R. Vesicarius L. Nephroprotektív hatást fejt ki a ciszplatin által kiváltott oxidatív stressz ellen
Mar 26, 2022
Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Md. Mahmudul Hasan1, A legtöbb. Sayla Tasmin2, Ahmed M. El-Shehawi3, Mona M. Elseehy4, Md. Abu Reza1és Ariful Haque2*
Absztrakt
Háttér:A ciszplatin kiemelkedő rákellenes gyógyszer, de alkalmazása jelentősen csökkent a súlyos nefrotoxicitás miatt. A R. vicarious L. egy leveles zöldség, amely antiangiogén, gyulladáscsökkentő, antiproliferatív, májvédő és nefroprotektív hatással rendelkezik. Ezért ezt a tanulmányt úgy tervezték, hogy megvizsgálja a metanolos kivonatát (RVE) esetleges nefroprotektív hatás szempontjából.
Mód:Elsősorban in vitro az RVE antioxidáns aktivitását a 2, 2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) szabad gyökfogó képessége alapján igazoltuk. Ezt követően svájci albínó hím egereket ciszplatinnal (2,5 mg/kg) kezeltünk 5 egymást követő napon keresztül, hogy nefrotoxicitást váltsunk ki. A nefrotoxicitásból való felépülést úgy vizsgáltuk, hogy az állatokat RVE-vel (25, 50 és 100 mg/kg) intraperitoneálisan (ip) kezeltük a következő 5 egymást követő napon. A kezelés befejezése után az egereket leöltük, és a veséket összegyűjtöttük. Egy részét nátrium-foszfát pufferben homogenizáltuk a malondialdehid (MDA) szint meghatározására, másik részét a gén (NQO1, p53 és Bcl-2) expressziójának értékelésére használtuk. Ezen túlmenően az RVE hidrogén-peroxid (H2O2) semlegesítő képességét HK-2 sejtekben in vitro értékelték. Végül az RVE bioaktív fitokemikáliáit gázkromatográfiás tömegspektrometriával (GC-MS) határoztuk meg.
Eredmények:Az RVE in vitro antioxidáns aktivitást mutatott dózisfüggő módon, 37,39 ± 1,89 ug/ml IC50 értékkel.
Az RVE kezelés jelentősen (p < {0}}.05)="" csökkentette="" a="" veseszövet="" mda-tartalmát.="" emellett="" az="" nqo,="" p53="" és="" bcl-2="" gének="" expressziója="" szignifikánsan="" (p="">< 0,05)="" mérséklődött="" dózisfüggő="" módon="" az="" rve="" adása="" következtében.="" az="" rve="" szignifikánsan="" (p="">< 0,05)="" majdnem="" normálisra="" fordította="" a="" h2o2="" szintet="" a="" hk-2="" sejtekben.="" a="" gc-ms-ből="" tíz="" vegyület,="" köztük="" három="" ismert="" antioxidáns:="" "4h-pyran-4-one,="" 2,="" 3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-"="" ,="" "hexadekánsav"="" és="" "szkvalén"="" volt="" kimutatható.="" a="" kivonat="" „13-dokozénamid”="" alkaloidban="" gazdag="">
Következtetés:Összességében az RVE védőhatással rendelkezik a ciszplatin által kiváltott vesekárosodás ellen.
Kulcsszavak:Ciszplatin, R. vicarious, egerek, vese, HK-2 sejtek, oxidatív stressz, NQO1 gén
A Cistanche deserticola megelőzi a vesebetegséget, kattintson ide a mintaért
Bevezetés
Az oxidatív stressz a reaktív oxigénfajták (ROS) képződése és a rendszeres antioxidáns védekező mechanizmusok közötti aránytalanság eredménye [1]. A rendszeres biokémiai reakciók, a gyakori kitettség a kedvezőtlen környezetnek és a fokozott xenobiotikum bevitel ROS termelést eredményez [1]. A ROS kölcsönhatásba lép a redox-érzékeny jelzőmolekulák cisztein-maradékaival, beleértve a transzkripciós faktorokat, protein tirozin-foszfatázokat és protein-kinázokat; következésképpen az ezeken a maradékokon lévő tiolcsoportok oxidációja a megcélzott fehérjék, a biológiai hatások, a jelátviteli kapacitás, az immunitás és a kiegészítő sejt élő/halott paradigmáinak megváltozásához vezet [2]. A reaktív tulajdonságokkal rendelkező oxigéntartalmú vegyi anyagok ROS néven ismertek, amelyek szabad gyököket és nem gyökös molekulákat, például szuperoxidot és H2O2-t tartalmaznak [3]. A ROS által kiváltott oxidatív stressz számos betegség, köztük a rák etiológiájával függ össze. Az akut mieloid leukémia (AML) a vérsejtek rákos növekedése a csontvelőben. Az AML hátterében álló sejtes és molekuláris események közé tartozik a DNS-károsodás, a klonális szaporodás, a fokozott sejthalál és a további genetikai instabilitás, amelyek a ROS által kiváltott oxidatív stressz következményei [4]. A humán fiziológiát számos olyan mechanizmussal ruházták fel, amelyek antioxidánsokat állítanak elő, hogy védelmet fejtsenek ki az oxidatív stressz ellen, ami megvédi a sejteket a toxikus hatásoktól és a betegségek megelőzését szolgálja [5]. A sejtek azonban endogén mechanizmusokat fejlesztenek ki az oxidatív stressz ellensúlyozására és a szükséges ROS megőrzésére [6].
