Absztrakt

A depresszió világszerte elterjedt és rokkant pszichiátriai rendellenesség. Egyre több bizonyíték utal arra, hogy a hippocampuson belüli túlzott neurogyulladásos aktiváció jelentősen hozzájárul a depressziós tünetek kialakulásához és progressziójához. Cistanche fenil-etanol-glikozidok (CPhG-k), a hagyományos ehető gyógynövényekből kivont fő bioaktív összetevőkCistanche deserticolaésCistanche tubulosakorábbi vizsgálatok során számos neuroprotektív farmakológiai tulajdonságot mutattak. Jelen vizsgálat célja a CPhG-k által kifejtett terápiás hatások és molekuláris mechanizmusok feltárása volt a krónikus, előre nem látható enyhe stressz (CUMS) által kiváltott depresszió-szerű viselkedési fenotípusokra C57BL/6 egerekben.

Hatvan SPF-minőségű C57BL/6 egeret véletlenszerűen hat kísérleti csoportba osztottak: kontrollcsoport, CUMS-modell-csoport, nagy dózisú CPhG-csoport (700 mg/kg), közepes dózisú CPhG-csoport (350 mg/kg), alacsony dózisú CPhG-csoport (175 mg/kg), ox-pozitív csoport (175 mg/kg) és ox-pozitív csoport. A CUMS modellezést követő négyhetes gyógyszeres szondával végzett beavatkozást követően átfogó idegi viselkedési értékeléseket hajtottak végre, beleértve a szacharózpreferencia tesztet (SPT), a nyílt terepen végzett tesztet (OFT), a farok felfüggesztési tesztet (TST) és a kényszerúszó tesztet (FST). Az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati (ELISA) készletek számszerűsítették a szérum monoamin neurotranszmitter-koncentrációit, a hippocampalis gyulladást elősegítő citokinek és gyulladásos mediátorok mellett. A hematoxilin-eozin (HE) festés és a Nissl festés a neuronális patológiás sérüléseket vizualizálta a hippocampalis fogazatú gyrus régiókban. Az immunhisztokémia kimutatta a gliafibrilláris savas fehérje (GFAP), az ionizált kalciumkötő adaptermolekula-1 (Iba-1), az NLRP3 és a kaszpáz-1 fehérjék expressziós intenzitását. Az immunfluoreszcens festés tovább értékelte az upstream TLR4/NF-κB jelátviteli kaszkád aktivációs állapotát.

Kísérleti eredményeink azt mutatták, hogy az orális CPhG-k alkalmazása jelentősen enyhítette a depresszióval összefüggő viselkedési rendellenességeket. A CPhG-k növelték a szacharóz preferencia százalékát és csökkentették a mozdulatlanság időtartamát a kétségbeesés alapú viselkedési paradigmákban. Ezenkívül a CPhG-kezelés visszaállította a kimerült szérum- és hippocampális szerotonin (5-HT), valamint a dopamin (DA) szintjét. A biokémiai kimutatás a hippocampalis pro-inflammatorikus mediátorok jelentős elnyomását és a citokin túltermelést tárta fel. A hisztopatológiai megfigyelések a CUMS által kiváltott hippocampalis neuronális károsodás dózisfüggő enyhítését mutatták be. Az immunhisztokémiai eredmények azt mutatták, hogy a CPhG-k növelték a GFAP által jelzett asztrocita sűrűséget, gátolták az Iba-1-pozitív mikroglia patológiás hiperaktivációját, és csökkentették az NLRP3 gyulladással összefüggő fehérjebőséget. Az immunfluoreszcens vizsgálatok igazolták, hogy a CPhG-k visszatartották a túlzott TLR4-et és foszforilálták az NF-κB p65 aktivációját a hippocampális szövetben.

Ezek az eredmények együttesen megerősítik, hogy a CPhG-k kiemelkedő antidepresszáns-szerű hatást fejtenek ki a CUMS-stimulált depresszió-szerű megnyilvánulásokkal szemben egerekben. Farmakológiai mechanizmusát részben kettős szabályozó funkció közvetíti: a monoamin neurotranszmitter homeosztázis helyreállítása és a TLR4/NF-κB/NLRP3 jelátviteli tengely által közvetített neurogyulladásos válaszok visszafogása. Ez az állatkísérlet preklinikai kísérleti alapot biztosít, amely támogatja a CPhG-k további kiaknázását, mint ígéretes természetes hatóanyagjelölteket vagy funkcionális élelmiszer-összetevőket a depresszió-adjuváns beavatkozásokhoz.

