A TtrA és PduA gének hiányában előforduló Salmonella Enterica szerovariánsok fokozzák a sejtek immunválaszát a csirkefertőzések során

Salmonella spp. az egyik legjelentősebb élelmiszer eredetű kórokozó, amely gazdasági veszteségeket okoz a baromfiiparnak, és közegészségügyi következményekkel is jár. Mind a kórokozó túlélési képessége a bélkörnyezetben a gyulladás során, mind a gazdaszervezet immunrendszerével való kapcsolata kulcsszerepet játszik a baromfi fertőzések során. A tanulmány célja a makrofágok és a CD{0}} /CD8+ sejtpopulációk jelenlétének mennyiségi meghatározása volt immunhisztokémiai technikával a Salmonella vad típusú és mutáns törzseivel kísérletileg fertőzött csirkék kereskedelmi törzseiben. Enteritidis és Salmonella Typhimurium ttrA és pduA gének hiányában. A Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA a festett terület nagyobb százalékát váltotta ki, mint a vad típus, kivéve a világos tojótyúkokat. A Salmonella Typhimurium vad típusú törzs és a Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA fertőzések hasonló mintázatot eredményeznek, amelyben 1 és 14 dpi-nél a madarak vakbélmandulája és csípőbéle kifejezettebb festődést mutatott a 3 és 7 dpi-hez képest. Minden vizsgált vonalban a makrofágok jelentős beszűrődését figyelték meg a CD4+ és CD8+ sejtekhez képest. Összességében a mutáns törzzsel fertőzött állatok pozitívan festődött területe magasabb volt, mint a vad típusé. A ttrA és a pduA gének deléciói a makrofágok, valamint a CD4+ és CD8+ sejtek intenzívebb beszűrődését eredményezték a gazdamadarakban, ami arra utal, hogy a kórokozó nem gyengült, még a különböző Salmonella törzsekben sem.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

A Salmonella enterica egy élelmiszer eredetű kórokozó, amely az állatállomány veszteségét okozza, és közvetlenül a közegészségügyre is hatással van. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Az Enteritidist (Salmonella Enteritidis) és a Typhimuriumot (Salmonella Typhimurium) évtizedek óta főként élelmiszerfertőzéssel hozták összefüggésbe. 1995 és 2010 között a Salmonella Enteritidist a Salmonella spp1-re pozitív minták 34,2%-ában azonosították. Ezen túlmenően Winter és munkatársai 2 jelentős tanulmányt publikáltak a tetrationátot kódoló gén szerepének vizsgálatáról, a Salmonella Typhimurium szerotípust választották, de kísérleti modellként egereket használtak. Ezt figyelembe véve a gazda-kórokozó kölcsönhatásról szerzett ismereteink elmélyítése segíthet a védekezési és eradikációs mérések javításában. A szalmonellózis patogenezisében több tényező is szerepet játszik, mint például a kórokozó szaporodási képessége gyulladt nyálkahártya környezetben, a tápanyagfelvételtől és az anaerob légzéstől függően2. A tápanyag elérhetősége azonban nem garantálja a baktériumok túlélését más mikroorganizmusok által sűrűn benépesített versenykörnyezetben. Így a Salmonella enterica azon képessége, hogy tetrationát-reduktázt használva metabolizálja a tetrationátot, hogy energiaforrásként 1,2-propándiolt állítson elő, fitneszelőnyt jelent. Ezt az enzimet a TtrA, TtrB és TtrC alkotja. Az első idézett alegység a molibdopterin (MPT) szupercsaládba tartozik, és van egy FeS-kötő doménje, amely részt vesz a tetrationát tioszulfáttá redukálásában (S2O3 2−)2–4. A Te 1,2-propándiolt a bakteriális mikrokompartmentek (MCP) használják. Ez a szerkezet hét különböző fehérjéből áll, amelyek közül a PduA az MCP szerkezet fő összetevője5. Először is, az 1,2-propándiol propionaldehiddé alakul, amely viszont a propándiol-dehidratáz aktivitás hatására propanollá és propionáttá redukálódik. Ez a folyamat foszforilálással ATP-t hoz létre, egy elektron (1-propanol) gradienst a NAD regenerációjához, és egy köztes anyagot (propionil-CoA), amely szén- és energiaforrásként használható a metil-citrátban, mivel a szintetizált B12-vitamintól függ. endogén módon6. A csirkefertőzések során a Salmonella enterica szerovariánsok azon képességét, hogy behatoljanak a bélhámsejtekbe és a makrofágokba, és túléljenek azokon belül, az immunválasz elkerülése követi7. Ebben az összefüggésben a fertőzés egy kritikus szakasz, amely a bakteriális és gazdasejtek közötti kölcsönhatástól, valamint a baktériumok azon képességétől függ, hogy leküzdjék a bélhám gátjait a kolonizáció és a replikáció garantálása érdekében. Mindazonáltal aktiválja a gyulladásos és immunválaszokat8, amelyek endocitózishoz, illetve fagocitózishoz vezetnek az epiteliális, illetve antigénprezentáló sejtek (APC) által. Ezeknek a sejteknek az antimikrobiális aktivitása veleszületett választ vált ki a makrofágokon keresztül, és az adaptív immunválasz-szerelvény a CD4+ és CD8+ aktiválásán alapul9. A csirkékben a Salmonella által okozott bélfertőzés hátterében álló gazda-kórokozó kölcsönhatások megvilágítása érdekében értékeljük az immunrendszer sejtpopulációját a bél kolonizáció és a szisztémás fertőzés során olyan kereskedelmi származású madaraknál, amelyeket Salmonella Enteritidis és Salmonella Typhimurium vad típusú mutáns törzsei támadtak meg. , amely deléciókat hordoz a tetrationát (ttrA) és az 1,2-propándiol (PDU) metabolizmusával kapcsolatos génekben.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Eredmények

