SLC37A2, a foszforral kapcsolatos molekula növekedése a simaizomsejtekben a meszesedett aormában

Vaszkuláris meszesedésfő forrásaszív-és érrendszeri betegségekkrónikus vesebetegségben szenvedő betegeknél.Hiperfoszfatémiafokozott intracelluláris foszfor beáramláshoz vezet, ami az oszteoblaszt-szerű sejtek számának növekedéséhez vezet a vaszkuláris simaizomsejtekben. A PiT-1 a foszfátot a vaszkuláris simaizomsejtekben szállítja. Az erek meszesedésének mechanizmusa azonban nem teljesen ismert. Ez a tanulmány a PiT-1-tól eltérő, foszforral rokon molekulák jelöltjeit vizsgálta. Feltételeztük, hogy a foszforral rokon molekulák aoldott anyag-hordozó(SLC) szupercsalád részt vesz a vaszkuláris meszesedésben. A DNS microarray analízis eredményeként az SLC37A2-re összpontosítottunk, és kimutattuk, hogy ezen sejtek mRNS expressziója megnövekedett a meszes aorta simaizomsejteken (AoSMC). Beszámoltak arról, hogy az SLC37A2 glükóz-6-foszfát/foszfát és foszfát/foszfát cserét egyaránt szállít. Az in vitro analízis azt mutatta, hogy az SLC37A2 expresszióját nem befolyásolta az AoSMC gyulladása. Az SLC37A2 mRNS és fehérje expressziója nőtt a meszesedett AoSMC-ben. Az in vivo elemzés azt mutatta, hogy az SLC37A2 mRNS expressziója az aortábankrónikus vesebetegségpatkányoknál korrelált az oszteogén marker génekkel. Ezenkívül az SLC37A2 expresszálódott a vaszkuláris meszesedés területénkrónikus vesebeteg patkányok. Ennek eredményeként megmutattuk, hogy az SLC37A2 egyike azon molekuláknak, amelyek növekedésével együtt növekszikvaszkuláris meszesedésin vitro és in vivo.

Kulcsszavak: SLC37A2,vaszkuláris meszesedés, aorta simaizom sejtjei,krónikus vesebetegség, hiperfoszfatémia

KATTINTSON IDE, HOGY TERMÉSZETES SZERVES CISTANCHE KIVONATOT SZEREZZE MEG 25% ECHINAKOZIDOT ÉS 9% AKTEOZIDOT A VESEMŰKÖDÉSÉRT

A Wecistanche támogató szolgáltatása – Kína legnagyobb ciszterna exportőre:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Vásároljon további specifikációkért:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Mivel a betegek számakrónikus vesebetegség(CKD) nő, a betegek számadialízist igényelis növekedni fog. A legtöbb halálozás az átesett betegeknél történikdialízismiattszív-és érrendszeri betegségekmint példáulszívelégtelenség, cerebrovaszkuláris rendellenességek, vagy szívinfarktus. (,2) Fő forrásaszív-és érrendszeri betegségeka méhen kívüli meszesedés,() olyan rendellenesség, amelyet a lágy szövetekben kalcium-foszfát kristályok képződése és lerakódása okoz. (4 6) Különféle tényezők, például a gyulladás. Az oxidatív stressz, valamint a plazma kalcium (Ca) és foszfor (P) szintjének emelkedése szerepet játszik az erek meszesedésének progressziójában. Ezen tényezők közül a hiperfoszfatémia a legerősebben az erek meszesedéséhez kapcsolódik. (7.8) A hiperfoszfatémiát a P túlzott bevitele okozza csökkent vesefunkció mellett. Ezért a dialízis alatt álló betegeknek korlátozniuk kell a P bevitelét. (79-12) Azonban arról számoltak be, hogyvaszkuláris meszesedésmár előrehalad a dialízis megkezdésekor; korai stádiumú CKD-ben szenvedő betegeknél is megfigyelték, amikor a hyperphosphataemia nem nyilvánvaló. (3) Következésképpen fontos megelőzni a vaszkuláris meszesedést a korai stádiumú CKD-ben szenvedő betegeknél az életkilátások javítása érdekében.

