Az endothel őssejtek mikrovezikuláinak védő hatásai az Ang II által kiváltott patkány vesesejtek sérülésére
Mar 11, 2022
Absztrakt.A krónikus magas vérnyomás avesekárosodás,hypertoniás nephropathia vagy hypertoniás nephrosclerosis néven ismert. A hipertóniás nephropathia kialakulásának molekuláris mechanizmusainak további megértése elengedhetetlen a hatékony diagnózis és kezelés érdekében. A jelen tanulmány azokat a mechanizmusokat vizsgálta, amelyek révén az endothel progenitor sejtek (EPC-k) javítják a patkány elsődlegességétvesesejtek (PRK-k). ELISA-t, Cell Counting Kit-8-at és áramlási citometriás vizsgálatokat alkalmaztak az EPC-k vagy EPC-MV-k hatásának elemzésére az oxidatív stresszre, a gyulladásra, a sejtproliferációra, az apoptózisra és a PRK-k AngII által indukált ciklusára. A PRK sérülési modellt angiotenzin II (Ang II) felhasználásával hozták létre. Az Ang II indukciót követően a PRK proliferációja csökkent, az apoptózis fokozódott, és a sejtciklust blokkolták a G1 fázisban, mielőtt az S fázisba került volna. Megállapították, hogy a reaktív oxigénfajták és a malondialdehid szintje emelkedett, míg a glutation-peroxidáz és szuperoxid-diszmutáz szintje csökkent. Ezenkívül az IL-1, IL-6 és TNF- gyulladásos citokinek szintje jelentősen megemelkedett. Így az Ang II károsította a PRK-kat az oxidatív stressz stimulálásával és a gyulladásos válasz elősegítésével. Ha azonban a PRK-kat EPC-kkel együtt tenyésztették, az Ang II által kiváltott károsodás jelentősen csökkent. A jelenlegi tanulmány összegyűjtötte az EPC-k által szekretált mikrovezikulákat (MV-ket), és együtt tenyésztette őket Ang II-indukálta PRK-kkal, és megállapította, hogy az EPC-MV-k megőrizték védő hatásukat a PRK-kra. Összefoglalva, az EPC-k megvédik a PRK-kat az Ang II által kiváltott károsodástól a szekretált MV-kon keresztül.
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEBETEGSÉGET
Bevezetés
A hipertónia a szív- és érrendszeri és agyi érrendszeri megbetegedések előfordulásának, valamint az ezekkel összefüggő mortalitásnak kockázati tényezője (1). Azvesemagas vérnyomást okozhat, és a magas vérnyomás károsodásának egyik célszerve (2). KrónikusvesebetegségA (CKD) az elmúlt két évtizedben világszerte a magas vérnyomásban szenvedő egyének halálozásának növekedésének egyik fő oka volt (3,4). Ezért sürgős szükség van a hypertoniás nephropathia kezelésének elősegítésére és kóros mechanizmusának tanulmányozására. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az angiotenzin II (Ang II) érkárosodást váltott ki, és számos mechanizmuson keresztül kulcsszerepet játszott az érrendszeri betegségekben, mint például apoptózis indukálása (5), sejtciklus-leállás (6), reaktív oxigénfajták (ROS) szintjének növelése. 7), elősegíti az oxidatív stresszválaszt a malondialdehid (MDA) szekréciójának növelésével, valamint a glutation-peroxidáz (GSH-Px) és a szuperoxid-diszmutáz (SOD) szekréciójának csökkentésével (8,9). Az Ang II elősegíti a gyulladással kapcsolatos faktorok, például az IL-6, IL-1 és TNF- (10-12) termelését is. Az ang II által kiváltott károsodást ezért a magas vérnyomás in vitro modellezésére használták, beleértve az elsődleges patkányokat isvesesejtek (PRK-k) (13,14).