1. kísérlet – Salmonella Enteritidis fertőzés.

A brojler, könnyű tojótyúkok és félnehéz tojótyúkok vakbél mandulájában, vakbélben, csípőbélben és májban az immunválasz sejtek jelenlétének számszerűsítésének eredményeit az 1., 2. és 3. táblázat tartalmazza. További CD-t találtunk. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA-val (SEΔttrAΔpduA) fertőzött brojlerekből származó 4+ és makrofágsejt-infiltráció, mint a Salmonella Enteritidis vad típusú törzzsel (wt-SE) vagy nem fertőzött madarakból származó brojlerekből, minden értékelt szövetben. Kivételt találtak a CD4+ sejt infiltrációja 3 dpi-nél a vakbél mandulákban, a csípőbélben és a májban, valamint a makrofágok infiltrációja 3 és 14 dpi-nél a májban SEΔttrAΔpduA-val fertőzött brojlerekből. Ezenkívül a SEΔttrAΔpduA-val fertőzött madaraknál nagyobb mennyiségben figyelték meg a beszivárgott CD8+ sejtek számát 1 és 7 dpi-vel a vakbélben és májban, 3 dpi-vel a vakbél mandulában és 14 dpi-vel az ileumban. Ezzel szemben a wt-SE-fertőzött madarakban magas volt a CD8+ sejtek infiltrációja az ileumban és a vakbél mandulában 1, illetve 7 dpi-vel (1. táblázat; S1 kiegészítő ábra). A 2. táblázat és az S2 kiegészítő ábra mutatja a félnehéz tojótyúkok szöveteiben talált CD4+ és CD8+, valamint makrofág infiltrációt. Általánosságban elmondható, hogy nagy eltérések mutatkoztak a sejtinfiltrátumok területei között mind a provokáló törzs, mind a vizsgált szövetek tekintetében. A SEΔttrAΔpduA-val fertőzött madarak nagyobb területeket fedtek le CD4+ sejtekkel (az ileumban 1 és 14 dpi-nél, a májban pedig 7 dpi-nél), valamint makrofágokkal (az ileumban 7 dpi-nél, a májban pedig 3, 7 és 14 dpi-nél). dpi), mint a wt-SE-fertőzött madarak ugyanabban a szövetében. Másrészt CD8+ sejteket nagyobb mennyiségben találtak a wt-SE törzzsel fertőzött madarak vakbélmandulájában (1 és 7 dpi-nél) és vakbélében (3 dpi-nél). A Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA brojler és félnehéz tojócsibékben eltérően megfigyelt, kevésbé intenzív immunválaszt váltott ki sejtterületeken, mint a vad típus, könnyű tojótyúkok fertőzésében. A Wt-SE-fertőzött madarak nagyobb CD4+ infiltrációs területeket mutattak a vakbél mandulában (1 és 3 dpi-nél), a vakbélben (3, 7 és 14 dpi-nél), a csípőbélben (1 és 7 dpi-nél) és a májban (a 14 dpi). Hasonlóképpen, a SEΔttrAΔpduA-val való kihívások csökkentették a CD{56}} infiltrációs területeit a vakbél mandulákban (1 dpi-nél) és a csípőbélben (7 és 14 dpi-nél), valamint a makrofágokat a vakbélmandulákban és a vakbélben (3 dpi-nél). összehasonlítva a wt-SE-fertőzött madarakkal. Nem figyeltek meg szignifikáns változást a CD8+ és a makrofágsejtek immunrendszeri sejtterületének területén sem SEΔttrAΔpduA, sem wt-SE-fertőzött madarak májában. A könnyű tojótyúkokkal végzett kihívás részletes eredményeit a 3. táblázat mutatja (lásd az S3 kiegészítő ábrát).