ami a P fokozott beáramlásához vezet a vaszkuláris simaizomsejtekbe (VSMC). A P beáramlás a PiT{0}}-on keresztül történik, amely a VSMC sejtmembrán felületén található transzporter. A PiT- az oldott-hordozó (SLC) szupercsalád tagja, amely magában foglalja az SLC20A1 által kódolt nátrium-foszfát transzportert.04 A PiT- foszfátot szállít a Na-függő sejtmembránokon, majd a megnövekedett p-szintek miatt a mátrix mineralizációját. A P szint emelkedik, a VSMC elkezd kifejezni osteogén transzkripciós faktorokat, mint például a runt-kapcsolódó transzkripciós faktor 2(Runx2)(16) Ezt a hatást az oszteoblaszt-specifikus gének fokozott expressziója követi, mint például az osteopontin és az osteocalcin. Ezenkívül csökkentette a simaizom-specifikus fehérjék expresszióját. mint például a simaizomfehérje 22-0 (SM22-0), előfordul. Ennek eredményeként a VSMC oszteoblasztszerű sejtekké alakul át. (1718) A legújabb klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy a vér kalciumszintje. a protein részecskék (CPP), amelyek a kalcium-foszfát kolloid részecskéket képviselik, a vesefunkció csökkenésével növekednek. (19-21)Továbbá összefüggéseket jelentettek a vér CPP- és P-szintjével.2o2i) Lehetséges, hogy a CpP kiválthatja a vaszkuláris meszesedés progresszióját.22-24)

Azonban vaszkuláris meszesedést figyeltek meg olyan korai stádiumú CKD-ben szenvedő betegeknél, akiknek normális plazma P-szintje volt. (13) Ezenkívül.PiT-1 mRNS minden szövetben mindenütt expresszálódik. Így egy másik molekula elsősorban a vaszkuláris meszesedés területén hathat. Vannak olyan jelentések, hogygyulladáselősegíti az erek meszesedését. Gyulladásos faktorok, mint például az interleukin (IL)-1B, IL-6 és a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-a) indukálták a VSMC oszteoblasztszerű sejtekké történő differenciálódását (2s26) A TNF-a vaszkuláris meszesedést indukál az oszteoblasztok differenciálódásában szerepet játszó cAMP útvonalon keresztül.2728) Az IL-6 a VSMC vaszkuláris meszesedéséhez vezető különféle utakat szabályozza2-31) Továbbá. Az IllB, IL-6 és a TNF-a szintén a magas p-szintek által kiváltott fokozott vaszkuláris meszesedéssel kapcsolatos tényezők.3233) Azonban. A jelenlegi adatok nem magyarázzák meg teljesen a vaszkuláris mechanizmust

ezek a tényezők által kiváltott meszesedés. Feltételeztük, hogy lehetnek más, P-vel rokon molekulák, például az SLC szupercsaládba tartozók, amelyek részt vesznek az erek meszesedésében. Az SLC szupercsalád membránfehérjéire összpontosítottunk, és a PiT-1-tól eltérő potenciális P-rokon molekulákat vizsgáltunk az érmeszesedésben való részvétel szempontjából. Továbbá megvizsgáltuk a jelölt molekulák és a vaszkuláris meszesedés közötti kapcsolatot videóban és in vivo.

Anyagok és metódusok

Sejttenyésztés. A normál humanaorticsmoothmuscle sejteket (AoSMC) a Lonzától (Basel, Svájc) szereztük be. Az AoSMC-t a gyártó utasításai szerint tenyésztettük. Az AoSMC-t növesztő tápközegben tartottuk (simaizomsejt-bázis táptalaj, kiegészítve 5% magzati borjúszérummal (FBS), epidermális növekedési faktorral, inzulinnal, fibroblaszt növekedési faktor-B-vel és gentamicin/amfotericin-B-vel). A médiát minden második napon cserélték. Az AoSMC-ket párásított 5%-os CO inkubátorban tenyésztettük 37 fokon, és addig tartottuk, amíg el nem értek egybefolyást, majd kísérletekben alkalmaztuk.

Meszesedett AoSMC. Az AoSMC meszesedését a korábban leírtak szerint indukáltuk.435) Az AOSMC-ket 15% FBS-sel és penicillin-sztreptomicinnel kiegészített Dulbecco által módosított Eagle táptalajban tenyésztettük, és 2,6 mM P-vel tenyésztettük 3, 6, 9, 12 és 14 napig. A P-koncentrációt P-puffer-NaH-val, PO/Na-val és HPO-val állítottuk be. pH 7,2). Más AoSMC-ket nem tenyésztettünk 2,6 mM P-vel.

