vonatkozó hatályos spanyol jogszabályok (RD53/2013, 2013. február 1.) irányelvei szerint történt. A hím Wis-tar patkányokat (200-250 g) ellenőrzött környezeti feltételek mellett tartották a Salamancai Egyetem Állatházának létesítményében, ingyenes hozzáféréssel a vízhez és a szokásos ételhez.

4.3. Biológiai hasznosíthatósági tanulmány

A patkányokat két kísérleti csoportra osztottuk: O (n=5), amelyben az állatok egyetlen p.kvercetin(50 mg/kg); és PQ(n=5), amelyben az állatok egyetlen ip ekvimoláris dózisban kaptak P-kvercetin(100 mg/kg (azaz 50 mg/kg-ot tartalmazkvercetin). Ezt követően vérmintákat vettek etilén-diamin-tetraecetsavval (EDTA) bevont csövekben a farok hegyén lévő kis bemetszéssel a következő időpontokban:0.25,0.5,1,2,8, 12 és 24 óra. A plazmát centrifugálással és 10 µl 10 mM aszkorbinsavval nyertük (hogy elkerüljükkvercetindegradáció) 100 μl plazmához adtuk, és az elemzésig -80 fokon lefagyasztottuk.kvercetina koncentrációkat fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerrel határoztuk meg UV-detektálással. Prosper 3 um részecskeméretű C18 oszlopot használtunk, amelynek mozgófázisa 28% acetonitrilből és 72% 0,2% ortofoszforsav vizes oldatból állt, 1 ml/perc áramlási sebességgel. A detektálási hullámhossz 371 nm volt. A kromatográfiás berendezésbe történő injektálás előtt a mintákat glükuronidálási eljárásnak vetettük alá az összmennyiség meghatározására.kvercetin. Ebből a célból 1000 egység Helix pomatia -glükuronidázt 0,1 M acetát pufferben (pH 5) adtunk 100 μl plazmához, és ezt a keveréket 37 fokon 1 órán át inkubáltuk. . Ezután 100 μl 0,5 M80-20 acetonitril/ecetsav keverékkel extraháltuk (háromszor). Miután a felülúszót nitrogénáramban elpárologtattuk, a száraz maradékot újra feloldottuk a 40 µl-es mozgófázisban, és 20 µl-t injektáltunk a HPLC rendszerbe.

4.4. Nephroprotection Study

A patkányokat a következő kísérleti csoportokba osztottuk (6. ábra): Kontroll (n=3) állatok vivőanyagot (NaCl0,9 százalék) intraperitoneálisan (ip) 9 napon keresztül; A CP(n=5) állatok egyszeri nefrotoxikus dózisú ciszplatint (6,5 mg/kg,ip) kaptak a kísérlet 3. napján; a CP plusz Q(n=5) állatok napikvercetin(50 mg/kg, ip) 9 napon keresztül és egyetlen adag ciszplatin (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon; és CP plusz PQ (n=5) állatok napi adag P-kvercetin(100 mg/kg, ip (azaz 50 mg/kgkvercetin)) 9 napig, és egy adag ciszplatint (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon.

6. ábra A nefrotoxicitási modell vázlata.

CP: ciszplatin (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon; CP plusz Q:kvercetin(50 mg/kg, ip) 9 napig és ciszplatin (6,5 mg/kg, ip) a 3. napon; CP plusz PQ:P-kvercetin(100 mg/kg, ip.) 9 napig és ciszplatin (6,5 mg/kg, ip.) a 3. napon.

A vérmintákat (15{1}} μL) a 0., 3., 5., 7. és 9. napon vettük a heparinizált kapillárisokból a farok hegyén lévő kis bemetszésből. A plazmát centrifugálással (11.000 fordulat/perc 3 percig) elválasztottuk, és -80C-on tartottuk. A 7. és 9. napon 24 órás vizeletet gyűjtöttünk metabolikus ketrecekben, centrifugálással tisztítottuk (2000 × g 9 percig), és -80 fokon tároltuk. A kísérlet végén (9. nap) a patkányokat elaltattuk, ésveseszövettani vizsgálatokhoz kimetszettük, lemértük és 3,7 százalékos paraformaldehidben rögzítettük.