1. táblázat. A különböző immunválasz sejtek mennyiségi eloszlásával kapcsolatos szignifikáns eltérések bemutatása Salmonella Enteritidis vad és mutáns törzsekkel fertőzött brojlerek szerveiben a fertőzést követő különböző napokban. DPI, napok a fertőzés után; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis vad típusú; ns, nincs jelentős eltérés. Az egyes szerveken és a DPI-n belül a * kétirányú ANOVA-val, majd Bonferroni-féle összehasonlító teszttel végzett különbséget jelent a vad és a mutáns törzsek értékei között (*P kisebb vagy egyenlő, mint 0.05; **P kisebb mint vagy egyenlő 0.01; ***P kisebb vagy egyenlő, mint 0,001; ****P kisebb vagy egyenlő, mint 0,0001). A táblázatban szereplő te törzs (∆-SE vagy wt-SE) mint szignifikáns a szerven belül és a DPI az, amely az egyes sejtekhez tartozó fő infltrációs területet mutatja.

2. táblázat: A különböző immunválasz sejtek mennyiségi eloszlásával kapcsolatos szignifikáns eltérések Salmonella Enteritidis vad és mutáns törzsekkel fertőzött félnehéz tojótyúkok szerveiben a fertőzést követő különböző napokban. DPI, napok a fertőzés után; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis vad típusú; ns, nincs jelentős eltérés. Az egyes szerveken és a DPI-n belül a * kétirányú ANOVA-val, majd Bonferroni-féle összehasonlító teszttel végzett különbséget jelent a vad és a mutáns törzsek értékei között (*P kisebb vagy egyenlő, mint 0.{{10}}5 **P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,01; ***P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,001; ****P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,0001). A táblázatban szereplő te törzs (∆-SE vagy wt-SE) mint szignifikáns a szerven belül és a DPI az, amely az egyes sejtekhez tartozó fő infltrációs területet mutatja.

3. táblázat. A különböző immunválasz sejtek mennyiségi eloszlásával kapcsolatos szignifikáns különbség bemutatása Salmonella Enteritidis vad és mutáns törzsekkel fertőzött könnyű tojótyúkok szerveiben a fertőzést követő különböző napokon. DPI, napok a fertőzés után; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis vad típusú; ns, nincs jelentős különbség. Az egyes szerveken és a DPI-n belül a * kétirányú ANOVA-val, majd Bonferroni-féle összehasonlító teszttel végzett különbséget jelent a vad és a mutáns törzsek értékei között (*P kisebb vagy egyenlő, mint 0.{{10}}5 **P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,01; ***P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,001; ****P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,0001). A táblázatban szereplő törzs (∆-SE vagy wt-SE) a szerven és a DPI-n belül szignifikánsnak mutatja az egyes sejtek fő infiltrációs területét.

cistanche növény-növelő immunrendszer

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. kísérlet – Salmonella Typhimurium fertőzés.

A brojlerek, félnehéz tojótyúkok és könnyű tojótyúkok vakbél mandulájában, vakbélben, csípőbélben és májában az immunválasz sejtek jelenlétének mennyiségi meghatározásának eredményeit a 4., 5. és 6. táblázat tartalmazza. Összességében a mutáns törzzsel fertőzött brojlerek pozitív, megjelölt területe magasabb volt, mint a Salmonella Typhimurium vad típusú törzzsel (wt-STM) fertőzöttek mind a négy mintavételi napon. Ezen túlmenően, a nem fertőzött kontrollcsoportokban az immunválasz sejtek változását nem figyelték meg. A Te CD4+ sejtterületek a brojlercsirke minden szövetében statisztikailag 1 dpi-nél különbséget értek el, nagyobb infiltrációkkal a Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA) fertőzéshez. Szignifikáns különbség volt az STM∆ttrA∆pduA- és wt-STM-fertőzött madarak immunválaszának területe között, amikor a fertőzés a vakbélben és a csípőbélben 1 dpi-vel történt mutáns törzzsel, valamint a májban nagyobb infiltrációt mutatott. 14 dpi-nél (CD8+ cellák); a vakbélben, a csípőbélben és a májban 1 és 14 dpi-vel (makrofágok) (4. táblázat; S4 kiegészítő ábra). A félnehéz tojó madarak eredményei nem mutattak statisztikai különbséget a mutáns és a vad típusú törzsek fertőzései között a vakbélben lévő CD4+ sejtek, valamint a vakbél mandulák és az ileum CD8+ sejtjei között mind a 4 napon. utólagos fertőzések értékelése (5. táblázat; S5 kiegészítő ábra). Ha azonban az immunrendszer sejtjeinek jelentős koncentrációs területét figyelték meg, a félnehéz tojótyúkokat STM∆ttrA∆pduA-val fertőzték meg: a fő makrofágok infiltrációs területe minden vizsgált szövetben (1 és 14 dpi-nél); a CD4+ sejtek fő infiltrációs területe a vakbélmandulákban és a májban (1, 7 és 14 dpi-nél) (5. táblázat; S5 kiegészítő ábra). A 6. táblázat és az S6 kiegészítő ábra mutatja a könnyű tojótyúkok szöveteiben talált CD4+, CD8+ és makrofág infiltrációt. Az STM∆ttrA∆pduA-val fertőzött madarak CD4+ fő immunrendszersejt-területét és makrofágsejteket mutattak a vakbél mandulában és a vakbélben (14 dpi-nél), valamint a csípőbélben (1 és 14 dpi-nél) az immunválasz sejtekhez képest ugyanazon szövetek területének wt-STM-fertőzött madarakból. Nem találtak statisztikai különbséget a CD8+ infiltrációs terület tekintetében a fertőzés által érintett madarak vakbélmanduláiban, vakbélében és csípőbélében. Ellentétben más szövetekben kapott eredményekkel, az STM∆ttrA∆pduA-fertőzött madarak májában mind a négy dpi-ben kifejezettebb volt a CD4+ és CD8+ sejtek immunválasz sejtjeinek festődése. és makrofágok 1 és 14 dpi-vel.

