A mézelő méhek szociális immunitása: A méhpempő, mint eszköz a bakteriális kórokozó-töredékek fészektársak közötti átvitelében

ABSZTRAKT

A szociális immunitás olyan viselkedési és fiziológiai tulajdonságok összessége, amelyek lehetővé teszik a kolónia tagjai számára, hogy megvédjék egymást a kórokozóktól, és magában foglalja az immunológiai vegyületek orális átvitelét a fészektársak között. A mézelő méhekben a méhpempő a dolgozók egy csoportja által termelt mirigyváladék, amelyet a királynőnek és a fiatal lárváknak etetnek, és amely számos antimikrobiális vegyületet tartalmaz. A társas immunitás egy rokon formája, a transzgenerációs immun-priming (TGIP) lehetővé teszi a királynők számára, hogy kórokozó-fragmenseket vigyenek át fejlődő petékbe, ahol azokat az embrió immunrendszere felismeri, és nagyobb kórokozó-rezisztenciát vált ki az új utódokban. Ezeket a kórokozó-fragmenseket a vitellogenin (Vg), a tojássárgája prekurzor fehérje szállítja, amelyet a nővérek is használnak méhpempő szintetizálására.

Ezért a méhpempő eszközként szolgálhat a kórokozók töredékeinek a dolgozóktól a többi fészektárshoz szállítására. Ennek vizsgálatára nemrégiben kimutattuk, hogy a lenyelt baktériumok a nővérek kocsonyát termelő mirigyeibe szállítják, és itt megmutatjuk, hogy a kórokozó fragmentumok beépülnek a méhpempőbe. Ezenkívül megmutatjuk, hogy a kórokozó sejtek fogyasztása magasabb szinteket indukál a méhpempőben található antimikrobiális peptid, a defenzin-1 mennyiségében.

Az immunvegyületek orális adagolása jelentősen befolyásolhatja az emberi immunrendszer működését. Ezek a vegyületek javíthatják az immunitást azáltal, hogy erősítik vagy modulálják a szervezet immunrendszerét. Az immunitás a szervezet betegségekkel szembeni ellenállása, beleértve a védekező mechanizmusokat, például az immunsejteket és az antitesteket. Az orális immunizáló vegyületek aktiválhatják az immunsejtek aktivitását, fokozhatják az antitestek termelését a szervezetben, valamint gátolhatják a kórokozó baktériumok és vírusok szaporodását, ezáltal javítva az immunitást és csökkentve a fertőzésveszélyt. Ezenkívül az immunvegyületek orális adagolása csökkentheti a gyulladást, valamint a betegséggel járó fájdalmat és kényelmetlenséget, ezáltal javítva az életminőséget. Így szoros kapcsolat van az immunvegyületek orális adagolása és az immunitás között. Ebből láthatjuk, hogy immunrendszerünk javítására kell figyelnünk. A Cistanche fokozhatja az immunitást. A húsban található poliszacharidok szabályozhatják az emberi immunrendszer immunválaszát, javíthatják az immunsejtek stressz-képességét, és fokozhatják az immunsejtek sterilizáló hatását.

Kattintson a Cistanche egészségügyi előnyei

KULCSSZAVAK:

Mézelő méhek, Szociális immunitás, Méhpempő, Amerikai költés.

BEVEZETÉS

A méhpempő régóta lenyűgözi a biológusokat, mivel kulcsszerepet játszik a mézelő méhek kasztfejlődésében. Ezt a mirigyváladékot a dolgozók kasztjának ápolónőkként ismert alcsoportja állítja elő, és etetik a királynőt fejlődése és felnőtt élete során, míg a munkásra szánt lárvákat életük első 3 napjában méhpempővel etetik, mielőtt átváltanának egy ápolónőre. pollen alapú étrend (Johansson, 1955; Haydak, 1970; Townsend és Lucas, 1940). Az analitikai kémiai módszerek fejlődésével a tudósok elkezdték tanulmányozni a méhpempő táplálkozási összetevőit, és azt találták, hogy számos kórokozó-ölő vegyületet tartalmaz, amelyek megvédik a királynőt és a fiatal lárvákat a betegségektől (Blum et al., 1959; Fontana et al., 2004; Fujiwara és munkatársai, 1990; Okamoto és mtsai, 2003; Romanelli és mtsai, 2011; Sugiyama és mtsai, 2012; Vucevic és mtsai, 2007). A kórokozó-ellenes vegyületek fészektársak közötti átvitele a szociális immunitás egy formája, olyan viselkedési és fiziológiai tulajdonságok összessége, amelyek segítenek a telep tagjainak megvédeni egymást a kórokozóktól (Cremer et al., 2007).

