A neuritdegeneráció számszerűsítése fokozott pontossággal és hatékonysággal a Parkinson-kór in vitro modelljében 2. rész

Eredmények

A PD-vel kapcsolatos neuritdegeneráció sejtkultúra-modelljének felállítása

A PD sejtkultúra modelljében a neurit degeneráció vizsgálatára szolgáló módszer kidolgozásához tenyésztett LUHMES sejteket, feltételesen halhatatlanná tett humán mesencephalis sejtek populációját használtuk. A differenciálódás során a LUHMES sejtek posztmitotikussá válnak, az érett dopaminerg neuronokra jellemző génexpressziós profilt vesznek fel, és neuronális morfológiát alakítanak ki akár 500 mm hosszúságú neuritokkal (1A. ábra; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011; Kraemer et al., 2021).

A neurodegeneráció, egy olyan állapot, amelyben az idegsejtek mutálódnak vagy elpusztulnak, szorosan összefügg a memóriával. Sejttenyésztési modellekben szabályozhatjuk a tenyésztési körülményeket, hogy enyhítsük a neurodegeneráció kifejeződését és ezáltal javítsuk a memória teljesítményét.

Tanulmányok kimutatták, hogy az idegsejtek homeosztázisa fontos szerepet játszik a sejtek túlélésében és a rendszer működésében. A sejtek stabilitását úgy tudjuk javítani, ha a tápközegben olyan tényezőket szabályozunk, mint a tápanyagok és a növekedési faktorok. Ugyanakkor ügyeljen a tenyésztési környezet tisztaságának és hőmérséklet-szabályozásának megőrzésére, hogy megakadályozza a sejtek megzavarását és károsodását a környezet által.

Emellett a sejttenyésztési modellben bizonyos vegyületeket vagy gyógyszereket is befecskendezhetünk a sejtekbe, hogy csökkentsük a neuromoduláció kifejeződését, ezáltal javítva a sejtek túlélési arányát és memóriateljesítményét. Ezt a technikát széles körben alkalmazzák a neurodegeneratív betegségek tanulmányozásában is.

Röviden, a neurodegeneráció fontos hatással van a sejtek stabilitására és a rendszer működésére, és a sejtkultúra-technológia egy jó modellkutatási módszer, amely mélyreható feltárást és kutatást végezhet a neurodegeneráció és a memória kapcsolatáról. A neuromodulációs teljesítményt a környezetkontroll ápolásával, gyógyszerek sejtekbe történő befecskendezésével stb. tudjuk enyhíteni, hogy javítsuk a sejtek túlélését és a memória teljesítményét, és átfogóbb alapot biztosítsunk a neurodegeneratív betegségek vizsgálatához. Látható, hogy javítanunk kell a memóriánkat. A Cistanche jelentősen javíthatja a memóriánkat, mert a Cistanche szabályozhatja a neurotranszmitterek egyensúlyát is, például növelheti az acetilkolin és a növekedési faktorok szintjét, amelyek nagyon fontosak a memória és a tanulás szempontjából. Ezenkívül a hús javíthatja a véráramlást és elősegítheti az oxigénszállítást, ami biztosítja, hogy az agy elegendő tápanyaghoz és energiához jusson, ezáltal javítva az agy vitalitását és állóképességét.

Kattintson a know-kiegészítőkre a memória javítása érdekében

Az üvegnek a műanyaghoz képest kiváló optikai tulajdonságai miatt a tenyészeteket nyolc közegkamrát tartalmazó üveglemezeken hoztuk létre. Korábbi jelentések alapján (Lotharius és mtsai, 2005; Scholz et al., 2011; Kurowska és mtsai, 2014) kezdetben PLO-val és fibronektinnel bevont kamralemezeken próbáltunk tenyészeteket létrehozni; azonban az ilyen tenyészetek adhéziós hiányt és alacsony életképességet mutattak. Ennek eredményeként megvizsgáltuk, hogy a további szubsztrátokkal való bevonás javítja-e az üvegfelületeken létesített LUHMES sejttenyészetek életképességét.

A LUHMES sejttenyészeteket bevonat nélküli vagy PLO-val és fibronektinnel, PDL-lel és lamininnel, vagy mind a négy szubsztrát kombinációjával bevont tárgylemezeken hoztuk létre. Az életképes sejtmagok fluoreszcens mikroszkópos elemzése feltárta, hogy a tárgylemez bevonása jelentősen befolyásolta a tenyészetek életképességét [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001], a post hoc többszörös összehasonlító elemzések pedig azt mutatták, hogy a tárgylemezek mind a négy fent említett szubsztrát kombinációjával bevonva szignifikánsan nagyobb arányban jelennek meg az életképes sejtek, mint a csak PLO-val és fibronektinnel bevont tárgylemezekkel (p{5}}.0437; 1B, C ábra).

A LUHMES sejtek üveglemezeken történő tenyésztéséhez optimális bevonó szubsztrátumok azonosítása után értékeltük a sejtsűrűség hatását a tenyészetek alkalmasságára neurit degeneráció mérésére. A LUHMES sejteket differenciáló tápközegben tenyésztettük 57 500 sejt/lyuk, 115 000 sejt/lyuk vagy 230 000 sejt/lyuk, és a differenciálódás ötödik napján a sejteket. 4%-os PFA-val rögzítettük és fáziskontraszt mikroszkóppal leképeztük.

A lyukonkénti 57 500 sejt sűrűsége rosszul hálózatba kötött neuritokkal és szabálytalan neuritmorfológiájú tenyészeteket eredményezett, míg a 230,000 sejtes lemezsűrűséggel létrehozott tenyészetek, bár életképesek, túl magas neuritsűrűséget tartalmaztak a pontos neuritméréshez. A lyukonként 115,{5}} sejt köztes sejtsűrűség magas életképességet és jól elkülönülő axonpályákat biztosított, amelyek elősegítik a pontos neuritdegenerációs méréseket (1D. ábra).

