A szekretált neutrofil zselatinázzal asszociált lipocalin erősebben képes gátolni az ADPKD-sejtek ciszta-megnagyobbodását a nem szekretált formához képest Ⅱ

3. Eredmények

3.1. Az NGAL expresszió és a sejtszaporodás összehasonlítása az M-1 vad típusú és a 2L3 ADPKD sejtek között

A 2L3 sejtvonalat Pkd1L3/L3 egerek primer vese epiteliális sejtjeinek SV40 vírus transzdukciójával hozták létre [17]. A BCRC-től (Hsinchu, Tajvan) vásárolt M-1 sejteket (egér vad típusú vese epiteliális sejtvonal) használtuk kontrollként. A 2L3 és M-1 sejtek Pkd1 transzkriptumainak PCR genotipizálását végeztük a genotípusok ellenőrzésére primerek segítségével a célzott allél 30. intronjában lévő első loxP hely előtt és után (1A. ábra). Pkd1+/+, Pkd1L3/+ és Pkd1L3/L3 egérszöveteket használtunk genotipizálási kontrollként. Az M-1 sejtekből származó PCR termékek egyetlen vad típusú (WT) Pkd1+/+ sávot (473 bp), míg a 2L3 sejtekből származó PCR termékek egyetlen Pkd1L3/L3 sávot (507 bp) mutattak. egy extra loxP szegmens (34 bp) miatt (1B. ábra).

Annak jellemzésére, hogy az M-1 és a 2L3 sejtek származnak-ehasonló eredetű vesetubulusok, először összehasonlítottuk a 2 sejtvonal morfológiáját; Az M-1 sejtek és a 2L3 sejtek nagyon hasonló morfológiát mutattak (1C. ábra). Ezen túlmenően Lotus tetragonolobus lektinnel (LTL, a differenciált proximális tubulusok markere, fluoreszceinnel jelölt) és Dolichos biflorus agglutininnel (DBA, differenciált disztális tubulusok és gyűjtőcsatornák markere, rodaminnal jelölt) lektinfestést végeztek eredetük ellenőrzésére. vesetubulusokból (1D. ábra). A festési eredmények azt mutatták, hogy az M-1 és a 2L3 sejtek LTL- (többnyire DAPI-val kolokalizálva) és DBA-pozitívak (citoplazmában lokalizálódnak) (1D. ábra). Ez az eredmény arra utalt, hogy az M-1 és a 2L3 sejtek származnakvesetubulusokhasonló eredetűek és hasonló tulajdonságokkal rendelkezhetnek. A valós idejű PCR eredmények azt mutatták, hogy a 2L3 sejtek Pkd1 mRNS expressziós szintje jelentősen csökkent az M-1 sejtekhez képest (1E ábra), ami összhangban volt a 2L3 egerek adataival, amelyek Pkd1 fehérje expressziós szintje csak 25%-os volt. a vad típusú egerekét [17]. Kimutatták, hogy a 2L3 egerek veséjében magasabb a NGAL és NGAL receptor (NGAL-R) fehérje szintje, mint a vad típusú egerekben [31]. A valós idejű PCR eredmények azt mutatták, hogy az Lcn2 mRNS expressziós szintje 15.{20}}szer nagyobb volt a 2L3 sejtekben, mint az M-1 sejtekben (1F ábra), ami összhangban van a 2L3 egerekről közölt adatokkal [31], míg nem volt szignifikáns különbség az Slc22a17 mRNS expressziójában a két csoport között (1G. ábra). A Western blot eredmények azt is mutatták, hogy a 2L3 sejtekben magasabb volt az NGAL expressziós szintje, mint az M-1 sejtekben, míg az NGAL-R expressziós szintjében nem volt szignifikáns különbség a két csoport között (1H. ábra). Az M-1 és a 2L3 sejtek sejtjeit és felülúszóit 48 órás tenyésztés után gyűjtöttük össze, hogy ELISA-val meghatározzuk az NGAL mennyiségét a sejtlizátumokban és a felülúszókban (amelyek a szekretált NGAL-t képviselik). A Western blot eredményekkel összhangban az ELISA azt mutatta, hogy a 2L3 szignifikánsan magasabb intracelluláris NGAL-t és NGAL-szekréciót mutatott a felülúszóban, mint az M-1 (1I. ábra).