Kulcsszavak: Cistanche feniletanol-glikozidok (CPhG-k); depresszió; krónikus, előre nem látható enyhe stressz; ideggyulladás; asztrociták; mikroglia; TLR4/NF-κB/NLRP3 gyulladásos útvonal

1. Bevezetés

A depresszió egy sokrétű affektív pszichiátriai betegség, amelyet olyan alapvető klinikai megnyilvánulások jellemeznek, mint a tartós rossz hangulat, anhedonia, pszichomotoros retardáció, alvás-ébrenléti zavar és szomatikus diszfunkció. A súlyos depressziós epizódok potenciálisan önkárosításhoz és öngyilkossági gondolatokhoz vezethetnek, és világszerte óriási közegészségügyi terheket rónak rájuk. A Kínából származó epidemiológiai felmérések szerint a depresszió országos prevalenciája elérte a 2,1%-ot, az Egészségügyi Világszervezet pedig a súlyos depressziós rendellenességet a világviszonylatban a rokkantság alapján korrigált életévek elvesztéséhez vezető betegségek közé sorolta.

Ennek ellenére a depresszió patogenezisének hátterében álló teljes molekuláris etiológia továbbra sem teljesen tisztázott, ami akadályozza a tökéletes klinikai terápiás megoldásokat. A kortárs patofiziológiai hipotézisek a hangsúlyt a neuroimmun áthallási mechanizmusok felé helyezték át. A felhalmozódó preklinikai és klinikai kutatások rávilágítanak a tartós ideggyulladásra, mint a depressziós rendellenességek létfontosságú patogén mozgatójára. Krónikus pszichológiai vagy fiziológiai stresszhatások hatására a hippocampalis gliasejtek abnormális aktiváción mennek keresztül. A túlaktivált mikroglia és a diszfunkcionális asztrociták több gyulladást elősegítő mediátor erőteljes felszabadulását váltják ki, pro-inflammatorikus citokin-kaszkád amplifikációs hatásokat hozva létre. Az ilyen ideg-gyulladásos inzultusok tovább indukálják a neuronok morfológiai romlását, a neurotranszmitterek metabolikus zavarát és a szinaptikus plaszticitás károsodását, végső soron elősegítve a depresszióhoz hasonló kóros progressziót.

A jelenlegi főbb klinikai antidepresszáns beavatkozások túlnyomórészt szintetikus kémiai antidepresszánsokra támaszkodnak, amelyeket a fluoxetin képvisel, egy szelektív szerotonin-visszavétel-gátló (SSRI). Annak ellenére, hogy bizonyos betegeknél részlegesen enyhülnek a tünetek, a szintetikus antidepresszánsoknak jól ismert hátrányai vannak: nem kielégítő teljes remissziós arányok, gyakori maradék depressziós tünetek, nagy a visszaesés valószínűsége a gyógyszeres kezelés abbahagyása után, valamint káros gyomor-bélrendszeri, máj- és metabolikus mellékhatások a hosszú távú alkalmazás során. Ezzel szemben a hagyományos növényi gyógyszerek többcélú modulációs jellemzőkkel és viszonylag enyhe biztonsági profillal rendelkeznek, ezért egyre nagyobb a kutatási érdeklődés a hangulatzavarok adjuváns terápiája iránt.

Cistanche deserticolaésCistanche tubulosaA közönséges nevén "sivatagi ginzeng" az Orobanchaceae családba tartozik. Húsos száruk klasszikus homológ gyógy-élelmiszer-alapanyagként szolgál a hagyományos ázsiai gyógynövény-gyakorlatban. A modern farmakológiai vizsgálatok számos neuroprotektív bioaktivitást dokumentálnakCistanchekivonatok, beleértve az Alzheimer-kór és a Parkinson-kór elleni neurodegenerációs hatásokat. A fenil-etanol-glikozidok a fő bioaktív frakciókCistanchefőként echinakozidot és verbaszkozidot tartalmazó kivonatok. A Cistanche fenil-etanol-glikozidok (CPhG-k) daganatellenes, antioxidáns, immunmoduláló és neuroprotektív bioaktivitást mutatnak több kísérleti platformon.

A korábbi előzetes laboratóriumi munkák kimutatták, hogy a CPhG-k növelhetik a striatális dopaminkoncentrációt és enyhíthetik a menopauzával összefüggő depresszív fenotípusokat rágcsáló állatmodellekben. Azonban még mindig hiányzik a szisztematikus feltárás arról, hogy a CPhG-k védő hatást gyakorolnak-e a krónikus stressz által kiváltott depresszióra, és az ilyen bioaktivitásokat közvetítő részletes jelátviteli kaszkádokat. A krónikus, kiszámíthatatlan enyhe stressz (CUMS) állati paradigma az egyik jól bevált preklinikai depressziómodell. Azáltal, hogy a laboratóriumi rágcsálókat az egymást követő hetek során változatos, véletlenszerű enyhe stresszhatásoknak teszik ki, a CUMS megbízhatóan összefoglalja az olyan alapvető depressziós jellemzőket, mint az anhedonia, a viselkedési kétségbeesés és a hippocampalis neuropatológiai károsodás.