A betegek számáraveseműködésa peritubuláris mikrovezikulák (MV-k) elvesztésének fő okai az endothelsejtek károsodása, károsodása, valamint a regeneráció és helyreállítás csökkenése (15). A csontvelőből származó endoteliális progenitor sejtek (EPC) elősegíthetik az endothel helyreállítását (16, 17). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az EPC-k javíthatják a szív- és érrendszeri regenerációt (18) és szabályozhatják az angiogenezist (19), valamint terápiás hatást fejtenek ki az akut betegségekre.vese-ischaemia-reperfúziós károsodás (20) és betegeknélveseátültetés(21). Legjobb tudomásunk szerint azonban az EPC-k hypertoniás nephropathiára gyakorolt hatásáról korábban nem számoltak be. Feltételeztük, hogy az EPC-k védő hatást fejthetnek ki a hipertóniás nephropathiával szembenvese-sejteket. Az MV-ket folyamatosan választják ki a test különböző sejtjei, például hámsejtek, daganatsejtek és őssejtek, és számos testnedvben, például vérben, vizeletben és tejben találhatók, ahol biológiai funkciókat közvetítenek (22). A felhalmozódó bizonyítékok azt sugallják, hogy az EPC-k védő hatása szorosan összefügg az MV-k felszabadulásával (23,24). Jelen tanulmányban az EPC-MV-k lehetséges alkalmazását a hypertoniás nefropátia kezelésére a védőhatások és mechanizmusok vizsgálatával vizsgáltuk. amelyen keresztül az EPC-MV-k védelmet nyújtanak az Ang II által kiváltott PRK-sérülés ellen, hogy biológiai elméleti alapot biztosítsanak a hypertoniás nephropathia kezeléséhez.
Kulcsszavak:EPC-MV-k, hipertóniás nephropathia, Ang II, ROS, MV-k, gyulladás, vese, vese
Anyagok és metódusok
Állatok.Összesen 12 8-hetes hím Wistar-Kyoto (WKY) specifikus kórokozó-mentes patkányt (80-120 g súlyú) a Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.-től szereztünk be (engedély) sz. SCXK, Guangdong, 2015-0063). A patkányokat állandó hőmérsékletű és páratartalmú (hőmérséklet, 23±2˚C; páratartalom, 50±10 százalék) helyiségbe helyeztük 12 órás világos/sötét ciklus alatt, ahol ad libitum hozzáférhetett standard patkányeledelhez és vízhez. polisztirol ketrec. Valamennyi állatkísérletet jóváhagyott a Hainani Orvosi Egyetem Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (Haikou, Kína; jóváhagyási szám: HYLL-2021-053), és a National Institutes of Health irányelvei szerint végezték el (25).
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE/VESE MŰKÖDÉSÉT
A PRK-k elszigeteltsége és kultúrája.A vízhez szabad hozzáféréssel rendelkező WKY patkányok 12 órán keresztül koplaltak a kísérlet előtt. A WKY egereket pentobarbitál-nátrium intraperitoneális injekciójával (200 mg/ttkg) elaltattuk, majdveseaszeptikusan eltávolítottuk, és a corticalis része avesekimetszett és átültetett egy kis főzőpohárba. Azvese-a kérget ~1 mm3-es szövetfragmensekre vágtuk, háromszor mostuk PBS-sel (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), centrifugáltuk 1, 000 xg-vel 25 °C-on 5 percig, és a felülúszót elöntöttük. A szövetfragmenseket I-es típusú kollagenázhoz (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) adtuk 1 g/l végső koncentrációban, majd a szövetfragmenseket oszcilláltuk és 37 °C-on 3{10}} percig emésztettük. 200 mesh (0,075 mm) rozsdamentes acél szitán való szűrést követően a sejteket Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) sűrűséggradiens centrifugálással (26) választottuk el. 1,000 xg-vel, 25 °C-on 2 percig végzett centrifugálás után a közbenső szuszpenziót összegyűjtöttük, és MEM/F12 táptalajjal (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) összekevertük, 6 lyukú lemezre oltottuk és 37 °C-on tenyésztettük 5 százalékos CO2 alatt. 24 óra elteltével a táptalajt eltávolítottuk, friss táptalajra cseréltük, majd a nem rögzített táptalajtvese-sejteket és szöveteket eldobták. 48 óra elteltével a tápközeget ismét eltávolítottuk, a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és PRK-ként jelöltük őket (27, 28); a fő alkotóelem a patkány glomeruláris mezangiális sejtek voltak. A PRK-kat három generáción keresztül tenyésztettük, és Ang II-vel (1 µM; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) kezeltük 37 °C-on 24 órán át a PRK létrehozása érdekében.vesekárosodásmodell. Az Ang II által kiváltott gyulladás patkánybanvese-tubuláris epiteliális sejteket Nair és munkatársai (29) korábban leírtak szerint végeztek.