4. táblázat. A különböző immunválasz sejtek mennyiségi eloszlásával kapcsolatos szignifikáns eltérések bemutatása Salmonella Typhimurium vad és mutáns törzsekkel fertőzött brojlerek szerveiben a fertőzést követő különböző napokban. DPI, napok a fertőzés után; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium vad típusú; ns, nincs jelentős eltérés. Az egyes szerveken és a DPI-n belül a * kétirányú ANOVA-val, majd Bonferroni-féle összehasonlító teszttel végzett különbséget jelent a vad és a mutáns törzsek értékei között (*P kisebb vagy egyenlő, mint 0.05; **P kisebb mint vagy egyenlő 0.01; ***P kisebb vagy egyenlő, mint 0,001; ****P kisebb vagy egyenlő, mint 0,0001). A táblázatban szereplő törzs (∆-STM vagy wt-STM) a szerven belül szignifikánsként és a DPI-ben az, amely az egyes sejtekhez tartozó fő infltrációs területet mutatja.

5. táblázat. A különböző immunválasz sejtek mennyiségi eloszlásával kapcsolatos szignifikáns eltérések a Salmonella Typhimurium vad és mutáns törzsekkel fertőzött félnehéz tojótyúkok szerveiben a fertőzést követő különböző napokban. DPI, napok a fertőzés után; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium vad típusú; ns, nincs jelentős eltérés. Az egyes szerveken és a DPI-n belül a * kétirányú ANOVA-val, majd Bonferroni-féle összehasonlító teszttel végzett különbséget jelent a vad és a mutáns törzsek értékei között (*P kisebb vagy egyenlő, mint 0.{{10}}5 **P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,01; ***P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,001; ****P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,0001). A táblázatban szereplő törzs (∆-STM vagy wt-STM) a szerven belül szignifikánsként és a DPI-ben az, amely az egyes sejtekhez tartozó fő infltrációs területet mutatja.

6. táblázat. A különböző immunválasz sejtek mennyiségi eloszlásával kapcsolatos szignifikáns különbség ábrázolása Salmonella Typhimurium vad és mutáns törzsekkel fertőzött könnyű tojótyúkok szerveiben a fertőzést követő különböző napokon. DPI, napok a fertőzés után; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium vad típusú; ns, nincs jelentős különbség. Az egyes szerveken és a DPI-n belül a * kétirányú ANOVA-val, majd Bonferroni-féle összehasonlító teszttel végzett különbséget jelent a vad és a mutáns törzsek értékei között (*P kisebb vagy egyenlő, mint 0.{{10}}5 **P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,01; ***P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,001; ****P Kisebb vagy egyenlő, mint 0,0001). A táblázatban szereplő törzs (∆-STM vagy wt-STM) szignifikánsnak tekinthető a szerven és a DPI-n belül, amely az egyes sejtek fő infiltrációs területét mutatja.

Vita

A baktériumok, ha anaerob körülményeknek vannak kitéve, tetrationát és 1,2-propándiol anyagcsere-szubsztrátokat használhatnak energia- és légzési forrásként10. Így a Salmonella spp. régóta vizsgálják, hogy az ezekért az útvonalakért felelős gének deléciója hogyan befolyásolja a túlélésüket a gazdaszervezetben. Legjobb tudomásunk szerint csak egy olyan tanulmányt publikáltak, amely egyidejűleg vizsgálta a tetrationátot és a propándiolt kódoló gének szerepét. Kutatócsoportunk ezeknek a delécióknak a hatásairól számolt be a Salmonella Enteritidis és Salmonella Typhimurium szisztémás fertőzésének és széklettel történő kiválasztódásának értékelésével kereskedelmi forgalomba kerülő csirkékben11. A témával kapcsolatos viták fokozása érdekében a jelen eredmények rávilágítottak a csirke-vonal különböző szöveteibe infiltrált immunsejtekre, amelyek mind vad típusú, mind mutáns törzsekkel támadtak, amelyek deléciót hordoznak a ttrA és pduA génekben. A 2-hetes kísérlet során a CD4+ és CD8+ sejtek és makrofágok pozitívan festődő területei többnyire hasonló mintát követnek, ahol 1 és 14 dpi-nél nagyobb számú immunválaszt mutatnak. sejteket. Ez azzal magyarázható, hogy a kórokozó behatolásakor a gazdaszervezet védekező rendszere elsődleges kontaktusba kerül. A korábbi jelentés kimutatta, hogy a fertőzött csirkéknél még akkor is, ha a Salmonella nem ürül ki 12 dpi-vel, a fertőzés 13 dpi-től kezdődően pozitívvá válhat kloáka tamponnal12, ami megmagyarázza, hogy az immunrendszer sejtterületei 3 és 7 dpi-nél miért voltak alacsonyabbak, de nőttek. . Első pillantásra várható volt, hogy a gazdaszervezet által kiváltott válasz csökkenne, ha mind a pduA, mind a ttrA törlődik, mivel ezek a gének fontos szerepet játszanak a túlélésben a Salmonella fertőzés során2, 4, 13–15. A két gént nem tartalmazó kettős mutánst összehasonlító eredményeink azonban ennek az ellenkezőjét mutatták, a Salmonella Enteritidis és Salmonella Typhimurium mutáns törzsei nagyobb immunválaszt váltottak ki, mint a vad típusú törzsek.