Ennek megfelelően ez a kutatás CUMS-indukálta depresszív egérmodellt épített fel, hogy szisztematikusan értékelje a CPhG három gradiens dózisának in vivo antidepresszánshoz hasonló hatását. Különösen a monoamin neurotranszmitterek helyreállítására, a hippocampális gliasejtek fenotípusos transzformációjára és a TLR4/NF-κB által szabályozott NLRP3 gyulladásos neuro-gyulladásos útvonalra összpontosítottunk. Ez a tanulmány objektív kísérleti bizonyítékokkal kíván szolgálni a CPhG-k jövőbeni gyógyszerfejlesztésének és a depresszív tünetek javítását célzó funkcionális élelmiszer-alkalmazásának támogatására.

2. Anyagok és módszerek

2.1 Kísérleti anyagok, reagensek és műszerek

A szabványosított CPhG-k nyers kivonatot a Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd.-től szerezték be (. 20231221. tételszám, Xinjiang, Kína). Összes fenil-etanol-glikozid-tartalom Legfeljebb 85 %, legalább 40 % echinakozidot és 16 % vagy nagyobb verbakozidot tartalmaz. A fluoxetin-hidroklorid kapszulákat a Patheon France cégtől szereztük be. Az 5-HT, DA, iNOS, COX-2, PGE2, TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-ekhez készült kereskedelmi ELISA tesztkészleteket minősített biológiai reagens beszállítóktól szerezték be. Az immunhisztokémiára és immunfluoreszcenciára alkalmazott elsődleges antitestek közé tartoztak az anti-GFAP, anti-Iba-1, anti-NLRP3, anti-kaszpáz-1, anti-TLR4 és anti-foszfo-NF-κB p65 antitestek. A HE és Nissl festéshez szövettani festőkészleteket készítettek a paraffinos agymetszet feldolgozásához.

A legfontosabb laboratóriumi analitikai eszközök közé tartozott a nagy pontosságú elektronikus analitikai mérleg, a Milli-Q ultratiszta víztisztító munkaállomás, a SpectraMax többmódusú mikrolemez-olvasó, a Leica függőleges fluoreszcens mikroszkóp, valamint a teljes rágcsáló viselkedéselemző hardver és a SMART 3.0 mozgáskövető szoftverrendszer.

Hatvan hím SPF-minőségű C57BL/6 egeret, hét hetes, 18–22 grammos kezdeti testtömegű egereket a Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.-től vásároltak. Minden egérkísérleti manipuláció hivatalos etikai jóváhagyást kapott a Shaanxi Kínai Orvostudományi Egyetem Állat-etikai Bizottságától. ID:32MDL01500. Az egereket specifikus kórokozó-mentes állattartó létesítményekben helyezték el. A környezeti paramétereket környezeti hőmérsékleten (21 ± 2) fokon, 60 % ± 10 % relatív páratartalom mellett tartottuk, szabványos 12 órás világos-sötét megvilágítási ciklusokat alkalmazva. A rágcsálóeledel és az ivóvíz ad libitum volt hozzáférhető. A formális kísérleti munkafolyamatok megkezdése előtt egyhetes adaptív akklimatizációs időszakot hajtottak végre.

2.2 Állatcsoportosítás, CUMS modellezés és gyógyszerfelügyelet

Egyhetes adaptív nevelést követően az előzetes szacharózpreferencia-szűrés kizárta az egyes egereket, akiknek eredendően alacsony a cukorfogyasztási preferenciája. A minősített kísérleti egereket véletlenszerűen hat vizsgálati csoportba osztották (minden csoportban n = 10 állat):

Kontroll csoport (Con): nincs CUMS stressz, izovolumetriás ionmentes víz intragasztrikus adagolása;

CUMS modellcsoport (Mod): teljes CUMS-stimuláció, szondán keresztül azonos térfogatú ionmentesített vízzel;

Nagy dózisú CPhG-k csoportja (CPhGs-H): CUMS-expozíció, CPhG-k 700 mg/ttkg napi gyomorszondával;

Közepes dózisú CPhG-csoport (CPhGs-M): CUMS-expozíció, CPhG-k 350 mg/kg napi gyomorszondával;

Alacsony dózisú CPhG-k csoportja (CPhGs-L): CUMS-expozíció, CPhG-k 175 mg/kg napi gyomorszondával;

Fluoxetin pozitív kontrollcsoport (FLX): CUMS expozíció, 15 mg/ttkg fluoxetin naponta egyszer.