A szociális immunitás egy rokon formája, a transzgenerációs immun-priming (TGIP) szintén nagy figyelmet kapott az elmúlt években (Sadd és mtsai, 2005; Moret, 2006; Freitak és mtsai, 2009, 2014; Zanchi et al., 2011; López és mtsai, 2014; Knorr és mtsai, 2015; Salmela et al., 2015). Itt a kórokozó támadást túlélő nőstény rovarok átvihetik a kórokozó-fragmenseket a petékbe, és betegségekkel szemben ellenállóbb utódokat hozhatnak létre. Ezek a kórokozó-fragmensek kórokozóhoz kapcsolódó molekuláris mintázatokat, a mikrobiális sejtek sejtfalában található szerkezeti komponenseket tartalmaznak, amelyek immunválaszt váltanak ki a fejlődő utódokban. Míg a TGIP-et mézelő méhekben is kimutatták, a vizsgálatok a királynőknek oltóanyaggal való befecskendezésén alapultak, és ez problémát jelentett: hogyan lehet egy királynőt természetes körülmények között beoltani kórokozókkal, mivel kizárólag méhpempővel táplálkozik, és nincs lehetősége potenciálisan fogyasztani. szennyezett nektárt és pollent, amit a takarmányozói gyűjtöttek össze? Csoportunk egyik jelentős felfedezése egy új lehetséges útra utalt. A királynők a kórokozó-fragmenseket vitellogenin (Vg) segítségével (Salmela és mtsai, 2015), egy tojássárgája prekurzor fehérje segítségével juttatják át tojásaikba, amelyet az ápolónők is használnak méhpempő szintézisére (Amdam et al., 2003).

Így a mézelő méhek a méhpempőt hordozóként használhatják a kórokozó-fragmensek dajkálók és királynők közötti átviteléhez, a lárvákat pedig egy kolóniaszintű immunrendszer részeként. Ennek az útnak a felderítésének első lépéseként megmutattuk, hogy az ápolónők, akik lenyelték a baktériumokat, képesek voltak átvinni azt a középbélből a zselétermelő mirigyeikbe, és hogy a vg expresszió leállítása akadályozta ezt a folyamatot (Harwood et al., 2019). Most azt igyekszünk meghatározni, hogy a bakteriális kórokozókat lenyelő ápolónők be tudják-e építeni azokat a méhpempőjükbe, és hogy a kórokozók lenyelése növeli-e a méhpempő egyéb antimikrobiális komponenseinek koncentrációját is.

A mézelő méhek immunpályáinak megértése nemcsak a szervezetbiológia, hanem az emberi élelmezésbiztonság szempontjából is fontos. A mézelő méhek a legfontosabb rovarbeporzók a mezőgazdaságban, évente legalább 15 milliárd dollárral növelik a termés értékét csak az Egyesült Államokban (USDA sajtóközlemény, 2020. április 6.).

A nagy éves kolóniaveszteség azonban továbbra is sújtja az amerikai méhészeket (Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma, 2019), számos stressztényező, például a peszticid-expozíció és a rossz táplálkozás miatt. De a méhkártevők és kórokozók is jelentős mértékben hozzájárulnak, és gyakran kimutathatóak az elpusztult kolóniákban (Amerikai Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma, 2019). Ezek a kórokozók számos baktériumot, gombát és vírust tartalmaznak, amelyek közül sok nem rendelkezik gyógyszeres kezeléssel. Annak megértése, hogy a szociális immunitás miként közvetíti a kórokozók fertőzéseit, átfogóbb kezelési rendeket tesz lehetővé, és segít csökkenteni a telepek elvesztését okozó betegségeket.

Fontos megérteni, hogyan alakultak ki a szociális immunitás mechanizmusai 2020. június 12-én; 2021. február 17-én elfogadva kiegészítik az egyes méhekben jelenlévő immunológiai védekezést.