NAD(P)H: A kinon-oxidoreduktáz 1 (NQO1) egy flavoenzim [7], amely képes két- vagy négyelektronos redukciót katalizálni, és ezt a tulajdonságát a kininek méregtelenítésére használja [8]. Megvédheti a sejteket az oxidatív károsodástól azáltal, hogy félreteszi a redox ciklust és csökkenti a szabad gyökök képződését [8]. A xenobiotikus méregtelenítés mellett az NQO1 részt vesz a szuperoxid semlegesítésben, a p53 proteaszóma lebomlásának modulációjában [9], a Bcl-2 gátlásában [10] és a sejtkárosodásra való fokozott fogékonyságban [11].
A ciszplatin az első Food and Drug Administration (FDA) által jóváhagyott platinaalapú rákellenes gyógyszer [12]. A ciszplatin apoptózist fejt ki az oxidatív stressz indukálásával és a p53 tumorszuppresszor gén túlzott expressziójával [12]. Számos káros hatás, köztük a nefrotoxicitás, a hepatotoxicitás, a gasztrotoxicitás, az ototoxicitás, a mieloszuppresszió és a neurotoxicitás a ciszplatin által kiváltott oxidatív stressz következménye [12]. Ezek a mellékhatások jelentősen csökkentették a ciszplatin használatát, bár kiemelkedő rákellenes hatása van. A ciszplatinról jól ismert, hogy oxidatív stresszt indukál és elnyomja az NQO1 gént egérvesékben [13]. Ezért az antioxidánsok hatékony természetes forrásainak felkutatása és validálása a tudatosság területévé válik. A növényi eredetű antioxidánsok, például flavonoidok, karotinoidok és fenolos vegyületek bevitele védelmet nyújthat a szív- és érrendszeri betegségek, a szürkehályog és a rák ellen [14].
A R. vicarious (Polygonaceae) bengáli nyelven "Takpalong/Chukapalong/Amlabetom" néven ismert [15]. Ázsia, Ausztrália és Észak-Afrika sivatagi és félsivatagos területein nő [16]. Ez egy kevéssé tanulmányozott, veszélyeztetett növény Bangladesben. Bangladesben az emberek az egész növényt zöldségként fogyasztják sóval, különböző fűszerekkel és olajjal történő főzés után. Néha az emberek csak a friss leveleket használják vegyes salátában a saláta alternatívájaként. A nyers levél enyhén savanyú, de főzés után erősen savanyúvá válik. Ezenkívül a halételekbe főzés közben általában kevés levelet kevernek, hogy enyhén savas ízt kapjanak.
Ezt a növényt zöldség- és gyógynövényként használják világszerte [17]. A leveleket és a magokat a kígyó- és a skorpióméreg ellenszereként használják [17]. A népi kezelésben az R. vicarious-t régóta használják májbetegségek, rossz emésztési zavarok, székrekedés, hámlás, hányás, puffadás, szívpanaszok, fájdalmak, lépbántalmak, dyspepsia, fogfájás, hörghurut, asztma, rüh, leukoderma, valamint hashajtó, gyomorcsillapító, étvágygerjesztő, tonik, vízhajtó és fájdalomcsillapító [18]. Ez a növény számos biológiailag fontos vegyületet tartalmaz, beleértve a flavonoidokat, antrakinonokat, karotinoidokat, vitaminokat, lipideket és szerves savakat, amelyek jól ismertek antioxidánsként, antimikrobiális és rákellenes szerekként [19]. Ennek a növénynek minden része megemelkedett mennyiségben tartalmaz kvercetint (flavonoidokat) [15]. Ez a növény 0,25 mg A-vitamint, 1,33 mg C-vitamint, 2,37 mg E-vitamint [15], 3,38 mg flavonoidot és 5,66 mg polifenolt [20] tartalmaz 100 g száraz tömegben.
Shahat és munkatársai [21] patkánymodellben kimutatták a R. vicarious légi része metanolos kivonatának (80 százalék) antiangiogén és antiproliferatív hatását hepatocelluláris karcinóma ellen. Egy másik tanulmány kimutatta az R. vicarious kivonat in vitro antiangiogén potenciálját [22]. A teljes R. vicarious metanolos kivonata in vivo védelmet nyújt a szén-tetraklorid által kiváltott hepatotoxicitás ellen [23]. Nyulak gyulladáscsökkentő hatását a R. vicarious metanolos levélkivonata bizonyította [24]. Egy újabb tanulmány [25] a frakcionált etanolos R. vicarious kivonat in vivo nefroprotektív hatásáról számolt be a gentamicin és a kálium-dikromát toxicitása ellen.
Figyelembe véve a fenti információkat, arra törekedtünk, hogy megvizsgáljuk az R. vicarious kivonatok (RVE) hatását a ciszplatin által kiváltott nefrotoxicitásból való felépülés szempontjából az NQO1 génexpresszió fenntartása állatmodellben.
A cistanche egészségügyi előnyei: vesebetegségek kezelése
Anyagok és metódusok
Vegyszerek és reagensek
A ciszplatint és a 2,{1}}difenil-1-pikrilhidrazilt (DPPH) a SIGMA-ALDRICH-tól (USA) vásároltuk.