A PD-vel összefüggő neuritdegeneráció in vitro modellezéséhez a differenciált LUHMES sejteket 6-OHDA-nak, egy széles körben használt neurotoxinnak tesszük ki, amely elősegíti az oxidatív stresszt és a katekolaminerg neuronok degenerációját (Bové és Perier, 2012). A differenciált LUHMES sejtek 6-OHDA-nak való kitétele elősegítette a neuritdegeneráció dózisfüggő növekedését, az 5,0 mM 6-OHDA és a 7,5 mM 6-OHDA mérsékelt, illetve súlyos neuritdegenerációt indukált (1. ábra). 2F). Az 6-OHDA hatásnak kitett LUHMES-sejtek tenyészeteiben a neuritdegeneráció számszerűsítésére egy széles körben hivatkozott módszert alkalmaztunk, amelyben a tenyészetek fáziskontrasztos képeit binárisizáljuk, a képeken lévő sejttesteket digitálisan eltávolítjuk, és a részecskeanalizátor algoritmusát alkalmazzuk. Az ImageJ-t a neuritfragmensek területének mérésére alkalmazzák. A töredezett neuritterületeket ezután összeadják, és elosztják a teljes neuritterülettel, hogy meghatározzák a DI-t (2A–E. ábra; Sasaki et al., 2009; Kraemer és mtsai, 2014; Di Stefano és mtsai, 2015; Hill et al. ., 2018; Geisler et al., 2019).

Ahogy az várható volt, a differenciált LUHMES sejtek 6- OHDA-nak való kitettsége a DI dózisfüggő növekedését okozta (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374; 2G ábra). Az 6-OHDA hatásának kitett sejtek elemzése során azonban több olyan problémát is megfigyeltünk, amelyek negatívan befolyásolták a DI mérések pontosságát és hatékonyságát. Igyekeztünk tehát optimalizálni ezt a DI mérések végzésére általánosan elterjedt módszert, amelyet a továbbiakban hagyományos DI módszernek nevezünk, hogy egy olyan protokollt hozzunk létre, amely elősegíti a neurit fragmentáció hatékonyabb mérését.

A mikroképes binarizáláshoz kapcsolódó mesterséges töredezettség csökkentése

A hagyományos DI-módszer használata során gyakran tapasztaltunk olyan problémát, amelyben a fáziskontrasztos képeken az ép neuritok töredezettnek tűntek a megfelelő bináris képen (3A. ábra). Ez a mesterséges töredezettség elsősorban az alacsony kiemelkedésű idegsejteket érintette. Így megvizsgáltuk, hogy a probléma csökkenthető-e a kép kontrasztját fokozó eljárásokkal. A képkontraszt javítása érdekében először a neuritákról készített felvételeket különféle fényintenzitásokkal határoztuk meg a kép fényerejének szintjét, amely optimális kontrasztot eredményez.

Az optimális fényintenzitással rögzített képeket ezután további kontrasztjavításnak vetettük alá az ImageJ segítségével, amellyel LUT-t alkalmaztunk 90, illetve 205 minimális és maximális intenzitásértékkel. Ezeknek a kontrasztjavításoknak a beépítése a neuritok mérsékelten pontosabb ábrázolását biztosította a fáziskontrasztos képekből előállított bináris képeken (3B. ábra). Mindazonáltal az egészséges idegsejtek bináris képeinek kvantitatív elemzése azt mutatta, hogy a kontrasztjavítások nem csökkentették szignifikánsan a mesterséges fragmentációt (p=0.9999; 3D. ábra). Így a következőkben azt vizsgáltuk, hogy az immunfluoreszcens képalkotás alkalmazása kiváló kontrasztú képeket eredményez-e, és ezáltal megkönnyíti-e a pontosabb bináris neuritképek előállítását, csökkentett mesterséges fragmentációval.

A 2. ábrán bemutatott, fix LUHMES sejteket tartalmazó, különböző koncentrációjú 6- OHDA-nak kitett tárgylemezeket a citoszkeletális fehérje b III-tubulinra immunfestették, fluoreszcens mikroszkóppal leképezték, és vak vizsgálóval mesterséges fragmentációra elemezték (1. 3C). A fluoreszcens és a megfelelő fáziskontraszt-mikroszkópos felvételekből nyert binarizált képek kvantitatív elemzése feltárta, hogy a mikroszkóp típusa befolyásolta a mesterséges fragmentáció szintjét [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . Pontosabban, a fluoreszcens mikrográfok bináris képeket eredményeztek, amelyek mesterséges fragmentációja jelentősen csökkent a fáziskontrasztos mikrográfiákhoz képest (p=0.0016; 3D. ábra).

Ennek eredményeként az egészséges tenyészetekről készült felvételek szignifikánsan alacsonyabb DI pontszámot adtak, ha fluoreszcens mikrográfokat használtak fáziskontraszt mikrográfok helyett (F(1,8)= 131.4, p=0.{12} }001, R2=0.1442; 3E. ábra). Ezen túlmenően figyelemre méltó általános tendencia, hogy az egészséges (vivőanyaggal kezelt) tenyészetekhez és a neuritdegenerációt mutató (5,0 vagy 7,5 mM 6-OHDA-val kezelt) tenyészetekhez kapcsolódó átlagos DI-értékek közötti többszörös változás nagyobb volt fluoreszcens mikrográfokkal mérve. mint a fáziskontraszt mikrográfokról készült (3E. ábra). Ez annak ellenére történt, hogy a mérsékelt neuritdegenerációjú (5 mM 6-OHDA-nak való kitettség által kiváltott) tenyészetekről készült fluoreszcencia-mikroszkópos felvételek a mesterséges fragmentáció csökkenése miatt szignifikánsan alacsonyabb DI pontszámot mutattak, mint a megfelelő fázisú képeken (p=0.0001). , d=0.6312).

Paraméterek optimalizálása fragmentált neurit és teljes neurit detektálásához
A DI mérések végrehajtásának hagyományos módszere az ImageJ Analyze Particles beépülő moduljának használata 20 10,000 pixel méretparaméterekkel a neuritfragmensek kimutatására. Megfigyeltük azonban, hogy a neuritfragmensek nagy részét nem észlelte a részecskeanalizátor, amikor ezeket a széles körben idézett paramétereket használták (Shin és mtsai, 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. , 2020; Shin és Cho, 2020), hogy mérjék a neuritdegenerációt az 6-OHDA hatásának kitett LUHMES sejtek fáziskontrasztos mikroképein, amelyeket a 2. ábrán leírtak szerint hoztak létre.

