Az előzetes félelemtanulás lehetővé teszi az új félelememlékek gyors asszimilációját közvetlenül a kérgi hálózatokba 2. rész

A korábbi kontextuális félelemtanulás lehetővé teszi az elülső cinguláris kéreg számára, hogy azonnal kódolja az új emlékeket

A mai napig vizsgáltuk a rendszerkonszolidáció dinamikáját a hallási félelem emlékeiben. A rendszerkonszolidáció modellje azonban többnyire a hippocampus-függő memóriával kapcsolatos tanulmányokból származik.

A hallási félelem nagyon gyakori pszichológiai probléma, amely nagy hatással lehet az emberek mindennapi életére. Amikor hallásfóbia lép fel, az emberek nagyon kényelmetlenül érezhetik magukat, és különféle egészségügyi problémákat is okozhatnak. Ugyanakkor vannak olyan kísérletek is, amelyek bizonyítják, hogy a hallási félelem is javíthatja a memóriát.

Az elmúlt években a kutatók azt találták, hogy a hallásfóbiában szenvedők figyelmesebbek és érzékenyebbek, mint mások. Agyuk erősebben és gyorsabban reagál a hangingerekre. Ez a reakció érzékenyebbé teszi őket az életük hangjaira. Egyes esetekben jobban képesek feldolgozni a különféle információkat, és még hasznosabb jelzéseket is kapnak a hangokból, ami potenciálisan javítja általános memóriájukat.

Amikor egy személy feszült vagy szorongó érzelmi állapotban van, az agy egy adrenalin nevű anyagot bocsát ki. Ez az anyag elősegítheti az agyi neuronok aktivitását és növelheti az emberek koncentrációját. Ezért hallási félelem állapotában az adrenalin felszabadulása nagyobb koncentrációhoz és memóriához vezet a hallgatóban.

Ugyanakkor, ha az audio félelem ingere továbbra is fennáll, az agy képes alkalmazkodni ehhez az ingerhez azáltal, hogy mélyebb emléket épít a hangról. Ez az emlék segíthet a betegeknek abban, hogy jobban reagáljanak a különböző hangingerekre, így magabiztosabbá és függetlenebbé válhatnak.

Ezért, bár a hallási félelem sok kellemetlenséget okozhat az emberek mindennapi életében, pozitív hatással lehet a memóriára is. Amikor az emberek megtanulják, hogyan kell kezelni ezt a pszichológiai problémát, le tudják győzni a félelmeiket, és még profitálhatnak is belőlük. Ez arra is emlékeztet bennünket, hogy helyesen kell szemlélnünk a pszichológiai problémákat, oda kell figyelnünk a mentális egészségre, és pozitív hozzáállással kell kezelnünk a nehézségeket életünk jobbá tétele érdekében. Látható, hogy javítanunk kell a memóriánkat. A Cistanche deserticola jelentősen javíthatja a memóriát, mert a Cistanche deserticola szabályozhatja a neurotranszmitterek egyensúlyát is, például növeli az acetilkolin és a növekedési faktorok szintjét. Ezek az anyagok nagyon fontosak a memória és a tanulás szempontjából. Emellett a hús javíthatja a vérkeringést és elősegítheti az oxigénszállítást is, ami biztosítja, hogy az agy elegendő tápanyagot és energiát kapjon, ezáltal javítva az agy vitalitását és állóképességét.

Kattintson a know-kiegészítőkre a memória javítása érdekében

Úgy gondolják, hogy ezek az emlékek kezdetben mind a hippocampális, mind a kortikális szinten alakulnak ki. Idővel a hippokampusz és a kérgi hálózatok közötti összehangolt kölcsönhatás a kérgi áramkörök fokozatos átalakításához vezet, amelyek végül távoli emlékeket tárolnak [1–5]. Ezzel összhangban a naiv állatokban a hippokampusztól függő félelememlékek, nevezetesen a kontextuális félelememlékek kezdetben a hippocampustól függenek, és fokozatosan függővé válnak az ACC-t és a prefrontális kérget magába foglaló kérgi hálózattól [1,2,6-8 ].

Ezért megvizsgáltuk, hogy ez az időfüggő átszervezés másképpen történt-e, ha egy korábbi memória rendszerkonszolidációja korábban megtörtént. A patkányokat arra képezték ki, hogy a kontextust az Egyesült Államokkal társítsák. Két héttel korábban a patkányok egy csoportja egy másik összefüggést tanult meg egy másik kontextus és az Egyesült Államok között (CtxA-CtxB), míg egy másik csoport csak azonnali fájdalmas ingereket kapott, amelyek hátráltatták a kontextuális félelem tanulását (sokk-CtxB) (S1A ábra). Az állatokat CNQX-szel vagy sóoldattal fecskendezték be az ACC-be 24 órával a kontextuális tanulás után (4A és S1B ábra).

