Az alfa-liponsav védő hatásai a 5-fluorouracil által kiváltott gyomor-bélrendszeri nyálkahártya-gyulladás ellen patkányokban 1. rész

Absztrakt: Az alfa-liponsavat (ALA) széles körben használják multivitamin formulákban és öregedésgátló termékekben. Ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy megvizsgálja az ALA potenciális védő előnyeit a 5-fluorouracil (5-FU) által kiváltott gyomor-bélrendszeri nyálkahártya-gyulladás ellen Wistar albínó patkányokban. A gyomorból, a vékonybélből és a vastagbélből kimetszett szöveteket, és vérszérumot vettünk az olyan biokémiai mutatók azonosítására, mint a TNF-, IL-1, MDA, GPx, SOD, MMP-1, {{ 8}}, -8 és TIMP{10}}. Szövetszövettani vizsgálatot is végeztek. Az eredmények a nyálkahártyagyulladás miatt emelkedett TNF-, IL-1, MDA, MMP-1, -2, -8 és TIMP-1 szinteket mutattak ki mind a szövetekben, mind a szérumban és ezek az értékek drámaian csökkentek az ALA kezelést követően. A csökkent SOD és GPx aktivitások a mucositis csoportokban megfordultak az ALA-val kezelt csoportokban. A gyomor és a vékonybél nyálkahártyagyulladása által okozott károsodás az ALA-val kezelt csoportban a hisztopatológiai értékelés szerint visszafejlődött. Következésképpen az ALA-kiegészítés alkalmazása a 5-FU-terápiában védő beavatkozásként működhet a gyomor-bélrendszeri nyálkahártya-gyulladásban szenvedő rákos betegeknél. Az eredmények fényében az ALA, egy élelmiszerből származó, pleiotróp tulajdonságokkal rendelkező antioxidáns hatékony kezelést jelenthet a 5-FU által kiváltott gyomor-bélrendszeri nyálkahártya-gyulladásban, és megelőzheti az oxidatív stresszt, a gyulladást és a szövetkárosodást olyan rákos betegeknél, akik {{ 24}}FU-terápia.

A cisztanche glikozidja növelheti az SOD aktivitását a szív- és májszövetekben, és jelentősen csökkentheti az egyes szövetek lipofuscin- és MDA-tartalmát, hatékonyan megkötve a különböző reaktív oxigéngyököket (OH-, H2O₂ stb.) és megvédheti a DNS-károsodást. OH-gyökök által. A Cistanche feniletanoid glikozidok robusztus szabadgyök-megkötő képességgel rendelkeznek, nagyobb redukáló képességgel rendelkeznek, mint a C-vitamin, javítják a sperma szuszpenzióban lévő SOD aktivitását, csökkentik az MDA-tartalmat, és bizonyos védőhatást fejtenek ki a spermium membrán funkciójára. A cistanche poliszacharidok fokozhatják a SOD és a GSH-Px aktivitását a D-galaktóz által okozott kísérletileg öregedő egerek eritrocitáiban és tüdőszöveteiben, valamint csökkenthetik a tüdő és a plazma MDA- és kollagéntartalmát, valamint növelhetik az elasztintartalmat. jó eltávolító hatás a DPPH-ra, meghosszabbítja a hipoxia idejét öregedő egerekben, javítja a SOD aktivitását a szérumban, és késlelteti a tüdő fiziológiás degenerációját kísérletileg öregedő egerekben A sejtmorfológiai degenerációval a kísérletek kimutatták, hogy a Cistanche jó antioxidáns képességgel rendelkezik és potenciálisan gyógyszer lehet a bőröregedési betegségek megelőzésére és kezelésére. Ugyanakkor a Cistanche-ban található echinakozid jelentős mértékben képes megkötni a DPPH szabad gyököket, és képes megkötni a reaktív oxigénfajtákat, megakadályozza a szabad gyökök által kiváltott kollagén lebomlását, valamint jó javító hatással van a timin szabad gyökök anionjainak károsodására.