A PRK-kat immunfluoreszcens (IF) vizsgálattal azonosították.Miután háromszor öblítettük PBS-sel és 4 százalékos paraformaldehiddel fixáltuk 25 ˚C-on 1 órán át, a sejteket 2 órán át inkubáltuk (25 ˚C) Triton X-100-val, majd 5 százalékos BSA-val (Peking). Solar Science & Technology Co., Ltd.) 25°C-on 30 percig. A PRK-kat ezután egy éjszakán át sötétben inkubáltuk simaizom aktinnal (-SMA; 1 µg/ml; kat. sz. ab7817; Abcam) és vimentinnel (1:250; kat. sz. ab92547; Abcam) 4 °C-on. Háromszori öblítés után PBS-sel a sejteket Alexa Fluor® 488- (1:100; kat. sz. ab150077; Abcam) vagy 647-tel jelölt (1:200; kat. sz. ab150075; Abcam) másodlagos antitestekkel inkubáltuk 37 °C-on. ˚C 1 órán át. Ezután a sejteket DAPI-val (0,5 µg/ml; Beyotime Institute of Biotechnology) festettük 25 °C-on 5 percig. Végül fluoreszcens mikroszkóppal (nagyítás, 400; Leica Microsystems GmbH) rögzítettük a képeket.
Az EPC-k kultúrája és azonosítása.A patkány combcsontját és sípcsontját kimetszettük, és mindegyik csontvelőcsövet steril PBS-sel átöblítettük. A kapott keveréket centrifugáltuk (1, 000 xg; 25 °C; 15 perc), és a részecskéket újra szuszpendáltuk MEM/F12 tápközegben. A sejteket Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) sűrűséggradiens centrifugálással (1,000 xg; 25 ˚C; 20 perc) izoláltuk, és fibronektinnel bevont 25 cm2-es tenyészlombikba (BD Biosciences) helyeztük. A sejteket komplett tápközegben tartottuk standard körülmények között (37 °C; 5% CO2). A táptalajt 4 nap múlva cseréltük, és a tapadó sejteket további 3 napig tenyésztettük (30). Dil komplex acetilált alacsony sűrűségű lipoprotein (Dil-Ac-LDL) festést (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) használtak az EPC-k azonosítására. Az együtttenyésztési rendszerhez PRK-kat (1x104 ) adtunk egy ko-tenyésztő lemez (Corning, Inc.) alsó kamrájába 24 órára, majd Ang II-t (1 µM) vagy 200 µl PBS-t és EPC-ket (3 x 104 ) adtunk. hozzáadtuk a felső kamrához, és 37 °C-on 24 órán át inkubáltuk, mielőtt további sejtfunkciós elemzést végeznénk. A PRK-k és az EPC-k legjobb arányának szűrésekor a sejtszám aránya 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 és 1:7 volt.
