A SARS-CoV sebezhetőségi helye-2 Spike széleskörű védő ellenanyagot indukál az antigén szempontjából megkülönböztethető Omicron-alvariánsok ellen
Nov 30, 2023
A súlyos akut légzőszervi szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) Omicron-változatainak gyors fejlődése hangsúlyozta, hogy széleskörű semlegesítő képességgel rendelkező antitesteket kell azonosítani a jövőbeli monoklonális terápiák és vakcinázási stratégiák kidolgozásához. Itt azonosítottuk az S728-1157-t, egy széles körben semlegesítő antitestet (bnAb), amely a receptor-kötő helyet (RBS) célozza meg, és amely olyan egyedből származik, amelyet korábban WT SARS-CoV-vel -2 fertőzött a fertőzés terjedése előtt. aggodalomra okot adó változatok (VOC). Az S728-1157 az összes domináns változat széles körű keresztsemlegesítését mutatta be, beleértve a D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu és Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/) BL.1/XBB). Ezenkívül az S728-1157 megvédte a hörcsögöket a WT, Delta és BA.1 vírusok által okozott in vivo kihívásokkal szemben. A szerkezeti elemzés kimutatta, hogy ez az antitest egy 1. osztályú/RBS-A epitópot céloz meg a receptorkötő doménben többszörös hidrofób és poláris kölcsönhatások révén nehézlánc komplementaritást meghatározó 3. régiójával (CDR-H3), a CDR-H1/ általános motívumai mellett. osztályú 1/RBS-A antitestek CDR-H2-je. Fontos, hogy ez az epitóp könnyebben hozzáférhető volt nyitott és prefúziós állapotban, vagy hexaprolinnal (6P) stabilizált tüskekonstrukciókban, mint a diprolin (2P) konstrukcióknál. Összességében az S728-1157 széles terápiás potenciállal rendelkezik, és hasznos lehet a célvezérelt vakcinatervek kidolgozása a SARS-CoV-2 jövőbeni variánsai ellen.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Bevezetés
A járvány 2019. decemberi kezdete óta a súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) vírusa 2019-ben több mint 660 millió koronavírusos megbetegedéshez (COVID-19), és több mint 6,5 millió esethez vezetett. millió haláleset világszerte. Bár a vakcinák és terápiák gyors fejlesztése és elterjesztése nagymértékben visszafogta a COVID-19 hatását, a keringő aggodalomra okot adó variánsok (VOC) megjelenése továbbra is komoly veszélyt jelent a további immunelkerülési lehetőségek miatt. és fokozott patogenitás. A D614G változat volt a legkorábban megjelent változat, és ezt követően vált általánosan elterjedtté. A WT-vel összehasonlítva a D614G variáns inkább megnövekedett fertőzőképességet mutatott, mint megnövekedett patogenitást, ezért nem valószínű, hogy csökkentené a vakcinák hatékonyságát a klinikai vizsgálatok során (1). A D614G megjelenése és 2021 októbere között 4 további jelentős VOC fejlődött ki világszerte, köztük az Alpha, a Beta, a Gamma és a Delta. Ezen változatok közül a Delta súlyos globális fenyegetéssé vált átvihetősége, fokozott betegség súlyossága és részleges immunelkerülése miatt, amint azt a poliklonális szérum és az mAb-k csökkent képessége mutatja a törzs semlegesítésére (2–6). Nem sokkal ezután, 2021 novemberében az Omicron változatot azonosították, és új VOC-ként jelentették be. Ez a variáns rendelkezett eddig a legtöbb mutációval, és úgy tűnt, hogy gyorsabban terjedt, mint a korábbi törzsek (7, 8). Jelenleg az Omicron alvonalak széles skálája létezik, amelyek új COVID{21}} esetekhez vezetnek, a BQ.1, BQ.1.1 és XBB.1.5 pedig dominánssá vált a BA.5-tel szemben, és a legtöbb új esetet a világ akkoriban jelentették. az írás. Az Omicron-változatok különböző mértékben elkerülhetik a COVID-19 vakcinával összefüggő immunitás általi felismerést, ezáltal jelentősen csökkentve a lábadozó, teljesen mRNS-oltott egyénekből és az új WT/BA.5 bivalenssel megerősített egyénekből származó szérum antitestek semlegesítő hatását. mRNS vakcina (9, 10). Hasonlóképpen, az Omicron variánsok képesek voltak elkerülni számos sürgősségi felhasználási engedély (EUA) terápiás monoklonális ellenanyag kötődését, annak ellenére, hogy ezek korábban hatásosnak bizonyultak a korábbi VOC-k ellen (10–12). Az Omicron elleni csökkent semlegesítés és a jövőbeni VOC-k folyamatos fenyegetése miatt sürgősen szükség van olyan széles körű és hatékony semlegesítő antitestek azonosítására, amelyek védelmet nyújthatnak a változatos, fejlődő SARS-CoV-2 vonalak ellen. Ebben a vizsgálatban egy erős receptorkötő doménreaktív (RBD-reaktív) mAb-t azonosítottunk egy SARS-CoV-2-gyógyulásban lévő egyén perifériás véréből, amely hatékonyan semlegesítette az alfa, béta, kappa, delta, mu, és Omicron változatok (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 és XBB). Ez az S{50}} mAb szignifikánsan csökkentette a BA.1 Omicron, Delta és WT vírusterhelést a tüdőben és az orrnyálkahártyában a hörcsögök in vivo fertőzését követően. Az S728-1157 megköti a receptorkötő helyet (RBS), amely teljesen szabaddá válik, amikor a tüskén lévő RBD a felfelé irányuló konformációban van. Az mAb olyan CDR-H1-ben és CDR-H2-ben található motívumokat használ, amelyek közösek az IGHV3-53/3-66 Class 1/RBS-A antitestekben (13, 14), de a CDR-rel való kiterjedt egyedi kapcsolat révén is. -H3 a VOC-csúcsok mutációinak megkerülésére. Ez azt sugallja, hogy az Omicron-változatokat lefedő, jövőbeni vakcina-erősítések racionális tervezését úgy kell módosítani, hogy stabilizált csúcsot mutasson a többnyire felfelé irányuló konfigurációban, hogy optimálisan indukálhassa az 1. osztályú/RBS-A monoklonális ellenanyagokat, amelyek hasonló CDR-H3 jellemzőkkel rendelkeznek.
A cistanche jótékony hatású – erősíti az immunrendszert
Eredmények
Az RBD-reaktív monoklonális ellenanyagok izolálása, amelyek különböző neutralizációs és hatásos mintákat mutatnak. Az Omicron vonalak elterjedése előtt korábban 43 mAb-t jellemeztünk, amelyek a tüskeprotein különböző epitópjait célozták meg, beleértve az N-terminális domént (NTD), az RBD-t és a 2. alegységet (S2). Ezen antitestek egyike sem volt képes semlegesíteni az akkor keringő SARS-CoV-2 variánsokat (15). Ebben a vizsgálatban egy további RBD-reaktív monoklonális antitestet expresszáltak 3 magas válaszreakciójú egyénből, akik robusztus tüske-ellenes IgG-válaszokat mutattak be, a korábban meghatározottak szerint (16) (1. és 3. kiegészítő táblázat; kiegészítő anyagok online elérhetők ehhez a cikkhez; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Bár a tüskés RBD-kötő B-sejtek aránya hasonló volt a magas és közepesen reagáló csoportokhoz képest (1. ábra, A–C), a nehézlánc szomatikus hipermutáció aránya szignifikánsan magasabb volt a magas válaszadójú csoportban (1. ábra). , D és E), ami arra utal, hogy ezeknek az egyéneknek lehet a legnagyobb potenciálja erős keresztreaktív mAb-k előállítására (16). Ezeket az antitesteket tovább vizsgálták az RBD mutánsok ellen, hogy azonosítsák epitóp-besorolásukat (17). A 14 RBD-reaktív mAb közül 4 2. osztályú mAb-t, 2 3. osztályú mAb-t és 8 be nem osztályozott mAb-t azonosítottunk, amelyek a vizsgált kulcsfontosságú RBD mutánsokkal szemben alig vagy egyáltalán nem csökkentették a kötődést (1F. ábra). Meg kell jegyezni, hogy a 2., 3. és 4. osztályú antitestek megközelítőleg megfelelnek a korábbi vizsgálatokban meghatározott RBS BD, S309 és CR3022 epitópoknak (13, 18). A 2. és 3. osztályú RBD mAb-k nem ismertek fel egy többváltozatú RBD-mutánst, amely K417N/E484K/L452R/N501Y szubsztitúciókat tartalmazott, vagy egy mesterségesen megtervezett RBD-t, amely kulcsfontosságú mutációkat tartalmazott a vírus kiszökéséhez (17, 18), és nem mutattak keresztreaktivitást a A SARS-CoV{54}} és a közel-keleti légúti szindróma (MERS)-CoV RBD-je (1F. ábra). Funkcionálisan a 2. és 3. osztályú RBD mAb-k hatékonyan semlegesítették a D614G és Delta variánsokat, de a semlegesítő aktivitás korlátozottabb volt a Bétával, Kappa-val és Mu-val szemben (1G. ábra). A vizsgált 2. vagy 3. osztályú antitestek egyike sem semlegesített egyetlen tesztelt Omicron-variánst sem.