A kreatinin kolorimetriás vizsgálati készletet (termékazonosító – 700 460) a Cayman Chemical-tól (USA) vásároltuk. A Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), magzati szarvasmarha szérum (FBS) és az antibiotikum (10,000 U/ml penicillin és 10,000 ug/ml sztreptomicin) a Gibco-tól (Gibco Laboratories, USA). A ROS-Glo™ H2O2 Assay kit és a GoTaq® qPCR Master Mix a Promegától (USA). A TIAN-Script M-MLV reverz transzkripciós készletet a TIANGEN-től (Kína), a primereket pedig az IDT-től (Integrated DNA Technologies, Malajzia) vásároltuk. A kísérletben használt összes többi vegyszer és reagens analitikai minőségű volt.
Növényi mintagyűjtés és kivonat készítés
Friss R. helyettesítő növényeket vásároltak a helyi Sonadighi, Rajshahi, Banglades piacról. A növénymintát Dr. Ahmad Humayan Kabir, a Banglades-i Rajshahi Egyetem Növénytani Tanszéke azonosította és hitelesítette. számú utalvány alatti példány. A 00095-öt a Rajshahi Egyetem Növénytani Tanszékének herbáriumában tárolták. A növény légi részeit megtisztítottuk, 37 fokon szárítottuk, elektronikus szárítóval durva porrá őröltük, majd zárt edényben 4 fokon tároltuk. A finom port (10 g) feloldjuk metanolban (500 ml). A tartalmat ultrahanggal kezeltük (Soniprep 150, Kína) 20 kHz-en 10 percig. Az extraktum szűrését Glass Fiber Filter papír (Macherey NAGEL, GmBH, német) és DURAN Filtering Apparatus (német) segítségével végeztük. Végül a szűrletet fagyasztva szárítóval (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, USA) betöményítettük. A kivonatot végül RVE-nek nevezték el.
In vitro antioxidáns aktivitási teszt
Az RVE in vitro antioxidáns kapacitását a DPPH eltávolítása alapján határoztuk meg a korábban leírtak szerint [26], kis módosítással. Az RVE DPPH gyökfogó képességét a DPPH lila színének sárgává alakítása alapján értékeltük. A reakcióelegy mindegyik mikrocentrifuga csőben (2 ml) 95{5}} μl metanolos DPPH-gyök-oldatot (0,1 mM) és 50 μL RVE-t tartalmazott öt különböző koncentrációból (200, 500, 1000, 2000 és 4000 ug). /ml metanol) 10, 25, 50, 100 és 200 ug/ml végső koncentráció eléréséhez. Kontrollként egy másik csövet tartottunk, amely 50 µl metanolt és 950 µl metanolos DPPH oldatot tartalmazott. A kémcsöveket 30 percig sötét helyen hagytuk. A keverékek abszorbanciáját GENESYS 10S UV-VIS spektrofotométerrel (Thermo SCIENTIFIC, USA) 517 nm-en vettük fel. Végül a gyökfogó aktivitás (RSA) százalékos arányát a DPPH elszíneződése alapján számítottuk ki a következő képlet segítségével: százalékos RSA=[(ADPPH − ARVE)/ADPPH] × 100, ahol ADPPH a DPPH-oldat abszorbanciája (kontroll), az ARVE pedig az RVE oldat abszorbanciája. Azt a koncentrációt, amelynél az RVE 50 százalékos RSA-t eredményezett, IC50-értéknek neveztük, és egy grafikon segítségével számítottuk ki, amely a százalékos RSA-t a különböző alkalmazott RVE-koncentrációk függvényében helyezi el.
Kísérleti állatok és kísérleti tervezés
42 napos hím svájci albínó egereket (30-32 g testtömeg) 1 hétig akklimatizáltunk a kísérlet megkezdése előtt egy szobában (körülbelül 25 ± 2 fok hőmérséklet és ~50 százalékos páratartalom, 12 órás sötét/világos ciklus). Ivóvizet és élelmet ad libitum biztosítottak.
Az egereket véletlenszerűen nyolc csoportra osztották (n {0}}). Az első (kontroll) csoportot 0,2 ml 0,9 százalékos NaCl-dal kezeltük. A következő négy csoportot 2,5 mg/kg ciszplatinnal kezeltük 5 napon keresztül, 24 órás időközönként. A ciszplatin beadása után az egyik csoportot (a második csoportot) további kezelés nélkül hagytuk, és stresszes kontrollcsoportnak jelöltük. A harmadik, negyedik és ötödik csoportot 25, 50 és 100 mg/kg RVE-vel kezelték tovább 5 napon keresztül. További három csoportot csak 25, 50 és 100 mg/kg RVE-vel kezeltek 5 napon keresztül. A ciszplatint és az RVE-t desztillált vízben oldottuk. Minden kezelést intraperitoneálisan adtunk. Az utolsó kezelés 24 órája után az állatokat elaltatták a nyaki diszlokációt követően [25]. Ezután ollóval felnyitottuk a hashártyát, szívpunkciót követően vért vettünk, csipesszel a veséket. Vérrel ellenőrizték a kreatinin szintjét a szérumban. A veséket a malondialdehidszint és a génexpresszió értékelésének vetettük alá.