EPC-MV-k előkészítése. Az EPC-ket 7 napig tenyésztettük a korábban leírtak szerint (30), kétszer mostuk PBS-sel, és 12 órán át szérum-éheztettük. Ezt követően a tenyésztett EPC-ket tartalmazó MEM/F12 táptalajt összegyűjtöttük és 4 °C-on centrifugáltuk (1,{6}} xg; 15 perc), majd a felülúszót 4 °C-on (100,{10}} xg); 60 perc) a szekretált EPC-MV-k összegyűjtésére. Pon 812 epoxigyantába (Structure Probe, Inc.) történő beágyazás után éjszakára 37 °C-ra helyeztük. Ezután elektronmikroszkópos fixáló oldatot (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) adtunk hozzá 4 órára, majd urán-acetátot (2 százalék; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) és ólom-citrátot (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) adtunk hozzá. ) 25 °C-on 15 percig festettek. Az MV-ket transzmissziós elektronmikroszkóppal igazoltuk. Az együtttenyésztési rendszerben 50 µg/ml EPC-MV-t (31) adtunk egy Transwell vizsgálati lemez felső kamrájához, és parkokat adtunk az alsó kamrához a korábban leírtak szerint, és 24 órán át inkubáltuk.
Sejtproliferációs vizsgálat.A PRK-kat tripszinnel emésztettük, 96 lyukú lemezekre oltottuk 3x103 sejt/lyuk sűrűséggel, és 24 órán át tenyésztettük. Az optikai sűrűséget 450 nm-en mértük 10 µl Cell Counting Kit-8 reagenssel (CCK-8; Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) 37 °C-on 60 percig, a gyártó utasításai szerint, a sejtburjánzási sebesség.
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEFÁJDALÁST
Sejtapoptózis vizsgálat.A sejt apoptózis vizsgálatát Annexin V-FITC Apoptosis Detection készlettel (BD Biosciences) végeztük a gyártó utasításai szerint. A PRK-kat összegyűjtöttük, kétszer mostuk jéghideg PBS-sel (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), és újraszuszpendáltuk 500 µl kötőpufferben. Az újraszuszpendált PRK-kat ezután 5 µl Annexin V-FITC-vel és 5 µl PI-vel inkubáltuk sötétben 15 percig 23±2 °C-on. A sejtapoptózist áramlási citometriával (FCM; FACSCanto II; BD FACSChorus™ szoftver, verzió: 1.0; BD Biosciences) értékeltük.
EPC-MV és PRK fúzió.Annak megfigyelésére, hogy az EPC-MV-k fuzionáltak-e PRK-kkal, az EPC-MV-ket lipidmembránba ágyazott fluoreszcens festékkel (PKH26) jelöltük meg az együttes inkubáció előtt. Röviden, 50 µg/ml EPC-MV-ket 2 ml PKH26-tal (2x10-6 M; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) kombináltunk, és 23±2˚C-on 5 percig kevertük. A jelölt elegyet 2 ml 1%-os BSA-hoz (v) adtuk, és 100,{13}} xg-vel centrifugáltuk 4 °C-on 60 percig, majd hideg PBS-sel öblítettük. A csapadékot 1 ml MEM/F12 tápközegben szuszpendáltuk, hozzáadtuk a PRK-khoz, és 37 °C-on 24 órán át inkubáltuk. Végül 1 µg/ml DAPI-t adtunk a magfestéshez 25 °C-on 15 percig. A sejtképeket fluoreszcens mikroszkóppal (nagyítás, 400; Leica Microsystems GmbH) készítettük.
Sejtciklus vizsgálat.A sejtciklus-vizsgálatot a Cell Cycle Detection kit (BD Biosciences) segítségével végeztük. Az EPC-ket vagy PRK-kat (1x106 ) begyűjtöttük, kétszer mostuk PBS-sel, majd 500 µl 70%-os jéghideg etanolban 2 órán át 25 °C-on fixáltuk. A sejteket ezután kétszer mostuk hideg PBS-sel, és PI-ben (400 µl) és RNázban (100 µl) inkubáltuk 30 percig 37 °C-on, sötétben. A PI jelet FCM (FACSCanto II) segítségével detektáltuk. A G1, S és G2 fázisban lévő sejtek százalékos arányát FlowJo szoftverrel (10.0.6-os verzió; FlowJo LLC) megszámoltuk és összehasonlítottuk.
ROS mérés FCM-mel.A PRK-kat 60-70 százalékos összefolyásig tenyésztették, és tripszinezéssel gyűjtötték be. Minden sejtet 1,0 µM 2',7'-diklór-dihidrofluoreszcein-diacetáttal inkubáltunk 15 percig 37 °C-on. Ezután a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és FCM-en keresztül elemeztük a ROS kimutatására, 488 nm-es lézerrel a gerjesztéshez és egy 535 nm-es lézerrel a detektáláshoz.