Ezzel szemben a besorolatlan monoklonális ellenanyagok többsége az RBD multivariánshoz kötődött, és keresztreakciót váltott ki a SARS-CoV-1 RBD-vel (1F. ábra). Ezek közül 3 mAb-t azonosítottunk: S451-1140, S626-161 és S728-1157, amelyek nagy semlegesítő hatást mutattak a D614G és a keresztsemlegesített Beta, Delta, Kappa, Mu és S{7}} ellen. Omicron BA.1 99%-os gátló koncentrációval (IC99) a 20–2500 ng/ml tartományban (1G. ábra). Tekintettel a 3 mAb széles közömbösítő hatására, a plakk vizsgálati platformon kívül neutralizációs tevékenységet is végeztünk az autentikus BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 és XBB vírusok fókuszcsökkentési neutralizációs teszttel (FRNT) (1G. ábra). Ezek közül az S728-1157 magas semlegesítő aktivitást mutatott az Omicron-változatok paneljével szemben, beleértve a BA.1, BA.2, BA.4 és BA.5 változatokat, IC99 értékkel 100 ng/ml-ig terjedő értékkel mérve. plakk vizsgálat. Hasonló forgatókönyvet figyeltek meg az FRNT használatakor, ahol az S728-1157 megőrizte magas semlegesítési aktivitását a BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 és XBB ellen 8–300 ng közötti IC50 értékkel. /ml (1G. ábra). Az S451-1140 hatásosan semlegesítette a BA.1-et, BA.2-t, BA.2.75-öt és BL.1-et, de a BA.4-et és a BA.5-öt nem, amint azt mindkét neutralizációs vizsgálati platformon megfigyelték. Másrészről az S626-161 nem mutatott közömbösítő hatást a BA.1 változaton túlmutató Omicron-variánsokkal szemben (1G. ábra). Bár az S626-161 semlegesítő képessége alacsonyabb volt a vizsgált VOC-k ellen, mint a másik 2 antitest, ez volt az egyetlen mAb, amely nemcsak a SARS CoV{58}} RBD-vel mutatott keresztreaktivitást, hanem képes volt semlegesíteni a denevért is. koronavírusok WIV{59}} és RsSHC014 (1. ábra, F és G). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az S626-161 felismer egy konzervált epitópot, amely megoszlik ezen arbovírus-vonalak között, de hiányzik a BA.2 és későbbi törzsekben. Ezenkívül az S728-1157 és S451-1140-hez képest az S626-161 hosszabb CDR-H3-mal rendelkezik, amely fokozott képességet biztosíthat az arbovírusok között megosztott, erősen konzervált maradékok felismerésére, a leírtak szerint. egy korábbi tanulmányban (19) (1. kiegészítő ábra). Ha összehasonlítottuk e 3 mAb immunglobulin nehéz (IGHV) és könnyű lánc (IGLV vagy IGKV) variábilis génjeit a rendelkezésre álló SARS-CoV-2 neutralizáló mAb adatbázissal (13, 15, 20–27), azt találtuk, hogy a nehéz lánc az S728-1157 (IGHV3-66), az S451-1140 (IGHV3-23) és az S626-161 (IGHV4-39) által használt variábilis gének korábban beszámoltak róla, hogy számos, az RBD-t célzó, hatékonyan semlegesítő SARS-CoV{85}} antitestet kódolnak (21, 22, 28, 29). Azonban csak az S728-1157 rendelkezik olyan egyedi nehéz- és könnyűlánc-variábilis génpárokkal, amelyekről nem számoltak be az adatbázisban (3. kiegészítő táblázat), ami azt jelzi, hogy ez nem nyilvános klonotípus.
1. ábra: COVID-19 – lábadozó egyénekből izolált RBD-reaktív mAb-ek jellemzése
Ezt a 3 mAb-t (S451-1140, S626-161 és S728-1157) tovább jellemeztük, hogy meghatározzuk a SARSCoV-2 VOC-okkal szembeni kötési szélességüket (2. ábra, A és B) . Az S2 alegységben (2P; diprolin) a 2-prolin szubsztitúciókat tartalmazó prefúzióval stabilizált tüske kiváló immunogénnek bizonyult a WT-csúcshoz képest, és számos jelenlegi SARS-CoV-2 alapja. vakcinák, beleértve az mRNS-alapú vakcinákat (30, 31). Újabban a 6 prolinnal (6P; hexaprolin) stabilizált tüskeproteinről számoltak be, hogy fokozza az expressziót, és még stabilabb, mint az eredeti diprolin konstrukció; ennek eredményeként javasolták a COVID{17}} vakcinák következő generációjában való alkalmazását (32, 33). Annak megállapítására, hogy vannak-e antigenitási különbségek a diprolin és a hexaprolin tüskekonstrukciók között, mindkét immunogént bevontuk tesztpanelünkbe. ELISA-val mérve azt találtuk, hogy 3 mAb nagyobb mértékben kötötte meg a 6P-WT spike antigént, mint a WT-2P spike (2. ábra, A és B). Mind a 3 mAb hasonló kötődést mutatott az alfa-, béta-, gamma- és deltavírusok tüskéihez, a WT-2P-hez képest (2. ábra, A és B). Ennek a 3 mAb-nak a kötési reaktivitása azonban lényegesen csökkent az Omicron család antigének paneljével szemben (2. ábra, B és C). Az S451-1140 kötődés érzékeny volt a BA.1-ben és BA.2-ben talált mutációkra, ami a kötődés nagymértékű csökkenését és a neutralizáció 31-szeresét csökkentette ezekkel a változatokkal szemben a WT-hez képest-2 P antigén és D614G vírus (2B. ábra). A sarbecovírus-kereszt neutralizáló mAb, az S626-161 szintén 1.2--35--szeresére csökkent kötődést mutatott a tüske BA.1 antigénhez, ami egy {{45} }szeres csökkenése a BA.1 elleni semlegesítési aktivitásban (1G. ábra és 2. ábra, B és C). A legerősebb, széles körben közömbösítő antitest (bnAb), az S728-1157 esetében az Omicron antigénekhez való kötődése kisebb mértékben (1.{51}} és 4.{53}}-szeres tartományban) csökkent az előzőhöz képest. A WT-2P kiugrott, és nem befolyásolta a semlegesítő aktivitást (1G. ábra és 2. ábra, B és C). Az Omicron-semlegesítő monoklonális antitestek BA.1 tüskéhez való kötődésének jelentős csökkenése a mobilitás megváltozásának, valamint az Omicron 3-RBD-lefelé irányuló struktúráinak szoros tömítettségével és a 1- preferenciájával kapcsolatos. egy korábbi tanulmány szerint (34). A 2P és 6P stabilizáló mutációk eltérő hatást fejtenek ki az Omicron variánsokban is, ahol mind a 3 mAb 2{67}}szeresére nőtt a spike BA-hoz való kötődése.1-6P a BA-hoz képest.1-2P verzió, de csak kismértékben növelte a kötődést a BA.2 és BA.4/5 6P tüskés változatokhoz a 2P változatukhoz képest 1,2-1,4-szeresével, ami arra utal, hogy az Omicron-semlegesítő monoklonális antitestek valamivel jobban hozzáférhetők a hexapol verziókhoz, különösen a tüske BA.1 konstrukcióhoz. Az ELISA-n kívül bioréteg interferometriát (BLI) alkalmaztunk a 3 mAb kötődési sebességének és egyensúlyi állandóinak (kon, koff és KD) számszerűsítésére a tüske-antigének paneljéhez (2. kiegészítő ábra). A fragmens antigénkötődésének (Fab) a hexaprolin tüskékhez való felismerési aránya 1.{83}}-3.3-szer gyorsabb volt a diprolin tüskékhez képest (2. kiegészítő ábra, B és C), ami azt mutatja, hogy az antitestek gyorsabban kötődnek a 6P konstrukcióhoz, mint a 2P konstrukcióhoz. Ez várható lett volna, ha az epitópok jobban hozzáférhetők lennének az RBD-n, nyitott állapotban a hexaprolincsúcson. Az S626- 161 kivételével a Fabs lassabban disszociált a hexaprolin-csúcstól (alacsonyabb koff-értékkel rendelkezett), mint a diprolin-csúcs, így a teljes KD azt mutatta, hogy S728-1157 és S451-1140 kötődik a hexaprolin tüske nagyobb affinitással (2. kiegészítő ábra, B és C). A hexaprolin-csúcshoz való kötődés növekedése még figyelemreméltóbb volt az érintetlen IgG esetében az 1:2 interakciós modell szerint, amint azt az S728-1157 és S451- 1140 mAb-k mutatják, összhangban a több epitóp expozíciójával a 6P stabilizálással. javított aviditás (2. kiegészítő ábra, A és C). Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy a megcélzott epitópok viszonylag könnyebben hozzáférhetők a 6P-stabilizált tüskén, amikor az RBD nyitott állapotban van. Ezt követően szerkezeti elemzéseket végeztünk ennek a feltételezésnek az igazolására.