A korábbi tanulmányokkal [1, 6, 8] összhangban az ACC inaktiválása olyan állatokban, amelyek korábban nem tanultak meg egy másik félelem-asszociációt, nem befolyásolta a CtxB fagyását, ami arra utal, hogy ez a manipuláció nem befolyásolta a közelmúltbeli memóriát. Az auditív félelem tanulása során kapott adatokhoz hasonlóan azonban az ACC inaktiválása a közelmúltbeli CtxB értékre csökkentette a lefagyást azokban a patkányokban, amelyek korábban megtanulták a kontextuális félelem összefüggést (4B és 4C ábra).

Ez a jelenség ok-okozati összefüggésben állt az első emlék lassú rendszerkonszolidációjának kialakulásával, mivel hiányzott azoknál az állatoknál, ahol a két félelemeseményt csak 7 vagy 24 óra választotta el egymástól, és azokban az állatokban, ahol az ACC 24 órával inaktiválódott mindkét az első és a második a kontextuális félelemtanulás. Ezenkívül nem volt jelen azokban a patkányokban, amelyek az első kontextus feltárását tapasztalták UH hiányában (Context-CtxB csoport) (4D és 4E ábra).

Kritikusan az ACC inaktiválása, amelyet a tanulás után 1 órával hajtottak végre, szintén hatással volt a közelmúltbeli félelemre (4F és 4G ábra). Ekkor az anizomicin beadása a CtxB-re csökkentette a fagyást azokban az állatokban, amelyek korábban kontextuális félelemtanulást tapasztaltak (4H. és 4I. ábra). Ezek az adatok alátámasztják azt az elképzelést, hogy az első félelemesemény memorizálása után a neokortex azonnal elengedhetetlenné válik az új emlékek számára, csupán a szinaptikus konszolidációs mechanizmusok alkalmazásával.

A korábbi kontextuális félelemtanulás átszervezi az ACC-BLA-projekciókat, hogy támogassák a közelmúltbeli emlékeket

Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a naiv állatok távoli memóriamegtartása során felhalmozott idegi kapcsolat részt vehet-e a közelmúltbeli memóriamegtartásban azoknál az állatoknál, amelyek korábban megtanultak egy másik kontextuális félelem-emlékezetet. Ebből a célból megvizsgáltuk az ACC-től a BLA-ig tartó vetületek szerepét a közelmúltbeli és távoli kontextuális emlékek megőrzésében.

Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a prefrontális kéregből a BLA-ba vetített axonterminálisok optogenetikai gátlása távoli, de nem friss időpontokban károsította a kontextuális félelem-memória megtartását naiv állatokban [7]. Az adeno-asszociált vírusvektort (AAV5-CaMKIIa-eNpHR3.0-mCherry) vagy a kontrollvektort (AAV5-CaMKIIa-mCherry) 2 csoportban injektáltuk az ACC-be, mint pl. a fent leírt kísérleteket (5A–5C. és S3C. ábra). Az ACC terminálisok optogenetikai gátlása a BLA-ban a közelmúltban a kontextuális félelem-memória megtartása során csak azoknál az állatoknál rontotta a CtxB-hez való lefagyást, amelyeket eNpHR3-mal injekcióztak.{13}}mCherry vektor, és amelyek korábban megtanultak egy különálló kontextus-USA asszociációt (5D. ábra). ).

Ebben a csoportban az ACC terminálok későbbi gátlása a BLA-ban szintén jelentősen csökkentette a CtxA lefagyását, ami arra utal, hogy ez a távoli kontextus-USA asszociáció megtartását is befolyásolta (5E. ábra). Ezek az eredmények alátámasztják azt az elképzelést, hogy ugyanaz a neurális útvonal elengedhetetlen az első félelemesemény távoli emlékének és az új analóg események közelmúltbeli emlékeinek megőrzéséhez. Ezek az adatok azt is sugallják, hogy a kérgi pályák BLA-ba süllyedő átrendeződése, amelyet az első emlék indukál, gyakori folyamat mind a hallási, mind a kontextuális félelmemlékeknél.

Egy előzetes félelemtanulás után a dorsalis hippocampus és az ACC egyaránt szükséges az új emlékek kialakulásához

Ezek az eredmények felvetik a kérdést, hogy a hippokampusz akkor is alkot-e új emlékeket, ha korábban kontextuális félelemtanulás történt. Alternatív megoldásként a kéreg új emlékeket képezhet, még a hippokampusz hiányában is. E kérdések megválaszolásához a fenti kísérletekhez hasonlóan 2 csoportban inaktiváltuk a hippokampuszt 1 órával a kontextuális félelem tanulása után.