Így az adatkészletből származó képeket újraelemeztük, különböző minimális mérethatárokat használva a részecskedetektáláshoz, hogy meghatározzuk az optimális paramétereket a neuritfragmensek azonosításához. A fáziskontraszt-mikroszkópos felvételekből előállított binarizált képek kvalitatív értékelése alapján az 5–10,000 pixeles méretparaméterek javították a neuritfragmensek észlelését, de összefüggésbe hozhatók a háttérzaj, képi műtermékek vagy más kis méretű hibás azonosítással is. nem neurit anyag, mint neurit töredék. A széles körben használt 20–10,000 pixeles paraméterekkel összehasonlítva azonban a 10–10,000 pixeles paraméterek javították a neuritfragmensek észlelését anélkül, hogy észrevehetően jelentős mértékben nőtt volna a hamis pozitív értékek (4A. ábra). , bal).

Hasonló elemzéseket végeztünk a b III-tubulinra immunojelölt LUHMES sejtek fluoreszcens mikrográfiáiból nyert bináris képekkel is. A részecskeanalizátor 5–10,{3}} pixeles méretparaméterei megkönnyítették a neuritfragmentumok legérzékenyebb kimutatását, és mivel a fluoreszcens mikrográfok kevesebb apró törmeléket tartalmaztak, ezek a paraméterek nem növelték észrevehetően a nem neurit anyag neuritfragmensként való téves azonosítását. (4A. ábra, jobbra).

A DI mérések végzésének hagyományos módszere, a részecskeanalizátor 20–10,{2}} pixeles méretparamétereinek használatával, kizárja a 20 pixelnél kisebb objektumokat a neuritfragmensek méréséből.

Az ilyen kis objektumok azonban jellemzően tévesen szerepelnek a teljes neuritterület mérésében, mivel a hagyományos DI mérési módszer magában foglalja a teljes neuritterület kiszámítását a binarizált képek összes fekete pixelének összegzésével. A probléma megoldására az ImageJ részecskeeltávolító beépülő modulját használtuk, amelyet Wayne Rasband, az ImageJ fejlesztője írt, hogy eltávolítsuk a kis, nem neurit objektumokat a binarizált képekből. Ennek a beépülő modulnak az alkalmazása DI mérések végzése közben az 6-OHDA-nak kitett LUHMES sejtek fáziskontrasztos mikrográfiájával, amelyet a 2. ábrán leírtak szerint generáltak, és a DI mérések szignifikáns növekedését eredményezte a neurotoxin expozíció összes koncentrációja esetén (F(1). ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
Továbbá egy szignifikáns kölcsönhatás azt jelezte, hogy a részecskeeltávolító használata okozta DI növekedés nagyobb koncentrációknál erősebb lett (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094; 4B ábra, C). Ugyanezeket a sejtlemezeket fluoreszcens mikroszkóppal is leképeztük, és felmértük a kis részecskék eltávolításának hatását a fluoreszcens mikrográfiával kapott DI mérésekre. Míg a kis részecskék eltávolítása elméletileg pontosabb DI-értékeket biztosít, ezek az értékek átlagosan nem tértek el szignifikánsan a részecskeeltávolító plugin használata nélkül kapott értékektől, ha fluoreszcens mikrográfokkal mérik (F(1,8)=2). 613, p=0.1446, R2=0.0013; 4D. ábra).

DI mérések automatizálása fluoreszcens mikrográfokról

A hagyományos módszerrel végzett DI mérések fáradságos és időigényes képfeldolgozást, a szabadkézi eszköz használatát az egyes sejttestek digitális eltávolításához, valamint a töredezett neurit és az összes neuritterület mérését követeli meg az egyes képekről. Így a módszer hatékonyságát egy olyan makró írásával igyekeztünk fokozni, amely teljesen automatizálja a DI elemzéseket. A szómaeltávolítás automatizálása érdekében az ANDI makró végrehajtja a sejtmagok képeinek binarizálását, amelyeket a DAPI nukleáris festéssel jelöltek meg, majd a binarizált képet úgy módosítják, hogy a küszöbértékkel rendelkező nukleáris régiók megnagyobbodjanak, hogy magukban foglalják a szóma teljes régióját. Az ilyen, bináris és megnagyobbodott sejtmagokat tartalmazó képeket ezután levonják a b III-tubulinra immunjelölt neuronok megfelelő fluoreszcens mikroszkópos felvételeiből, így olyan képet állítanak elő, amely kizárólag neuritokat tartalmaz (5A, B ábra).

A neurodegenerációval összefüggő nukleáris zsugorodás vagy fragmentáció által okozott változó nukleáris méretekhez való alkalmazkodás érdekében a sejtmagok binarizált képei olyan dilatációk és eróziók kombinációjával megnagyobbodnak, amelyek egyesítik a nukleáris fragmentumokat és kiterjesztik a binarizált régiókat, hogy nagyobb területet foglaljanak el, mint a differenciált LUHMES sejtek szómái. . A kizárólag neuritokat tartalmazó képeket ezután binarizáljuk, és egy sor automatizált funkció segítségével DI-elemzésnek vetjük alá (5C., D. ábra). A képekről a szóma eltávolításával kapcsolatos makróműveletek pontosságának értékeléséhez összehasonlítottuk a sejttesteknek a fluoreszcens mikrográfokról az ImageJ szabadkézi eszközével (ahogy korábban a 4D. ábrán látható) manuális eltávolítását követően kapott DI pontszámokat a DI pontszámokkal. azonos képek analíziséből jött létre a sejttest automatizált eltávolítását követően, az ANDI makróban szereplő szómaeltávolítási műveletekkel. Elemzéseink kimutatták, hogy az automatizált sejttest-eltávolítással számított DI-pontszámok közel azonos korrelációt mutattak a kézi szómaeltávolításnak alávetett képek DI-méréseivel (r(34)=0.980, p, 0,0001; ábra). 5E).