A CUMS modell felépítéséhez tíz különféle enyhe stressztényezőt alkalmaztak: fizikai korlátozás (60 perc), vízszintes rázás (60 perc), farok felfüggesztése (60 perc), ketrec 45 fokos szögben megdöntve (24 óra), nedves ágynemű környezet (24 óra), üres ketrec szigetelése (24 óra), éjszakai világítás (12 óra megvilágítás), 4 perc. hidegvízi úszás 4 fokon 5 percig, és farokcsipesz stimuláció 2 percig. Két különböző stressztényezőt alkalmaztak véletlenszerűen minden egyes nap; azonos stresszor nem jelenik meg egymás után két szomszédos napon. A CUMS modellezési eljárás négy hétig tartott.

A négyhetes stresszmodellezés befejezése után a megfelelő vizsgálandó anyagokat vagy oldószeres vivőanyagot intragasztrikusan adagoltuk naponta egyszer további négy héten keresztül. A nyolcadik kísérleti héten az összes neuro-viselkedési kimutatási projektet egymás után hajtották végre.

2.3 Neuro-viselkedési teszt akkumulátor

2.3.1 Szacharózpreferencia teszt (SPT)

A szacharózpreferencia teszt az anhedonia-szerű mag depresszív fenotípust értékeli rágcsálókban. A formális mérés előtt minden egeret külön-külön helyeztünk el. Három napos szacharóz-ital adaptációs fázist hajtottak végre. Első nap: két üveg 1%-os szacharózoldatot helyezünk el minden ketrecben 24 órára. Második nap: egy szacharózoldatos palack, egy tisztított vizes palackkal párosítva. Harmadik nap: cserélje fel a cukros- és tisztavizes tartályok helyzetét, hogy kiküszöbölje a helyeltolódást. Az adaptációs ciklus után az egerek 24 órán keresztül tápláléktól és víztől éheztek. Ezt követően előre lemért 1 %-os szacharóz vizes palackot és tisztított vizes palackot biztosítottak. A palackok helyzetét 12 óra elteltével felcseréltük. A teljes 24 órás tesztelés után mindkét palack maradék folyadéktömegét pontosan rögzítették. Szacharóz-preferencia arány (%)=(szacharózoldat fogyasztás)/(szacharózoldat fogyasztás + tisztított víz fogyasztás) × 100 %.

2.3.2 Nyílt mező teszt (OFT)

A nyílt terű készülékek egy 50 cm × 50 cm × 50 cm-es nyitott tetejű kockadobozt alkottak. A központi tér régiót egy 25 cm × 25 cm-es központi zónaként határozták meg, amely az arénán belül helyezkedik el. Mindegyik egeret óvatosan helyeztük el a nyitott mező központi felületére. Öt perc szabad alkalmazkodási időt engedélyeztek. A viselkedésrögzítés és az adatok elemzése a következő ötperces megfigyelési időszakra összpontosított. Az elsődleges kijelzési jelzők a teljes mozgási távolságot, a központi zónában töltött időt és a központi zónába való belépés gyakoriságát tartalmazták. Ezek a paraméterek spontán mozgásszervi aktivitást és felfedezési hajlandóságot tükröznek ismeretlen környezeti körülmények között.

2.3.3 Farok felfüggesztési teszt (TST)

Az egér farkát biztonságosan rögzítettük, lehetővé téve, hogy az állat fejjel lefelé lógjon a talajfelszín felett. A teljes felvételi idő hat perc volt. Dokumentálták a mozdulatlan időtartamot a későbbi négyperces szakaszban. A megnövekedett mozdulatlanság ideje fokozott viselkedési-kétségbeesés-depresszív állapotot jelent.

2.3.4 Kényszerúszó teszt (FST)

Átlátszó hengeres úszóhordót (átmérője 15 cm, magassága 50 cm) töltöttünk meg (25 ± 2) fokos vízzel; vízmélysége elérte a 20 cm-t. Mindegyik egeret óvatosan az úszóedénybe helyeztük a teljes felvételi idő hatperces időtartamára. Az utolsó négy perc lebegő mozdulatlansági idejét statisztikailag számszerűsítettük. A hosszabb mozdulatlanság időszaka a kétségbeeséssel összefüggő viselkedési teljesítmény fokozódását jelzi.

2.4 Mintagyűjtés és szövet-előkészítés

A 8. hét kísérleti végpontján az egerek 3%-os pentobarbitál-nátrium (10 ml/kg) intraperitoneális injekciót kaptak mély érzéstelenítés céljából. A vérmintákat szemgolyó-eltávolító vérzéses technikával vették. Ezt követően méhnyak-diszlokációs eutanáziát végeztek. A hideg normál-sóoldatos szívperfúzió kitisztította az agyszövetekben keringő vért. A teljes agyi mintákat gyorsan kiboncolták. Az agyszövetek felét 4%-os paraformaldehid oldatba merítettük 72 órás szövetrögzítésre a későbbi szövettani vizsgálathoz. A hippocampális agyi régiókat gyorsan izolálták a megmaradt agymintákból előhűtött jégplatformon, és megőrizték a folyékony-nitrogéntároló környezetben. A biokémiai méréshez 10 mg hippocampális szövetmintát előhűtött normál sóoldattal kevertünk össze 1:9 tömeg-térfogat arány mellett, jégfürdős mechanikai homogenizálással. A szövethomogenizátumot 4000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 15 percig, és a felülúszó frakciókat összegyűjtöttük az ELISA biomarker kvantifikációjához.