A 2L3 egerekről kimutatták, hogy magasabb sejtproliferációt mutatnak, mint a vad típusú egerek [17]. MTT és BrdU beépülési vizsgálatokat végeztek annak vizsgálatára, hogy a 2L3 sejtvonal jobb életképességet és proliferációt mutat-e, mint a vad típusú sejtek (2A–C. ábra). A reprezentatív képek a 2L3 sejtek nagyobb összefolyását mutatták ki, mint az M-1 sejtek 48 órás tenyésztés után, azonos kezdeti oltási számokkal (2A. ábra). Az MTT vizsgálatok azt mutatták, hogy a 2L3 sejtek életképessége szignifikánsan jobb volt, mint a 24 és 48 órán át tenyésztett M-1 sejtek (2B. ábra). Az M-1 és a 2L3 sejtek proliferációs képességének összehasonlítása érdekében a sejteket 24 órán keresztül tenyésztettük a BrdU beépülési vizsgálatot követően, amely azt mutatta, hogy a 2L3 sejtek szignifikánsan jobb proliferációt mutattak, mint az M-1 sejtek (2C. ábra). .

ÚJ GYÓGYNÖVÉNYEK VESEBETEGSÉGRE

3.2. Az mNGAL hozzáadásának hatása a 2L3 sejtek életképességére és proliferációjára

Kimutatták, hogy az exogén NGAL alkalmazása csökkenti a ciszták növekedését in vitro [25]. Korábbi vizsgálatunk kimutatta, hogy az NGAL túlzott expressziója egy ADPKD egérmodellben (Pkd1L3/L3; NGALTg/Tg egerek) csökkentette a ciszta progresszióját, amelyet egy sor molekuláris útvonal változásai kísértek.sejtburjánzás, apoptózis, ésfibrózis[31]. Ezért megvizsgáltuk a rekombináns mNGAL hatását a 2L3 sejtek életképességére az MTT assay segítségével (3. ábra). Az E. coli-ból tisztított (szignálpeptid nélküli) rekombináns mNGAL tisztaságát először SDS-PAGE-val és Coomassie blue-val történő festéssel határoztuk meg, amely egyetlen 20- kD sávot és egy nagyon könnyű dimer sávot mutatott ki magas koncentrációknál ( 3A. ábra). Ezenkívül az mNGAL stabilitását a sejttenyésztő tápközegben Western blottal elemeztük, amely kimutatta az mNGAL stabilitását a tápközegben legalább 48 órán keresztül (3B. ábra). Észrevettük, hogy az mNGAL szignifikánsan csökkentette a 2L3 sejtek életképességét a kontrollcsoporthoz képest 8 órás kezelés után (3C. ábra). Ebben a kísérletben pozitív kontrollként rapamicint használtunk, amelyről az mTOR inhibitoraként ismertek, és ismert, hogy gátolja a hámsejtek proliferációját és a ciszta növekedését PKD egérmodellben [32]. Ezenkívül a BrdU beépülési vizsgálat azt is kimutatta, hogy a 24 órás mNGAL-kezelés jelentősen gátolta a 2L3 sejtek proliferációját (3D. ábra). A sejtproliferáció az ADPKD kulcsfontosságú jellemzője, és az a megállapítás, hogy a 2L3 sejtproliferációt az mNGAL csökkentheti, arra utalt, hogy az mNGAL tovább gátolhatja a ciszta képződését a 2L3 sejtekben.

3.3. Jelátviteli útvonalak, amelyeket az mNGAL 2L3 sejtekhez való hozzáadása érint

A NGAL és NGAL-R kapcsolódásról kimutatták, hogy megköti az intracelluláris vasat és tovább indukálja az apoptózist [29]. Ezenkívül a vizsgálatok kimutatták, hogy az NGAL in vitro és in vivo is képes apoptózist indukálni egy ADPKD modellben [25,31]. Annak vizsgálatára, hogy az mNGAL képes-e indukálni a 2L3 sejtek apoptózisát, áramlási citometriával elemeztük a 2L3 sejt apoptózisát. Annak alapján, hogy az mNGAL gátolta a 2L3 sejtek proliferációját 8 órás mNGAL kezelés után (3D ábra), elemeztük az mNGAL 2L3 sejtekre gyakorolt ​​hatását korábbi (4 óra) és későbbi (12 óra) időpontokban is.