Az elemzések pontosságának növelése érdekében az ANDI-ba beépítettünk több, a DI méréseket javító, korábban leírt beállítást. A makró kontrasztjavító műveleteket, a Particle Remover beépülő modult használja a nem neurit anyagok eltávolítására a neurit képekről és a nem nukleáris anyagok eltávolítására a magképekről, valamint a neurit fragmentumok kimutatását 5–10 méretparaméterek segítségével,000 az Analyze Particles beépülő modulhoz.

Feltételeztük, hogy együttesen a fluoreszcens mikroszkóp, a kontrasztfokozó műveletek, a kis tárgyak eltávolítása a részecskeeltávolítóval és a részecskedetektálás optimalizált paraméterei együttesen hozzájárulnak a neuritdegeneráció pontosabb méréséhez. Ennek a hipotézisnek a tesztelésére a 2. ábrán leírtak szerint előállított, különböző koncentrációjú 6-OHDA-nak kitett LUHMES-sejtek fáziskontrasztos képeit vak és szubjektív pontozással elemeztük 0 közötti értéktartomány használatával. 0 és 1.0, az értékek a töredezett neuritterület látszólagos arányát jelentik. Ezt követően értékeltük a hagyományos módszerrel kapott szubjektív pontszámok és DI mérések közötti összefüggést, valamint az ANDI Makró segítségével kapott szubjektív pontszámok és DI mérések közötti összefüggést.

Míg a hagyományos módszerrel kapott DI mérések szubjektív pontszámokkal korreláltak (r {0}}.7850, p,0.0001; 5F. ábra), az ANDI makró azt eredményezte, hogy olyan mérések, amelyek sokkal erősebben korreláltak a szubjektív értékelésekkel (r 2=0.978, p, 0,0001; 5G. ábra). A közvetlen statisztikai összehasonlítások azt mutatták, hogy az ANDI makróval kapott pontszámok szignifikánsan erősebben korreláltak a szubjektív értékelésekkel, mint a hagyományos módszerrel kapott pontszámok (z=6.626, p, 0,0001; 5F, G ábra). A további elemzések feltárták, hogy a makró elősegíti a DI mérések elvégzését az időhatékonyság robusztus és jelentős javulásával. Az ANDI makró használatával végzett DI-elemzések átlagosan 12,75 mp-es időt igényeltek képenként, szemben a hagyományos módszerrel elemzett átlagos képenkénti 5,27 perces idővel [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ANDI gyors DI-méréseket eredményez, amelyek a hagyományos módszerrel kapott pontszámokkal összehasonlítva jobban megközelítik azt a degenerációt, amelyet a kutatók a neuritképek kvalitatív elemzése során észlelnek.

Miután meghatároztuk az ANDI makró pontosságát és hatékonyságát az 6-OHDA-nak kitett, differenciált LUHMES-sejtek neuritdegenerációjának mérésére, értékeltük a makró alkalmasságát más sejttenyésztési modellekkel végzett kísérletekhez. Először egy kísérleti vizsgálatot végeztek, hogy felmérjék az ANDI pontosságát a DI-mérés során, a b III-tubulinra és DAPI-ra immunjelölt primer szimpatikus tenyészetek mikrofelvételei segítségével. Érdekes azonban, hogy a szimpatikus neuronok sejttestei nagyobbak, mint a differenciált LUHMES-sejteké, így az ANDI-ban az automatizált szómaeltávolításhoz kapcsolódó műveletek nem távolították el a szóma egészét (az adatokat nem mutatjuk be).

A probléma megoldása érdekében felülvizsgáltuk az ANDI-t, hogy egy párbeszédpanelt tartalmazzon, amely lehetővé teszi a felhasználók számára, hogy megválasszák a szómaeltávolítás méretét azáltal, hogy szabályozzák, hányszor táguljanak ki a magok bináris mikroképei. Az ANDI ezen 1.1-es verzióját használták ezután DI mérések elvégzésére olyan mikrográfokról, amelyek egészséges, hordozóval kezelt szimpatikus neuronokat vagy hidrogén-peroxidnak kitett, degeneráló szimpatikus neuronokat ábrázoltak. A hidrogén-peroxidnak kitett neuronokról készült képek szignifikánsan magasabb DI-pontszámot adtak, mint a hordozóval kezelt neuronok képei (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301; 6A, C ábra). Ezenkívül összehasonlítottuk ezeket az ANDI-val kapott DI-pontszámokat ugyanazon képkészletből kapott DI-mérésekkel, miután a sejttesteket manuálisan eltávolítottuk a fluoreszcens mikrográfokról, az ImageJ szabadkézi eszközével. Nem volt szignifikáns különbség a kézi szómaeltávolítást követően számított DI-pontszámokban az ANDI-val kapott pontszámokhoz képest (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0). 0000; 6A–C. ábra). A post hoc tesztek azt is megerősítették, hogy az ANDI-val kapott DI pontszámok nem különböztek szignifikánsan sem a kezeletlen neuronok (p=0.0972), sem a hidrogén-peroxid hatásának kitett neuronok esetében (p=0). 9986).

Ezen túlmenően, az ANDI-ból kapott DI-pontszámok közel azonos korrelációt mutattak a sejttestek megfelelő mikrográfokról való manuális eltávolítását követően kapott DI-pontszámokkal (r(34)=0.991, p, 0.0001). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ANDI alkalmas a neuritdegeneráció mérésére primer neuronok tenyészeteiben, olyan szómaeltávolítási műveletekkel, amelyeket a felhasználó testre szabhat a különböző neurontípusokhoz. Ezenkívül a hidrogén-peroxidnak kitett tenyészetekben a neuritfragmensek kimutatása bizonyítja a makró alkalmazhatóságát olyan kísérletekben, amelyekben az 6-OHDA-n kívüli források által kiváltott neuritdegeneráció is szerepel. Az ANDI különböző okokkal összefüggő neuritdegeneráció kimutatására való felhasználásának további igazolására a makrót használtuk a neuritdegeneráció mérésére egészséges szimpatikus kultúrák vagy NGF-elvonásnak kitett tenyészetek mikroképein. Ahogy az várható volt, az NGF-elvonásnak alávetett tenyészetekről készült felvételek szignifikánsan magasabb DI értékeket adtak az egészséges kultúrák képeihez képest (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958; 6D, E ábra). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy az ANDI felhasználható a különféle biológiai összefüggésekhez kapcsolódó neuritdegeneráció kimutatására.