A cistanche tubulosa előnyei- erősíti az immunrendszert

A legrövidebb festett terület nagyszámú kolóniához vezethet a bélrendszerben, megerősítve egy korábbi vizsgálatot, amelyben a Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA és Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA törzsek nagyobb számban kerültek kinyerésre a kloáka vad típusú tamponokból11. . A szalmonella a rendelkezésre álló tápanyag-repertoártól függően extracelluláris vagy intracelluláris baktériumként viselkedhet, és a bélben való kolonizáció és a gazdasejtekbe történő internalizáció közötti váltásként fordul elő16. Amikor a baktériumokat a makrofágok lenyelik és elpusztítják, néhány peptidfragmens átkerül az antigénprezentáló sejt felszínére, amelyeket a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) kódol, II. osztály. Ez a peptid-MHC II kötődés stimulálja a T CD4+ limfocitákat. Ha azonban a baktériumok úgy döntenek, hogy megtámadják a gazdasejtet, és belépnek a makrofág citoplazmájába, a peptidkapcsolat egy másik típusú, I. osztályú MHC-vel serkenti a T-CD8+ limfocita termelést17. Érdekes módon a CD4+ és CD8+ sejtek ugyanazt a makrofág mintázatot mutatják a kísérlet során, még akkor is, ha különböző immunválaszokat képviselnek. Mivel a CD4+ és CD8+ sejtek főként T-limfocitákat képviselnek, amelyek az adaptív immunválasz részét képezik, a makrofágok a veleszületett immunválasz részét képezik9. Ezen túlmenően megfigyeltük, hogy a brojlerek kifejezettebb pozitívan jelölt területeket mutatnak, mint a tojótyúkok, amit egy korábbi vizsgálat is megerősített, ahol a mutáns törzsekkel fertőzött brojlerek például invazívabb béltelepülést és szisztémás fertőzést mutattak11. Eredményeink azt sugallják, hogy az immunhisztokémiai megközelítés érdekes információkkal szolgál az immunválasz sejtek viselkedéséről különböző kereskedelmi származású több szerven a Salmonella enterica szerovariánsokkal való fertőzés során. Ezenkívül a jelen tanulmány bizonyítja, hogy mindkét gén törlése még a Salmonella különböző törzseiben is olyan baktériumokat eredményezett, amelyek magasabb immunválaszt váltottak ki a gazdaszervezetben, ami azt mutatja, hogy a kórokozó nem gyengült. Megfontolhatjuk, hogy a Salmonella talán egy másik túlélési mechanizmust is talált, amely még patogénebbé vált. A ttr és pdu operonok cob és PRP operonokkal összhangban történő felhasználását az előző tanulmány kimutatta, hogy szükséges az anaerob légzéshez16, ami arra késztet bennünket, hogy nem csak több gént kell törölni az egyes operonokból18, hanem elgondolkodni az egész halmaz törlésén, hogy elérjük a Salmonella enterica kevésbé patogén törzseit.

Anyagok és metódusok

A vonatkozó iránymutatások és előírások szerint végrehajtott kísérleteket a Sao Paulo Állami Egyetem Állathasználati Etikai Bizottsága hagyta jóvá (CEUA/Unesp Process-006621/18; 2018. május 10-én) a madárkórban végezték. A Sao Paulo Állami Egyetem (FCAV/Unesp) Mezőgazdasági és Állatorvostudományi Iskola Patológiai, Teriogenológiai és One Health Tanszékének laboratóriuma, Jaboticabal, Brazília.

Baktériumtörzsek és mutánsok felépítése.

Az itt használt baktériumtörzseket 30% glicerinnel (Merck, BR-H30402394 228) kiegészített Lysogeny húsleves (LB; BD DifcoTM, USA) fagyvédő táptalajban tároltuk, és ultrafagyasztóban (- 80 fok) az FCAV/UNESP Madárkórtani Laboratóriumában. Salmonella Enteritidis P125109 (hozzáférési szám: AM933172) és Salmonella Typhimurium str. A 9819-et nalidixinsav- és spektinomicin-rezisztenciára (Nalr Spcr) indukálták, és ezek biztosították a genetikai hátteret a mutáns törzsek Lambda-red technikával20 történő megalkotásához, kisebb módosításokkal, amelyeket Saraiva et al.11 ír le. Az itt konstruált mutáns baktériumok a szövegben SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) és STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due) néven szerepelnek.