2.5 Biokémiai index mérése

A kereskedelmi forgalomban lévő ELISA készletek gyártói használati útmutatói szerint a szérum és a hippocampális homogenizátum felülúszó mintáit mértük, hogy meghatározzuk a monoamin neurotranszmitterek, köztük az 5-HT és a DA koncentrációértékeit. A hippokampusz homogenizátum felülúszóját tovább vizsgálták az iNOS, COX-2, PGE2 gyulladásos mediátor indikátorokra, valamint a TNF-, IL-1, IL-18, IL-6 és IFN- gyulladást elősegítő citokinekre. Az optikai sűrűség abszorbancia leolvasásait mikrolemezes spektrofotométerrel rögzítettük. A minta fehérjekoncentrációját BCA fehérje kvantifikációs készlettel kalibráltuk a citokin kimutatása előtt.

2.6 Hippocampalis hisztopatológiai festés

A rögzített agyszövetmintákat paraffinviaszba ágyaztuk, és 4 μm vastagságú szövettani metszetekre vágtuk. A HE festéshez: a paraffin metszeteken xilol viaszmentesítés, gradiens etanol hidratálás, hematoxilin magfestés, eozin citoplazmatikus ellenfestés, sósav-alkohol differenciálás, gradiens etanol dehidratálás, xilol átlátszó kezelés és semleges gumi szerelés történt. A mikroszkópos megfigyelés a sejtmorfológiára, a nukleáris státuszra és a citoplazmatikus szerkezeti integritásra összpontosított a hippocampalis gyrus fogazatban.

A Nissl-festés a neuronális Nissl-testeket vizualizálja, tükrözve az idegsejtek bioszintetikus aktivitását és a sejt vitalitását. A viaszmentesített paraffin szeleteket Nissl festő munkaoldatban inkubáltuk. A desztillált vizes mosási lépések után a szakaszok dehidratálást, átlátszósági eljárást és lezárást kaptak. A hippocampalis neuronok hisztomorfológiai eltéréseit optikai mikroszkóp alatt figyelték meg.

2.7 Immunhisztokémiai vizsgálat

A paraffinba ágyazott hippocampális szövetmetszeteket viaszmentesítettük és hidratáltuk. Az antigén-visszakeresési, az endogén peroxidáz blokkolási és a nem specifikus fehérjekötő blokkoló lépéseket egymás után hajtották végre. A szövetszeleteket egy éjszakán át 4 fokos hőmérsékleten inkubáltuk hígított primer antitestekkel: anti-GFAP (1:400), anti-Iba-1 (1:400), anti-NLRP3 (1:300), anti-kaspáz-1 (1:400). Másodlagos antitest-inkubálás után DAB kromogén reakciót hajtottak végre. A sejtmag ellenfestési, víztelenítési és szerelési eljárások befejeződtek. Fénymikroszkóppal készített digitális látómező képek. Az Image-J képfeldolgozó szoftver átlagos optikai sűrűségértékeket számított ki a célfehérje expressziós intenzitásának félkvantitatív értékeléséhez.

2.8 Immunfluoreszcens festés

Az előkészített paraffinos hippocampális metszeteken viaszmentesítést, antigén-visszakeresést és blokkoló műveletet végeztek. Elsődleges anti-TLR4 (1:400) és anti-foszfo-NF-κB p65 (1:200) antitesteket alkalmaztunk, és egy éjszakán át inkubáltuk négy Celsius-fokos körülmények között. Fluoreszcensen jelölt másodlagos antitesteket adtunk hozzá egyórás inkubációhoz, fényárnyékoló státuszban. DAPI nukleáris ellenfestéket tartalmazott a rögzítő közeg. Lézer-fluoreszcens mikroszkóp fluoreszcens jeleket fényképezett. Az Image-J szoftver kiszámította az átlagos fluoreszcencia intenzitást, amely a TLR4 és a p-NF-κB p65 fehérje aktiválási nagyságát reprezentálja.