A szérum kreatininszint mérése
A szérum kreatinint a Creatinine Colorimetric Assay Kit{0}},460 (Cayman Chemical, USA) segítségével mérték a készlethez mellékelt gyártói protokoll szerint.
A vese lipidperoxidációjának mérése
A malondialdehid (MDA) a veseszövet lipid-peroxidációjának végterméke, és általában a ROS termelés indikátoraként mérik. Egy korábbi tanulmány szerint azonban az MDA szintet a veseszövetben mérték [27]. Először a veseszövetet nátrium-foszfát pufferben (0,1 M, pH 7,4) homogenizáltuk. 0,8% tiobarbitursavat (1,5 ml), 8,1% SDS-t (200 μL), 20% (pH 3,5) ecetsavat (1,5 ml) és dH2O-t (600 μL) tartalmazó reakcióoldatot adtunk 100-hoz. μl homogenizált szövetet, majd a keveréket 95 fokon 1 órán át inkubáltuk. Lehűlés után az elegyeket 10,000 g-vel centrifugáltuk 10 percig 4 fokon, és a felülúszó abszorbanciáját mértük 532 nm-en standard 1, 1, 3, 3- tetrametoxi-propánnal. A teljes fehérje mennyiségét a Bradford Protein Assay kit (BIO-RAD, USA) segítségével, valamint a standard szarvasmarha szérum albuminnal (BSA) összehasonlítva mértük. A lipid-peroxidok intenzitását nanomol (nM) MDA per milligramm (mg) fehérje formájában fejeztük ki.
Valós idejű polimeráz láncreakció (valós idejű PCR)
A valós idejű PCR-t a korábban leírtak szerint végeztük [28, 29]. A veseszövetből a teljes RNS-t TRIzol® reagenssel (Invitrogen) izoláltuk a gyártó által biztosított protokoll szerint. Az izolált RNS-t (1 ug) ezután cDNS-vé alakítottuk. Először 2 μL random hexamert (10 μM), 2 μL dNTP-t (10 mM), 1 ug RNS-t és 15 μL-ig nukleázmentes HO-t vettünk, és 5 percig 70 fokon inkubáltunk. Az elegyet azonnal jégre tesszük 2 percre. Ezután 4 μl 1. szál puffert (5x) és 1 μL M-MLV reverz transzkriptázt adtunk minden csőbe, és 10 percig inkubáltuk, majd 50
min 25 fokon, illetve 42 fokon. Végül az M-MLV reverz transzkriptáz enzimet inaktiváltuk úgy, hogy a keveréket 95 fokon 5 percig inkubáltuk. A szintetizált cDNS-termékeket valós idejű PCR-nek vetettük alá az NQO1, p53 és Bcl-2 génexpresszió mennyiségi meghatározására specifikus primerek segítségével (1. táblázat). Mindegyik reakciót (10 μL) három párhuzamosban hajtották végre, amely 5 μL GoTaq qPCR Master Mix-et (2x) (Promega, USA), 0,5 μL (10 mM) mindegyik primerből, 3 μL nukleázmentes vizet és 1 μL cDNS 48-lyukú reakciólemezeken. A termikus ciklust valós idejű PCR géppel (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, USA) végeztük a következő cikluskörülmények között: 95 fok 10 percig, majd 40 95 fokos ciklus 30 másodpercig, 50 fok 30 másodpercig, és 72 fok 25 másodpercig. A PCR-reakciók specifitását az olvadási görbe elemzése igazolta 95 fokon 15 másodpercig, 45 fokon 15 másodpercig, és 95 fokon 15 másodpercig. A PCR-reakciók specifitását az olvadási görbe elemzése igazolta 95 fokon 15 másodpercig, 45 fokon 15 másodpercig, és 95 fokon 15 másodpercig. A génexpresszió relatív mennyiségi meghatározását endogén GAPDH gén felhasználásával végeztük kontrollként a ΔΔCq módszer alapján.
Sejttenyésztés és kezelés
A humán vese proximális tubulus epiteliális sejtvonalát, a HK-2 sejteket 10% FBS-sel és antibiotikumokkal (50 U/ml penicillin és 50 ug/ml sztreptomicin) kiegészített DMEM-ben tartottuk 5% CO2-t és 95% szén-dioxidot tartalmazó inkubátorban. százalékos páratartalom 37 fokon.
H2O2 mérési vizsgálat
A H2O2 szintet a HK-2 sejtekben a ROS-Glo™ H2O2 Assay kit (Promega, USA) segítségével becsültük meg a kit gyártója által biztosított protokoll szerint. HK-2 sejteket (1000 sejt) 70 μl DMEM-ben helyeztünk a 96-lyuk mikrotiterlemez üregeibe. Miután lehetővé tették a sejtek rögzítését a falfelületen, a mikrotiterlemez üregeiből származó 10 μL DMEM-et 10 μL ciszplatinnal (25 μM DMEM-ben) helyettesítettük, és 12 órán át inkubátorban tartottuk. Ezután 10 μL RVE-t adtunk hozzá, hogy a végső koncentráció 125, 250 és 500 ug/ml legyen DMEM-ben, és további 12 órán át inkubáljuk. Ezt követően 20 μL H2O2 szubsztrát oldatot és 100 μL ROS-Glo™ detektáló oldatot adtunk minden egyes lyukba. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 20 percig inkubáltuk. Végül a lumineszcenciát GloMax Luminometer (Promega, USA) segítségével mértük.