Kattintson a Cistanche Tubulosa elemre

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Bemutatkozás

Az alfa-liponsav (ALA) számos élelmiszerben megtalálható, beleértve a zöldségeket (spenót, brokkoli, paradicsom) és a húsokat (különösen a zsigerekben), valamint számos táplálék-kiegészítőt [1,2]. Az ALA számos antioxidáns hatással rendelkezik, beleértve az endogén antioxidáns mechanizmusok aktiválását és a fémionok, például a vas, a cink és a réz kelátképzését [3,4]. Szerves kénmolekulaként az ALA képes megkötni a reaktív oxigénfajtákat (ROS) és fokozza a szöveti antioxidáns enzimek, például a glutation-peroxidáz (GPx) és a szuperoxid-diszmutáz (SOD) aktivitását [5–7]. Antioxidáns tulajdonságai miatt az ALA-ról kimutatták, hogy csökkenti az ALA-függő sejthalált tüdőrákban [8], emlőrákban [9] és vastagbélrákban [10]. Ezenkívül korábbi kutatások kimutatták, hogy az ALA gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkezik [11–16]. Az ALA csökkenti a gyulladást a gyulladásos citokinek, például a tumornekrózis faktor-alfa (TNF-) és az interleukin-1 (IL-1) expressziójának modulálásával [17,18]. Az ALA farmakológiai előnyeit a gyógyszerekkel kapcsolatos számos területen igazolták, beleértve a szív- és érrendszeri, neuroprotektív, kognitív és öregedésgátló modelleket [19].

A rák a halálozás vezető oka minden országban, és a hosszú élettartam egyik fő akadálya [20]. A kemoterápiás gyógyszerek mellékhatásai az egyik legfontosabb legyengítő tényező a rák elleni küzdelemben, a nyálkahártya-gyulladás pedig a rákos betegek egyik legelterjedtebb betegsége [21]. A mucositis egy kóros gyulladásos állapot, amelyet a gyomor-bélrendszer nyálkahártyájának fekélyesedése és gyulladása jellemez [22]. A nyálkahártya-gyulladás növeli az opioid fájdalomcsillapítók alkalmazását a fájdalom miatt, és felgyorsítja a teljes parenterális táplálkozásra való átállást táplálkozási problémák miatt [23]. A nyálkahártya-gyulladás és a nyálkahártya-gyulladással összefüggő nehézségek rontják a beteg életminőségét, míg az életveszélyes állapotok kialakulása és a terápiára adott negatív válaszok aggodalomra adnak okot az elváltozások rossz kezelése miatt [24].

A gyomor-bélrendszeri rosszindulatú daganatok kezelésére leggyakrabban használt kemoterápiás gyógyszer a pirimidin analóg 5-fluorouracil (5-FU). 5-A FU rákellenes hatását a timidilát-szintáz (TS) gátlásával fejti ki, és metabolitjait RNS-be és DNS-be integrálja [25]. Ez a szer azonban gasztrointesztinális nyálkahártya-gyulladást vált ki, ami súlyos legyengítő mellékhatás [26]. Ezen káros hatások kialakulásában különösen az oxidáns-antioxidáns egyensúly lebomlása, a gyulladást elősegítő citokinszint emelkedése és a proteolitikus enzimaktivitás játszik nagy szerepet. Bár antioxidáns és gyulladáscsökkentő gyógyszereket alkalmaztak ennek a problémának a megoldására, egy különösen robusztus terápiás módszert még nem sikerült azonosítani [27,28].

A mai napig számos tanulmány számolt be a 5-FU és az ALA együttes alkalmazásáról különböző rákos megbetegedések esetén; ezek közé tartoznak a cervicalis és colorectalis daganatok [29,30]. Ezenkívül előnyösek lennének olyan kiegészítő gyógyszerek, amelyek beépíthetők a kezelési eljárásokba, hogy megakadályozzák a rákos betegeket a 5-FU által kiváltott gastrointestinalis mucositis káros hatásaitól. Így ennek a vizsgálatnak a célja az volt, hogy meghatározzuk az ALA alkalmazásának biológiai hatásait patkányokban a 5-FU által létrehozott nyálkahártyagyulladás-modellben, valamint megvizsgáljuk az ALA lehetséges alkalmazását a kezelési protokollokban.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatok

Az állatokat a Közel-Kelet Egyetem Állatkísérletek Osztályából vettük. A patkányokat (Wistar albino, mindkét nem) 12:12 órás sötét/világos ciklus alatt tartottuk kezdettől fogva 22 ± 2 ◦C szobahőmérsékleten, szabályozott páratartalmú helyiségben (50 ± 5 százalék). Az etetés ad libitum volt, a szokásos patkányeledel és ivóvíz korlátozása nélkül. A patkányokat plexi ketrecben tartottuk (ketrecenként 4 patkány 60 × 40 × 40 cm méretű). A vizsgálati protokollt a Közel-Kelet Egyetem Helyi Állatkísérletek Etikai Bizottsága engedélyezte (2019/01 számú jóváhagyás 2019. január 17-én és 2020/11 számú jóváhagyás 2020. november 27-én), valamint az 1964-es Helsinki Nyilatkozatban és annak későbbi módosításaiban említett etikai irányelvek. követték.

Harminckét, mindkét nemű, 200–250 g tömegű Wistar Albino patkányt négy, egyenként nyolc patkányból álló csoportba osztottak (n=8): Kontroll, ALA, Mucositis és Mucositis plusz ALA csoportok. A kontrollcsoport csak intraperitoneális (ip) sóoldatot (SF) kapott naponta egyszer egy héten keresztül. Az ALA-csoport csak ALA-t kapott 100 mg/ttkg ip. dózisban naponta egyszer, az 1. naptól számítva egy héten keresztül [31,32]. A Mucositis csoportot SF-vel (ip) kezelték az 1. napon és 400 mg/kg 5-FU-t ip a 2. naptól a kísérlet végéig [33]. A Mucositis plusz ALA csoport 100 mg/kg ip ALA-t kapott az 1. napon és 400 mg/kg ip 5-FU-t a 2. napon. Ezután a 100 mg/kg/nap ip. ALA adagolást a kísérlet végéig folytattuk. . Az állatokat egy hétig figyeltük, és ezalatt nem tapasztaltak elhullást. Az összes csoportban lévő állatokat a kutatási időszak végén elaltatták ketamin/xilazin túladagolás kombinációjával. A laboratóriumi vizsgálatokat a Közel-Kelet Egyetem Állatkórház Diagnosztikai Laboratóriumában és Szövettani Laboratóriumában végezték.

2.2. Vér- és szövetminták gyűjtése

Vérmintákat vettünk és szérumleválasztó csövekben juttattuk el a laboratóriumba. A szérummintákat 2000 × g-vel 10 percig elválasztottuk, és –80 ◦C-on tartottuk a további elemzésig. A felesleges vér eltávolítása érdekében a gyomrot, a vékonybél- és a vastagbélszöveteket összegyűjtöttük, és foszfát pufferoldattal (pH=7,4) öblítettük. Majd a laboratóriumba szállítás után homogenizálási eljáráson estek át. A szövethomogenizálást a gyártó protokollja szerint végeztük RIPA puffer (cikkszám: 10010263, tételszám: 0490889-1, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) és Dounce szövetőrlő készlet (D8938, Lot. 3110, Sigma) felhasználásával. -Aldrich, St. Louis, MO, USA) jégen. Homogenizálás után a mintákat 1600×g-vel centrifugáltuk 10 percig plusz 4 ◦C-on. A Bradford fehérjemeghatározási technikát alkalmazták a fehérjeszintek mennyiségi meghatározására a szövetmintákban, majd a felülúszókat -80 ◦C-on lefagyasztottuk a további vizsgálatokhoz.

2.3. Biokémiai indexek mérése

Az alanin transzamináz (ALT), aszpartát transzamináz (AST), alkalikus foszfatáz (ALP), laktát-dehidrogenáz (LDH), lipáz (LIP), amiláz (AMY), kreatinin, vér karbamid-nitrogén (BUN), összfehérje (TP) aktivitása , és az albuminszinteket biokémiai indexként mértük szérummintákban egy automata BS-240 VET Clinical Chemistry Analyzer (Mindray, Shenzhen, Kína) segítségével.

2.4. Citokinek mérése szérumokban és szövetekben

A TNF- és IL-1-koncentrációt a szérumokban és szövetmintákban a kereskedelemben kapható patkányspecifikus enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati (ELISA) tesztkészletek (ELR-TNF- és ELR-IL1 -, RayBiotech Life) segítségével mérték. Inc., Norcross, GA, USA) a gyártó utasításait követve.