A mézelő méhek több védelmi réteggel rendelkeznek, kezdve a strukturális korlátokkal, például egy vízzáró kutikulával, amelyek blokkolják a kórokozók bejutását (Moret és Moreau, 2012). A lenyelt kórokozók a középbélben, az emésztésért és felszívódásért felelős szervben kötnek ki, és itt egy másik fizikai gáttal, a peritrofikus mátrixszal találkoznak (Brandt et al., 1978; Lehane, 1997; Hegedus és mtsai, 2009). Ez egy kitinszerű anyag, amely a bélközéphámsejtekből választódik ki, és amely szitaként működik, hogy megakadályozza a nagy részecskék, például a kórokozó sejtek felszívódását.

Ha a kórokozók áttörik ezeket a fizikai korlátokat, a kórokozó-mintázat-felismerő receptorok észlelik őket, amelyek számos sejtes és humorális immunválaszt aktiválnak. A sejtes védekezés közé tartozhat a hemociták fagocitózisa (Evans és Spivak, 2010; Marringa és mtsai, 2014; Lavine és Strand, 2002), míg a humorális válaszok közé tartozhat a melanin termelése az idegen részecskék beágyazásához (González-Santoyo és Cóguirdolar 2012), valamint a kórokozókat közvetlenül elpusztító antimikrobiális peptidek (AMP) előállítása (Bulet és Stöcklin, 2005; Bulet és mtsai, 1999; Evans és mtsai, 2006). A melanizációs válasz akkor indukálódik, amikor a méhméreg szerinproteáz (Bi-VSP) aktiválja a fenoloxidáz kaszkádot, amely melanintermeléshez vezet (Choo et al., 2010). Az AMP-k, például a lizozim és a defenzin{11}} a Toll vagy az immunhiányos (IMD) útvonalak aktiválását követően indukálódnak (De Gregorio et al., 2002).

A robusztus kórokozó-ellenes arzenál ellenére a mézelő méhek kevesebb immunrendszerrel kapcsolatos génnel rendelkeznek, mint a magányos méhfajok (Evans et al., 2006; Claudianos és mtsai, 2006), nagyrészt a szociális immunitás fejlődésének köszönhetően. A méhpempő számos, az imént tárgyalt enzimet és peptidet tartalmaz, beleértve a Bi-VSP-t, a lizozimot és a defenzint-1, valamint a glükóz-oxidázt, amely hidrogén-peroxidot termel, amely a kórokozókat is elpusztítja (Fontana et al., 2004; Fujiwara és munkatársai, 1990; Romanelli és mtsai, 2011; Furusawa és mtsai, 2008; Han és mtsai, 2011; Fujita és mtsai, 2012). Ez a dúsított táplálék különösen fontos a kolónia legsebezhetőbb tagjai, a fiatal lárvák számára, akiknek immunvédelme még csak fejlődik. Például a fiatal lárvákban alacsonyabb a pro-fenoloxidáz (Chan és Foster, 2008; Chan és mtsai, 2009) (fontos a melanizációs kaszkádban) és az AMP-szintje (Chan és Foster, 2008), és a még érő középbélük és a peritróf mátrix sérülékenyen hagyja a bélközéphámjukat (Yue et al., 2008; Garcia-Gonzalez és Genersch, 2013; Riessberger-Gallé és mtsai, 2016).

Ennek eredményeként a lárvák érzékenyek bizonyos betegségekre, amelyek a felnőttek számára meglehetősen ártalmatlanok. Ide tartozik az amerikai tenyésztenyészet, amelyet a spóraképző Gram-pozitív Paenibacillus larvae baktérium okoz (Genersch, 2010; Hansen és Brødsgaard, 1999). Az amerikai tenyésztési fertőzés nemcsak a kolóniák számára halálos, hanem a méhészek számára is költséges, mivel a spórák ellenállóak és évekig életképesek maradnak, ami azt jelenti, hogy a méhészek kénytelenek megsemmisíteni a fertőzött kaptárakat. Így a lárvák hasznot húznak a kórokozókat elpusztító vegyületekkel vagy olyan kórokozó részecskékkel kiegészített táplálékból, amelyek immunerősítést válthatnak ki.