2.9 Statisztikai elemzés

Az eredeti kísérleti adatokat SPSS 26.0 statisztikai szoftverrel és GraphPad Prism 9.0 grafikus programmal dolgoztuk fel. Minden kvantitatív eredményadatot átlag ± szórás (\\(\\bar{x} \\pm s\\)) formájában fejeztünk ki. A csoportok közötti statisztikai összehasonlításokat megfelelő statisztikai tesztekkel végezték el. A 0,05-nél kisebb P-értéket statisztikailag szignifikáns különbségnek ítélték; P< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Kísérleti eredmények

3.1 CPhGs javította az Anhedonia tünetet és helyreállította a monoamin neurotranszmitter szintjét

A CUMS-modellezés megkezdése előtt a szacharózpreferencia alapértékei nem mutattak nyilvánvaló statisztikai eltérést az összes kísérleti állatcsoportban. Négyhetes CUMS-stressz plusz négyhetes beavatkozási ciklus után a CUMS-modell-csoport egyértelműen csökkent szacharózpreferencia arányt mutatott a nem stresszes kontroll állatokhoz képest (P< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

A Mod-modell kohorszával összehasonlítva a magas, közepes és alacsony dózisú CPhG-kezelési csoportok, valamint a fluoxetin-pozitív csoportok a szacharóz-preferencia százalékos, a szérum 5-HT, a szérum DA, a hippocampalis 5-HT és a hippocampalis DA tartalom jelentős emelkedését eredményezték (P< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 CPhGs továbbfejlesztett felfedező tevékenység nyílt terepen

A nyílt terepen végzett viselkedésértékelés során a CUMS-modell egerek a teljes mozgási távolság, a központi zónában tartózkodási idő és a központi régióba való belépési gyakoriság jelentős csökkenést mutattak a kontroll egerekhez képest (P< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 A CPhG-k lerövidítették a mozdulatlanság idejét a kétségbeesés alapú viselkedési paradigmákban

A farok felfüggesztési tesztje és a kényszerúsztatási teszt észleli a viselkedési kétségbeesést, ami az alapvető depresszióhoz hasonló viselkedési leolvasásokat jelenti. A Mod csoport drasztikusan megnyúlt mozdulatlansági időt mutatott mind TST-ben, mind FST-ben (P< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3,4 CPhG csökkentette a túlzottan expresszált hippocampalis gyulladásos citokinek mennyiségét

A CUMS-modell állatokban a hippocampalis gyulladást elősegítő citokinkoncentráció (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) drasztikusan megemelkedett a kontroll társaihoz képest (P< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3,5 CPhGs lefelé szabályozott hippocampalis gyulladásos közvetítő biomarkerek

A hippocampális gyulladásos mediátorok iNOS, COX-2 és PGE2 CUMS modell egerekben szignifikánsan megemelkedtek (P< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3,6 CPhGs attenuált CUMS által kiváltott hippocampalis neuronális patológiás sérülés

HE festési eredmények: a Mod csoportból származó hippocampalis dentate-gyrus neuronok súlyos patológiás elváltozásokat mutattak: rendellenes sejtelrendeződés, nucleus piknózis, citoplazmatikus vakuoláris degeneráció, amely kiemelkedő neuronális károsodást mutatott. A CPhGs-L csoport csak triviális javító hatást mutatott. A közepes és nagy dózisú CPhG-k nyilvánvalóan visszafordították az ilyen kóros elváltozásokat; a nagy dózisú CPhGs-H csoport a fluoxetin csoporthoz képest jobb neuronvédő hatást mutatott részleges látómezőkben.

A Nissl-festés eredményei: A Mod-csoportú hippocampalis neuronok rendezetlen elrendeződést mutattak, a Nissl-testek mennyiségének szembetűnő csökkenése, ami az idegsejtek károsodott szintetikus funkcióját és az alacsony sejtvitalitást tükrözte. A CPhG-k adagolása dózisfüggően helyreállította a Nissl-test bőségét. A neuronális morfológia és a Nissl-testsűrűség a CPhGs-H csoporton belül megközelítette a normál kontrollcsoport szintjét. A hisztopatológiai leletek megerősítették, hogy a CPhG-k megvédték a hippocampális neuronok integritását a krónikus stressz által közvetített pusztulástól.

3.7 CPhG-k által szabályozott hippocampális gliasejtek aktiválási állapota

A GFAP az asztrocita populáció specifikus biomarkere. A Con csoporthoz képest a Mod-csoport hippocampális GFAP pozitív jelintenzitása jelentősen csökkent (P< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

Az Iba-1 fehérje marker a mikrogliát képviseli. A CUMS modellcsoport drámaian megnövekedett Iba-1 pozitív expressziós jelet mutatott (P< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3,8 CPhG-gátolt hippocampális NLRP3-gyulladással kapcsolatos fehérje expresszió

Az immunhisztokémiai kimutatás azt mutatta, hogy az NLRP3 és a kaszpáz-1 fehérje expressziója a Mod-csoport hippokampuszában jelentősen felszabályozott (P< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3,9 CPhG elnyomja a TLR4/NF-κB jelzési útvonal túlaktiválását