GC-MS elemzés
A (metanolban oldott) RVE GC-MS analízisét a korábban leírtak szerint [30] hajtottuk végre egy automatikus mintavevőt (AOC{) tartalmazó GCMS-QP2020 (SHIMADZU) használatával. {5}}s), egy automatikus befecskendezőt (AOC-20i) és egy gázkromatográfot (GC-2010 Plus), amely egy SH-Rxi-vel felszerelt tömegspektrométerhez kapcsolódik{{1{{ 37}}}}Sil MS kapilláris oszlop (30 m × 0,25 μm ID × 0,25 μm DF). A hélium vivőgázt 1,72 ml/perc állandó áramlási sebességen tartottuk, és 5 µl befecskendezési térfogatot 10:1 osztási arány mellett végeztünk. Az injektor hőmérsékletét 220 fokon tartottuk, az ionforrás hőmérsékletét 280 fokon, a sütő hőmérsékletét 80 fokról programoztuk (tartsa 2 percig), 5 fok/perc emeléssel 150 fokra (tartási idő 5,0). min), majd 5 fok/perc 280 fokig, 280 fokon 8 perces izotermiával végződve. A tömegspektrumokat 1,5 kV-on vettük fel 0,5 s szkennelési időközzel, és a mintát 45-350 m/z tartományban futtattuk. Az oldószer késleltetése 0-3 perc, a teljes GC-MS futási idő 55 perc volt. A kimutatott vegyületek relatív koncentrációját úgy határoztuk meg, hogy az átlagos csúcsterületet összehasonlítottuk a teljes területtel. A tömegspektrum értelmezését a GC-MS-ben a National Institute Standard and Technology (NIST) adatbázisai segítségével végezték, beleértve a NIST08, NIST08s és NIST14 adatbázisokat.
Statisztikai analízis
A statisztikai elemzéseket ANOVA-val végeztük, Dunnett T3 tesztjét követve, IBM SPPS (20-as verzió) szoftverrel. Az adatok átlag ± szórás (SD) formában vannak artikulálva. A szignifikáns összehasonlítást a p<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
Eredmények
In vitro antioxidáns aktivitási teszt
Bár korábban az RVE antioxidáns aktivitásáról számoltak be, újra ellenőriztük kivonatunk antioxidáns aktivitását a DPPH szabad gyökfogó képessége segítségével. Az RVE dózisfüggően semlegesítette a DPPH-t (1. ábra). Az RVE jelentős in vitro antioxidáns aktivitást mutatott, és az RVE számított IC50 értéke 37,39 ± 1,89 ug/ml volt.
A szérum kreatininszint mérése
A szérum kreatininszint egerekben szignifikánsan (p < {{0}},05)="" emelkedett="" a="" ciszplatin="" beadása="" után="" (2.="" táblázat).="" az="" rve-kezelés="" jelentősen="" (p="">< 0,05)="" javította="" a="" kreatininszintet="" dózisfüggő="" módon="" (2.="">
A vese lipidperoxidációjának mérése
A kontrollhoz képest a ciszplatin jelentősen (p < {0}},05)="" növelte="" az="" mda-tartalmat="" az="" egerek="" veseszövetében="" (3.="" táblázat).="" ezzel="" szemben="" az="" rve-kezelés="" jelentősen="" (p="">< 0,05)="" az="" mda-t="" szinte="" normálisra="" állította="" dózisfüggő="" módon="" (3.="">
Valós idejű PCR
A ciszplatin szignifikánsan (p < {0}.05)="" 0.15-szeresére="" csökkentette="" az="" nqo1="" mrns="" expresszióját,="" és="" növelte="" a="" p53="" és="" bcl-2="" mrns-t="" kifejezés="" 24-szeresére,="" illetve="" 4.{9}}szeresére="" (2.="" ábra).="" az="" rve="" jelentősen="" (p="">< 0.05)="" csökkentette="" az="" nqo1,="" p53="" és="" bcl-2="" mrns="" expresszióját="" dózisfüggő="" módon="" (2.="" ábra).="" az="" egyetlen="" ciszplatinnal="" kezelt="" csoporthoz="" képest="" az="" nqo1="" mrns="" expressziója="" 3,57,="" 6,36="" és="" 9.{25}}szeresére="" nőtt="" 25,="" 50="" és="" 100="" mg/kg="" rve,="" illetve="" (2a.="" ábra).="" a="" p53="" mrns="" expressziója="" ismét="" 0,63,="" 0,46="" és="" 021--szeresére="" csökkent="" 25,="" 50="" és="" 100="" mg/kg="" rve="" mellett="" (2b.="" ábra).="" a="" bcl-2="" mrns="" expressziója="" szintén="" 0,71,="" 0,40="" és="" 0,40-szeresére="" csökkent="" 25,="" 50="" és="" 100="" mg/kg="" rve="" mellett="" (2c.="" ábra).="" az="" nqo1,="" p53="" és="" bcl{56}}="" gének="" expressziós="" szintjében="" azonban="" nem="" találtunk="" szignifikáns="" (p=""> 0,05) változást az RVE-kezelés következtében (3. ábra).