Mivel a TH-festést általában a katecholaminerg neuronok megjelenítésére használják, értékeltük a TH-festést ábrázoló mikrográfok alkalmasságát is a neuritdegeneráció mérésére ANDI segítségével. A hordozóoldattal kezelt egészséges szimpatikus neuronok vagy a hidrogén-peroxid hatásának kitett degeneráló szimpatikus neuronok tenyészeteit fixáltuk és immunfluoreszcens jelölésnek vetettük alá TH és b III-tubulin, valamint DAPI ellenfestésnek. Ezután a TH vagy b III-tubulin festődését ábrázoló neuritképeket, valamint a DAPI-jelöléssel ellátott magok megfelelő képeit hasonló látómezőkben rögzítettük. Az ANDI-t végrehajtottuk, és a TH festést vagy b III-tubulin festést tartalmazó képeket választottuk ki neuritképként. Elemzéseink azt mutatták, hogy a TH-festés képeivel kapott DI-pontszámok nagyon erősen korreláltak a b III-tubulinfestés képeiből kapott pontszámokkal (r(28)= 0.962, p, 0.0001; ábra 6F, G). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ANDI pontos DI-méréseket érhet el olyan alternatív festési eljárásokkal, amelyek a neuritok egészét jelölik, például a TH immunjelölését.

A továbbfejlesztett módszer DI mérések tudományos kísérletben való alkalmazhatóságának demonstrálására az új módszerrel felmértük a JNK szerepét az oxidatív stressz által kiváltott neuritdegenerációban humán mesencephalis sejtekben. A differenciált LUHMES sejteket 1 órán át előkezeltük JNK inhibitor SP600125 vagy hordozóoldattal. A sejteket ezután 24 órán keresztül 6- OHDA-val kezeltük az oxidatív stressz indukálása céljából, vagy hordozóoldattal. A rögzített sejteket immunjelölésnek vetettük alá b III-tubulin és DAPI festéshez, és ANDI-t használtunk a DI mérések fluoreszcens mikrográfiákból történő előállításához. Míg a JNK-gátlóval nem kezelt tenyészetek neuritdegenerációt mutattak az 6-OHDA-nak való kitettséget követően, a JNK-gátlás az 6- OHDA-indukálta neuritdegeneráció jelentős és jelentős csökkenését eredményezte (p= 0.0001). , d= 2.0209; 7. ábra). Ezek az eredmények alátámasztják a JNK jelátvitel kulcsfontosságú szerepét az oxidatív stressz által kiváltott neuritdegenerációban az emberi mesencephalikus sejtekben, és ami fontos, bemutatják új módszerünk hasznosságát tudományos felfedezések generálására azáltal, hogy elősegíti a neuritdegeneráció gyors és pontos mérését.

Vita

A neuritok degenerációja számos neuropatológiai állapothoz kapcsolódik, de a neuritok lebomlásának hátterében álló molekuláris mechanizmusok továbbra sem teljesen ismertek. A neuritdegeneráció pontos és hatékony elemzését elősegítő módszerek elengedhetetlenek a fontos sejtes eseményt szabályozó új tényezők sikeres azonosításához. Jelen tanulmányban több hibaforrást tárunk fel, amelyek a neuritdegeneráció számszerűsítésére általánosan használt módszerhez kapcsolódnak. Kísérleti adatokat közölünk, amelyek támogatják a DI elemzési hibák csökkentése érdekében végrehajtható eljárásmódosításokat, és az ilyen módosításokat beépítjük egy új ImageJ makróba, hogy eszközt biztosítsanak a nyílt forráskódú és ingyenes szoftverek segítségével végzett gyors, pontos és objektív DI elemzésekhez. Továbbá bemutatjuk, hogy a továbbfejlesztett módszer hogyan alkalmazható a neuritdegeneráció mérésére a PD sejtkultúra-modelljében, egy olyan rendellenességben, amelyben a dopaminerg neuronok axonális fragmentációja egy korai stádiumú esemény, amely megelőzi az esetleges neuronok elvesztését (Tagliaferro és Burke, 2016). .

Jelen tanulmányban bemutatjuk az ANDI makró hasznosságát a neuritok degenerációjának mérésében a PD sejtkultúra modelljében, amely az 6-OHDA hatásának kitett, differenciált LUHMES sejtekből áll.

Kísérleti eredményekről számolunk be, amelyek alátámasztják azokat az optimális szubsztrátokat, amelyeken a tenyészeteket létre kell hozni, valamint bemutatjuk azt a lemezesítési sűrűséget, amely a legmegfelelőbb a neuritdegenerációs elemzésekhez. Ennek a modellrendszernek a használata a neuritok degenerációjának tanulmányozására számos előnnyel jár. A sejtekben jól behálózott és jellemzően 0,500 mm hosszúságú idegsejtek fejlődnek ki, és a tenyészetek érzékenyek a PD klasszikus, neurotoxin-modelljei által kiváltott neurodegenerációra, mint például a 6-OHDA, 1-metil{{4 }}fenilpiridinium-ion (MPP1) és rotenon (Lotharius és mtsai, 2005; Zhang és mtsai, 2014; Smirnova et al., 2016; Kraemer és mtsai, 2021). Továbbá a LUHMES sejtek humán eredete növeli a modellhez kapcsolódó leletek átültethetőségét, a feltételes halhatatlanság pedig elősegíti a tenyészetek gyors létrehozását és szaporítását (Scholz et al., 2011). Így az ANDI segítségével végzett automatizált elemzésekkel párosulva a LUHMES sejtek felhasználhatók a PD-vel összefüggő neuritdegenerációval kapcsolatos új felfedezésekre, miközben lényegesen nagyobb áteresztőképességet tesznek lehetővé az elsődleges neuronális kultúrákkal végzett nem automatizált elemzésekhez képest.