Az immunfluoreszcens detektálás kimutatta, hogy a CUMS-modell egerek jelentősen megnövelték a TLR4 receptor és a foszforilált NF-κB p65 alegység fluoreszcencia intenzitását (P< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Vita

A súlyos depressziós rendellenesség súlyos neuropszichiátriai betegség. Az elmúlt években a depresszió neuro-inflammatorikus elmélete széles körű kutatási figyelmet kapott. A krónikus, ismétlődő pszichés stressz a veleszületett immunrendszer aktiválódását válthatja ki a központi idegrendszerben. A hippokampusz, az egyik agyi régió, amely nagyon érzékeny a stressz inzultusaira, szorosan összefügg a hangulatmodulációval, a jutalomfeldolgozással és a memóriafunkcióval. Tartós stresszstimuláció hatására a hippocampalis gliasejtek homeosztázisa összeomlik. A hiperaktivált mikroglia és a sérült asztrociták nagy mennyiségű pro-inflammatorikus citokint választanak ki, ami idegi szerkezeti károsodáshoz, monoamin-neurotranszmitter anyagcserezavarhoz vezet, ami végül depresszió-szerű viselkedés kialakulását idézi elő.

A hagyományos gyógynövényekből származó aktív természetes termékek többcélú farmakológiai előnyökkel rendelkeznek, és ígéretes forrásjelöltté válnak az antidepresszáns gyógyszerek felfedezéséhez. A CPhG-k jellegzetes bioaktív komponensek, amelyekből izoláljákCistanchegyógynövény. Ez a kutatás CUMS-indukálta krónikus stressz-depressziós egérmodellt épített fel, átfogóan igazolva a gradiens dózisú CPhG-k in vivo antidepresszánshoz hasonló hatékonyságát. A viselkedési kísérleti eredmények azt mutatták, hogy a CPhG-kezelés jelentősen enyhítette az anhedonia tüneteit, javította a felfedező aktivitást, és csökkentette a kétségbeeséssel összefüggő mozdulatlanság idejét depressziós modellű egerekben, egyértelmű dózis-hatás összefüggést mutatva.

A monoamin neurotranszmitter hipotézise a klasszikus depresszió-patogenezis elmélet. A szerotonin és a dopamin kritikus szabályozó szerepet tölt be, beleértve az érzelmi stabilizálást, a jutalom-visszacsatolás észlelését és a motivációval kapcsolatos viselkedésmodulációt. A CUMS-stressz az 5-HT és a DA koncentrációjának nyilvánvaló csökkenéséhez vezetett a szérumban és a hippocampális szövetekben modellállatainkban. A CPhG-k beavatkozása hatékonyan helyreállította ezt a két monoamin neurotranszmitter szintet. Ez az eredmény összhangban van a korábban közzétett kutatási jelentésekkelCistancheaz agyi monoamin neurotranszmittereket moduláló kivonatok.

További biokémiai biomarker-tesztek kimutatták, hogy a CUMS több gyulladást elősegítő citokin (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) és gyulladásos mediátorok (iNOS, COX-2, PGE2) erőteljes növekedését indukálta a hippocampális szövetben. A CPhG-k beavatkozása szignifikánsan megfordította az ilyen gyulladásos túlexpressziós állapotot. A hisztopatológiai HE és Nissl festés intuitív módon bebizonyította, hogy a CPhG-k mérsékelték a stressz okozta hippocampális-neuron károsodást és megvédték a neuronok morfológiai integritását.

A gliasejtek populációi központi résztvevőként szolgálnak a neuro-gyulladásos válaszok közvetítésében. Az asztrociták fenntartják a neurotranszmitterek újrahasznosítását, a vér-agy gát szerkezeti stabilitását és az idegsejtek táplálékellátását. A mikroglia rezidens veleszületett immun effektor sejtekként funkcionál az agy parenchymájában. A krónikus stressz asztrocita veszteséget vagy funkcionális inkompetenciát vált ki, a mikroglia patológiás hiperaktivációja mellett. Immunhisztokémiai adataink azt mutatták, hogy a CPhG-kezelés növelte a GFAP-pozitív asztrocita denzitást, miközben csökkentette az Iba-1-jelzéssel jelölt túlaktivált mikroglia mennyiségét a hippocampusban. Ez a gliasejt-fenotípus szabályozó tulajdonság részben a CPhG neuroprotektív és depresszióellenes farmakológiai hatásának hátterében állhat.