Ebben a tanulmányban kettős célunk volt: egyrészt annak megállapítása, hogy az amerikai tenyésztenyésztő vegetatív sejteket fogyasztó ápolónők képesek-e kórokozó-fragmenseket beépíteni a méhpempőjükbe, másrészt annak megállapítása, hogy ez a méhpempőben található immunfehérjék magasabb szintjét indukálja-e. Ennek érdekében a nővéreket fluoreszcensen jelölt és hővel elölt P. lárva sejtekkel etettük, majd megvizsgáltuk az általuk előállított méhpempőt. Fluoreszcens mikroszkóppal igazoltuk a baktériumsejt-fragmensek jelenlétét a méhpempőben, és tömegspektrometriával hasonlítottuk össze a fertőzött és kontroll telepekről származó méhpempő proteomikus profilját. Különösen azt a hipotézist teszteltük, hogy a fertőzött kolóniákból származó méhpempő magasabb a glükóz-oxidáz, Bi-VSP, lizozim és defenzin immunfehérjékben-1.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Patogén baktériumok tenyésztése

A P. lárvák vegetatív sejtjeit a Göteburgi Egyetem tenyészetgyűjteményéből szereztük be, és normál baktériumtenyésztési körülmények között tenyésztettük. Röviden, a sejteket MYPG táptalajban szuszpendáltuk, és egy éjszakán át 37 °C-on tartottuk rázóinkubátorban, majd MYPG agarra szélesztettük, és 1 hétig 37 °C-on inkubáltuk. Ezt követően a vegetatív sejteket összegyűjtöttük, és 1x foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) szuszpendáltuk, majd autoklávban hővel megöltük. A kapott életképtelen baktériumsejteket ezután fluoreszcens festékkel konjugáltuk pHrodo™ Red Phagocytosis Particle Labeling Kit (Invitrogen #a10026) segítségével a gyártó utasításait követve. A festés után a P. larvae sejteket 1×PBS-ben szuszpendáltuk 10 mg ml-1 koncentrációig, és 4 fokon tároltuk felhasználásig.

Méhek és takarmányozási kísérlet

A természetesen párosított európai mézelő méheket, az Apis mellifera Linnaeus 1758-at szabvány Langstroth kaptárdobozokban tartották a Helsinki Egyetemen, a finnországi Vikki campuson. Ezek a szabványos Langstroth-kaptárak donorként szolgáltak a mini párzási kaptárokban elhelyezett kisebb királynő nélküli kolóniák számára. E kisebb királynő nélküli telepek létrehozásához a 12 cm × 12 cm méretű 1-napos lárvákat tartalmazó fiasítási fésűt kimetszettünk a donorkaptárból, és egy mini párosító Nuc dobozba helyeztük át. Körülbelül 100-200 ápolónőt is átvittek ugyanabból a donorkaptárból, és a mini-párzó Nuc dobozba helyezték őket. Az ápolónőknek azokat az egyedeket azonosították, akik bejutottak a tenyészsejtekbe, és lárvákat tápláltak a donorkaptárban.

Összesen N{{0}} kis királynő nélküli kolónia jött létre, mindegyik külön donorkaptárból. A kolóniákat királynővé tették, hogy az ápolónőket több méhpempő előállítására ösztönözzék, hogy új királynőt hozzanak létre (Sahinler és Kaftanoglu, 1997). Az ápolónőket és a fiatal lárvákat 3 napra a mini párzó Nuc dobozokba zártuk, és 30 százalékos szacharózoldattal látták el a mennyezetre felfüggesztett fecskendős adagolóban. Az N=3 telepek kontroll étrendet kaptak, míg az N=3 szacharózukhoz fluoreszcensen jelölt P. lárvákat adtak 0,6 mg ml-1 végső kórokozó koncentrációig. A kontroll és a kórokozókkal teli étrendet naponta friss élelmiszerrel pótoltuk. A 3 nap elteltével az újonnan lerakódott méhpempőt gyűjtöttük ki az egyes telepek dolgozó ivadékfésűjéből, és két munkafolyamat egyikére osztottuk: fluoreszcens mikroszkópos vagy proteomikai analízis.