Mivel a rendszerkonszolidációról szóló irodalom nagy része olyan tanulmányokból származik, amelyekben a hippocampus véglegesen elpusztult, a tanulás után 1 órával a dorsalis hippocampus visszafordíthatatlan léziójával kezdtük (6A–6C. ábra). A hippocampális elváltozások mindkét csoportban szignifikánsan csökkentették a CtxB-hez való fagyást (6C. ábra). Mivel az excitotoxikus elváltozások átmenetileg megzavarhatják a hippokampuszon kívüli agyi régiók, például az ACC aktivitását, megismételtük ezt a kísérletet a dorsalis hippocampus inaktiválásával CNQX-szel, hogy blokkoljuk a helyi AMPA glutamát receptorokat, és amnéziás hatásokat találtunk mindkét csoportban (6D és 6E ábra). ).

Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a hippokampusz szükséges az új kontextuális emlékek kialakulásához, függetlenül attól, hogy történt-e előzetes félelemtanulás. A fenti eredményekkel együtt ezek az adatok azt is jelzik, hogy azokban az állatokban, amelyek korábban megtanultak egy kontextuális félelem eseményt, mind a hippocampus, mind az ACC szükséges a közelmúltbeli félelem emlékeinek kialakításához, és ezek a helyek önmagukban nem támogatják a memória kialakulását hiányában. a másiké.

Ezután megvizsgáltuk a hippocampális érintettség időbeli lefolyását úgy, hogy a hippocampális léziót a tanulás után 1 hétre késleltettük. A korábbi eredményekkel összhangban [46] a hippocampális elváltozások továbbra is befolyásolták az emlékezet kialakulását olyan állatokban, amelyek korábban soha nem tanultak más félelem-asszociációkat. Ezzel szemben, abban a csoportban, amely megtanult egy korábbi félelem eseményt, a hippocampális elváltozások nem befolyásolták a memória megtartását (6F és 6G ábra), ami arra utal, hogy a korábbi félelemmemória lerövidíti a hippocampális érintettség időablakát (2 hétről 1 hétre), mivel térbeli tanulásnál is megfigyelhető [3,20,21].

Vita

Jelen tanulmányban azt találtuk, hogy a hallási félelem memória korábbi rendszerkonszolidációja lehetővé teszi a Te2 számára, hogy szinaptikus konszolidáción keresztül azonnal kódoljon egy új hallási félelem memóriát. Sőt, a korábbi tanulás megszilárdítása során aktivált, a Te2-től a BLA-ig tartó leszálló projekciók szükségessé válnak az új hallási félelem emlékek kialakulásában.

Hasonló eredményeket figyeltek meg a hippocampus-függő kontextuális félelemtanulásban. Az utóbbi feladatban azt is megállapítottuk, hogy a korábbi tanulás lerövidíti a hippocampális részvétel időtartamát a közelmúltban a kontextuális félelem tanulásában. Eredményeink összességében azt sugallják, hogy a korábbi tanulás átszervezi az agyi áramköröket, így az új analóg információk azonnal megtanulhatók a kérgi struktúrákban.

A hippokampusz-függő emlékek rendszerkonszolidációjának jelenlegi koncepciója azt feltételezi, hogy a hippokampusz időben korlátozott módon vesz részt, és az agyi körfolyamatok egyidejű fokozatos átrendeződése idővel megy végbe, így a kérgi hálózatok egyre fontosabbá válnak [1–5].

Bár léteznek alternatív elméletek is [47], számos tanulmány támasztja alá, hogy a hippokampusz időben korlátozott szerepe van a memóriafolyamatokban mind az emberi, mind az állati modellekben [1–3]. Éppen ellenkezőleg, a memóriát támogató agyi áramkörök idővel történő átrendeződését főként állatmodellekben mutatták ki, míg az emberek esetében a bizonyítékok ellentmondásosabbak [3].

Egyes tanulmányok kimutatták, hogy a hippokampusz aktivitása az emlékezet-visszakeresés során emberekben hetek és hónapok alatt fokozatosan csökken, míg a ventrális mediális prefrontális régióban [48], a temporális neocortexben [49] vagy a kérgi területek közötti kapcsolódás [48] szignifikánsan megnőtt. Éppen ellenkezőleg, az újabb tanulmányok azt mutatták, hogy bár a hippocampális aktivitás az idő múlásával csökkent, a kérgi aktivitás az idő múlásával stabil maradt [50] vagy csökkent [51]. Állatoknál következetesebb bizonyítékot szereztek a memóriát támogató agyi áramkörök időbeli átrendeződéséről [1–3]. Ezeket a vizsgálatokat kísérletileg naiv állatokon végezték.