2. ábra: Omicron-semlegesítő mAb-k kötési szélessége
Széles körben semlegesítő mAb-k szerkezeti elemzése. A kötött epitópok első közelítéseként ELISA-kompetíciós vizsgálatot alkalmaztunk annak meghatározására, hogy ez a 3 nagymértékben semlegesítő mAb átfedésben van-e a jelenlegi mAb-panelünkkel, amely a korábbi vizsgálatokból ismert epitópspecifitású mAb-k gyűjteménye (15, 25, 35). és 2 másik jelenleg klinikai használatban lévő mAb, az LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) és a REGN10933 (Regeneron) (37). Az S451-1140 és S728-1157 kötőhelyei részben átfedtek a CC12.3-mal (23, 25), egy 1. osztályú neutralizáló antitesttel, és a legtöbb 2. osztályú antitesttel, beleértve az LY-CoV555-öt és a REGN10933-at, de nem osztályú és 4. osztályú antitestekkel (3A. ábra). Az S626-161 jelentős átfedést mutatott a kötőrégióban az 1. osztályú CC12.3-mal, számos 4. osztályú antitesttel, köztük a CR3022-vel, és más nem osztályozott antitestekkel, miközben részleges átfedésben volt több 2. osztályú és egyetlen 3. osztályú antitesttel (ábra). 3A). Hasonlóképpen, egy kompetíciós BLI-teszt kimutatta, hogy S451-1140 és S728-1157 erősen verseng egymással a WT-6P tüskéhez való kötődésért, míg S626-161 nem (kiegészítő ábra). 3). Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy S451-1140 és S728-1157 hasonló epitópokat ismer fel, amelyek különböznek az S626-161-től.
3. ábra: S728-1157 széles körű semlegesítésének mechanizmusa
Az S{0}} antitestet az IGHV3-66 kódolta, és rövid, komplementaritást meghatározó 3-as régióval (CDR-H3) rendelkezett. Nevezetesen azok a mAb-k, amelyek megkötik az RBS-t az 1. kötési módban (azaz RBS-A vagy 1. osztályú hely), amelyeket a CC12.1, CC12.3, B38 és C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39) jellemez, hajlamosak IGHV3-53 vagy 3-66 használatára, és érzékenyek a VOC-mutációkra (40). Az S728-1157 CDR-H3 régiója azonban nagymértékben különbözik ebbe az osztályba tartozó más antitestektől, ami potenciálisan magyarázza szélesebb aktivitását. Annak érdekében, hogy megértsük az S728-1157 által ezen az epitópon végzett széles körű semlegesítés szerkezeti alapját, feloldottuk az IgG S728-1157 krioelektronmikroszkópos (krio-EM) szerkezetét (3B. ábra) a WT{ tüskés komplexben. {31}}P-Mut7, a WT-6P tüske változata, amely protomerek közötti diszulfidkötést tartalmaz a C705 és C883 pontokon, körülbelül 3,3 Å globális felbontással (4E. kiegészítő ábra). Szimmetria-bővítés, fókuszált osztályozás és finomítási módszerek alkalmazásával az RBD-Fv interfész lokális felbontását körülbelül 4 Å-re értük el (4E kiegészítő ábra és 8. kiegészítő táblázat). Az S728-1157 Fab kristályszerkezetét 3,1 Å felbontással határoztuk meg, és az RBD-Fv interfészen az atommodell felépítéséhez használtuk. Szerkezeteink megerősítik, hogy az S728-1157 megkötötte az RBS-A (vagy 1. osztályú) epitópot az RBD-up konformációban (3B. ábra és 4E. kiegészítő ábra), hasonlóan más IGHV-hez3-53/{{55} } antitestek (3C. ábra). Az angiotenzin-konvertáló enzim 2 (ACE2) kötőhelyének S728-1157 általi szterikus blokkolása magyarázza a SARS-CoV-2 elleni nagy semlegesítő hatását. Az S728-1157 CDR-H1 és -H2 32NY33 motívuma és 53SGGS56 motívuma (23) csaknem ugyanúgy kölcsönhatásba lép az RBD-vel, mint a CC12.3 (4. kiegészítő ábra, B és C). A CC12.3-ban lévő VH 98DF99-hez képest azonban az S728-1157 CDR-H3-ban lévő VH 98DY99 kiterjedtebb kölcsönhatásokat alakít ki, beleértve a hidrofób és poláris kölcsönhatásokat is, az RBD-vel, ami a VOC-k elleni széles körű semlegesítést okozhatja (ábra). 3D és 6. és 7. kiegészítő táblázat). A diglicin VH 100GG101 az S728- 1157 CDR-H3-ban szintén elősegítheti a kiterjedtebb kötődést, mint a VH Y100 a CC12.3-ban, valószínűleg a glicin-maradékok rugalmassága miatt, ami a CDR csúcsának eltérő konformációjához vezet. -H3 hurok és a maradékok relatív eltolódása 98DY99-nél.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez
【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Bár az Omicron VOC-k kiterjedt mutációkkal rendelkeznek az RBD-ben, ezeknek a maradékoknak a többsége nem lép kölcsönhatásba az S{0}}-mal, mivel a kötődés továbbra is megfigyelhető (4A. kiegészítő ábra). A mi tüskés WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157 modellünkből az Y505-től a VL Q31-ig, valamint az E484-től a VH-ig Y99-ig hidrogénkötést hoznak létre (4D kiegészítő ábra és 6. kiegészítő táblázat). ), amelyeket az Omicron Y505H és E484A mutációi megzavarhatnak. Azonban az Y505H mutáció továbbra is lehetővé tenné a hidrogénkötést a VL Q31-gyel, az E484A mutáció pedig egy másik hidrofób oldalláncot adna a VL Y99, F456 és Y489 hidrofób oldalláncok közelében. Ezek az érintkezések részben magyarázatot adhatnak arra a mechanizmusra, amely lehetővé teszi, hogy az S728-1157 megtartsa a semlegesítő aktivitást, bár csökkent, a tüske BA.1 antigénnel szemben (1G. ábra és 2B. ábra). A BA.1 antigén viszont valószínűleg az Omicron mutációihoz kapcsolódik, amelyek megváltoztatják a tüskeprotein konformációs tájképét (34). Azonban számos szomatikusan mutált aminosav, azaz a VH L27, L28, R31, F58, valamint VL V28 és Q31 az S728-1157-ben részt vesz a SARS-CoV-2 RBD-vel való kölcsönhatásban (1. kiegészítő ábra és Kiegészítő 7. táblázat), amely szintén hozzájárulhat a CC12.3-hoz képest széles reaktivitásához. Összességében szerkezeti vizsgálataink feltárták az S728-1157 széles körű semlegesítésének alapját, amely képes befogadni a legtöbb mutációt a SARS-CoV-2 VOC-kban.
4. ábra: A bnAb-k védekező hatékonysága a SARS-CoV-2 fertőzéssel szemben hörcsögökben.
Az S728-1157 csökkenti a SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta és WT SARS-CoV-2 replikációját szíriai hörcsögökben. A széles körben semlegesítő monoklonális ellenanyagaink védőhatékonyságának értékelésére egy arany szír hörcsögfertőzési modellt használtunk, amelyet széles körben használtak a SARS-CoV-re{7}}. A hörcsögök 5 mg/kg teszt mAb-t vagy egy irreleváns antigént (ebolavírus glikoproteint) célzó izotípus kontrollt kaptak intraperitoneális injekcióban a SARS CoV{10}} vírussal való fertőzés után 1 nappal. A tüdő- és orrszöveteket 4 nappal a fertőzés után gyűjtöttük össze (4A. ábra). Az S728-1157 terápiás beadása a WT, BA.1 Omicron és Delta variánsok titereinek csökkenését eredményezte a fertőzött hörcsögök orrnyálkahártyájában és tüdejében (4. ábra, B–D). Érdekes módon az S728-1157 hatása a tüdőben drámai volt, mintegy 104 PFU-val csökkentve a WT és a BA.1 Omicron vírusterhelést, miközben a BA.1 Omicron variáns vírustiterei teljesen megszűntek (4C. ábra). Ellentétben az in vitro semlegesítéssel (1G. ábra), az S451-1140 nem csökkentette a BA.1 Omicron vírusreplikációját tüdő- és orrturbinátumokban, ami azt jelzi, hogy az in vitro semlegesítés és az in vivo védelme között megszakadt a klón (4E. ábra). . Összehasonlításképpen, az S626-161 beadása marginálisan szignifikáns csökkenést eredményezett a tüdő vírustiterében a WT és BA.1 fertőzést követően (4. ábra, F és G). Ezek az adatok alátámasztják, hogy a széles körben védő monoklonális ellenanyagok pontos meghatározásához a védelem hatékonyságát a semlegesítési tevékenységgel párhuzamosan kell értékelni. A továbbiakban érdekes lesz megvizsgálni, hogy az S728-1157 védőképessége mennyire Fc-függő. Összességében az S728-1157 ígéretes monoklonális antitestet képvisel, amely széles körű semlegesítő hatékonysággal rendelkezik a SARS CoV-2 variánsaival szemben, amelyek képesek drámaian csökkenteni a WT, Delta és BA.1 replikációját in vivo.