Fluoreszcens mikroszkóp

A méhpempőt mindegyik fésűből 200 µl-es reakciócsövekbe vittük át. Az egyes kaptárokból nyert zselé térfogatának becsléséhez 30 reakciócsövet töltöttünk meg 1 és 30 µl közötti növekvő térfogatú vízzel, és két megfigyelőnk volt egymástól függetlenül, és vakon értékelték, hogy melyik víztérfogat felel meg a méhpempő térfogatának. Mind a 6 esetben minden méhpempő minta azonos térfogatbecslést kapott a két megfigyelőtől. Ezután minden méhpempőmintát 1x PBS-sel (pH 7,4) hígítottunk 10 térfogatszázalékos végső koncentrációra, és vortexeltük. A mintákat ezután hemocitométerre vittük, és Leica DM6000 fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. A hemocitométeren a látómező egyenletesen 9 részre oszlik, összesen 5 metszeten végeztünk megfigyelést: a 4 sarokszelvényen és a középső szakaszon. Ez lehetővé tette a fluoreszcens részecskék koncentrációjának kiszámítását mikroliter méhpempőre (C) a következő képlet segítségével:

ahol P az egyes mintákban megfigyelt pozitív fluoreszcens részecskék száma, S a hemocitométeren megfigyelt négyzetek teljes száma (N{0}}), V a hemocitométeren megfigyelt egyes négyzetek térfogata (0,1 µl), D pedig a méhpempő hígítási tényezője (10-szeres hígítás). Minden mintát azonos mikroszkóp-beállítások mellett figyeltünk meg.

A kamera {{0}}bites felbontásra lett beállítva (Waters, 2009), ami 0 és 65 535 közötti fényerő-intenzitást eredményez. A pozitív fluoreszcencia jelek azonosításához kórokozó-étrend-mintáinkban először meg kellett határoznunk a háttérzaj alapszintjét, amely felett meg tudtuk határozni, hogy a jel valódi fluoreszcencia-e vagy csupán műtermék. Ehhez megvizsgáltuk az intenzitásértékeket a kontroll-diéta mintáink minden egyes képén, és mindegyiknél kivontuk a minimális intenzitásértéket a maximális intenzitásértékből, hogy megkapjuk a háttérzaj tartományát (Waters, 2009). Ezután összehasonlítottuk az összes kontroll-diéta mintaképenket, hogy megkapjuk a háttérzaj tartományának átlagát és szórását. Ezt követően a kórokozó-diéta mintáinkban megfigyelt jeleket a háttérzaj feletti pozitív fluoreszcencia jelnek tekintettük, ha legalább 3 szórással (P kisebb vagy egyenlő, mint 0,01) az átlagos háttérintenzitás-tartomány felett volt. Az átlagos (sd) háttérintenzitás tartomány 329±27 volt

További pozitív és negatív kontrollok

Annak igazolására, hogy a jelölt baktériumok képesek fluoreszkálni a méhpempőben, több európai és észak-amerikai régióból (Ausztria, Norvégia, Arizona és Illinois, USA) gyűjtöttünk méhpempőmintákat, amelyeket 10 százalékra hígítottunk PBS-pufferben. és jelölt baktériumokat (1 térfogatszázalék) közvetlenül a mintákhoz adtunk. PBS puffert használtunk standard pH 7,4-en (a fentiek szerint), vagy csökkentett pH-n 4.0, amely megfelel a méhpempő savasságának annak meghatározására, hogy a környezet savassága befolyásolja-e a fluoreszcencia szintjét, ahogy azt a címkézőkészlet gyártója. Ezenkívül egy további negatív kontrollt is végeztünk (pH 4,0 PBS, nincs jelölt baktérium), hogy megerősítsük, hogy a fluoreszcencia megfigyelései nem mikroszkópos műtermékek vagy az anyagkomponensek autofluoreszcenciája miatt következtek be. Azt találtuk, hogy a méhpempő minták minden földrajzi régióból fluoreszcenciát mutattak, amikor jelölt baktériumokat adtak hozzá, függetlenül a használt puffer pH-jától (S1. ábra). Ezt a mikroszkópos munkát Zeiss AxioZoom V16-on végeztük, Axiocam HRm monokróm kamerával.