In vivo kísérlet.

1. kísérlet – Salmonella Enteritidis. A három különböző származásból (brojler, félnehéz tojótyúkok és könnyű tojótyúkok) származó harminchat 1-naposcsibe, összesen száznyolc állatot kereskedelmi keltetőkből szereztek be. Érkezéskor megvizsgálták a szállítókártya-dobozok alját, hogy megerősítsék a madarak szalmonella-mentességét21, és az állatokat fémketrecekben helyezték el az akklimatizált helyiségben, és ad libitum antibiotikum-mentes takarmányt és vizet kaptak. Az első napon 24-órás fényprogramot választottak az optimális víz- és ételfogyasztás biztosítása érdekében, majd az első héten egy 12-órás fényprogramot alkalmaztak, amely a fennmaradó napokon 8 órára csökkent. Az oltóanyagot Berchieri Junior et al.22 szerint készítettük el. Ehhez a fagyasztott tenyészeteket LB-be oltottuk, és egy éjszakán át inkubáltuk 37 °C-on 15 0 fordulat/perc mellett. A következő napon a baktériumtenyészeteket friss tápközegbe vittük át, és 18 órán át inkubáltuk a korábbiakkal megegyező körülmények között. Ezután a 108 telepképző egységet/ml-t (CFU/ml) tartalmazó tenyészetekből 0,2 ml-t fémszondán keresztül orálisan beoltottunk közvetlenül a madarak termésébe. Kilenc csoportot alakítottunk ki (A-tól I-ig), amelyeket véletlenszerűen osztottunk fel a különböző leszármazási vonalak és törzsek szerint (7. táblázat). A fertőzést követő egy, három, hét és 14-nappal (dpi) csoportonként három madarat minden nap reggelre elaltattak nyaki diszlokációval, hogy begyűjtsék a vakbél mandulák középső részét, a vakbélt, és az ileum, valamint a máj bal lebenyének disztális szakasza további immunhisztokémiai (IHC) elemzéshez. Ehhez a mintákat előzőleg folyékony nitrogénben hűtött n-Hexane pa (n-Hexano pa, Synth, Brazília) alá merítettük. Közvetlenül a szövet fagyasztása után egy 2 ml-es kriocsőbe (Corning, USA) vittük át, és folyékony nitrogénben kondicionáltuk. A mintavételt követően a szöveteket –80 fokon tároltuk az IHC folyamatig.

2. kísérlet – Salmonella Typhimurium. Ezt a kísérletet az 1. kísérletben említett jellemzők szerint végeztük. A harminchat (1 napos) csirkét véletlenszerűen kilenc csoportra osztották (A-tól I-ig) származásuk és törzseik alapján (7. táblázat).

7. táblázat: Létrehozott csoportok a különböző leszármazási vonalak és törzsek szerint. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis vad típusú; wt-STM, Salmonella Typhimurium vad típusú; NC, negatív kontroll.

Immunhisztokémia.