H2O2mérési assay
A H2O2 mérési vizsgálatban a H2O2szintet a lumineszcenciával arányosnak tekintették. A ciszplatin alkalmazása szignifikánsan (p < {0}}.05)="" a="" h2o2="" szintet="" 22--szeresére="" emelte="" (4.="" ábra).="" az="" rve-kezelés="" jelentősen="" csökkent="" (p="">< 0.05)="" h2o2-szint="" 0,25,="" 0,38="" és="" 0,{16}}szeresére="" 125,="" 250="" és="" 500="">
GC-MS elemzés
Összesen 10 vegyület (4. táblázat és 5. ábra), köztük "Izoborneol, pentametil-disilanil-éter (szeszkviterpén-alkohol)", "Timin (pirimidin-nukleobázis)", "4H-Pyran-4-one, 2,{{ 8}}dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil- (szaponin)", "Hexadekánsav, metil-észter (zsírsav-metil-észter)", "9,12- Oktadekadiénsav, metil-észter (zsírsav-metil-észter)", "9-Oktadecénsav (Z)-, metil-észter (zsírsav-metil-észter)", "Metil-sztearát (zsírsav-metil-észter)", "Diizooktil-ftalát (észter)", "13-dokozénamid, (Z)- (alkaloid)" és "szkvalén (triterpén)" volt kimutatható az RVE-ben.
A cistanche tubolosa előnyei: csökkenti a vérzsírokat
Vita
A természetes és szintetikus antioxidánsokat átfogóan tanulmányozták, és kimutatták, hogy alkalmasak a toxicitás megelőzésére vagy enyhítésére az állatfiziológiában [31]. Az antioxidáns-kiegészítők vagy kémiai szintézissel, vagy természetes élelmiszerekből történő extrakcióval kifejlesztett komponensek, de ezek összetételükben nem azonosak az élelmiszerekben elérhető antioxidánsokkal [5]. Ezért a vélemények idővel megoszlanak, hogy a szintetikus antioxidánsok hasonló egészségügyi előnyökkel járnak-e, mint a természetes antioxidánsok [32]. Felmerül a késztetés, hogy csökkentsük a szintetikus antioxidáns-kiegészítők használatát, és keressük a hatékony természetes antioxidánsok alternatív, olcsó, megújuló, természetes és esetleg biztonságosabb forrásait.
Az egyik legfontosabb mechanizmus a nukleáris faktor eritroid -2 kapcsolódó faktor-2 (Nrf2) útvonala, amely általában megvédi a sejteket az exogén vagy endogén stresszorok által kiváltott oxidatív stressztől [27]. A hatékony antioxidánsok indukálják az Nrf2 expresszióját, amely tovább költözik a sejtmagba, és az antioxidáns válaszelemhez (ARE) kötődik, amely az NQO1 II. fázisú méregtelenítő és antioxidáns gén expresszióját váltja ki [33, 34]. Az NQO1 széles körben és eltérően expresszálódik szövetspecifikus módon. Az NQO1 egy citoszolos antioxidáns flavoprotein, amely katalizálja a kinonok 2-elektronok hidrokinonokká történő redukcióját, ami az elektrofilek méregtelenítését és a redox ciklus előrejelzését eredményezi [35]. Egy korábbi tanulmány szerint [36] a -lapachone aktiválja az NQO1-et, ami tovább növeli az intracelluláris NAD plusz szintet, és megvédi a vesét a ciszplatin által kiváltott akut sérüléstől.
A ciszplatinról ismert, hogy oxidatív stresszen, gyulladáson és apoptózison keresztül károsítja a glomeruláris filtrációs membránt, ami összességében a glomeruláris filtrációs sebesség csökkenéséhez és a normál membrán permeabilitásának elvesztéséhez vezet [37]. Emiatt a szérum kreatinin szintje megemelkedett. A szérum kreatinin az egyik lehetséges vesefunkció marker. A ciszplatin kezelés megnövelte a veseszövet MDA-tartalmát, amely a lipidperoxidáció másodlagos terméke, és ez a jelentés változatlan a korábbi tanulmányokhoz képest [27, 35, 37, 38]. Az RVE-kezelés jelentősen csökkentette a veseszövet MDA-tartalmát. Ugyanakkor a kreatinin szint is csökkent, ami az RVE javító hatását jelzi.
Emellett az NQO1 expressziója szignifikánsan csökkent, a p53 és Bcl-2 expressziója pedig szignifikánsan megnőtt a ciszplatin expozíció után. Az NQO1 és p53 in vivo expresszióját tekintve eredményeink összhangban vannak egy korábbi vizsgálattal [13]. Egy nemrégiben végzett tanulmány [39] kimutatta, hogy a ciszplatin szignifikánsan csökkentette a Bcl-2 expresszióját egerek veséjében, de meglepő módon emelkedett expressziót tapasztaltunk. Ez a különbség a dóziskülönbség következménye [40], mivel Mohamed és munkatársai [39] 8 mg/kg-ot használtak 12 napig, míg mi 2,5 mg/kg-ot csak 5 napig. Egy másik tanulmány [41] megállapította, hogy a ciszplatin növelheti a Bcl-2 expresszióját olyan dózisban, amikor az nem citotoxikus. A megnövekedett Bcl-2 expresszió ismét érzékenyíti a sejteket az oxidatív stresszre [40].