Minta előkészítés proteomikai elemzéshez

A méhpempő mintákat 150 µl 8 mol l-1 karbamid hozzáadásával hígítottuk, és vízfürdőben ultrahanggal kezeltük. A fehérjekoncentrációt 2,1 mg ml-1-re állítottuk be a Bradford-teszt segítségével 100 µl végső térfogattal. A ciszteinkötéseket 45 mmol l-1 ditiotreitollal (#D0632, Sigma-Aldrich) redukáltuk 20 percig 37 fokon, majd szobahőmérsékleten 0,1 mol l-1 jódacetamiddal (#57670 Fluka, Sigma-Aldrich) alkileztük. A mintákat 0,75 µg tripszin (Sequencing Grade Modified Trypsin, V5111, Promega) hozzáadásával emésztettük egy éjszakán át 37 °C-on. Emésztés után a peptideket C18 micro spin oszlopokkal (Harvard Apparatus) tisztítottuk a gyártó protokollja szerint. A szárított peptideket A pufferben (30 µl 0,1%-os trifluor-ecetsav 1%-os acetonitrilben) rekonstituáltuk.

Folyadékkromatográfia tandem tömegspektrometriához kapcsolva (LC-MS/MS)

Az elemzést EASY-nLC1{{10}00 folyadékkromatográfon (Thermo Fisher Scientific) végeztük, amely Velos Pro-Orbitrap Elite hibrid tömegspektrométerhez (Thermo Fisher Scientific) volt csatlakoztatva nanoelektrospray ionforrással ( Thermo Fisher Scientific). Az LC-MS/MS mintákat egy kétoszlopos elrendezéssel választottuk el, amely egy 2 cm-es C18-Pepmap csapdaoszlopból (Thermo Fisher Scientific), majd egy 15 cm-es C18-Pepmap analitikai oszlopból állt. Thermo Fisher Scientific). A lineáris elválasztási gradiens 5 százalék B pufferből (0,1 százalék trifluor-ecetsav 98 százalék acetonitrilben) 5 percig, 35 százalék B pufferből 60 percig, 80 százalék B pufferből 5 percig és 100 százalék B pufferből 10 percig áramlás mellett állt. sebessége 0,3 µl min-1. Minden LC-MS/MS futtatáshoz 6 ul mintát injektáltunk és elemeztünk. Teljes MS-vizsgálatot végeztünk 60,000 felbontású normál tömegtartományban az orbitrap-analizátorban, majd a CID-MS2 20 legintenzívebb prekurzor ionjával követtük az ioncsapdán belül (35-ös energia). Az adatokat LTQ Tune szoftverrel szereztük be.

Fehérje azonosítás

A shotgun proteomikai megközelítésben a fehérjéket enzimatikusan emésztjük kisebb peptidekre, majd ezeket a peptideket egy annotált genomban lévő fehérjékhez illesztjük. Ezen peptidszekvenciák némelyikét több fehérje is megoszthatja, míg néhány a proteom egyetlen fehérjére jellemző. Elemzésünk összesen 496 fehérje találatot eredményezett, amelyek legalább 1 peptid spektrum egyezést (PSM) és 1 egyedi peptidet tartalmaztak.

A téves pozitívumok további kizárása érdekében csak a legalább 2 egyedi peptidet tartalmazó fehérjéket tekintettük megbízható fehérjetalálatnak, amint azt más méhpempő proteomikai vizsgálatokban is megtették (Hu és mtsai, 2019; Zhang és mtsai, 2014), és részben azért, mert a minta-előkészítési lépések kísérleti változása leginkább a tömegspektrometriás mintákban legkevésbé előforduló fehérjéket érinti (Zhang et al., 2010). A fehérjéket az Amel_4.5 mézelő méh genomjához annotáltuk, és UniProt és GenBankot használtunk azonosításuk és funkcióik megerősítésére. Ezután összehasonlítottuk 4 immunrendszerrel rokon fehérje mennyiségét a kontroll-étrendben és a kórokozó-diétás méhpempőben: glükóz-oxidáz, BiVSP, lizozim és defenzin{10}}.

Statisztikai analízis

Az immunrendszerrel kapcsolatos fehérjék mennyiségének értékeléséhez a kontroll-diéta és a kórokozó-étrendű méhpempő között összehasonlítottuk a kiválasztott fehérjék PSM-értékeit. Nem-paraméteres Wilcoxon rangösszeg teszteket használtunk a korlátozott mintanagyság (N=3 kezelésenként) meghatározásához. Egyoldalú összehasonlításokat alkalmaztunk, mivel a tervezett hipotéziseink azt jósolták, hogy ezek a kiválasztott immunfehérjék a kórokozókkal táplált telepekről származó méhpempőben felfelé fognak szabályozni. A fehérjebőségben bekövetkező fold-változásokat a (PSMpathogen-PSMcontrol)/PSMcontrol képlet alapján számítottuk ki. Minden elemzést R-ben (3.5.2-es verzió) végeztünk.