A SARS-CoV-2 fertőzés ritkán vált ki erős S728-1157-szerű keresztsemlegesítő monoklonális antitesteket. Tekintettel az S728-1157 keresztneutralizációs és profilaktikus potenciáljára, arra törekedtünk, hogy értékeljük, hogy az S728–1157-szerű antitestek gyakran indukálódnak-e a poliklonális válaszok között SARS-CoV-2 betegekben. Ennek értékelésére kompetitív ELISA-vizsgálatokat végeztünk lábadozó szérum felhasználásával, hogy kimutathassuk azokat az anti-RBD antitest-titereket, amelyek versenghetnek az S728-1157-hez való kötődésért (5A. ábra). Az alanyokat 3 csoportra osztották az antitestválaszok nagysága alapján, a korábban meghatározottak szerint (15, 16). Noha a magas és közepesen reagálóknak magasabb volt az S728-1157-kompetitív szérum antitestek titere az alacsony válaszreakciókhoz képest (5B. ábra), a titerek minden csoportban meglehetősen alacsonyak voltak, ami arra utal, hogy nem gyakori a magas S{{ 18}}-szerű antitestek a poliklonális szérumban WT SARS-CoV-2 fertőzést követően. Az S728-1157 mellett teszteltük a lábadozó szérum versengését más mAb-ekkel, köztük az S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 és CC12.3-mal. Az S728-1157-hez hasonlóan viszonylag alacsony titereket figyeltünk meg az S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 és CC12.3 ellenanyagokkal versengő antitestek poliklonális szérumában a lábadozó betegek többségéből. egyének (5. ábra, C–F és H). Mindazonáltal a jól reagálók általában szignifikánsan magasabb titereket értek el a semlegesítő mAb-ekkel szemben, mint a gyengén reagálók (5. ábra, B–F és H). Ezzel szemben a CR3022 epitóp helyét megcélzó antitestek kifejezettebbek voltak lábadozó egyénekben, ami arra utal, hogy a 4. osztályú RBD antitestek feldúsultak a poliklonális szérumban (5G. ábra). Nevezetesen, nem volt szignifikáns különbség a CR3022 titerében a 3 reagáló csoport között, ami arra utal, hogy a CR3022-helyi antitestek következetesen indukálódtak a WT SARS-CoV-2 fertőzés során a legtöbb egyénben. Érdekes módon a CC12.3-hoz képest az S{50}} 4-szer alacsonyabb szinten volt kimutatható a jól reagáló szérumban. Így annak ellenére, hogy az 1. osztályba tartozó antitesteket gyakran természetes fertőzés és vakcinázás indukálja (14, 20, 28, 29, 41–43), adataink arra utalnak, hogy az S728–1157-szerű antitestek, amelyek ennek az osztálynak egy alcsoportját képviselik, viszonylag ritkák.
Ezenkívül megvizsgáltuk a 2P és a 6P-stabilizált tüske közötti reaktivitás különbségét lábadozó kohorszszérumunkban (5. ábra, I–K). Azt találtuk, hogy mind a három reagáló csoport 6-11-szeresére növelte a 6P-stabilizált tüske-WT elleni tüske-reaktív antitesteket, mint a 2P-stabilizált tüske-WT-t (5J. ábra), ami azt jelzi, hogy a fő antigén epitópok jobban mutatkoztak vagy stabilizálódtak a 6P-stabilizált antigénen. Ugyanezeket a mintákat használva a magas és közepesen reagálók a BA-ellenes tüske-ellenes antitestek titerét is 4–5-szörösére csökkentették. Megjegyzendő, hogy a gyengén reagálóknál kisebb volt a változás a kötési reaktivitásban a BA.1 Omicron-2P és 6P tüske ellen (2-szeres csökkenés) a WT-2P és 6P tüskehöz képest ({ {28}}szeres csökkenés) (5. ábra, J és K), ami arra utal, hogy a BA.1 Omicron-reaktív epitópok elleni szérum antitest mennyisége korlátozottabb lehet a gyengén reagáló alanyokban. Összességében ezek az adatok azt sugallják, hogy a természetes fertőzés által kiváltott jobb poliklonális kötődés a 6P-stabilizált tüskéhez, mind a WT, mind az Omicron vírusok esetében.
Az S728–1157-szerű antitestek optimálisan indukálódnak a hibrid immunitás összefüggésében. A védőoltás nélküli elsődleges SARS-CoV-2 fertőzés a jelenlegi globális környezetben ritkasággá vált, és több tanulmány is beszámolt arról, hogy a SARS-CoV-2 immunitása eltérő a specifikus oltási/fertőzési múlttal rendelkező egyének között. Ennek eredményeként a következőkben azt próbáltuk megvizsgálni, hogy az ősi SARS-CoV-2 ősi WT-fertőzéstől eltekintve mely gyakori expozíciók indukálnak hatékonyan S728–1157-szerű antitesteket a monovalens mRNS-alapú vakcinák plazmájában előzetes beoltással vagy anélkül. fertőzés. A szükséges biomintát a SARS-CoV-2 elleni gyors immunitással összefüggő Védelem (PARIS) vizsgálati kohorsztól szereztük be, amely a világjárvány kezdete óta longitudinálisan követte az egészségügyi dolgozókat (44). Plazmamintákat választottunk a teljesen immunizált (2x vakcinázott) vizsgálati résztvevőktől, fertőzéses és nem fertőzött, valamint az emlékeztető oltásban részesülő (3x vakcinázott) résztvevőktől, fertőzéssel és anélkül. Ezen túlmenően a vizsgálatban részt vevők mintáit is bevontuk, akik megkapták a bivalens mRNS vakcinát (az ősi WA1/2020 plusz Omicron BA.5) (6A. ábra és 2. kiegészítő táblázat). Az emlékeztető oltásban részesült résztvevők áttöréses fertőzései akkor következtek be, amikor az Omicron leszármazottai kiszorították az összes többi SARS-CoV{22}} törzset a New York-i nagyvárosban. Azt találtuk, hogy a kétszeresen vakcinázott egyéneknél volt a legalacsonyabb az S728-1157 kompetitív szérum antitestek titere a vizsgált 5 mintacsoport közül (6B. ábra). Figyelemre méltó, hogy ezek a szintek hasonlóak voltak a lábadozó, be nem oltott kohorszunkban megfigyeltekhez (minden reagáló; 5B. ábra). Összehasonlításképpen: azoknál az egyéneknél, akiknek a kórtörténetében természetes fertőzés szerepelt, beleértve azokat a lábadozó egyéneket, akik 3-ból 2 vakcinaadagot kaptak, és akik áttöréses fertőzésen estek át, és bivalens emlékeztető oltást kaptak, szignifikánsan magasabb S728-1157-kiváltást mutattak, mint a nem fertőzötteknél. hanem beoltott egyének (6B. ábra). Bár a nem fertőzött 3-dózisú csoport csak nem szignifikáns növekedést mutatott a 2-dózisú csoporthoz képest, a vakcinatípusok szerinti páros bontás azt jelzi, hogy a BNT162b2 és mRNS homológ harmadik dózisa-1273 szignifikánsan növelte az S{{ 38}}, mint a neutralizáló antitest titerek 2,72 ×, illetve 2,85 × (6. ábra, C és D). Meg kell jegyezni, hogy azon résztvevők között, akiknek összesen 3 kontaktusa volt bármilyen módon kiugrással, az S728-1157-szerű antitesttiterek 3-szor magasabbak voltak a lábadozó kettős vakcinázottaknál, mint a fertőzés előtt még nem kapott hármas oltásoknál, ami arra utal, hogy a SARS-CoV{{ 51}} fertőzés optimálisabban indukálja ezt a klonotípust. A hibrid immunitású csoportok közül megjegyeztük, hogy a kétértékű emlékeztető oltásban részesült, áttörést jelentő, megerősített egyedek többségének S728-1157 antitesttitere csak kis mértékben volt magasabb, mint a pre omikron lábadozó vakcinázott csoportoknál, ami arra utal, hogy az S{{53 }} titer valószínűleg egy platóhoz közeledett 3 expozíció után. Vizsgáltuk azon poliklonális antitestek titerét is, amelyek az S728-1157 mellett a CC12.3-mal és a CR3022-vel is versengtek. Minden egyed viszonylag magas CC12.3- és CR3022-szerű antitesteket mutatott, függetlenül az expozíciók számától és típusától (5. kiegészítő ábra), ellentétben azzal, amit az S728-1157- esetében tapasztaltunk. mint az antitestek. Összességében ezek az adatok azt mutatják, hogy a SARS-CoV-2 fertőzés és az mRNS-oltás egyaránt hozzájárul az S728-1157-szerű antitestek indukciójához, és a fertőzés dominánsabb szerepet játszik a beoltott egyénekben.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Végül, a 2P-vel és 6P-vel stabilizált tüske elleni válaszok összehasonlításakor az mRNS-oltási kohorszban azt találtuk, hogy a legtöbb csoport hasonló szintű antitesteket váltott ki mindkét konstrukció ellen. Ez alól kivételt a nem fertőzött, háromszoros vakcinával beoltott csoport képezett, akik statisztikailag magasabb, bár csak kis mértékben megnövekedett reaktivitást mutattak a 2P-vel szemben, mint a 6P-vel stabilizált tüske (6E. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a természetes fertőzéssel ellentétben (5. ábra, J és K) a vakcinázás önmagában olyan poliklonális választ vált ki, amely inkább a Spike{11}}P konstrukció epitópjaira korlátozódik, összhangban a Spike{12 }}A jelenlegi vakcinák P formulája. Végső soron ezek az eredmények alátámasztják azt az elképzelést, hogy a jövőbeni SARS-CoV-2 vakcinák 6P-stabilizálása jelentős előnyökkel járhat az S728-1157-hoz hasonló, széles körű védelmet nyújtó antitest-klonotípusok kiváltásában.