Az áramlási citometriás analízishez sokkal nagyobb sejtszámra és rövidebb tenyésztési időtartamra volt szükség, mint a korábban végzett MTT-vizsgálatoknál; ezért 2L3 sejteket oltottunk 6-lyukú lemezekre, és magasabb koncentrációjú mNGAL-t (600-1200 µg/ml) alkalmaztunk a sejtekre. Az eredmények azt mutatták, hogy az 1200 µg/ml mNGAL szignifikánsan gátolta a sejtek életképességét 4 és 12 órás kezelés után, míg a 600 µg/ml mNGAL csak 4 órás kezelés után gátolta a sejtek életképességét (3E. ábra). Az apoptózis vizsgálatokat áramlási citometriával végeztük az Annexin V-FITC-vel és PI-vel festett sejtek kimutatására. Az Annexin V-nek nagy affinitása van a foszfatidil-szerinhez (PS), és a kitett PS-t tartalmazó apoptotikus sejtek azonosítására használják [33]. A festési eredmények szerint a sejtek normál (AV−/PI−), korai apoptózis (AV+/PI−), késői apoptózis (AV+/PI+) és nekrózis (AV−/PI+) kategóriákba sorolhatók. kvadrantális diagramok (3F. ábra). A korai apoptotikus stádiumban lévő sejtek érintetlen membránokat őriznek, ami különbözik a késői apoptotikus stádiumban lévő, szétesett membránokkal rendelkező sejtektől [34]. Az eredmények azt mutatták, hogy a 2L3 sejt apoptózis aránya (beleértve a korai AV+/PI- és késői AV+/PI+ apoptózist is) szignifikánsan megnőtt a kontroll csoporthoz képest 12 órás mNGAL kezelés után (1200 µg/ml; 3F ábra, G ).

1. ábra: NGAL expresszió összehasonlítása M-1 vad típusú és 2L3 ADPKD sejtek között. (A) A Pkd1 gén vad típusú és L3 alléljainak szerkezete. A PCR genotipizálást primerekkel végeztük az első loxP előtt és után a Pkd1 30-as intronjában. Kitöltött háromszögek: loxP; egy mc1 promoter által vezérelt neomicin rezisztencia gént (mc1-neo), amelyet két loxP hely szegélyez, a Pkd1 34. intronjába inszertáltunk.(B) M-1 sejtek Pkd1 transzkriptumainak PCR genotipizálása (473 bp) és 2L3 sejteket (507 bp). Kontrollként a vad típusú (+/+), heterozigóta (L3/+) és homozigóta (L3/L3) egerek Pkd1 transzkriptumait használtuk. Az RT-qPCR azt mutatta, hogy a 2L3 szignifikánsan alacsonyabb Pkd1 (C) M-1-val rendelkezik, és a 2L3 sejtek hasonló morfológiát mutattak. Skála: 100 µm. (D) Az M-1 és 2L3 sejteket Lotus Tetragonolobus Lectinnel (LTL, fluoreszceinnel jelölt, zöld) és Dolichos biflorus agglutininnel (DBA, Rhoda aknával jelölt, piros) és DAPI-val (kék) festették meg, és egy konfokális mikroszkóp. Skála: 50 µm. Az RT–qPCR azt mutatta, hogy a 2L3 szignifikánsan alacsonyabb Pkd1 (E) és magasabb Lcn2 (NGAL) (F) expressziós szintekkel rendelkezik, mint az M-1 vad típusú sejtekben. (G) Nincs szignifikáns különbség az Slc22a17 (NGAL-R) expressziós szintjében az M-1 és a 2L3 sejtek között. RQ: relatív mennyiségi meghatározás=2 −ΔΔCt; A Gapdh-t használtuk minden minta belső kontrolljaként. Az értékeket M{51}} értékre normalizáltuk. (H) Western blot eredmények azt mutatták, hogy a 2L3