DNS microarray. A 2,6 mM P-vel tenyésztett és nem tenyésztett AoSMC minták teljes RNS-ét használtuk. Az 5.0 ug össz-RNS-t DNS microarray segítségével elemeztük (Agilent Technologies, Tokió, Japán). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray-t körülbelül 26,000 gén vizsgálatára használtunk. Az arányt úgy számítottuk ki, hogy a 2,6 mM 12 napig tenyésztett AoSMC expressziós szintjét elosztottuk a 2,6 mM P-vel nem tenyésztett AoSMC expressziós szintjével.

DNS microarray

A 2,6 mM P-vel tenyésztett és nem tenyésztett AoSMC minták teljes RNS-ét használtuk. Az 5.0 ug össz-RNS-t DNS microarray segítségével elemeztük (Agilent Technologies, Tokió, Japán). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray-t körülbelül 26,000 gén vizsgálatára használtunk. Az arányt úgy számítottuk ki, hogy a 2,6 mM 12 napig tenyésztett AoSMC expressziós szintjét elosztottuk a 2,6 mM P-vel nem tenyésztett AoSMC expressziós szintjével. Az SLC37A2 expressziója érgyulladásban. Az AoSMC-ben gyulladásos válasz indukálására a sejteket tápközeggel tenyésztettük, amíg el nem értek egybefolyást, majd 1 ugmL lipopoliszacharidokkal (LPS) (LPS az escherichia coli O111:B4-ből; Sigma, St. Louis, MO) kezeltük 24 és 72 percig anélkül 2,6 mM P. Más AoSMC-ket nem tenyésztettünk valós idejű polimeráz láncreakció (PCR) analízissel. A teljes RNS-t a 24 és 72 órán át LPS-sel kezelt AoSMC-ből és az LPS-sel nem kezelt sejtekből extraháltuk. A SYBR zöld alapú kvantitatív valós idejű PCR-t szintetizált cDNS és minden egyes célgénhez megfelelő primerkészlet felhasználásával aStepOnePlus valós idejű PCR rendszerrel (Applied Biosystems, FosterCity, CA) végeztük. A primer szekvenciák a következők voltak: humán IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' és 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; humán SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' és 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- és 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3}.IL-6 és SLC37A2 mRNS expressziós szinteket számítottunk ki. SLCcal3-ban PDA2A GA-val történő normalizálás után) Az AoSMC-t a 2,6 mM P-vel nem tenyésztett AoSMC-ből és a 2,6 mM P-vel tenyésztett AoSMC sejteket 3, 6, 9, 12 és 14 napig extraháltuk. A valós idejű PCR-t a szintetizált cDNS felhasználásával végeztük. A primer szekvenciák a következők voltak: a következő: humán Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' és 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3 A Runx2 és SLC37A2 mRNS expressziós szintjeit APPH-val történt normalizálás után számítottuk ki.

Western blot elemzés.

A teljes fehérjét a valós idejű PCR analízishez használt körülmények között tenyésztett AoSMC mintákból gyűjtöttük össze. Ezeket a mintákat 5% NP-40-mal és 1% proteázgátló koktéllal kiegészített Tris-pufferolt sóoldattal (pH 75) lizáltuk. A fehérjekoncentrációt a BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific, Waltham, MA) segítségével mértük. és a koncentrációt Western blottal állítottuk be, 10 ug fehérjét választottunk el 10%-os poliakrilamid gélen nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel. A membránt elsődleges antitestként SLC37A2 antitesttel (Novus Biologicals, Centennial, CO) vagy GAPDH antitesttel (GeneTex, Irvine, CA) kezeltük, másodlagos antitestként Rabbit lgG Torma peroxidázzal konjugált antitesttel (R&D Systems, Minneapolis, MN) inkubáltuk. és az Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Anglia) és a lumineszcens képelemző (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokió, Japán) segítségével vizualizálták. A sávot lmagel segítségével határoztuk meg.

Kísérleti

Minden vizsgálati protokollt jóváhagyott a Hyogo Egyetem Etikai Bizottsága, a Humántudományi és Környezetvédelmi Kar. A 12 hetes hím Sprague-Dawley patkányokat a Japan SLC-től (Shizuoka, Japán) vásároltuk. A patkányokat 12-világos, 12-órás sötét ciklusban tartottuk (09:00-21:00), és szabad hozzáférést biztosítottak táplálékhoz és extra tiszta vízhez.