5. ábra: Lábadozó szérum antitest-kompetíció széles körben semlegesítő RBD-reaktív mAb-ekkel és a szérum antitest-válasz összehasonlítása 6P-vel és 2P-vel stabilizált tüskékkel szemben
6. ábra: mRNS-vakcinált szérum antitest versengés S728-1157 semlegesítő RBD-reaktív mAb-kkel és a szérum antitest válasz összehasonlítása 6P-vel és 2P-vel stabilizált tüskékkel.
Vita
Ebben a tanulmányban egy olyan erős bnAb-t azonosítunk, amelyet egy olyan egyén memória B-sejtjéből izoláltak, aki a COVID{2}} világjárvány kezdeti hulláma során felépült a SARS-CoV-2 fertőzésből. Ez a bnAb, S728- 1157 jelentős kötési reakcióképességet tartott fenn, és következetes semlegesítő aktivitást mutatott az összes vizsgált SARS-CoV-2 VOC ellen, beleértve az Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.{12}}R346T), BA.4, BA.5 és XBB, és jelentősen csökkenteni tudta a fertőző vírustitereket a Delta és a BA.1 fertőzést követően hörcsögökben.
Azt találtuk, hogy a kohorszunkból származó lábadozó szérum alacsony koncentrációban tartalmazott olyan antitesteket, amelyek versengenek az S728-1157 (1. osztályú/RBS-A antitest) és 2. osztályú epitóp mAb-kkel. Ez arra utal, hogy az S728-1157 némileg egyedi az 1. osztályú epitópokat célzó antitestektől, és ritkán indukálódik az RBD-specifikus memória B-sejtkészletben. Ehelyett úgy tűnt, hogy természetes fertőzési csoportunk a CR3022 (4. osztály) epitópot megcélzó antitesteket indukál; az ilyen specifikus antitestek gyakran keresztreaktívak, de kevésbé hatékonyan semlegesítenek, mint az RBS-t célzó antitestek (14, 17). Ezek az adatok kiegészítik korábbi megállapításainkat, amelyek azt mutatják, hogy a 3. osztályú/S309 antitestek bősége a lábadozó szérumokban hozzájárulhat az alfa- és gamma-variánsokkal szembeni semlegesítő aktivitáshoz, míg a 2. osztályú antitestek hiánya a Delta elleni neutralizációs képesség csökkenését okozhatja (15). . Ennek ellenére a legtöbb ilyen RBS-t célzó antitest (RBS-A/class 1, RBS-B, C/class 2 és RBS-D, S309/class 3) Omicron variánsokkal szemben a jelentések szerint erősen korlátozott. (11, 40, 45).
A jövőbeni fő kihívás annak meghatározása lesz, hogyan javítható a konzervált RBS-epitópokkal szembeni széles körben keresztreaktív antitestek kiváltása. Ebben a tekintetben azt figyeltük meg, hogy a hibrid immunitással rendelkező egyének szignifikánsan magasabb S728-1157-szerű antitesteket hoznak létre, mint az előzetes fertőzés nélkül beoltott egyének. Fontos, hogy ezt a jelenséget még akkor is megfigyelték, amikor az expozíciók számát ellenőrizték (azaz a lábadozó kettős vakcinázottaknál a nem fertőzött háromszoros vakcinázottakkal szemben), ami arra utal, hogy a fertőzéssel összefüggő immunitás bizonyos elemei (vagy olyan vakcinakészítmények, amelyek utánozhatják az ilyen típusú immunitást) fontos ennek a klonotípusnak a kiváltása szempontjából. Ez összhangban van azokkal a kísérleti bizonyítékokkal, amelyek azt dokumentálják, hogy a hibrid immunitással rendelkező egyének antitest-reaktivitási profilja szélesebb, mint azokkal, akiknek csak vakcinázás vagy elsődleges fertőzés által kiváltott immunválasza van (9).
Az itt leírt struktúrák azt mutatják, hogy az S728-1157 megkötötte az RBS-A/class 1 epitópot a felfelé konformációs RBD-ben. Úgy tűnik, hogy ez az epitóp könnyebben hozzáférhető a 6P-stabilizált tüskéken, amelyekről a jelentések szerint 2 RBD-t mutatnak a felső államban, szemben a 2P tüskékkel, amelyek csak 1-et (30, 33, 46, 47) tartalmaznak, és amelyek ellen antitesteink a felfelé ívelő tüskékre specifikusan javított kötődést mutatnak. S728-1157 természetes fertőzés után izolált; ilyen összefüggésekben az S728-1157-szerű klónok indukálásának esélye nagyobb, mivel az RBD-nek képesnek kell lennie egy felfelé ívelő konformáció elfogadására, akár átmenetileg is, hogy kötődjön az ACE2-hez, ezáltal felfedve ezt az epitópot. Az IGHV3-53/3-66 RBS-A/1. osztályú antitestek többségétől eltérően az S728-1157 a CDR-H3 és az RBD közötti kiterjedt kölcsönhatások révén képes befogadni a kulcsfontosságú mutációkat a VOC-csúcsokban (29, 48–50). Az S728-1157 más könnyű láncot (IGLV3-9) is használ más kevésbé széles antitestekhez képest, mint például a CC12.3 (IGKV3-20), ami befolyásolhatja az általános kötődési kölcsönhatásokat; elemzésünk azonban azt jelzi, hogy a CC12.3-hoz képest kevesebb hidrogénkötés van az S728-1157 könnyű lánc és az RBD között (7. kiegészítő táblázat). Noha ebben a kölcsönhatásban a VOC keresztreaktivitás szempontjából kritikus CDR-H3 kontaktmaradékok többsége csíravonal kódolt, és nem szomatikus mutációk vezetik be, számos szomatikusan mutált aminosav a keretrégiókban vagy a CDR-H1, CDR-H2 és CDR-L1 részt vesz a SARS-CoV-2 RBD-vel való kölcsönhatásban. Ez egyrészt arra utal, hogy az IGHV3-53/66 osztályú antitesteket kódoló memória B-sejtek hasonló mértékű keresztreaktivitásra tehetnek szert további affinitás-érés révén. Másrészt ez is jelzi a csíravonal-célzott immunogének tervezésének lehetőségét, amelyek az S{52}}a naiv B-sejtekhez hasonlóan céloznak. Bár kihívást jelenthet olyan vakcinák megtervezése, amelyek specifikusan S728-1157-szerű antitesteket váltanak ki kiválasztott CDR-H3-okkal, amelyek képesek legyőzni a VOC-mutációkat, biztató, hogy az IGHV-gén-restrikciót más erős SARS-CoV-fertőzésekben is megfigyelték. {58}} semlegesítő mAb-vizsgálatok (13, 15, 20–27). Alternatív megoldásként ez megvalósítható optimalizált RBD immunogénekkel végzett iteratív immunizálással is, amint azt korábban más kórokozók esetében is közölték (51–55).
Bár sok mutációt figyeltek meg az RBS-A/ 1. osztályú antigén helyén (18), az S728-1157 epitóp tekintetében a 15 teljes RBD-kontaktusból 13 és a 3 CDR-H{{9} közül 2. }a kötött RBD érintkezési maradékok az Omicronban és az összes többi VOC-ban konzerváltak. Ez arra utal, hogy az az RBD-régió, ahol az S728-1157 epitóp megtalálható, tartalmazhat olyan aminosavakat, amelyek kritikusak a dinamikus funkciója és a vírus alkalmassága szempontjából, ezért kevésbé toleráns a mutációkkal és az antigénsodródással szemben, mint a környező RBS-A/1. osztályú helymaradékok. Ha ez a helyzet, akkor csökkenteni kell annak a tendenciát, hogy ez a bizonyos epitóp elveszik a vírusvariánsok fejlődése során, ami az S728-1157 és hasonló antitestek és epitópok jellemzését fontossá teszi a variánsrezisztens vakcinák vagy az mAb terápiás fejlesztése szempontjából. Összefoglalva, tanulmányunk olyan bnAb-ket azonosít, amelyek a következő generációs variánsbiztos koronavírus-vakcinák immunogén-tervezéséhez vezethetnek, vagy olyan mAb-terápiákként szolgálhatnak, amelyek ellenállnak a SARS CoV-2 evolúciójának. Különösen a kombinált hatékonyság és szélesség tekintetében az S728-1157 tűnik a kategóriájában eddig izolált legjobb antitestnek. Tekintettel arra, hogy ez az antitest könnyebben kötődik a 6P-stabilizálással, az előrejelzések szerint elsősorban a 6P-vel stabilizált rekombináns tüskefehérjék vagy a teljes vírus indukálja, ami arra utal, hogy a hexaprolin módosítása előnyös lehet a jövőbeli vakcinakonstrukciók számára a jövőbeni SARS-CoV elleni optimális védelem érdekében. -2 változatok és egyéb arbovírusok.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Mód
Monoklonális antitest izolálás. A PBMC-ket leukoredukciós szűrőkből izoláltuk és lefagyasztottuk a korábban leírtak szerint (24). A B-sejteket PBMC-kből dúsítottuk fel FACS segítségével. A sejteket CD19, CD3 és oligofluoroforhoz konjugált antigénpróbákkal festettük; a kérdéses sejteket CD3–CD19+ Antigén+ként azonosították. Az összes mAb-t oligo-címkézett, antigéncsali-válogatott sejtekből állítottuk elő, amelyeket egysejtű RNS-Seq-vel azonosítottak, a korábban leírtak szerint (15, 24). Az ebben a vizsgálatban előállított egyetlen B-sejtes adatokat a Gene Expression Omnibus: GSE171703 és GSM5231088-GSM5231123 gyűjteménybe helyeztük el.