A kérdést olyan állatokon vizsgálva, amelyekben már kialakult egy korábbi félelememlékezet, azt találtuk, hogy a hippokampusz szükséges az új emlékek kialakulásához, függetlenül attól, hogy történt-e előzetes félelemtanulás. Az agyi áramköröknek az első tanulás által kiváltott átszervezése azonban lehetővé teszi a neokortex számára, hogy azonnal kódoljon új emlékeket, egyszerűen a szinaptikus konszolidáció sejtmechanizmusain keresztül. Ez a jelenség mind a hippokampusz-függő, mind az attól független félelememlékekre vonatkozik, és kifejezetten a kezdeti tanulási esemény által kiváltott lassú rendszerkonszolidáció váltotta ki.

Hiányzott azokban a patkányokban, ahol a 2 tanulási kísérlet időlegesen közel volt egymáshoz (néhány óra vagy 1 nap), és azokban, ahol az első tanulási eseményt követő kortikális inaktiváció kizárta a kéreg átrendeződését és az azt követő részvételt az új sejtek gyors asszimilációjában. emlékek. Sőt, miután az első félelemtanulás átszervezte az agyi összeköttetést, a kéregből a BLA-ba vezető utak nemcsak a távoli emlékek megőrzéséhez szükségesek, mint a naiv patkányoknál, hanem a közelmúltbeliek számára is. Arra a következtetésre jutottunk, hogy ha egy analóg memóriát korábban kódoltak, akkor az agyi áramkörök átszervezése már megtörtént, és már nem szükséges új emlékek kialakulásához, amelyek fordítva azonnal kapcsolatba lépnek a kéreggel és annak kölcsönhatásával a szubkortikális helyekkel.

Annak ellenére, hogy nagyszámú tanulmány bizonyítja az agyi körök időfüggő átrendeződését naiv állatokban, ennek a folyamatnak a pontos célja még korántsem tisztázott. Mivel a memóriával kapcsolatos viselkedési reakciók idővel hasonlóak maradhatnak, úgy gondolják, hogy ez a folyamat idővel javítja a memória stabilitását [1,2,52]. Eredményeink alapján azt javasoljuk, hogy amikor egy félelem esemény először fordul elő, az agyi áramkörök hosszan tartó átszervezési folyamaton mennek keresztül, a rendszerkonszolidációs modellben leírtak szerint. Ez a folyamat a félelemmemóriát tartósan tároló neurális hálózatok átrendezését szolgálhatja, hogy azok szinaptikus konszolidációs mechanizmusokon keresztül azonnal új analóg információkhoz juthassanak. Valójában ez a működési mechanizmus „gazdaságosabbá” teheti az új tanulást, mert csökkentheti az új kapcsolódó információk megszerzéséhez szükséges erőforrások kiadását, ezáltal több erőforrás szabadul fel új, nem kapcsolódó információk megtanulására.

Eredményeinkből egy fontos kérdés, hogy a korábbi tanulás tartósan megváltoztatja-e a neurális hálókat úgy, hogy a hasonló tapasztalatok azonnal elraktározódjanak a neokorticusokban, még akkor is, ha nagyon távoli időintervallumokban fordulnak elő. Alternatív megoldásként az is előfordulhat, hogy a rendszer visszaáll a naiv állatok kezdeti szintjére, ha rövid időn belül nem történik hasonló új tapasztalat. A neokortex érintettségét az első és a második tanulás közötti növekvő időintervallumokban értékelő kísérletek tisztázzák ezt a kérdést.

Azt is megállapítottuk, hogy a neocortex blokádja az első tapasztalat korai konszolidációja során megakadályozta az új, hasonló tapasztalatok azonnali hozzárendelését a neokortexhez (lásd 1F és 4D ábra). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a neokortexben közvetlenül az első tanulás után bekövetkező sejtfolyamatok szükségesek a rendszermemória-konszolidációs folyamatba való felvételéhez. Ez az elképzelés összhangban van azokkal a megállapításokkal, amelyek szerint néhány "címkézett" sejt aktiválódik a neokortexben, amikor naiv állatokban tanulnak, és távoli, de nem friss emlékek tárolására szolgál [7, 8, 12, 44]. További vizsgálatokra van szükség annak tisztázására, hogy ezek a sejtek a korábbi tanulást követően is betöltik-e ezt a szerepet, vagy részt vesznek-e a közelmúlt emlékeinek kialakításában is.