A plazma és a vizelet kreatinint a Jaffe-módszeren [65] (QuantiChrom Creatinine Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) alapuló kereskedelmi kittel mértük. A plazma-karbamidot Jung-módszeren [66] (Quan-tiChrom Urea Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) alapuló kereskedelmi készlettel határoztuk meg. A kreatinin-clearance (Clcr) kiszámítása a következő képlettel történt: Clcr=Crur × UF/ Crp); ahol a Crur a kreatinin vizeletkoncentrációjának felel meg, az UF a vizeletáramlás, a Crp pedig a kreatinin plazmakoncentrációja. A proteinuriát Bradford assay-vel mérték [67]. A KIM-1 mennyiségét a Patkány segítségével határoztuk megVesesérülésmolekula 1(KIM-1)ELISA Kit (Cusabio, Houston. TX, USA). a gyártó utasításait követve.

A szövettani vizsgálatokhoz a vesemintákat paraffinba ágyaztuk, és 5 um-es szövetmetszeteket hematoxilinnel és eozinnal festettek. A fényképek egy Olympus BX51 mikroszkóp alatt készültek, amely egy Olympus DP70 színes digitális fényképezőgéphez volt csatlakoztatva (Olympus, Madrid, Spanyolország). A károsodások számszerűsítését a korábban leírtak szerint [68] vak módon végeztük. Röviden, öt véletlenszerű fényképet készítettek a kérgi régióról és öt fényképet a külső medulláris régióról (azaz a ciszplatin által károsított területekről), egyenletesen feltérképezve ezeket a területeket. Minden képet 10 azonos részre osztottak (a Microsoft Office PowerPoint 2016 szoftverrel), amelyek mindegyikéhez 0 (nincs sérülés), 1 (sérülés a terület kevesebb mint 1/3-án), 2 (sérülés jelenléte) pontszámot rendeltek. a terület 1/3-2/3-a), vagy 3 között (a terület több mint 2/3-án a sérülés jelenléte). A károsodást a tubuláris nekrózis és a sejtek leválása, a tubuláris tágulás, a vakuolizáció, a hialinlerakódások jelenlétének és a kefeszegély elvesztésének figyelembevételével értékelték.

4.5. Statisztikai elemzés

Az adatokat az átlag ± standard hiba (SEM) formájában adjuk meg. A kiugró értékeket a Grubbs-teszt|69] segítségével azonosítottuk. Az adatok normál eloszlását Shapiro-Wilk teszttel értékeltük ki. A biohasznosulási vizsgálatban a két csoport összehasonlítását Student-féle t-teszttel vagy Mann-Whitney U-teszttel végeztük. A farmakokinetikai vizsgálatot az átlagos plazmaszintek modellfüggetlen elemzésével végeztékkvercetin. A becsült paraméterek a relatív biológiai hozzáférhetőség értékeléséhezkvercetina plazmaszintek részleges görbéje alatti terület (AUC)24, a plazmaszintek teljes görbéje alatti terület (AUC)0~, a terminális fázis meredeksége, az elimináció felezési ideje (ti/2) , és az átlagos tartózkodási idő (MRT). A farmakokinetikai paraméterek becslését a parciális görbe alatti terület becslésére szolgáló trapéz módszer és a plazmaszintgörbe terminális fázisának nemlineáris regressziója kombinálásával végeztük. A nephroprotection vizsgálathoz varianciaanalízist (ANOVA) végeztünk Scheffe-teszttel vagy Kruskal-Wallis teszttel a csoportok közötti összehasonlításhoz. A statisztikai elemzést az IBM SPSS Statistics 20.0 szoftverrel (International Business Machines, Armonk, NY, USA) végeztük. A grafikák és illusztrációk elkészítéséhez Microsoft Office Excelt és PowerPoint 2016-ot (Microsoft, Redmond, WA, USA) használtak.

Hivatkozások

1. Awdishu, L.; Mehta, RLThe6R's of Drug-inducedNefrotoxicitás. BMCNephrol.2017,18,124. [CrossRefl[PubMed]

2. Perazella, MADrug Használata ésNefrotoxicitásaz intenzív osztályon.VeseInt.2012,81,1172-1178. [CrossRef] [PubMed]

3. Taber, SS; Mueller, BADrug-asszociált veseműködési zavar. Crit.Care Clin.2006,22,357-374, vi. [CrossRef] Huang, JX; Blaskovich, MA; Cooper, MACell- és biomarker-alapú tesztek az előrejelzéshezNefrotoxicitás.

Jegyzet:a fenti nem teljes referencialista