Számos kutatócsoport végzett DI elemzést fáziskontrasztos képek segítségével, hogy betekintést nyerjen a neuritdegenerációt szabályozó tényezőkbe (Press és Milbrandt, 20{{10}}9; Kraemer et al., 2014 Di Stefano és munkatársai, 2015; Hill és munkatársai, 2018; Geisler és mtsai, 2019). Itt egy fontos hátrányról számolunk be, amely ezzel a széles körben használt neuritdegeneráció mérési módszerrel kapcsolatos: a fáziskontrasztos képek binarizálása miatt az ép neuritok jelentős része töredezettnek tűnik. Míg a mikroszkópos felvételek készítésekor elérhető kontrasztszint a vizsgálók rendelkezésére álló mikroszkóprendszertől függően változik, ez a probléma a különböző kutatócsoportok körében átterjedt, mivel a 0,2-es DI-t általánosan elfogadott küszöbértéknek tekintik, amely felett a kultúrákat degenerálódónak tekintik. axonok, és a legtöbb tudományos jelentés, amely fáziskontraszt-mikroszkópos DI-méréseket tartalmaz, 0,1 és 0,3 közötti DI-pontszámról számolt be az egészséges neuronok esetében (Sasaki et al., 2009, 2016; Di Stefano és mtsai, 2015; Hill és mtsai, 2018; Loreto et al., 2020). Fluoreszcencia mikrográfiás felvételekből nyert DI elemzéseink, valamint vak kutatók szubjektív pontszámai azt mutatják, hogy a 10-20%-os neurit fragmentáció nem gyakori egészséges neuronkultúrákban. Inkább az ilyen tenyészetek átlagosan csak 2,5%-os neurit fragmentációt mutatnak. Eredményeink tehát alátámasztják, hogy olyan módszerekre van szükség, amelyek javítják a neuritdegenerációs elemzések pontosságát azáltal, hogy csökkentik ezt a gyakori és jelentős mérési hibaforrást.

Míg a DI méréseket magában foglaló tanulmányok többsége fáziskontrasztos képeket használt a neuritdegenerációs elemzések elvégzéséhez, a közelmúltban több kutatócsoport végzett DI méréseket a citoszkeletális filamentumok, például a neurofilamentum táptalaj polipeptid vagy a b-b-tubulin (Wakatsuki) számára immunjelölt neuronokról. et al., 2011; Li és mtsai, 2017; Pease-Raissi és mtsai, 2017; Hernandez és mtsai, 2018; Sundaramoorthy és mtsai, 2020). Azonban továbbra is tisztázatlan maradt, hogy a mikroszkópia melyik formája a legalkalmasabb a neuritdegeneráció mérésére, mivel vizsgálatokra volt szükség annak megértéséhez, hogy ezeknek a citoszkeletális fehérjéknek a lokalizációjában a neuritdegeneráció során bekövetkezett változások megfelelően modellezik-e a neurit morfológiájának teljes változását, valamint értékelni kell a milyen mértékben korrelálnak a fluoreszcens mikrográfokkal kapott DI-mérések a fáziskontraszt-mikroszkóppal kapott hasonló mérésekkel. Itt bemutatjuk, hogy a b III-tubulin festődést ábrázoló fluoreszcens mikrográfok nemcsak pontosan reprezentálják a neurit fragmentációt, hanem pontosabb DI méréseket is lehetővé tesznek, mivel kiváló kontrasztjuk van, és csökkent a mesterséges fragmentációra való érzékenységük binarizáláskor. Eredményeink tehát rávilágítanak a b III-tubulin festés hasznosságára a neuritdegeneráció mérésére.

A neuritdegeneráció mérésére szolgáló DI elemzéseket tartalmazó publikált tanulmányok között a neuritfragmensek kimutatására használt méret- és cirkularitási paraméterek jelentősen eltértek. Például egy közelmúltban végzett tanulmány, amely a tenyésztett hippocampális neuronok neuritdegenerációjának felmérésére irányult, 4–9{3}}0 pixel méretparamétereket használt (Li et al., 2017), míg egy tenyésztett DRG neuronokkal végzett vizsgálat a következő kimutatási paramétereket használta: 0–10,{5}} képpont (Wakatsuki et al., 2011). Az ilyen eltérések egyik lehetséges oka az, hogy a részecskeanalízis méretparamétereinek hatékonysága a neuritfragmensek kimutatásában a kép felbontásától függően változik, mivel a részecskedetektálás méretparaméterei pixelegységekhez kapcsolódnak. Sajnos a legtöbb publikált, DI elemzést tartalmazó tanulmány nem tartalmazza az elemzésekhez használt képfelbontás leírását. Ezért szükség volt szabványos elemzési paraméterek létrehozására olyan protokollon keresztül, amely teljes mértékben feltárja a fontos részleteket, például az ajánlott képfelbontást. Itt beszámolunk arról, hogy a neuritfragmentek kimutatásának leggyakrabban idézett paraméterei, 20–10, 000 pixel (Shin és mtsai, 2012; Di Stefano és mtsai, 2015; Sasaki és mtsai, 2016; Loreto et al. al., 2020; Shin és Cho, 2020), azt eredményezik, hogy a neuronfragmensek nagy része nem észlelhető. A neuritfragmentum-detektálás minimális méretkritériumának csökkentése növeli a fragmentum-detektálás érzékenységét, ugyanakkor növeli a képi műtermékek és nem neurit törmelékek számát, amelyeket hamisan neuritfragmentumként észlelnek. Az észlelési érzékenység és a téves pozitivitás aránya közötti legjobb egyensúlyt biztosító paraméterek keresése során a 10–10,000 elemzési paramétereket azonosítottuk, amelyek a legpontosabb neuritfragmensek detektálását biztosítják a fáziskontrasztos mikrográfokról készült binarizált képeken. Az 5–10,000 paraméterek lehetővé teszik a neuritfragmensek legpontosabb kimutatását a fluoreszcens mikrográfokról készült bináris képeken. Bár ezek a meghatározások 1280 1024 képfelbontással történtek, ezeknek a paramétereknek lehetővé kell tenniük a pontos neurittöredék-észlelést más, 1024 pixeles függőleges méretű képeken, például a szokásos teljes képernyős felbontáson ({{) 27}}, mivel az ilyen képeken ábrázolt neuronok hasonló pixelméretűek lennének.