ELISA.Centrifugálás (1,000 xg; 25˚C; 5 perc) után az egyes alcsoportok sejtfelülúszóját összegyűjtöttük az MDA, GSH-Px, SOD és a gyulladásos faktorok (IL-6, IL-) szintjének elemzésére. 1 és TNF- . A következő készleteket használtuk a gyártó utasításai szerint: Micro MDA assay kit (kat. sz. BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), GSH-Px assay kit (kat. sz. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), SOD aktivitásérzékelő készlet (kat. sz. BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), patkány IL-1 ELISA készlet (kat. sz. RLB{ {13}}; R&D Systems, Inc.), patkány IL-6 Quantikine ELISA készlet (katalógusszám: R6000B; R&D Systems, Inc.) és patkány TNF Quantikine ELISA készlet (katalógusszám: RTA00; R&D Systems, Inc.) ).
Statisztikai analízis.Minden kísérletet háromszor megismételtünk, és az összes adatot átlag ± SD-ben fejeztük ki. Az adatok elemzése az SPSS szoftver 21-es verziójával.{1}} (IBM Corp.) történt. A több csoport közötti különbségeket egyutas ANOVA és Dunnett post hoc teszt segítségével értékelték. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Eredmények
Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A). Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 százaléka, ami megerősíti, hogy az EPC-ket sikeresen izolálták. Az izolált PRK-kat IF-en (vimentin/-SMA) keresztül elemeztük. Az eredmények azt mutatták, hogy a vimentin/-SMA expressziós szintje a PRK-kban magas és pozitív volt, ami a PRK-k sikeres izolálására utal (1B. ábra).
Az EPC-k és a PRK-k optimális aránya.Megvizsgálták a különböző arányú PRK-k/EPC-k együttes tenyésztési rendszerben való kombinálásának hatását, és azt találták, hogy az 1:3 PRK-k/EPC-k arányában termesztett PRK-k nem mutattak nagyobb proliferációs rátát a 2: 1, 1:1 vagy 1:2 a PRK-k/EPC-k aránya (1C. ábra). Ezenkívül az EPC-k növekvő aránya (1:4, 1:5, 1:6 és 1:7) jelentős növekedést eredményezett a PRK proliferációjában az EPC-kéhez képest (1:3). Ezért a további vizsgálatokhoz 1:3 PRK/EPC arányt választottunk, hogy elkerüljük a túlzott EPC-k esetleges interferenciáját a következő kísérletekben.
Az EPC-kokultúra hatása az Ang II által kiváltott károsodásra.A PRK-kat (1x104 µl) 24 órával korábban beoltottuk egy Transwell lemez alsó részébe. A felső kamra 200 µl PBS-t tartalmazott a kontrollcsoportban és 200 µl EPC-t (3x104 µl) a kísérleti csoportban. Modelleznivesekárosodás,1 µM Ang II-t adtunk az alsó részhez. 24 óra elteltével CCK-8 és FCM vizsgálatokat végeztek a PRK-k proliferációs sebességének mérésére. Az EPC hiányában Ang II-t kapó PRK-k szignifikánsan csökkentek (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the="" g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">vesesejtmodell.
Az EPC-k megvédik a PRK-kat az Ang II által kiváltott károsodástól, megvizsgálták az Ang II által kiváltott oxidatív stressz szintjét az EPC-kkel együtt tenyésztett PRK-kban. Az FCM vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy az Ang II szignifikánsan megemelkedett (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).="" similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted="" mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c="" and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while="" prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">
Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 vs. PRKs:EPC, 2:1 csoport; * P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.="" (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;="" prks,="" primary="" rat="">vesesejtek; FCM, áramlási citometria; CCK-8, sejtszámláló készlet-8; Dil-Ac-LDL, Dil-komplex acetilezett alacsony sűrűségű lipoprotein; OD, optikai sűrűség; -SMA, -simaizom aktin; NS, nem jelentős. ellentétes eredményeket mutat ezen enzimek szekréciójával kapcsolatban. A ROS képződése ezért szerepet játszhat az Ang II által kiváltott sejtkárosodásban, és az EPC-kkel való együttes tenyésztéssel javítható.