Szövet szakasz. Az összegyűjtött mintákat –80 fokról –22 fokos kriosztátba (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Németország) vittük át, ahol egyenként blokkoltuk OCT vegyülettel (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Hollandia) 30 percenként. 6 µm-es metszetig alacsony profilú eldobható pengével (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Németország). Figyelemre méltó, hogy a metszeteket –22 fokon végezték, kivéve a májmetszeteket, amelyeket –15 fokon végeztek. A megjelölt immunsejtválaszonként az egyes szervek metszeteinek három ismétlését tartalmazó tárgylemezeket készítettünk, az ismétlések között ritkítással. Ecsettel a szövetmetszetek metszeteit poli-l-lizinnel (Sigma-Aldrich, Egyesült Királyság, katalógusszám: P4832) és szilánnal (Sigma-Aldrich, USA, katalógusszám: 440574) előkezelt szövettani tárgylemezekre helyeztük. A tárgylemezeket ezután –20 fokon tároltuk az IHC festésig. Az immunsejtek festése. Először a tárgylemezeket 200 ml hűtött acetonba merítettük (Acetone PA-ACS, Synth, Brazília), és -20 fokon 10 percig inkubáltuk. Ezt követően a tárgylemezeket egy páratartalmú kamrába (EasyPath®, Brazília) szobahőmérsékleten 5 percre átvittük, hogy a mintákat megszárítsuk. A tárgylemezeket ezután PBS-sel mostuk, és egy tócsát hagytunk 5 percig, hogy elkerüljük a szövetek kiszáradását. Tíz esetben a szöveteket sötét helyen 10 percenként 200 ml 4%-os H2O2-ba merítettük, és ismét PBS-sel mostuk. A szövetmetszetek környékét abszorbens papírral szárítottuk, és a mintát hidrofób tollal (Dako Pen, Dako Denmark A/S, Dánia) megkerültük. A tócsát hagyó mosási lépést az előzőek szerint megismételtük. Az immunsejtek megfestésére a biotinmentes készletet, az Egér- és Nyúlspecifikus HRP/DAB IHC Detection-Micropolymer-t (Abcam©, USA) használták, az Avidin-Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC) módszert választva. Ehhez a tócsát eltávolítottuk, és a szövetekhez nem specifikus háttérszínblokkoló reagenscseppeket adtak. A tárgylemezeket a páratartalmú kamrában, sötét helyen tartottuk 30 percig, a mosási lépést megismételtük, és 200 µl primer antitestet (Mouse Anti-Chicken CD4-UNLB; Mouse Anti-Chicken CD{{34} } UNLB; Mouse Anti-Chicken Monocyte/Macrophage-UNLB, Southern Biotech, USA) 1:200 (v/v) arányban hígított antitest-hígító reagenssel (Antibody diluent, Abcam©, USA) adtunk hozzá ezután. A tárgylemezeket 4 fokon 18 órán át inkubáltuk. A következő napon a tárgylemezeket az előzőek szerint mostuk. A feleslegben lévő PBS eltávolítása után tíz csepp másodlagos antitestet (Reveal Complement, Abcam©, USA) adtunk hozzá, és a páratartalmú kamrát sötét környezetbe helyeztük 30 percre. Ezt követően egy csepp 3,3′-diaminobenzidint (DAB Chromogen 50×, Abcam©, USA) hígítottunk 1 ml szubsztrátban (DAB Substrate, Abcam©, USA), amely térfogat három tárgylemezre elegendő, és hozzáadtuk a a szövetmetszetek. Egy perccel később a tárgylemezeket 200 ml dH2O-ba merítettük 5 percre. Ezt követően Harris hematoxilint tartalmazó műanyag kockába (Êxodo Científca, Brazília) helyeztük át, és 1 percig állni hagytuk. Utána a lemezeket 10 percig mossuk folyó víz alatt alacsony nyomáson. A tárgylemezeket alkohol-xilol sorozatnak vetették alá (70% alkohol, 90% alkohol, 100% alkohol, Xilol I és Xilol II). Végül a fedőlemezeket egy csepp vízmentes rögzítőközeg (Entellan®, Merck, Brazília) hozzáadása után helyezték a tárgylemezekre. A szövetmetszetekről véletlenszerűen, öt véletlenszerű nézeti mezőt választottunk, optikai mikroszkóp (400×-es lencse) (Coleman®, N-120 modell) és digitális fényképezőgép adapter segítségével további statisztikai elemzés céljából (1. ábra). ).

Adatelemzés.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

A CD{{0}} és CD8+ sejtek és makrofágok százalékos arányát az Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, USA) segítségével számítottuk ki. Ezeket százalékos értékekben határoztuk meg az immunsejt marker pozitív terület/teljes terület alapján. A statisztikai analízis és a grafika a GraphPad Prism v.8.{11}}.1 szoftverrel készült macOS-hez (GraphPad Software, La Jolla California, USA), és az adatokat elküldtük a Variance Analysis (ANOVA) rendszerbe, amelyet Bonferroni többszörös összehasonlítás követett. 5%-nál alacsonyabb szignifikanciaszintet figyelembe véve (P kisebb vagy egyenlő, mint 0,05).

1. ábra: Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA-val fertőzött brojler vakbelének metszete, amely makrofágokban immunreakciókat mutat, 7 nappal a fertőzés után (×400; Avidin–Biotin Streptavidin Peroxidase, hematoxilinnel ellenfestve).

Hivatkozások

1. Freitas Neto, OC, Penha Filho, RC & Barrow, PA Az emberi nem tífuszos szalmonellózis forrásai: áttekintés. Braz. J. Poult. Sci. 12. (1), 1–11. https://doi.org/10.1590/S1516-635X2010000100001 (2010).

2. Winter, SE et al. A bélgyulladás légúti elektronakceptort biztosít a Salmonella számára. Természet 467, 426–429. https://doi.org/ 10.1038/nature09415 (2010).

3. Hinsley, AP & Berks, BC A kénvegyületek Salmonella enterica általi redukciójában részt vevő légúti utak sajátosságai. Mikrobiológia (Reading) 148, 3631–3638. https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3631 (2002).

4. Tiennimitr, P. et al. A bélgyulladás lehetővé teszi a Salmonella számára, hogy etanol-amint használjon, hogy versenyezzen a mikrobiotával. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 17480–17485. https://doi.org/10.1073/pnas.1107857108 (2011).