2.5. Mátrix metalloproteinázok (MMP-k) és szöveti metalloproteináz-inhibitorok-1 (TIMP-1) mérése szérumokban és szövetekben

Az MMP-ket és a TIMP-t-1, amelyek számos biológiai folyamatban vesznek részt, mint például a rák és a gyulladás, szövethomogenizátumokban és szérumokban is mértük a gyártó utasításait és a kereskedelemben kapható patkányspecifikus ELISA-tesztek (MMP{) ajánlásait. {2}} E-EL-R0617; Elabscience, Wuhan, Kína; MMP-2 ELR-MMP2; MMP-8 ELR-MMP8; TIMP-1 ELR-TIMP-1 RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, USA). Az MMP-k és a TIMP{15}} szérumkoncentrációit pg/mL-ben, míg a szöveti szinteket pg/mg proteinben fejeztük ki.

2.6. Malondialdehid (MDA), GPx és SOD mérése szövetekben

A szövetekben az MDA-szinteket a kereskedelemben beszerezhető vizsgálati készletekkel értékeltük a lipidperoxidációs állapot meghatározására (TBARS Assay Kit, cikkszám: 10009055, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA). A mérési elv a tiobarbitursavval (TBA) forrásban lévő vízben, savas közegben 60 percig tartó reakción, valamint a reakcióelegy abszorbanciájának mérésén alapul 532 nm-en (Ohkawa et al., 1979). Az abszorbancia mérésére VersaMax Tunable Microplate Reader készüléket használtunk (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). A szövetek MDA-koncentrációit nmol MDA/mg fehérjeként fejeztük ki.

A szövetekben a GPx és SOD aktivitást felhasználásra kész vizsgálati készletekkel értékeltük. (RANSEL RS505, RANSOD SD125, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, Egyesült Királyság) automatizált BS-240 VET Clinical Chemistry Analyzer (Mindray, Shenzhen, Kína) segítségével. A szövetmintákban (gyomorban, vékonybélben és vastagbélben) a GPx és SOD mennyiségét U/mg proteinben fejeztük ki.

2.7. Hisztopatológiai értékelés

Közvetlenül a kísérleti időszak után nyert gyomor, vékonybél és vastagbél szöveteit 10 százalékos (v/v) semleges formalinban fixáltuk 24 órán át szobahőmérsékleten. Rögzítés után a szöveteket Leica TP1020 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Németország) szövetkövető készülékre helyeztük. A szövetkövető eszközről vett szöveteket ezután paraffinba ágyaztuk. A szövetekből egy Leica RM2255 mikrotómmal (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Németország) 5-µm vastag metszeteket vágtunk ki, és rutin hematoxilin és eozin (HE) festést végeztünk. A metszeteket hisztomorfológiailag Leica DM500 fénymikroszkóppal vizsgáltuk, amely a Leica Microsystem Framework integrált digitális képalkotó rendszerrel volt összekapcsolva (Leica Application Suite 3.0-s verzió, 38132019 sorozat, Leica ICC50 HD, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nußloch, Németország).

2.8. Statisztikai elemzések

A statisztikai elemzéshez GraphPad Prism szoftvert használtunk (7.04-es verzió, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Az adatokat átlag ± standard deviációban (X ± SD) fejeztük ki. Varianciaanalízis (ANOVA) tesztet használtunk az adatcsoportok összehasonlítására, majd Tukey többszörös összehasonlító tesztjét. Ezenkívül Kruskal–Wallis tesztet alkalmaztunk a csoportok hisztomorfológiai pontszámainak összehasonlítására. A p < 0,05 különbséget tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.

3. Eredmények

3.1. Az ALA pozitívan befolyásolja a biokémiai indexeket

Az 1. táblázat a szérum enzimaktivitást és a metabolitkoncentrációkat mutatja be. A Kontroll csoporthoz képest a Mucositis csoportban lényegesen magasabb volt az albumin, ALT, AST, ALP, LDH, amiláz, lipáz, BUN, kreatinin és TP szintje (p < 0.05). –0.0001). Ugyanakkor szignifikáns különbség volt az albumin, AST, ALT, ALP, LDH, BUN, kreatinin, amiláz, BUN és kreatinin szintjében az ALA plusz mucositis és a mucositis csoport között (p < 0,05-0,001). Az ALP, ALT, AST, LDH és amiláz szintjei is lényegesen különböztek a Mucositis és ALA csoportban (p < 0,05-0,0001). Ennek megfelelően a májenzimek, a hasnyálmirigy enzimek és a metabolitok szintje drámaian csökkent a mucositis csoportban, amikor ALA-t adtunk a kezeléshez.