Az antigén-specifikus B-sejteket a JMP Pro 15-tel analizált antigén-próba intenzitása alapján választottuk ki, hogy monoklonális ellenanyagokat állítsanak elő. Az antitest nehéz- és könnyűlánc-génjeit Integrated DNA Technologies (IDT) segítségével szintetizáltuk, és humán IgG1-be és humán κ vagy λ könnyűláncba klónozták. expressziós vektorokat Gibson-összeállítással, a korábban leírtak szerint (56). A megfelelő mAb nehéz és könnyű láncait átmenetileg kotranszfektáltuk HEK293T sejtekbe (ATCC). 18 órás transzfekció után a transzfektált sejteket fehérjementes hibridóma tápközeg felülúszóval (PFHM-II, Gibco) egészítettük ki. A szekretált mAb-t tartalmazó felülúszót a 4. napon összegyűjtöttük, és protein-A-agaróz gyöngyök (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával tisztítottuk, amint azt korábban részleteztük (56). A jól jellemzett antitestek nehéz és könnyű láncainak szekvenciáit a Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) és REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG), és a fent leírtak szerint szintetizálták. A CC12.3 mAb-t (PDB ID: 6XC4) Meng Yuan biztosította a Scripps Research Institute-tól (San Diego, California, USA). Rekombináns tüskefehérje expresszió. A rekombináns D614G SARS-CoV-2 teljes hosszúságú (FL) tüske, BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, egyetlen RBD-mutáns (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493Y, N493N,5 Az Y505A és az Y505F), az RBD-mutáns (K417N/E484K/L452R/NN501Y), a SARS-CoV-1 RBD és a MERS-CoV RBD kombinációját házon belül hozták létre. Röviden, a rekombináns antigéneket Expi293F sejtek (Thermo Fisher Scientific) segítségével fejeztük ki. A kérdéses gént emlős expressziós vektorba klónoztuk (házon belül módosított AbVec), és az ExpiFectamin 293 kit (Thermo Fisher Scientific) segítségével transzfektáltuk a gyártó protokollja szerint. A felülúszót a transzfekció utáni 4. napon összegyűjtöttük, és Ni-nitrilo-triecetsav (Ni-NTA) agarózzal (Qiagen) inkubáltuk. A tisztítást gravitációs áramlású oszlopon végeztük, és imidazol tartalmú pufferrel eluáltuk a korábban leírtak szerint (57, 58). Az eluátumot puffereljük és PBS-sel cseréljük egy Amicon centrifugális egység (Millipore) segítségével. A B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 és BA.4 Omicron változatok 2P mutációival stabilizált rekombináns FL tüskék a Seattle-i Gyermekkutató Intézet Sather Laboratóriumában készült. A K417V, N439K és E484K RBD-ket, valamint a WT-2P és 6P rekombináns FL tüskét a Sínai-hegyen található Icahn Orvostudományi Iskola Krammer laboratóriumában állították elő. A SARS-CoV-2-6P-Mut7-et és a spike BA1-6P-t egy korábbi tanulmányban leírtak szerint tervezték és gyártották (59). Az egyes antigénekhez tartozó fehérjeszekvenciákat és forrásokat a 4. kiegészítő táblázat tartalmazza. ELISA. A rekombináns SARS-CoV-2 spike/RBD fehérjéket nagy fehérjekötődésű mikrotiter lemezekre (Costar) vontuk be 2 ug/ml PBS-ben 50 μl/lyuk mennyiségben, és egy éjszakán át 4°C-on tartottuk. A lemezeket 0,05% Tween 20-at (PBS-T) tartalmazó PBS-sel mostuk, és 150 μl 20% FBS-t tartalmazó PBS-sel blokkoltuk 1 órán át 37 °C-on. A monoklonális antitesteket sorozathígítottuk, 10 ug/ml-től kezdve PBS-ben, és 1 órán át 37 fokon inkubáltuk a lyukakban. Ezután a lemezeket mostuk, és HRP-konjugált kecske anti-humán IgG antitesttel (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1,000) 1 órán át 37 fokon inkubáltuk. Mosás után 100 μl Super AquaBlue ELISA szubsztrátot (eBioscience) adtunk hozzá lyukonként. Az abszorbanciát 405 nm-en mértük mikrolemezes spektrofotométeren (Bio-Rad). A vizsgálatokat S144-509 (15) kontrollantitesttel standardizáltuk, minden lemezen ismert kötődési jellemzőkkel, és a lemezeket addig fejlesztettük, amíg a kontroll abszorbanciája el nem érte a 3,0 OD-t. Minden mAb-t két párhuzamosban teszteltünk, és mindegyik kísérletet kétszer végeztük el.
Szérum ELISA. A nagy fehérjekötődésű mikrotiterlemezeket rekombináns SARS-CoV-2 tüske-antigénekkel vontuk be 2 ug/ml koncentrációban PBS-ben egy éjszakán át 4 °C-on. A lemezeket PBS-sel 0.{7}}5% Tweennel mostuk, és 200 μL PBS-sel 0,1% Tween + 3% blokkoltuk. sovány tejport 1 órán át szobahőmérsékleten (RT). A szerológiai kísérlet elvégzése előtt a plazmamintákat hővel inaktiváltuk 1 órán át 56 fokon. A plazmát sorozatosan 2-szeresére hígítottuk PBS 0,1% Tween + 1% sovány tejporban. A lemezeket szérumhígításokkal 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az antitestek kötődésének kimutatására a HRP-vel konjugált kecske anti-humán Ig másodlagos antitestet 1:3 arányban,000 PBS-sel 0,1% Tween + 1% sovány tejporral hígítottuk. 1 órás inkubáció után a lemezeket 100 μl SigmaFast OPD oldattal (Sigma-Aldrich) 10 percig előhívtuk. Ezután 50 μL 3 M HCl-t használtunk a fejlesztési reakció leállítására. Az abszorbanciát 490 nm-en mértük mikrolemezes spektrofotométeren (Bio-Rad). A végpont titereket a szigmoid 4PL (ahol x a log koncentráció) standard görbéből extrapoláltuk minden egyes mintára. Az észlelési határ (LOD) a SARS-CoV-2 előtti egyének plazmájával rögzített OD-jel átlagos + 3 SD-értéke. Minden számítást a GraphPad Prism szoftverrel (9.0-s verzió) végeztünk.
Verseny ELISA. Az RBD-reaktív mAb-k célepitóp-besorolásának meghatározásához kompetitív ELISA-vizsgálatokat végeztünk, ismert epitópkötési jellemzőkkel rendelkező egyéb mAb-k alkalmazásával, mint kompetíciós mAb-k. A versengő mAb-ket EZ-Link szulfo-NHS-biotin (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával 2 órán át szobahőmérsékleten biotinileztük. A biotinilezett monoklonális ellenanyagok feleslegét 7k molekulatömeg-cutoff (MWCO) Zeba spin sótalanító oszlopokkal (Thermo Fisher Scientific) távolítottuk el. A lemezeket 2 ug/ml RBD antigénnel vontuk be egy éjszakán át 4 °C-on. A lemezeket PBS–20% FBS-sel blokkoltuk 2 órán át szobahőmérsékleten, és a meghatározatlan osztály vagy szérum monoklonális ellenanyagainak 2-szeres hígítását adtuk hozzá, 20-tól kezdve. ug/ml mAb-t és 1:10 hígítású szérumot. Az antitest 2 órás szobahőmérsékleten végzett inkubálása után a biotinilezett kompetitív mAb-t a disszociációs állandójának (KD) kétszeresének megfelelő koncentrációban adtuk hozzá, és további 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk az előzőleg hozzáadott mAb-vel vagy szérummal együtt. A lemezeket mostuk és 100 μl HRP-konjugált streptavidinnel (Southern Biotech) 1:1 hígításban,000 1 órán át 37 fokon inkubáltuk. A lemezeket Super AquaBlue ELISA szubsztrátummal (eBioscience) fejlesztettük ki. A vizsgálatok normalizálása érdekében a versengő biotinilezett mAb-t egy mérőhelyhez adtuk, anélkül, hogy kontrollként versenyezne mAb vagy szérum. Az adatokat akkor vettük fel, amikor a kontroll lyuk abszorbanciája elérte az 1,0–1,5 OD-t. A monoklonális ellenanyagok közötti kompetíció százalékos arányát ezután úgy számítottuk ki, hogy a minta megfigyelt OD-jét elosztottuk a pozitív kontroll által elért OD-vel, ezt az értéket 1-ből kivontuk, majd 100-zal megszoroztuk. %-os gátlási koncentráció (IC50) értékek a GraphPad Prism szoftverrel (9.0 verzió). Az adatokat Log1P-re transzformáltuk, és a szérumhígítás IC50-értékének kölcsönös szérumhígítását reprezentáló grafikonon ábrázoltuk, amely 50%-os versengést képes elérni a kérdéses versenytárs mAb-vel. Minden mAb-t két párhuzamosban teszteltünk, mindegyik kísérletet kétszer egymástól függetlenül végeztük el, és 2 független kísérlet értékeit átlagoltuk.