5. Staib, L. & Fuchs, TM A fukóz és az 1,{2}}propándiol felhasználásának szabályozása a Salmonella enterica Typhimurium szerovariáns által. Elülső. Microbiol. 6, 1116. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01116 (2015). 6. Horswill, AR & Escalante-Semerena, JC Propionát-katabolizmus Salmonella Typhimurium LT2-ben: Két eltérően átíródó egység alkotja a prp lókuszt 8,5 centiszómánál, a prpR a szigma-54 aktivátorcsalád egy tagját kódolja, és a prpBCDE gének családját. operont alkotnak. J. Bacteriol. 179, 928–940. https://doi.org/10.1128/jb.179.3.{23}}.1997 (1997).

7. Soria, MC, Soria, MA, Bueno, DJ & Terzolo, HR 3 tenyésztési módszer és PCR-vizsgálat összehasonlítása a Salmonella Gallinarum és Salmonella Pullorum kimutatására baromfitakarmányban. Csibe. Sci. 92, 1505–1515. https://doi.org/10.3382/ps.{7}} (2013).

8. Van Immerseel, F. et al. Az immunsejt-infiltráció dinamikája csirkék vakbéli lamina propriájában Salmonella Enteritidis törzzsel történt újszülöttkori fertőzés után. Dev. Összeg. Immunol. 26, 355–364. https://doi.org/10.1016/s0145-305x(01)00084-2 (2002).

9. Montassier, HJ Fisiopatologia do sistema immune. In Doenças das Aves (szerk. AndreattiFilho, RL et al.) 467–489 (FACTA, 2020).

10. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, TA & Roth, JR Az alternatív elektronakceptor tetrationát támogatja a Salmonella enterica Typhimurium szerovariáns B12-függő anaerob növekedését etanolamin vagy 1,{{4} }propándiol. J. Bacteriol. 183, 2463–2475. https://doi.org/10.1128/JB.183.8.{12}}.2001 (2001).

11. Saraiva, M. et al. A ttrA és pduA gének szerepének megfejtése a Salmonella enterica szerovariánsokban csirke fertőzési modellben. Avian Pathol. https://doi.org/10.1080/03079457.2021.1909703 (2021).

12. Beal, RK, Wigley, P., Powers, C., Barrow, PA és Smith, AL. A Salmonella enterica Typhimurium és Enteritidis szerovariánsokkal szembeni keresztreaktív sejtes és humorális immunválaszok összefüggésben állnak a heterológ újrakihívással szembeni védelemmel. Állatorvos. Immunol. Immunopathol. 114, 84–93. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.07.011 (2006).

13. Winter, SE & Bäumler, AJ Lélegzetelállító bravúr: A bél mikrobiótával való versengés érdekében a Salmonella arra készteti gazdáját, hogy légúti elektronakceptort biztosítson. Gut Microbes 2, 58–60. https://doi.org/10.4161/gmic.2.1.14911 (2011).

14. Rivera-Chávez, FI et al. A Salmonella energiataxikat használ, hogy hasznot húzzon a bélgyulladásból. PLoS Pathog. 9, e1003267. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003267 (2013).

15. Khan, CM Te Dinamikus kölcsönhatások a szalmonella és a mikrobiota között, a gyomor-bél traktus kihívást jelentő részében. Int. Sch. Res. Nem. 2014, 1–23. https://doi.org/10.1155/2014/846049 (2014).

16. Yoo, W., Kim, D., Yoon, H. & Ryu, S. Enzyme IIANtr szabályozza a Salmonella inváziót 1,2-propándiol és propionát katabolizmuson keresztül. Sci. Rep. 7, 44827. https://doi.org/10.1038/srep44827 (2017).

17. Salyers, AA & Whitt, DD A gazdaszervezet védekezése bakteriális kórokozók ellen: A szövetek és a vér védelme. In Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach (szerk. Salyers, AA & Whitt, DD) 16–29 (ASM Press, 1994).

18. Góes, V. et al. Salmonella Heidelberg oldallépcsős génvesztés a légzőszervi igényekhez csirke fertőzési modellben. Microb Pathog. 171, 105725. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105725 (2022).

19. Barrow, PA, Hassan, JO és Berchieri, A. Jr. A Salmonella Typhimurium F98 törzs székletürítésének csökkentése élettel beoltott és elölt S. Typhimurium organizmusokkal oltott csirkékben. Epidemiol. Megfertőzni. 104, 413–426. https://doi.org/10.1017/s095026880 0047439 (1990).

20. Datsenko, KA & Wanner, BL Kromoszómális gének egylépéses inaktiválása Escherichia coli K-12-ban PCR-termékek segítségével. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.1201632977 (2000).

21. Zancan, FB, Berchieri Junior, A., Fernandes, SA & Gama, NMSQ Salmonella spp. vizsgálat naposmadarak szállítódobozában. Braz. J. Microbiol. 31, 230–232. https://doi.org/10.1590/S1517-83822000000300016 (2000).

22. Berchieri, A. Jr., Murphy, CK, Marston, K. & Barrow, PA Megfigyelések a Salmonella enterica szerovarok Pullorum és Gallinarum perzisztenciájáról és vertikális átviteléről csirkékben: Bakteriális és gazdagenetikai háttér hatása. Avian Pathol. 30, 221–231. https://doi.org/10.1080/03079450120054631 (2001).