Eredetileg a rendszerkonszolidáció modellje ahhoz a további elképzeléshez vezetett, hogy a hippocampus gyorsan, míg a neokortex lassan tanulja meg az új információkat, de a későbbi vizsgálatok kimutatták, hogy a neokortex képes gyors tanulási folyamatokra is [3,20,21,53]. Adataink azt mutatták, hogy 2 különböző kéreg (Te2 és ACC) azonnal megtanulhat új információkat, ha korábban hasonló esemény történt.

Korábbi vizsgálataink szerint [10,16,17,34,43,45] a Te2 kifejezést az övhalló terület leghátsóbb régiójára használjuk, amely Zilles [24,25] vizsgálatai alapján többnyire magában foglalja. az időbeli társulás és az ektorhinális területek. Bár nem zárhatjuk ki, hogy eredményeink tükrözhetik a gyógyszerhatások hozzájárulását a környező régiókban is, nevezetesen a szomszédos látókéregben, az elsődleges hallókéregben és a perirhinalis kéregben, a naiv állatokon nyert adatok azt sugallják, hogy ezek elsősorban a Te inaktivációjának tudhatók be. .

Azt találtuk, hogy naiv állatokban a Te2 szükséges a távoli, de nem friss hallási emlékekhez, míg a szomszédos látókéreg inaktiválása nem befolyásolta a távoli hallási emlékeket [10]. Ezzel szemben az elsődleges és a Te2 kéreg együttes blokádja a közelmúltbeli memóriát is károsította [34]. Hasonlóképpen, az elülső perirhinális kéreg inaktiválása rontotta a félelememlékeket [32,54], míg a hátsó perirhinális kéreg inaktiválása nem volt hatással a közelmúltban [54] és a távoli [10] félelememlékekre.

Az ACC és a kontextuális félelem emlékei esetében is a szomszédos primer és szekunder motoros kéreg inaktiválása nem volt hatással a közelmúltbeli és távoli emlékekre [55], míg a szomszédos prelimbicus kéreg inaktiválása mind a közelmúltbeli, mind a távoli emlékeket rontotta [11].

Ami a kéregek memóriafolyamatokban betöltött szerepét illeti, a Te2 részt vesz a hangokkal párosított érzelmi érték memorizálásában [10,13,16,56]. Ezt az elképzelést a közelmúltban a magasabb rendű látókéregben is demonstrálták [57,58]. Másrészt az ACC emlékeket képezhet és tárolhat, de modulálhatja más kérgi területek aktivitását is [1–3,6].

Annak ellenére, hogy számos tanulmány kimutatta, hogy a Te2 és az ACC szükségesek a távoli, de nem közelmúltbeli emlékekhez, néhány közelmúltbeli tanulmány arról számolt be, hogy ezek a kéregek szükségesek lehetnek a közelmúltbeli hallási [34,59] és kontextuális [55] félelememlékek megőrzéséhez is. A pontos peremfeltételek, amelyek meghatározhatják ezeknek a kéregeknek a szükségességét a közelmúlt emlékei számára, kevéssé ismertek.

Az egyik tanulmány azt sugallta, hogy az érzelmi élmény intenzitása fontos szerepet játszhat [34], de a jövőbeli tanulmányoknak jobban foglalkozniuk kell ezzel a kérdéssel. A jövőbeni tanulmányoknak azt is tisztázniuk kell, hogy a naiv állatokban a neokortexben a tanulás hatására aktiválódó sejtek, amelyek távoli, de nem közelmúltbeli emlékek tárolására szolgálnak [7, 8, 12, 44], szintén betöltik-e ezt a szerepet a korábbi kísérletek nyomán. tanulást, vagy részt vesznek-e a közelmúlt emlékeinek kialakításában.

Ami a hippokampusz memóriafolyamatokban való részvételét illeti, itt azt találtuk, hogy a dorsalis hippocampus szükséges az új kontextuális emlékezet megtanulásához, még akkor is, ha korábban kontextuális tanulás történt. Hasonló eredményt figyeltek meg az alanyon belüli tervezés során olyan patkányokon, amelyek megtanulták a távoli és a közelmúltbeli kontextuális emlékeket [60]. Másrészt azt is kimutatták, hogy a hippocampusban a későbbi tanulást közvetítő sejtmechanizmusok eltérhetnek az előző tanulási kísérletben részt vevőktől [22,61].