A kísérleti diéták közé tartozik a kontroll P diéta (1.0% P, 0.6Ca, 20% fehérje), az adenin diéta (0,75% adenin , 1.0% P, 0,6%Ca, 2,5% fehérje), alacsony P (LP) diéta (0,2% P,0 0,6% Ca, 10% fehérje) és egy magas P (HP) diéta (1,0% P, 0,6% Ca, 10% fehérje) az AIN93-G diétán (keleti) Élesztő, Tokió, Japán) kazeinnel fehérjeforrásként.3637) Az alacsony fehérjetartalmú étrendről beszámoltak arról, hogy az adenin által kiváltott veseelégtelenségben szenvedő patkányokban elősegíti a vaszkuláris meszesedést, ezért fehérjekorlátozást hajtottak végre.3738) A csoportosítás előtt az összes patkány (n)=23) standard MF diétával (keleti élesztővel) etették egy hétig az akklimatizálódás érdekében. 13 hetes korukban a patkányokat 2 csoportra osztottuk: a kontrollcsoportba (n=5) és az adenin-indukált CKD csoportba (n=18). A kontrollcsoport 6 hétig kapta a kontroll P diétát. . Az adenin-indukált CKD csoport körülbelül 3 hétig kapott adenin diétát, majd további két alcsoportra osztották: a CKD-LP csoportra (n=8) vagy a CKDHP csoportra (n=10). A CKD-LP csoport és a CKD-HP csoport patkányai 3 hétig LP diétát, illetve HP diétát kaptak, a kísérleti időszakban a táplálékfelvételt naponta regisztráltuk. Az adenin diéta során vérmintákat vettek a farokvénából délelőtt 10:00 és délelőtt 11:00 között hetente egyszer a második hétig, majd ezt követően kétnaponta egyszer a plazmaszintek monitorozása céljából. Az LP diéta vagy a HP diéta során hetente egyszer vérmintát vettek. Vizeletmintákat vettünk, és hetente egyszer rögzítettük a vizelet mennyiségét. A patkányokat érzéstelenítővel leöltük izoflurán (Wako Pure Chemical Industries, Osaka Japán) és laparotomiák segítségével. Az inferior vena cava és a thoracoabdominalis aortából vett vérmintákat elemzés céljából.

SLC37A2 expresszió az aortán.

Az összegyűjtött thoracoabdominalis aorta körülbelül egyharmadát a meszesedés vizualizálására és az immunfestés elvégzésére használták. Az aortát paraffinba ágyaztuk, és 4-um metszeteket vágtunk. A metszeteket Von Kossa Method for Calcium Kit (Polysciences. Warrington, PA) segítségével festettük meg a gyártó utasításai szerint. az immunfestési analízist sorozatmetszetekkel végeztük. A metszeteket SLC37A2 antitesttel inkubáltuk egy éjszakán át 4 fokon, majd Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokió, Japán) 30 percig szobahőmérsékleten kezeltük. Ezt követően a metszeteket DAB-szubsztrát kittel (Nichirei) kezeltük.

A teljes RNS-t a fagyasztott thoracoabdominalis aorta többi részéből extraháltuk. Valós idejű PCR-t hajtottunk végre a szintetizált cDNS felhasználásával. A primer szekvenciák a következők voltak: patkány osteo-pontin, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' és 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' és; patkány SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' és 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Az oszteopontin mRNS és SLC37A2 mRNS expressziós szintjeit GAPDH-val történt normalizálás után számítottuk ki.

Statisztikai analízis.

Az adatokat átlag + SE formában adjuk meg. A csoportok közötti különbségeket t-próbával elemeztük. A foszfáttal indukált meszesített AoSMC kísérletekben a különbségeket egyirányú varianciaanalízissel, majd Dunnett módszerével elemeztük. A CKD modellkísérletekben a különbségeket K ruskal-Wallis teszttel, majd Steel-Dwass módszerrel elemeztük. A korrelációs együtthatókat (rs) a Spearman-féle korrelációs együttható rang teszttel határoztuk meg. Minden teszthez. kétirányú p értékek<0.05 were considered statistically significant.