Az Ang II a gyulladásos citokinek szekréciójának elősegítésével is károsíthatja a sejteket, míg az EPC-k megakadályozhatják a gyulladást (32). Ezt követően azt vizsgálták, hogy az Ang II elősegíti-e a gyulladásos citokinek szekrécióját PRK-kban, és hogy az EPC-k kifejthetik-e védő szerepüket a gyulladásos citokinek szekréciójának gátlásával. Az IL-1, IL-6 és TNF- szekréció jelentősen megnőtt a PRK-kban az Ang II hozzáadásával. Ezzel szemben az EPC-kkel együtt tenyésztett PRK-kban az IL-1, IL-6 és TNF- szintje (2E-G ábra) viszonylag alacsonyabb volt (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">
Az EPC-k védő hatását az MV-k fejtik ki.Azok a mechanizmusok, amelyeken keresztül az EPC-k védő hatást fejtenek ki az Ang II-indukáltakraveseA sejteket tovább elemeztük az MV-k EPC-kből történő izolálásával (3A. ábra). Az EPC-MV-ket PKH26-tal jelöltük, és az Ang II-vel együtt a PRK-khoz adtuk egy Transwell lemezen, a korábban leírtak szerint. PKH26 fluoreszcenciát észleltek a PRK-k citoplazmájában (3B. ábra), ami azt jelzi, hogy az EPC-MV-k egyesültek PRK-kkal. Aztán kiderült, hogy az EPC-MV-k gátolják az Ang II által kiváltott csökkent proliferációs rátát, elősegítette az apoptózist és a ciklus leállását a G1 fázisban (3C-E ábra). Az EPC-kkel együtt tenyésztett PRK-khoz hasonlóan az EPC-MV-k jelenlétében termesztett és Ang II-nek kitett PRK-k ROS- és MDA-szintje csökkent (4A. és B. ábra), GSH- és SOD-szintje emelkedett (4C. és D. ábra). és az IL-1, IL-6 és TNF- gyulladásos citokinek szekréciójának csökkenése (4E-G ábra), az Ang II csoporthoz képest.
Vita
Legjobb tudomásunk szerint a jelen tanulmány először bizonyította, hogy az EPC-k megvédhetik a PRK-kat az Ang II által kiváltott sejtkárosodástól. Ezt a védőhatást, legalábbis részben, az EPC-k által kiválasztott MV-k közvetítik, amelyek a ko-kultúra során egyesülnek a PRK-kkal. Az Ang II-nek kitett PRK-khoz dúsított MV-k hozzáadásával azt találták, hogy az EPC-MV-k önmagukban megvédhetik a PRK-kat az Ang II által kiváltott károsodástól az oxidatív stressz és a gyulladás gátlása révén. Az MV-ket membrán nanotörmelékként (0,05-1 µm) (33) definiálják, és aktiváció, stressz vagy apoptózis után válnak le a sejtfelszínről. Ezenkívül az MV-k különféle sejttípusokból származhatnak, például vérlemezkékből, endoteliális sejtekből, EPC-kből és fehérvérsejtekből (34, 35). Az MV-k specifikus sejtfelszíni markereket fejeznek ki, amelyek a származási sejttől és képződésüktől függően változnak, és gyulladásgátló, véralvadásgátló és angiogén hatást fejthetnek ki (36). Az EPC-kből felszabaduló MV-k hordozhatják szülősejtjük biológiai információit, és így hasonló funkciót fejtenek ki a célsejteken (33). Például az EPC-MV-k megvédik a szívizomsejteket az Ang II által kiváltott hipertrófiától és apoptózistól (28), javítják az endothel funkciót és az angiogenezist szabályozó képességet (37), valamint enyhítik az oxidatív stressz által kiváltott endoteliális diszfunkciót (38). Legjobb tudomásunk szerint azonban az EPC-MV-k hipertóniás nephropathiára gyakorolt hatásáról korábban nem számoltak be. Ezért jelen tanulmány célja az EPC-k és az EPC-MV-k lehetséges védőhatásainak vizsgálata voltvesesejtek sérülése.