Plakk vizsgálatok. A plakkvizsgálatokat SARS-CoV-2 variáns vírusokkal végezték Vero E6/TMPRSS2 sejteken (Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB)) (5. kiegészítő táblázat). A sejteket úgy tenyésztettük, hogy elérjék a 90%-os összefolyást, mielőtt tripszinezték volna, és 3 × 104 sejt/lyuk sűrűséggel 96-üreges lemezekre oltották volna. A következő napon a SARS-CoV-2 variáns 102 PFU-ját 2-szorosan hígított monoklonális ellenanyagokkal inkubáltuk 1 órán át. Az antitest-vírus keveréket Vero E6/TMPRSS2 sejtekkel inkubáltuk 3 napig 37 °C-on. A lemezeket 20%-os metanollal rögzítettük, majd kristályibolya oldattal megfestettük. A teljes gátlókoncentrációt (IC99) a log(inhibitor) és a normalizált válasz (változó meredekség) függvényében számítottuk ki GraphPad Prism (9.0-s verzió) segítségével. Minden mAb-t két párhuzamosban teszteltünk, és mindegyik kísérletet kétszer végeztük el. Fókuszcsökkentési semlegesítési teszt. Fókuszcsökkentési neutralizációs teszteket (FRNT) használtunk a semlegesítési aktivitás meghatározására a plakk vizsgálaton kívül további platformként. A szérum sorozathígításait 1:20 végkoncentrációtól kezdve 103 fókuszképző egységnyi vírussal kevertük lyukanként, és 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Egy összevont prepandémiás szérumminta szolgált kontrollként. Az antitest-vírus keveréket Vero E6/TMPRSS2 sejtekre (JCRB) oltottuk be 96-lyukú lemezeken, és 1 órán át 37 fokon inkubáltuk. Minden lyukba azonos térfogatú metil-cellulóz oldatot adtunk. A sejteket 16 órán át 37 fokon inkubáltuk, majd formalinnal fixáltuk. A formalin eltávolítása után a sejteket SARS-CoV-1/2 nukleoprotein [1C7C7 klón (Sigma-Aldrich)] elleni egér mAb-vel immunfestették, majd egy HRP-vel jelölt kecske anti-egér immunglobulinnal (Sigma- Aldrich; A8924). A fertőzött sejteket TrueBlue Substrate-vel (SeraCare Life Sciences) megfestettük, majd desztillált vízzel mostuk. Szárítás után a fókuszszámokat ImmunoSpot S6 Analyzer, ImmunoCapture szoftver és BioSpot szoftver (Cellular Technology) segítségével számszerűsítettük. Az IC50-et a log(inhibitor) és a normalizált válasz interpolált értékéből számítottuk ki, változó meredekségű (4 paraméteres) nemlineáris regressziót alkalmazva, amelyet a GraphPad Prism (9.0-s verzió) programban végeztünk.
Hivatkozások
1. Hou YJ et al. A SARS-CoV-2 D614G változat hatékony ex vivo replikációt és in vivo átvitelt mutat. Tudomány. 2020;370(6523):1464–1468.
2. Garcia-Beltran WF, et al. A SARS CoV-2 számos változata elkerüli a vakcina által kiváltott humorális immunitás semlegesítését. Sejt. 2021;184(9):2523.
3. Wall EC, et al. A SARS-CoV-2 VOC B.1.617.2 és B.1.351 elleni antitestaktivitás semlegesítése BNT162b2 vakcinációval. Gerely. 2021;397(10292):2331–2333.
4. Edara VV, et al. Fertőzés és vakcina által kiváltott neutralizáló antitest válaszok a SARS-CoV-2 B.1.617 variánsokra. N Engl J Med. 2021;385(7):664–666.
5. Zhou D és mtsai. Bizonyíték a SARS-CoV-2 B.1.351 variáns természetes és vakcina által kiváltott szérumból való kiszökésére. Sejt. 2021;184(9):2348–2361.
6. Weisblum Y, et al. Menekülés a SARS-CoV-2 tüskefehérje variánsai által semlegesítő antitestek elől. Elife. 2020;9:e61312.
7. Graham F. Napi eligazítás: Az Omicron koronavírus-változat éberségbe helyezi a tudósokat. Természet. 2021;.
8. Karim SSA, Karim QA. Omicron SARS-CoV-2 változat: új fejezet a COVID-19 világjárványban. Gerely. 2021;398(10317):2126–2128.
9. Carreño JM, et al. A lábadozó és vakcina szérum aktivitása a SARS-CoV-2 Omicron ellen. Természet. 2021;602(7898):682–688.
10. Wang Q és mtsai. A növekvő SARS-CoV-2 BQ és XBB alvariánsok riasztó antitestelkerülési tulajdonságai. Sejt. 2022;186(2):279–286.
11. VanBlargan LA, et al. Egy fertőző SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron vírus elkerüli a terápiás monoklonális antitestek általi semlegesítést. Nat Med. 2022;28(3):490–495.
12. Takashita E, et al. Az antitestek és vírusellenes gyógyszerek hatékonysága a Covid-19 Omicron Variant ellen. N Engl J Med. 2022;386(10):995–998.
13. Yuan M, et al. A SARS-CoV-2 receptorkötő domén felismerése ellenanyagok semlegesítésével. Biochem Biophys Res Commun. 2021;538:192–203.
14. Barnes CO, et al. A SARS-CoV{2}} semlegesítő antitest-struktúrák a terápiás stratégiák alapját képezik. Természet. 2020;588(7839):682–687.
15. Changrob S, et al. Az új SARS-CoV-2 aggodalomra okot adó variánsok keresztsemlegesítése olyan antitestek által, amelyek a tüske különböző epitópjait célozzák meg. Mbio. 2021;12(6):e0297521.
16. Guthmiller JJ, et al. A SARS-CoV-2 fertőzés súlyossága a tüske elleni kiváló humorális immunitáshoz kapcsolódik. Mbio. 2021;12(1):e02940–20.
17. Greaney AJ, et al. Mutációk feltérképezése a SARS-CoV-2 RBD-hez, amelyek elkerülik az antitestek különböző osztályai általi kötődést. Nat Commun. 2021;12(1):4196.
18. Liu H, Wilson IA. Védő, semlegesítő epitópok a SARS-CoV-ban-2. Immunol Rev. 2022;310(1):76–92.
19. Jette CA, et al. Széles körű keresztreaktivitás az arbovírusok között, amelyet a COVID-19 donorból származó neutralizáló antitestek egy része mutat. Cell Rep. 2021;36(13):109760.
20. Brouwer PJM, et al. A COVID{1}}-betegekből származó hatásos semlegesítő antitestek a sebezhetőség több célpontját is meghatározzák. Tudomány. 2020;369(6504):643–650.
21. Pinto D, et al. A SARS CoV-2 keresztneutralizálása humán monoklonális SARS-CoV antitesttel. Természet. 2020;583(7815):290–295.
22. Robbiani DF, et al. A SARS-CoV-2 elleni konvergens antitestválaszok lábadozó egyénekben. Természet. 2020;584(7821):437–442.
23. Yuan M, et al. A SARS-CoV-ra adott megosztott antitestválasz strukturális alapja-2. Tudomány. 2020;369(6507):1119–1123.
24. Dugan HL, et al. A SARS-CoV-2 fertőzés utáni B-sejt immundominancia profilozása feltárja a nem neutralizáló víruscélpontok ellenanyag-fejlődését. Immunitás. 2021;54(6):1290–1303.
25. Rogers TF, et al. Erőteljes SARS CoV-2 semlegesítő antitestek izolálása és betegség elleni védelem kisállatmodellben. Tudomány. 2020;369(6506):956–963.
26. Schmitz AJ, et al. A vakcina által kiváltott nyilvános antitest védelmet nyújt a SARS-CoV-2 és a kialakuló variánsok ellen. Immunitás. 2021;54(9):2159–2166.e6.
27. Shi R, et al. Egy humán neutralizáló antitest a SARS-CoV-2 receptorkötő helyét veszi célba. Természet. 2020;584(7819):120–124.
28. Cao Y és mtsai. Erőteljes neutralizáló antitestek a SARS-CoV-2 ellen, amelyeket a lábadozó betegek B-sejtjeinek nagy áteresztőképességű egysejtes szekvenálásával azonosítottak. Sejt. 2020;182(1):73–84.
29. Barnes CO, et al. A SARS-CoV-2-csúcshoz kötődő humán antitestek szerkezete feltárja az antitestek közös epitópjait és visszatérő jellemzőit. Sejt. 2020;182(4):828–842.