A p53 expressziója azonban normál fiziológiás körülmények között alacsony, de várhatóan felfelé szabályozódik, ha ciszplatinnal kezelik, mivel ez a platina alapú kemoterápiás szer aktiválja a p53-függő apoptotikus útvonalat. Miután egereket ciszplatinnal kezeltünk, a p53 szignifikánsan megemelkedett az egerek veséjében a kontrollhoz képest. Egy másik proto-onkogén Bcl{6}} szintén korrelál az NQO1 expressziós szintjével. A p53-expressziót utánozva azt is megállapítottuk, hogy a Bcl- 2 szintje megemelkedett a ciszplatin-kezelés hatására, de az RVE-kezelés hatására szignifikánsan újból lefedett. Ez lehetséges, mivel az oxidatív stressz hatására a p53 gén aktiválódik, és a sejtciklus leállását, az öregedést vagy az apoptózist eredményezi [6]. A méregtelenítés során az NQO1 túlzott expresszióját gyakran úgy tekintik, hogy összefüggésbe hozható a rákos sejtek apoptózisával [10], bár az apoptózis mögött meghúzódó mechanizmus és az NQO1 túlzott expressziója még mindig vitatott. Ezenkívül hepatocelluláris karcinómában az NQO1 túlzott expressziója csökkenti a Bcl-2 expresszióját [10]. A Bcl{21}} proto-onkogénnek is van p53-a, mint az NQO1-expresszióval. A p53 egy szekvencia-specifikus transzkripciós faktor, amely számos típusú celluláris stressz hatására aktiválódik [42], míg a Bcl-2 túlzott expressziója mitokondriális pórusstabilizátorként működött, elősegítve a citokróm-c felszabadulását oxidatív stressz hatására [12]. Esetünkben mindkét génreakciót ciszplatin kezeléssel ellenőriztük normál veseszövetben, és megnövekedett expressziót tapasztaltunk. Az RVE-kezelés a p53 és a Bcl-2 expresszióját szinte normális szintre állította vissza, dózisfüggő módon. Ezt a típusú Bcl-2 kifejezést a Trolox ROS scavenger segítségével is kimutattuk [43]. Ezen túlmenően a H2O2 szint is jelentősen megemelkedett a HK-2 sejtekben a ciszplatinnal végzett in vitro kezelés következtében. Az RVE-kezelést követően a H2O2 szint jelentősen visszaállt a normál körüli értékre. Ez feltehetően az RVE kezelés hatásának köszönhető, amely növelte az NQO1 expresszióját [44], amely védelmet nyújt az oxidatív stressz ellen [6].
A GC-MS kromatogram tíz vegyület jelenlétét igazolta az RVE-ben. Ezek közül a „4H-Pyran- 4-one, 2, 3-dihydro-3,5-dihidroxi-6-methyl-”, „hexadekánsav” és „ A szkvalén" jól ismert antioxidánsok[45–47]. Ez a három vegyület összességében valószínűleg szinergikus nefroprotektív hatást fejtett ki. Korábbi tanulmányok arról is beszámoltak, hogy A-vitamin [48], C-vitamin [49], E-vitamin [50], flavonoidok [51] és polifenolok [50] indukálják az NQO1-expressziót. Ezért ez a jelentés javasolja annak tisztázását, hogy ez a kivonat tartalmaz-e valamit az A-vitamin, a C-vitamin, az E-vitamin, a flavonoidok és a polifenol közül, vagy sem.
Következtetés
Az általános megállapítás arra utal, hogy az RVE fiziológiailag hatékonyan védi a veséket a ciszplatin által kiváltott károsodástól. Ezért kulcsfontosságú, hogy tisztázzuk azokat a pontos vegyületeket, amelyek felelősek a ciszplatin által kiváltott nefrotoxicitás mérsékléséért, amelyek emberi alkalmazásra előnyösek lehetnek.
Köszönetnyilvánítás
A szerzők hálásak a Banglades Tudományos és Ipari Kutatások Tanácsának (BCSIR), Rajshahi Branch-nek, amiért laboratóriumi támogatást nyújtottak az RNS mennyiségi meghatározásához.
A szerzők hozzászólásai
Az MMH kísérlettervezést, kísérletezést, adatelemzést és -előkészítést, kéziratírást és -szerkesztést, kézirat-lektorálást és szerkesztést végzett; MST és MME végzett kísérletezést és adatelemzést; Az AME & MAR hozzájárult a felügyelethez és az erőforrásokhoz; Az AH felelt a koncepcióalkotásért, a felügyeletért, az erőforrásokért és a kéziratok szerkesztéséért. Minden szerző
átnézte a kéziratot. A szerzők elolvasták és jóváhagyták a végleges kéziratot.
Finanszírozás
A jelenlegi munkát a Taif University Researchers Supporting Project number (TURSP - 2020/75), Taif University, Taif, Szaúd-Arábia finanszírozta.
Az adatok és anyagok elérhetősége.
Minden lényeges adat rendelkezésre áll, és kérésre átadható a megfelelő szerzőnek.