Számos kutatócsoport alkalmazott minimális méretkritériumot a részecskeelemzési paraméterek konfigurálásakor, hogy elkerüljék a kisméretű, nem neurit törmeléket a neuritfragmentum-mérések során (Shin és mtsai, 2012; Cosker és mtsai, 2013; Di Stefano et al., 2015; Sasaki és munkatársai, 2016; Li és mtsai, 2017; Loreto és mtsai, 2020; Shin és Cho, 2020; Sundaramoorthy és munkatársai, 2020). Az ilyen vizsgálatok azonban tévesen vettek bele kis, nem töredékes anyagot a teljes neuritterület mérésébe, mivel az ilyen méréseket a kép összes fekete pixelének összegzésével kapjuk. Itt bemutatjuk a Particle Remover beépülő modul hasznosságát a kis, nem töredékes törmelék eltávolítására a képről a DI elemzés előtt. A beépülő modul használata jelentősen növelte a fáziskontrasztos képekből nyert neuritdegenerációs mérések érzékenységét. Eredményeink tehát rávilágítanak a Particle Remover plugin értékére a fáziskontraszt-mikroszkópos DI-elemzést végző kutatók számára. Érdekes módon a fluoreszcens mikrográfok kevésbé apró, nem neurit törmeléket tartalmaztak, így kisebb, öt pixeles méretkritériumot lehetett használni a fragmentumok kimutatására. Míg az öt pixelnél kisebb méretű nem neurit törmelék részecskék eltávolítása nem befolyásolta szignifikánsan a fluoreszcens mikrográfokról kapott DI-méréseket, az ilyen műveletek elméletileg pontosabb értékeket adnak, és ezért szerepeltek az ANDI-ban.

Mivel a DI-analíziseket kizárólag neuritokat tartalmazó képek felhasználásával kell elvégezni, az elemzési módszer alkalmazása elsősorban a sejttestek eltávolítására alkalmas tenyésztési rendszerekre korlátozódott, mint például az explant tenyészetek, amelyekben a sejttestek fizikailag kivághatók (Catenaccio et al. , 2017; Shin és Cho, 2020) vagy mikrofluidikus eszközökben lévő tenyészetek, amelyek elősegítik a szóma- és axonkompartmentek szegregációját (Cosker et al., 2013; Pease-Raissi és mtsai, 2017; Tan és mtsai, 2018). Alternatív megoldásként a DI-elemzések disszociált kultúrákkal valósíthatók meg fárasztó és időigényes munkával, amely a sejttestek digitális eltávolításával jár együtt (Kraemer et al., 2014). Ebben a tanulmányban feltárjuk, hogy az ANDI lehetővé teszi a DI mérések elvégzését olyan mikrográfokról, amelyek LUHMES sejteket tartalmaznak, amelyek disszociálnak és mozaikszerűen eloszlanak egy 2D tenyésztőrendszerben. Eredményeink azt is mutatják, hogy az ANDI elősegíti az elemzések elvégzéséhez szükséges idő 24-szeres csökkentését, és az ANDI-ban a szómaeltávolításhoz kapcsolódó műveletek olyan DI-analízis eredményeket adnak, amelyek 98%-ban korrelálnak a kézi szómaeltávolítást követően végzett hasonló elemzésekkel. az ImageJ szabadkézi eszköze. Így a makró lényegesen növeli az analízisek hatékonyságát azáltal, hogy automatizált szómaeltávolítást hajt végre, a pontosságot nem feláldozva, és az ilyen műveletek kibővítik a módszer alkalmasságát mozaikos eloszlású sejttestekkel disszociált tenyészetek elemzésére.

Amellett, hogy megkönnyíti a sejttestek automatikus eltávolítását a képekről, az ANDI a DI-elemzés hagyományos módszerének számos revízióját tartalmazza, beleértve a fluoreszcens mikrográfok használatát, a részecskeelemzési paraméterek átdolgozását és a részecskeeltávolító használatát a kis, nem neurit törmelékek eltávolítására. képekből. Eredményeink azt mutatják, hogy ezek az optimalizálások együttesen olyan DI értékeket adnak, amelyek jobban megközelítik a vak és alávetett pontozással kapott értékeket. Így amellett, hogy jelentősen csökkenti az elemzések elvégzéséhez szükséges időt, az ANDI megkönnyíti a DI méréseket, amelyek a hagyományos módszerhez képest pontosabban tükrözik azt a neurit degenerációt, amelyet a kutatók a kvalitatív képelemzés során megfigyeltek.

A DI-elemzések végrehajtásának hagyományos módszerének egyik hátránya, hogy az ilyen elemzésekhez az ImageJ használatára vonatkozó képzésre van szükség, hogy a felhasználó ismerje az ImageJ műveletek unalmas halmazát. Ezen túlmenően az elemzések hatékony elvégzése érdekében a felhasználónak további képzésre van szüksége a kötegelt elemzések elvégzéséhez vagy az egyes lépések végrehajtását félig automatizáló szkriptek írásához. Az elemzés teljes automatizálásával az ANDI a makró letöltéséhez és végrehajtásához kapcsolódó néhány lépésben megkönnyíti a DI méréseket. A felhasználóbarátság növelése érdekében a makró tartalmaz egy kódot, amely interfészt biztosít az elemezni kívánt képeket tartalmazó könyvtárak kiválasztásához, valamint megkönnyíti az eredményképek és adattáblázatok kimenetét a felhasználó által választott könyvtárba. Ezenkívül a szkript számos olyan funkciót tartalmaz, amelyek célja a mérési pontatlanságok vagy a felhasználói hibák elkerülése, beleértve a korábbi ImageJ eredmények automatikus törlését; a képskálára vonatkozó információk eltávolítása a mérések pontos végrehajtásának biztosítása érdekében pixelegységekkel; az ImageJ színbeállítások, mérési beállítások és részecskeanalizátor paramétereinek megfelelő konfigurálása; hibaüzenet megjelenítése, ha a felhasználók hibásan olyan könyvtárakat választanak ki, amelyek egyenlőtlen számú, b III-tubulin festést és DAPI festést ábrázoló képet tartalmaznak; az elemzés előrehaladását jelző naplóleírások; és kódolás a Windows 10 által végzett automatikus .ini fájlgeneráláshoz kapcsolódó hibák megelőzése érdekében. Összességében ezek a szolgáltatások felhasználóbarátabbá teszik a DI elemzéseket, ami felkeltheti az érdeklődést a neuritdegenerációval kapcsolatos tanulmányok iránt.