Az NLRP3 gyulladásos létfontosságú molekuláris platformot képvisel, amely neuro-gyulladásos kaszkádot közvetít. Aktiválása serkenti a downstream IL-1 és IL-18 pro-inflammatorikus citokinek érését és szekrécióját. A TLR4/NF-κB jeltengely az NLRP3 gyulladásos aktivációjához elengedhetetlen felfelé irányuló indítójelként működik. A TLR4 receptor stimuláció elősegíti az NF-κB alegység foszforilációját és a nukleáris transzlokációt, tovább aktiválja az NLRP3, a pro-IL-1 gén transzkripcióját. Jelen tanulmányunkban a CUMS stressz egyidejűleg fokozta a TLR4, a foszforilált NF-κB p65, az NLRP3 és a kaszpáz-1 fehérje expresszióját. A CPhG-k beavatkozása egyértelműen gátolta ennek a teljes jelkaszkádnak az aktiválását. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a CPhG-k részben enyhítik a neuro-gyulladásos sérüléseket a TLR4/NF-κB által közvetített NLRP3 gyulladásos aktiváció visszaszorításával.

Összességében állatmodell kísérleti bizonyítékaink alátámasztják a mechanikai modellt: a CPhG-k antidepresszáns-szerű hatásokat generálnak CUMS-indukált depressziós egerekben, két fő dimenzión keresztül: (1) a hangulatfüggő monoamin neurotranszmitterek (5-HT, DA) homeosztázisának helyreállítása; (2) a hippocampalis gliasejtek homeosztázisának modulálása és a TLR4/NF-κB által vezérelt NLRP3 gyulladásfüggő neuro-gyulladásos kóros kaszkád elnyomása.

Ennek a vizsgálatnak több korlátja is megfontolást érdemel. Ez a munka kizárólag állati szintű in vivo kísérleteket valósított meg. Nem végeztünk sejtszintű mechanikai validálást, sem humán klinikai vizsgálatokat. Ezért az emberi depresszió terápiájára vonatkozó transzlációs következtetésnek körültekintőnek kell maradnia. Emellett ez a kutatás nem boncolgatta az egyes monomer vegyületek (echinakozid, verbaszkozid) hozzájárulását a vegyes CPhG-kivonathoz. A jövőbeli kutatások a sejtkultúra-mechanikai verifikációra, az egyes komponensek aktivitásának összehasonlítására, valamint az emberi alany előzetes kísérleti megfigyelésére összpontosíthatnak.

5. Következtetés

A Cistanche fenil-etanol-glikozidok (CPhG-k) jelentős antidepresszáns-szerű farmakológiai hatást fejtenek ki a krónikus, előre nem látható, enyhe stressz által kiváltott depresszió-szerű viselkedési fenotípusok ellen C57BL/6 egerekben. Terápiával kapcsolatos mechanizmusai a szérum és a hippocampalis szerotonin és dopamin neurotranszmitter szintjének helyreállításához, a hippocampalis neuronális szerkezet integritásának megőrzéséhez, az asztrocita-mikroglia funkcionális egyensúlyának modulálásához, valamint a TLR4/NF-κB/NLRP3 gyulladásos gyulladásos kakádok által közvetített neurotranszmitterek elnyomásához kapcsolódnak. Ez a preklinikai állatkísérlet kísérleti referenciaként szolgál a CPhG-k természetes terápiás adjuváns anyagként vagy funkcionális élelmiszer-összetevőként történő továbbfejlesztéséhez, amely a depressziós tünetek javulását célozza.

Hivatkozások

Ren L, Shao YT, Qin SH. Tanulmány a célpont azonosításáról és a szaponin A depressziós rendellenességre gyakorolt ​​hatásáról. Nat Prod Res Dev, 2024, 36:44–51.

Fan L, Peng Y, Wang JW és mások. A Cistanche tubulosa szárából származó összes glikozid enyhíti a depresszióhoz hasonló viselkedést: a fitokemikáliák és a bélmikrobióta kétirányú kölcsönhatását. Fitomedicina, 2021, 83:153471.

Fan L, Peng Y, Chen XN és mások. A fitokémiai összetétel, a farmakokinetika és a hálózati farmakológia integrált elemzése a Cistanche deserticola és a C. tubulosa szárai közötti különbségek vizsgálatára az antidepresszáns aktivitás alapján. Food & Function, 2022, 13:8542-8557.

Yirmiya R, Rimmerman N, Reshef R. Depresszió mint mikroglia betegség. Trends in Neurosciences, 2015, 38:637-658.

Jia XN, Gao ZH, Hu HL. Microglia depresszióban: jelenlegi perspektívák. Science China–Life Sciences, 2021, 64:911–925.

Wu B, Gan AN, Wang RX és mtsai. Alpinia oxyphylla Miq. Az illóolaj a TLR4 által közvetített MyD88/NF-κB jelátviteli útvonal gátlásával javítja a depressziós viselkedést és gátolja az ideggyulladást a CUMS-nek kitett egerekben. Journal of Chemical Neuroanatomy, 2023, 130:102270.