Nyilatkozatok
Etikai jóváhagyás és hozzájárulás a részvételhez
A kísérlet végrehajtásának etikáját az Institutional Animal, Medical Ethics, Biosafety és Biosecurity Committee (IAMEBBC), Institute of Biological Sciences (IBSc), Rajshahi Egyetem hagyta jóvá, és a 31/{{1} számú feljegyzés alatt biztosították. }IAMEBBC/IBSc. Minden módszert a fent említett etikai bizottság irányelvei és előírásai szerint végeztünk. Ezt a vizsgálatot az ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) irányelveinek megfelelően végeztük. A „Részvételi hozzájárulás” nem vonatkozik erre a tanulmányra.
A szerző adatai
1 Molekuláris Biológiai és Fehérjetudományi Laboratórium, Génmérnöki és Biotechnológiai Tanszék, Élet- és Földtudományi Kar, Rajshahi Egyetem, Rajshahi 6205, Banglades. 2 Molekuláris Patológiai Laboratórium, Biológiai Tudományok Intézete, Rajshahi Egyetem, Rajshahi 6205, Banglades. 3 Biotechnológiai Tanszék, College of Science, Taif University, PO Box 11099, Taif 21944, Szaúd-Arábia. 4 Genetikai Tanszék, Mezőgazdasági Kar, Alexandriai Egyetem, Alexandria 21545, Egyiptom.
Hivatkozások
1. Bagchi K, Puri S. Szabad gyökök és antioxidánsok az egészségben és a betegségekben: áttekintés. East Mediterr Health J. 1998;4:350–60.
2. Koh EM, Lee EK, Song CH, Song J, Chung HY, Chae CH és mások. A ferulát, a búzacsíra aktív komponense, javítja az oxidatív stressz által kiváltott PTK/PTP egyensúlyhiányt és a PP2A inaktivációt. Toxicol Res. 2018;34(4):333–41.
3. Hassan AI, Ibrahim RY. Néhány genetikai profil az Ehrlich ascites daganatos egerek májában a besugárzás által kifejtett stressz alatt. J Radiat Res Appl Sci. 2014;7(2):188–97.
4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY és mások. Az oxidatív stressz részvétele az akut mieloid leukémia visszaesésében. J Biol Chem. 2010;285(20):15010–5.
5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Szabad gyökök, antioxidánsok a betegségekben és az egészségben. Int. J. Biomed Sci. 2008;4:89–96.
6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. A NAD (P) H-kinon-oxidoreduktáz 1 (NQO1) szerepe a rák progressziójában és a kemorezisztenciában. J Clin Exp Oncol. 2017;6:1–6.
7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: kinon-oxidoreduktáz 1 (NQO1) a daganatellenes kinonokkal szembeni érzékenységben és rezisztenciában. Biochem Pharmacol. 2012;83(8):1033–40.
8. Dinkova-Kostova AT, Talalay P. NAD (P) H: kinon akceptor oxidoreduktáz 1 (NQO1), többfunkciós antioxidáns enzim és kivételesen sokoldalú citovédelem. Arch Biochem Biophys. 2010;501(1):116–23.
9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP és mások. A NADPH dikumarol gátlása: a kinon-oxidoreduktáz szuperoxid által közvetített mechanizmuson keresztül gátolja a hasnyálmirigyrák növekedését. Cancer Res. 2003;63(17):5513–20.
10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. A NAD (P) H túlzott expressziója: a kinon-oxidoreduktáz 1 gátolja a hepatocelluláris karcinóma sejtek proliferációját és apoptózist indukál az AMPK/PGC-1 útvonal aktiválásával. DNA Cell Biol. 2017;36(4):256–63.
11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. A NAD (P) H-kinon oxidoreduktáz 1 szuppressziója fokozta a kolangiokarcinóma sejtek kemoterápiás szerekkel szembeni érzékenységét. J Exp Clin Cancer Res. 2014; 33(1):1–13.
12. Dasari S, Tchounwou PB. A ciszplatin a rákterápiában: molekuláris hatásmechanizmusok. Eur J Pharmacol. 2014;740:364–78.
13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. Az S-Allylmercaptocysteine az apoptózis, az oxidatív stressz és a gyulladás elnyomása révén gyengíti a ciszplatin által kiváltott nefrotoxicitást. Tápanyagok. 2017;9(2):166.
14. Matkowski A. Növényi in vitro kultúra antioxidánsok előállítására – áttekintés. Biotechnol Adv. 2008;26(6):548–60.
15. El-Bakry AA, Mostafa HAM, Alam EA. A Rumex vicarious L. antioxidáns hatása a növekedés vegetatív szakaszában. Asian J Pharm Clin Res. 2012;5:111–7.
16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) Ausztráliában: újragondolás. Nuytsia. 1984; 5:75–122.
17. Shahat AA, Alsaid MS, Alyahya MA, Higgins M, Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: Egyes szaúd-arábiai gyógynövények kinon-oxidoreduktáz 1 induktor aktivitása. Planta Med. 2013;79(06):459–64.
18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. A Rumex vicarious L. J Food Sci. bioaktív vegyületeinek profilja. 2011;76(8): C1195–202.
19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde-Filho PF és társai. Az alfa-, béta-, gamma-, delta- és epszilon-karotinok forrásai: huszadik századi áttekintés. Rev Bras. 2008;18(1):135–54.
20. Laouini SE, Ouahrani MR. A Rumex vicarious L. kivonat fitokémiai szűrése, in vitro antioxidáns és antibakteriális hatása. Science Study Res: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017;18:367–76.