Azt is megállapítottuk, hogy azokban az állatokban, amelyek először tapasztaltak kontextuális félelmet, a hippocampusra a tanulás után 1 héttel is szükség van, összhangban a naiv állatokon végzett korábbi megállapításokkal [46]. Ezzel szemben a másik csoportban a hippocampális elváltozások nem befolyásolták a memória megtartását ebben az időintervallumban, ami arra utal, hogy a korábbi félelemtanulás lerövidíti a hippocampális érintettség időablakát, amint azt a térbeli tanulásnál is megfigyelték [3,20,21]. Ezek a tanulmányok és a mostani tehát egybehangzó bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a hippocampális elváltozások által kiváltott időbeli amnézia időablakja a térbeli és érzelmi emlékekben szerzett korábbi tapasztalatoktól függ.

Ezekben a tanulmányokban a szerzők azt is javasolták, hogy a patkányok hosszabb ideig tartó tréningje egy térbeli feladatban a tudás "mentális" sémáját hozza létre, ahol az új kapcsolódó információk gyorsan asszimilálhatók [3,20,21,53]. Bár eredményeink összhangban lehetnek ezzel az elképzeléssel, nagyon nehéz megmondani, hogy a félelemtanulás egy-egy kísérlete képes-e a tudás asszociatív "sémáját" kialakítani, és hogy egy más környezetben bekövetkező új és más esemény integrálható-e ebbe a sémába. . A kérdés tisztázásához további vizsgálatokra van szükség. Mindenesetre, tekintettel arra, hogy az emberekben és más állatokban a legtöbb emlék a múltbeli tapasztalatokra épül, azok az agyi hálózatok, amelyek először tárolnak távoli félelem emlékeket, azok lehetnek, amelyek a közelmúltbeli és a távoli félelem emlékeit egyaránt kódolják az élet során.

Módszerek kísérleti modell és alany részletei

Állatok

Egészséges hím Wistar patkányokat (65-70 napos; súly: 250-350 g, vad típusú), amelyek belső állattenyésztésből származnak, ketrecenként 3-at helyeztek el, ahol ad libitum élelem és víz állt rendelkezésre, 12 órás fény alatt. /sötét ciklus (a világítás reggel 7:00 órakor világít) 22 ± 1˚C állandó hőmérsékleten. Az összes kísérletet jóváhagyta az olasz egészségügyi minisztérium (408/2020-PR engedély) és a Torinói Egyetem helyi bioetikai bizottsága.

Kísérleti terv

Az adatok reprodukálhatóságát különböző ismétlésekkel értékeltük (S1 táblázat). Az első CNQX inaktivációs kísérleteket Te2-ben (1A–1C. ábra) több ismétlésben végeztük el, mivel ezek voltak az első kísérletek, amelyeket végeztünk, és a vizsgálatunk fő hipotézisének tesztelésére szolgáltak. Az állatokat eleve különböző viselkedési csoportokba sorolták, súly-kiegyensúlyozott módon.

Az azonos ivadékból származó hím állatokat véletlenszerűen besoroltuk minden kísérleti csoportba. Elsőként tanulmányunk fő hipotézisével foglalkoztunk, azaz a kérgi inaktiváció eltérően befolyásolhatja az új félelememlékezet megszilárdulását kísérletileg naiv patkányokban és olyan állatokban, amelyek korábban megtanultak egy félelmet. Az e csoportok közötti statisztikai különbségek esetén végül további kontrollcsoportokat végeztünk sóoldat befecskendezésével. Hasonló megközelítést alkalmaztunk az optogenetikai kísérleteknél is, ahol az AAV-kontroll csoportot csak a naiv és korábban betanított patkányok közötti statisztikai különbségek kimutatása után végeztük. Ezek a kísérleti ütemtervek lehetővé tették számunkra, hogy elkerüljük a szükségtelen kontrollcsoportokat és a szükségtelen állatok felhasználását, ami kulcsfontosságú kérdés az állatkísérletekre vonatkozó európai és olasz jogszabályokban (3 Rs elv).

Viselkedési eljárások

Valamennyi kísérletet a nap világos fázisában (8:00-16:00) végeztük. Az állatokat külön-külön szállították a létesítményből a kísérleti helyiségekbe, különböző kis átlátszó vödrökben, a kísérleti igényektől függően.

Auditív tréning: Első viselkedési foglalkozás.

Auditív félelem kondicionált állatok (CS1-CS2). Ebben a csoportban a patkányokat óvatosan kivettük otthoni ketrecükből, és a tárolóhelyiségből a hangszigetelt helyiségbe vitték. Miután megérkeztek, az állatokat a kondicionáló berendezésbe helyezték, amely egy téglalap alakú fekete ketrecből (35 × 4{15}} cm) állt, és rozsdamentes acél rudak ráccsal (1 cm átmérőjű, 1,5 cm távolságra vannak egymástól) csatlakoztatva a sokkolóhoz. beállít. A patkányokat 1 percig zavartalanul hagytuk. Ez után az idő után 7 kondicionált ingert (CS-t) adtunk be, amelyek 15 kHz-es tiszta hangból álltak (egyenként 15 másodperc időtartamú, 80 dB, 36 másodperces próbaidőköz). Mindegyik hang utolsó 1 másodperce fájdalmas UH-vel párosult (0,5 mA, 1 s). A kondicionálás végén a patkányokat visszavitték otthoni ketrecükbe.