30. Corbett KS, et al. A SARS-CoV-2 mRNS-vakcina tervezése, amelyet a prototípus kórokozók felkészültsége tesz lehetővé. Természet. 2020;586(7830):567–571.
31. Amanat F, et al. Két prolin bevezetése és a többbázisú hasítási hely eltávolítása a rekombináns tüske-alapú SARS-CoV-2 vakcina nagyobb hatékonyságát eredményezte egérmodellben. mBio. 2021;12(2):e02648–20.
32. Sun W, et al. A Newcastle-betegség vírusa, amely a SARS-CoV-2 stabilizált tüskeproteinjét expresszálja, védő immunválaszt indukál. Nat Commun. 2021;12(1):6197.
33. Hsieh CL, et al. Prefúzióval stabilizált SARS-CoV-2 tüskék szerkezet alapú tervezése. Tudomány. 2020;369(6510):1501–1505.
34. Gobeil SM, et al. A SARS-CoV-2 Omicron tüske szerkezeti sokfélesége. Mol Cell. 2022;82(11):2050–2068.
35. Yuan M, et al. Erősen konzervált rejtélyes epitóp a SARS-CoV-2 és a SARS-CoV receptorkötő doménjében. Tudomány. 2020;368(6491):630–633.
36. Starr TN, et al. A SARS-CoV-2 RBD-mutációk teljes térképe, amelyek elkerülik az LY-CoV555 monoklonális antitestet és annak LY-CoV016-tal való koktélját. Cell Rep Med. 2021;2(4):100255.
37. Baum A et al. A REGN-COV2 antitestek megelőzik és kezelik a SARS-CoV-2 fertőzést rhesus makákókban és hörcsögökben. Tudomány. 2020;370(6520):1110–1115.
38. Wu NC, et al. Az IGHV3-53 antitestek alternatív kötési módja a SARS-CoV-2 receptorkötő doménhez. Cell Rep. 2020;33(3):108274.
39. Wu Y és mtsai. Egy nem versengő humán semlegesítő antitestpár blokkolja a COVID-19 vírus kötődését az ACE2 receptorához. Tudomány. 2020;368(6496):1274–1278.
40. Yuan M, et al. Az antigén-drift szerkezeti és funkcionális következményei a SARS-CoV-2 legújabb változataiban. Tudomány. 2021;373(6556):818–823.
41. Yan Q és mtsai. A csíravonal IGHV3-53-kódolt RBD-t célzó neutralizáló antitestek gyakran jelen vannak a COVID-19 betegek antitest-repertoárjában. Emerg mikrobák fertőznek. 2021;10(1):1097–1111.
42. Zhang Q és mtsai. Erőteljes és védelmet nyújtó IGHV3- 53/3-66 nyilvános antitestek és közös menekülési mutánsaik a SARS-CoV-2 csúcsán. Nat Commun. 2021;12(1):4210.
43. Wang Z és mtsai. mRNS vakcina által kiváltott antitestek SARS-CoV-2 és keringő variánsok ellen. Természet. 2021;592(7855):616–622.
44. Simon V, et al. PÁRIZS és SPARTA: a SARS-CoV Achilles-sarkának megtalálása-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.
45. Starr TN, et al. SARS-CoV-2 RBD antitestek, amelyek maximalizálják a terjedelmet és a kiszökéssel szembeni ellenállást. Természet. 2021;597(7874):97–102.
46. Walls AC, et al. A SARS-CoV-2 spike glikoprotein szerkezete, funkciója és antigenitása. Sejt. 2020;181(2):281–292.
47. Henderson R, et al. A SARS-CoV-2 spike glikoprotein konformáció szabályozása. Nat Struct Mol Biol. 2020;27(10):925–933.
48. Shrestha LB, et al. Széles körben semlegesítő antitestek a feltörekvő SARS-CoV-2 variánsok ellen. Front Immunol. 2021;12:752003.
49. Greaney AJ et al. Az mRNS{1}} vakcinációval kiváltott antitestek szélesebb körben kötődnek a receptorkötő doménhez, mint a SARS-CoV-2 fertőzésből származó antitestek. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.
50. Reincke SM, et al. A SARS-CoV-2 Béta-variáns fertőzése erős leszármazási specifikus és keresztreaktív antitesteket vált ki. Tudomány. 2022;375(6582):782–787.
51. Wrammert J, et al. A 2009-es pandémiás H1N1 influenzavírus-fertőzés elleni humán B-sejt-válaszban széles körben keresztreaktív antitestek dominálnak. J Exp Med. 2011;208(1):181–193.
52. Guthmiller JJ, et al. Első expozíció a pandémiás H1N1 vírus által indukált, széles körben semlegesítő antitestekkel, amelyek a hemagglutinin fej epitópjait célozzák. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.
53. Bajic G, et al. Az influenza antigénsebészet a szubdomináns, de széles körben védő vírusepitóp elleni immunválaszokra összpontosít. Sejtgazda mikroba. 2019;25(6):827–835.
54. Nachbagauer R, et al. A kiméra hemagglutinin alapú univerzális influenzavírus vakcina megközelítés széles és hosszan tartó immunitást indukál egy randomizált, placebo-kontrollos I. fázisú vizsgálatban. Nat Med. 2021;27(1):106–114.
55. Angeletti D, et al. Az immundominancia túlszárnyalása a szubdomináns, széles körben semlegesítő epitópok megcélzására. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.
56. Guthmiller JJ, et al. Hatékony módszer monoklonális antitestek előállítására humán B-sejtekből. Módszerek Mol Biol. 2019;1904:109–145.
57. Amanat F, et al. Szerológiai vizsgálat a SARS-CoV-2 szerokonverziójának kimutatására emberekben. Nat Med. 2020;26(7):1033–1036.
58. Stadlbauer D, et al. SARS-CoV-2 szerokonverzió emberben: részletes protokoll a szerológiai vizsgálathoz, az antigéntermeléshez és a teszt beállításához. Curr Protoc Microbiol. 2020;57(1):e100.
59. Torres JL, et al. Szerkezeti betekintés egy rendkívül erős pán-semlegesítő SARS-CoV-2 humán monoklonális antitestről. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119(20):e2120976119.
60. Suloway C, et al. Automatizált molekuláris mikroszkóp: az új Leginon rendszer. J Struct Biol. 2005;151(1):41–60.
61. Lander GC, et al. Appion: integrált, adatbázis-vezérelt csővezeték az EM képfeldolgozás megkönnyítésére. J Struct Biol. 2009;166(1):95–102.
62. Voss NR, et al. DoG Picker és TiltPicker: szoftvereszközök a részecskekiválasztás megkönnyítésére egyrészecskés elektronmikroszkópiában. J Struct Biol. 2009;166(2):205–213.
63. Pettersen EF, et al. UCSF Chimera{1}}egy vizualizációs rendszer felfedező kutatáshoz és elemzéshez. J Comput Chem. 2004;25(13):1605–1612.
64. Punjani A, et al. Nem egységes finomítás: az adaptív regularizáció javítja az egyrészecskés krio-EM rekonstrukciót. Nat Methods. 2020;17(12):1214–1221.
65. Zhang K. Gctf: Valós idejű CTF meghatározása és korrekciója. J Struct Biol. 2016;193(1):1–12.
66. Zivanov J, et al. Új eszközök az automatizált, nagy felbontású krio-EM szerkezetmeghatározáshoz a RELION-ban-3. Elife. 2018;7:e42166.
67. Casanal A et al. A coot jelenlegi fejlesztései az elektronkrio-mikroszkópos és kristálytani adatok makromolekuláris modelljéhez. Protein Sci. 2020;29(4):1069–1078.
68. Frenz B, et al. A glikoprotein szerkezetek hibáinak automatikus javítása rosetta segítségével. Szerkezet. 2019;27(1):134–139.
69. Klaholz BP. Atommodellek származtatása és finomítása a krisztallográfiában és a krio-EM-ben: a legújabb Phenix eszközök a szerkezetelemzés megkönnyítésére. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019; 75 (10. pont): 878–881.
70. Pettersen EF, et al. UCSF ChimeraX: Struktúra vizualizáció kutatók, oktatók és fejlesztők számára. Protein Sci. 2021;30(1):70–82.
71. Otwinowski Z, Minor W. Az oszcillációs módban gyűjtött röntgendiffrakciós adatok feldolgozása. Módszerek Enzymol. 1997;276:307–326.
72. McCoy AJ és mtsai. Phaser krisztallográfiai szoftver. J Appl Crystallogr. 2007;40(pt 4):658–674.
73. Qiang M, et al. A SARS CoV-2 elleni semlegesítő antitesteket egy évtizedekkel ezelőtt épített humán antitest-könyvtárból választották ki. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.
74. Emsley P, Cowtan K. Coot: Modell-építő eszközök molekuláris grafikához. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004;60 (12. pont, 1. pont): 2126–2132.
75. Adams PD, et al. PHENIX: átfogó Python-alapú rendszer makromolekuláris szerkezeti megoldásokhoz. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66 (2. pont): 213–221.
76. Montiel-Garcia D, et al. Epitope-Analyzer: Struktúra alapú webes eszköz a széles körben semlegesítő epitópok elemzésére. J Struct Biol. 2022;214(1):107839.