3.2. Az ALA csökkenti a gyulladást elősegítő citokinek termelését

A gyulladást elősegítő citokinek TNF- és IL-1 szintje a szérum-, gyomor-, vékonybél- és vastagbélmintákban az 1. ábrán látható. A TNF- és IL-1 szint a szérumokban és az összes A Mucositis csoportba tartozó állatok szövetei szignifikánsan magasabbak voltak a kontroll, ALA és Mucositis plusz ALA csoporthoz képest (p < 0.05–0.0{ {17}}{{20}}1). Azonban a TNF- és IL-1 szintje a szérumban és az összes szövetben szignifikánsan csökkent a Mucositis plusz ALA csoportban a Mucositis csoporthoz képest (p < 0,05–0,0001). A Kontroll és a Mucositis plusz ALA csoportok között lényeges különbség volt a vékony- és vastagbélben a TNF-szintben. (p < 0,01). Szignifikáns különbségek voltak a vastag- és vékonybél TNF-szintjében is az ALA és Mucositis plusz ALA csoportok között. (p < 0,01, p < 0,001). Ezenkívül statisztikailag szignifikáns különbségek voltak a Kontroll és a Mucositis plusz ALA csoportok között a gyomor IL-1 szintjét tekintve (p < 0,05). Ezért úgy tűnt, hogy az ALA jelentősen elnyomja a gyulladást elősegítő citokinek szintjét mucositisben.

3.3. Az ALA kezelés csökkenti a lipidperoxidációt és növeli az antioxidáns enzimek aktivitását a szövetekben

Az MDA-szinteket, a GPx-et és az SOD-aktivitást számszerűsítettük a peroxidáció és az antioxidáns státusz szöveti szintű értékeléséhez (2. ábra). Az MDA szintek a Mucositis csoportban a gyomorban, a vékonybélben és a vastagbélben szignifikánsan magasabbak voltak, mint a kontroll, ALA és Mucositis plusz ALA csoportban (p < 0.05–0 .0001). Ezenkívül a Mucositis plusz ALA csoport vastagbelében az MDA szintje lényegesen eltér a kontroll és az ALA csoport szintjétől (p < 0,0001).

A kontroll- és ALA-csoport patkányainak SOD-szintje minden szövetben szignifikánsan magasabb volt, mint a mucositis csoportban (p < {{0}}.05–0.{{8) }}{{10}}01). A vastagbélminták SOD szintjei szignifikánsan különböztek az ALA és Mucositis plusz ALA csoportokban (p < 0,01). A gyomormintákban az SOD szintek szignifikánsan alacsonyabbak voltak az ALA és Mucositis plusz ALA csoportokban (p < 0,05). Ezenkívül a Mucositis csoportba tartozó patkányok vékonybelének SOD szintje lényegesen alacsonyabb volt, mint az ALA csoportban (p < 0,05). Mindazonáltal a Mucositis és Mucositis plusz ALA csoportba tartozó állatok gyomrában és vastagbelében az SOD szintje lényegesen különbözött (p < 0,05–0,0001).

3.4. Az ALA-kezelés növeli a szöveti MMP-k és a TIMP-szintet-1

Az MMP{{0}}, MMP-2, MMP-8 és TIMP-1 aktivitása (2. táblázat) a szérumban, a gyomorban, a vékonybélben és a vastagbélben szignifikánsan emelkedett magasabb a Mucositis csoportban, mint a kontroll és az ALA csoportban (p < 0.05–0,0001). Az MMP-1, MMP-2, MMP-8 és TIMP-1 szintjének növekedése a Mucositis patkányok szérumában, valamint a gyomrában, a vékonybélben és a vastagbélben szignifikánsan visszaszorult Mucositis plusz ALA patkányok (p < 0,05–0,0001), bár nem volt szignifikáns különbség a szérum MMP{17}} szintjében a Mucositis plusz ALA és a Mucositis csoportok között.