Csak sokkhatású állatok (sokk-CS2). Ebben a csoportban a patkányokat hasonló módon ugyanabba a kondicionáló berendezésbe helyezték. Közvetlenül ezt követően mindegyik patkányt közvetlenül egymás után 7-lábsokkoknak (1 s, 0,5 mA) vetettük alá. A stimuláció végén az állatokat visszavitték otthoni ketrecükbe. A kondicionáló ketrecben az időtartósság kevesebb volt, mint 9 másodperc. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy ez az eljárás lehetővé teszi a fájdalmas ingerek és a szenzoros ingerek közötti asszociációs folyamatok elkerülését [29,30].

Szag-félelem kondicionált állatok (szag-CS2). Ebben a csoportban a patkányokat ugyanabba a téglalap alakú fekete ketrecbe helyeztük, amelyet a fenti kísérleti csoportokban alkalmaztunk, és sokkoló berendezéshez csatlakoztattuk. A patkányokat 2 percig zavartalanul hagytuk. Ez után az idő után 7 vanília szagokból álló CS-t adtak be (egyenként 10 másodperc időtartamú, 24 másodperces próbaidőszak). Mindegyik szag utolsó 1 másodperce fájdalmas UH-vel párosult (0,5 mA, 1 s). A kondicionáló modult lélegeztetőforrás közelébe helyeztük, hogy elkerüljük a leadott ingerek fennmaradását azok eltolódása után. A ketrec felső ráccsal volt biztosítva. A szagokat áramlásos hígítású olfactométerrel mutattuk be. A tiszta levegőt (1,5 l/perc) egy mágnesszelephez irányítottuk, amely működés közben a levegőt egy 15 ml-es, 10 ml vanília szagú palackba vezette.

Csak tónusú állatok (Tone-CS2). Az ebbe a csoportba tartozó patkányokat ugyanabba a fekete ketrecbe helyezték, és a 15-kHz-es hangot (7 inger, 15 s időtartam, 36 s ITI) mutatták be az Egyesült Államok távollétében.

Előre kitett állatok (Tone-CS1-CS2). A patkányokat a kondicionáló ketrecbe helyezték, és 1 perccel később 20-szor csak a 15- kHz-es hangot adták nekik, majd 24 órával később ugyanezt a hangot párosították azzal, hogy az USA-ból a CS1 lett.

Fehér zaj félelem kondicionált állatok (WN-CS2). Ebben a csoportban a patkányokat a téglalap alakú fekete ketrecbe helyeztük, és 1 percig zavartalanul hagytuk őket. Ez után az idő után 7 WN-ből álló CS-t (egyenként 15 s időtartamú, 75 dB, 36 s a kísérletek közötti intervallum) adtak be. Mindegyik hang utolsó 1 másodperce fájdalmas UH-vel párosult (0,5 mA, 1 s). A kondicionálás végén a patkányokat visszavitték otthoni ketrecükbe.

Auditív félelem tanulása: Második viselkedési tréning.

Két héttel a fenti bekezdésben leírt eljárások után az állatokat egy másik, eltérő hallási félelem kondicionáló feladatra képezték ki. A patkányokat egy szabványos nyúzódobozba helyeztük, mint az előző munkánkban [10], és 2 percig zavartalanul hagytuk. Ez után az idő után 7 CS-t adtak le, amelyek 3 kHz frekvenciájú tiszta hangokból álltak (egyenként 8 s időtartamú, 80 dB, 22 s próbaközi intervallum). Mindegyik hang utolsó 1 másodperce fájdalmas UH-vel párosult (0,5 mA, 1 s). A kondicionálás végén a patkányokat visszavitték otthoni ketrecükbe.