Kísérletben való hasznosságának bemutatása érdekében az ANDI segítségével értékeltük a JNK hozzájárulását a neurit degenerációhoz 6-OHDA-nak kitett LUHMES sejttenyészetekben. A JNK egy stressz által aktivált kináz, amelyről beszámoltak a nem főemlős eredetű perifériás neuronok neuritdegenerációjának kulcsaként (Shin és mtsai, 2012), de további vizsgálatokra van szükség ahhoz, hogy megértsük a kináz szerepét a mesencephalicus emberi sejtekben a neurit degenerációban. . Itt bemutatjuk, hogy a JNK gátlása jelentősen megvédi az emberi mesencephalikus sejteket az oxidatív stresszhez kapcsolódó neurit-degenerációtól. Az ilyen eredmények nemcsak a JNK fontos szerepét tárják fel az emberi betegség modelljéhez kapcsolódó neurit-degenerációban, hanem azt is jól példázzák, hogy az ANDI használható automatizált és objektív képelemzésben új tudományos felfedezésekhez.

Míg az ANDI-t eredetileg arra tervezték, hogy megkönnyítse a neuritdegeneráció gyors és pontos mérését az 6-OHDA-nak kitett differenciált LUHMES-sejtek tenyészeteiben, eredményeink azt is jelzik, hogy a makró felhasználható más okok által kiváltott neuritdegeneráció kimutatására is, mint pl. hidrogén-peroxidnak való kitettség vagy neurotrofin megvonás. Ezenkívül a makró 1.1-es verziója tartalmaz egy párbeszédpanelt, amely lehetővé teszi a kutatók számára, hogy testreszabják a szómaeltávolítási műveleteket bizonyos méretű neuronokhoz. Adataink azt is alátámasztják, hogy a b III-tubulin immunjelölésén kívül más festési módszerek is használhatók a neuritdegeneráció pontos mérésére. Bár azt javasoljuk, hogy kísérleti tanulmányokat végezzenek a DI mérések pontosságának ellenőrzésére, amikor ANDI-t használnak korábban nem tesztelt sejttípusokkal vagy festési módszerekkel, ezek az eredmények alátámasztják, hogy a makró általában sokoldalú eszköz a tenyésztett neuronok neuritdegenerációjának mérésére. Mivel az ANDI-t nem optimalizálták a szövetek neuritdegenerációjának mérésére, jelenleg csak a tenyésztett sejtekhez kapcsolódó neuritdegeneráció elemzésére javasoljuk a használatát. Az ANDI kódja azonban nyilvánosan elérhető, és így hasznos lehet azoknak a kutatóknak is, akik érdeklődnek a szkript módosítása iránt, hogy az megfeleljen az in vivo vizsgálatoknak vagy más alkalmazásoknak.

Összefoglalva, ez a cikk olyan adatokat mutat be, amelyek feltárják a neuritdegeneráció számszerűsítésére széles körben használt módszerrel kapcsolatos gyakori hibaforrásokat. Kísérleti megközelítéseket alkalmaztak a módszer tökéletesítésére, és az ilyen fejlesztéseket beépítették egy ingyenes és nyílt forráskódú ImageJ makróba, amely segítségével gyorsan, pontos és objektív elemzést végezhet a fluoreszcens mikrográfokról a neuritdegeneráció szempontjából. Eredményeink feltárják az ANDI hatékonyságát a neuritdegeneráció számszerűsítésére a PD sejttenyésztési modelljét ábrázoló mikrográfokon, valamint bizonyítja azt az elvet, hogy a makró képes kimutatni más biológiai összefüggésekkel összefüggő neuritdegenerációt. A felhasználóbarát makró csökkenti a neurit-fragmentáció számszerűsítésének megtanulásához szükséges időt, miközben növeli a neuritdegeneráció hátterében álló tényezőket értékelő vizsgálatok teljesítményét és pontosságát. Az ANDI makró a következő URL-címen érhető el: https://github.com/kraemerb/kraemerlab.

Hivatkozások

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) Kognitív hanyatlás Parkinson-kórban. Nat Rev Neurol 13:217–231.

2. Adalbert R, Coleman MP (2013) Review: axon pathology in age-related neurodegenerative disorders. Neuropathol Appl. Neurobiol 39:90–108.

3. Bové J, Perier C (2012) A Parkinson-kór neurotoxin-alapú modelljei. Neuroscience 211:51–76.

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017) Molecular analysis of axonal-intrinsic and glial-asssociated co-regulation of axon degeneration. Cell Death Dis 8: e3166.

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) Target-derived neurotrophins koordinálja a transzkripciót.

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR és munkatársai. (2015) A NAD prekurzor nikotinamid-mononukleotid (NMN) növekedése a sérülés után elősegíti az axon degenerációját. Cell Death Differ 22:731–742.

7. Fukui K (2016) A reaktív oxigénfajták neuritdegenerációt indukálnak a sejthalál kiváltása előtt. J. Clin. Biochem. Nutr 59:155–159.

8. Geden MJ, Deshmukh M (2016) Axon degeneráció: a kontextus különálló útvonalakat határoz meg. Curr Opin Neurobiol 39:108–115.

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) A Vincristine és a bortezomib különálló upstream mechanizmusokat használ a közös SARM{3}}függő axondegeneráció aktiválására program. JCI Insight 4:e129920.

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) A glutamát excitotoxicitás által kiváltott axon degenerációt nekroptózis közvetíti. J Cell Sci 131:jcs214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com