Jelen tanulmányban egy PRK-sérülési modellt hoztak létre az Ang II-vel történő károsodás indukálásával. A korábbi jelentésekkel összhangban (26, 39) az Ang II csökkentette a PRK proliferációt, növelte az apoptózist és leállította a sejtciklust a G1 fázisban, mielőtt az S fázisba került. Ezen hipertóniával kapcsolatos markerek alapján arra a következtetésre jutottak, hogy az Ang II által kiváltott PRK hipertónia modellt sikeresen létrehozták. Ezenkívül megállapították, hogy az EPC-kkel való együtttenyésztés megvédte a PRK-kat az Ang II által kiváltott károsodástól. Az EPC-k PRK-kkal és Ang II-vel való együttes inkubációja után az oxidatív stressz enzimek és a gyulladásos faktorok szintje csökkent a PRK-kban. Így azok a lehetséges mechanizmusok, amelyeken keresztül az EPC-k kifejtik védő hatásukat a PRK-kra, magukban foglalhatják az oxidatív stressz és a gyulladás szabályozását. Legjobb tudomásunk szerint a jelenlegi tanulmány először bizonyította, hogy az EPC-k javíthatják az Ang II által kiváltott oxidatív stresszválaszt és a PRK-k gyulladását.
Az EPC-k hatékonyan védenekveseműködésCKD-ben (40), és fontos szerepet játszanak az érrendszeri integritás megőrzésében és az endothel sérülések helyreállításában (15), valamint csökkentik az érrendszeri szivárgást, javítják a szervek működését és növelik a túlélési arányt szepszisben (41). A felhalmozódó bizonyítékok arra utalnak, hogy az EPC-k védő szerepet játszhatnak az MV-k szekrécióján keresztül (37, 42, 43). Az EPC-MV-k PRK-kban való védőhatásának tesztelésére az EPC-MV-ket izoláltuk és PKH26-tal jelöltük, majd a jelölt MV-ket PRK-kkal és Ang II-vel együtt inkubáltuk. Az EPC-MV-k egyesültek a PRK-kkal, és jelentősen gátolták az oxidatív stresszválaszt és az Ang II által kiváltott gyulladást, és ezek az eredmények hasonlóak Fu és munkatársai eredményeihez (44). Az EPC-MV-k gátló hatása az oxidatív stressz enzimek szintjére nagyobb volt, mint az EPC-ké önmagában; ez annak tudható be, hogy az MV-k nagyobb koncentrációban vannak jelen az EPC-MV-vel kezelt PRK-kban, mint az EPC-kkel együtt tenyésztettekben. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az EPC-k PRK-kra kifejtett védő hatása az Ang II által kiváltott sejtkárosodással szemben a szekretált MV-ktől függhet. A jelen tanulmány korlátja, hogy nem vizsgálták teljes mértékben azokat a lehetséges mechanizmusokat, amelyeken keresztül az EPC-MV-k szabályozzák a mikroRNS-eket/mRNS-eket/jelátviteli tengelyeket. Az a szerep és mechanizmusok, amelyeken keresztül az EPC-MV-k védelmet nyújtanakvesekárosodásA hipertóniás nephropathia állatmodelljében kell értékelni, ami ígéretes irány a jövőbeli kutatások számára. Összefoglalva, a jelen tanulmány kimutatta, hogy az EPC-k megvédhetik a PRK-kat az Ang II által kiváltott oxidatív stressztől és a fokozott gyulladástól az MV-k szekrécióján keresztül. Ez új irányt ad a hypertoniás nephropathia kezelésében, és in vitro modellt hoz létre a tanulmányozáshoz.vese sérülés.