Félelem a memória megtartásától. A közelmúltban a CS2-re (3 kHz) szerzett hallási félelem-memória megtartását 4 nappal később tesztelték. Az optogenetikai kísérleteknél a legutóbbi memória tesztjét lézeres beadással végeztük 24 órával a CS2-US tanulás után, hasonlóan ahhoz az időintervallumhoz, amelyen belül a CNQX beadásával elvégeztük a kérgi inaktiválást (azaz 24 órával azután kiképzés). A patkányokat a kondicionáláshoz használttól eltérő berendezéshez szoktatták, és egy másik helyiségbe helyezték, hogy elkerüljék a feltételekhez kötött félelmet a kontextuális jelzésekre [10,62]. Az új készülék egy átlátszó műanyag kalitkából állt, amelynek feketére festett oldala egy elszívó ventilátorral ellátott hangcsillapító dobozba zárt, amely kiküszöbölte a szagú levegőt a burkolatból, és 60 dB-es háttérzajt biztosított. Az állatok a szoktatás ideje alatt napi 5 percig felfedezhették a ketrecet. A félelemmemória-megtartási teszt napján, 2 perc szabad felfedezés után, 4 db 3 kHz-es (8 s-22 ITI) CS2-t szállítottunk le, amelyet egyetlen US sem követett.

Ha a kísérleti igény megkívánta, a patkányokon megvizsgálták a távoli félelem-memória megtartását, amelyet 2 héttel a második hallási félelem kondicionálási kísérlete előtt szereztek. Ebből a célból 7 nappal a 3-kHz-es tónusú félelem-memóriamegtartási teszt után az állatokat új környezetbe (fekete-fehér csíkos ketrecbe) helyezték, majd bemutatták a 15-kHz-es hangot. Négy hangot adtak elő 36 másodperces időközönként.

Kontextuális tréning: Első viselkedési foglalkozás.

Kontextuális félelem kondicionáló csoport (CtxA-CtxB). Ebben a csoportban a patkányokat óvatosan kivettük otthoni ketrecükből, vödörbe helyezték, és a tárolóhelyiségből a hangszigetelt helyiségbe vitték. Miután ott voltak, az állatokat a kondicionáló berendezésbe helyezték, amely a fent említett téglalap alakú fekete ketrecből állt, és rozsdamentes acél rudak ráccsal voltak felszerelve, és egy sokkoló berendezéshez csatlakoztak. A patkányokat 1 percig zavartalanul hagytuk. Ez után az idő után 5 US-t (0,5 mA, 1 s) adtunk be 51 másodperces időközökkel. A foglalkozás végén az állatokat visszavitték otthoni ketrecükbe.

Csak sokk-csoport (sokk-CtxB). A patkányok, miután a kondicionáló berendezésbe kerültek, azonnal 5-lábütéseket (1 s, 0,5 mA) kaptak egymás után. Az időtartósság a kondicionáló ketrecben kevesebb, mint 7 másodperc volt. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy ez az eljárás lehetővé teszi a fájdalmas ingerek és a szenzoros ingerek közötti asszociációs folyamatok elkerülését [29,30].

Csak kontextus szerinti állatok (context-CtxB). A patkányokat ugyanabba a fekete ketrecbe helyeztük, amelyet a fenti kísérletekben használtunk 5 percre, anélkül, hogy UH-t adtak volna ki.

Új kontextuális félelem-kondicionálás és közelmúltbeli félelem-memória megtartása. Két héttel a fenti bekezdésben leírt eljárások után minden csoportot megtanítottak arra, hogy egy új kontextuális környezetet (a skinner box modult, egy másik helyiségbe helyezve) társítsanak fájdalmas UH-hez (0,5 mA, 1 s). . Mindegyik állatot az új kamrába helyeztük, és 2 percig zavartalanul hagytuk. Ezután 5 US-nak tették ki, 30 másodperces időközökkel elválasztva.

A kontextuális félelem-memória megtartását 4 nappal a félelem kondicionálási eljárása után teszteltük úgy, hogy a patkányokat ismét a Skinner dobozkamrába helyeztük 3 percre. Az optogenetikai kísérletekhez a legutóbbi memória tesztjét lézeres beadással végeztük 24 órával a CtxB-US tanulás után, hasonlóan ahhoz az időintervallumhoz, amelyen belül a kérgi inaktiválást végrehajtottuk a CNQX beadásával (azaz 24 órával az edzés után). Ha a kísérleti igény megkívánta, a patkányokat tesztelték a távoli félelem-memória megtartására úgy, hogy az állatokat az Egyesült Államokkal párosított kontextusba helyezték 2 héttel az új asszociáció előtt.

Az állatokat 2 különböző vödörben vittük a kondicionáló kamrákba a különböző kontextuális eljárások szerint.

Fagyasztó intézkedés. Valamennyi kísérleti eljárásban a félelem-memória megtartásának értékelését lefagyási válaszként határozták meg [10], a szomatikus mobilitás teljes hiányaként elemezték, kivéve a légzési mozgásokat. Minden egyes állat esetében a fagyasztásban eltöltött időt (másodpercben) 2 független megfigyelő mérte offline állapotban, akik vakok voltak az állatcsoportokra.

For more information:1950477648nn@gmail.com