EREDMÉNYEK

Kórokozó töredékek méhpempőben

Megállapítottuk, hogy az összes kórokozót tápláló telepről származó méhpempő minták tartalmaztak olyan részecskéket, amelyek lényegesen nagyobb intenzitással fluoreszkálnak, mint a megállapított háttérfluoreszcencia küszöbünk (lásd Anyagok és módszerek), ami arra utal, hogy a baktériumtöredékek beépültek a méhpempőbe. Egyetlen kontroll-diétás méhpempő minta sem tartalmazott ezt a küszöböt meghaladó részecskéket (1. ábra). A kórokozót tápláló kolóniákban átlagosan 66,67±28,87 (átlag±sd) fluoreszcens részecske volt mikroliter méhpempőben (N=3), míg a kontrollt táplált telepekben 0 fluoreszcens részecske volt mikroliter méhpempőben ( N=3) (1. ábra).

Proteomika

Összesen 496 fehérje találatot találtunk, és ezek közül 44-hez legalább 2 egyedi peptid volt hozzárendelve (1. táblázat). Az összes mintában a legnagyobb mennyiségben előforduló fehérjék a méhpempő fehérjék voltak, amint az várható volt. Általánosságban elmondható, hogy a mintáinkban megfigyelt fehérjék teljesen összhangban voltak a méhpempő más közelmúltbeli proteomikai vizsgálataival (Furusawa et al., 2008; Han és mtsai, 2011; Fujita és mtsai, 2012, 2013; Hu és mtsai, 2011). 2019; Zhang et al., 2014), de ebben a tanulmányban néhány olyan fehérjét azonosítottak, amelyekről máshol nem számoltak be. Ezek közé tartozik a transzferrin, egy vasszállító molekula (Kucharski és Maleszka, 2003), amely a mézelő méh méregmirigy szövetében is megtalálható (Peiren et al., 2008); Serpin-5, egy szerin-proteáz-inhibitor, amelyről ismert, hogy szabályozza a prophenoloxidáz aktivációját más rovarokban (Li et al., 2016); az articsóka, egy kemoszenzoros fehérje, amely a Drosophila melanogaster lárvamozgásában játszik szerepet (Andrés és mtsai, 2014); és az NPC{15}}szerű koleszterintranszporter, amely feltételezett alloparentális funkciókat lát el a mézelő méhekben (Thompson et al., 2006). A kórokozó-diétás méhpempő mintáinkban 3 további fehérjét is találtunk: glutation-peroxidázt, peptidil-prolil-cisz-transz izomerázt és egy nem jellemzett fehérjét (LOC725202). Ezeket a fehérjéket a kontroll-étrend-mintáinkban is megtaláltuk, de nem feleltek meg a két egyedi peptidre vonatkozó kritériumunknak (1. táblázat).

A kontroll-étrend és a kórokozó-étrend-minták összehasonlításakor nagyon csekély változást figyeltünk meg a méhpempőn belüli relatív fehérjebőségben (1. táblázat). Fokális immunfehérjéink közül nem találtunk szignifikáns különbséget a fehérjeszintekben a glükóz-oxidáz (U=7, P=0.9), Bi-VSP (U=1.5,5) kezelések között. P=0.134), vagy lizozim (U=2, P=0.184). Azonban szignifikánsan több AMP-defenzint-1 találtunk a kórokozó-tápmintákban, mint a kontrolltápmintákban (U=0, P=0.05) ( 2. ábra). A hajtás-változás plusz 0,68 volt.

VITA

Ez a tanulmány azt mutatja, hogy a kórokozó P. lárva sejtjeit lenyelő ápolónők úgy tűnik, hogy a sejtek töredékeit beépítik az általuk termelt méhpempőbe (1. ábra). Nemrég kimutattuk, hogy a dolgozók által lenyelt baktériumok a hypopharyngealis mirigyekbe, a méhpempő szintézisének helyére szállítódnak (Harwood et al., 2019), és itt megmutatjuk, hogy beépülnek a méhpempőbe. Ez a felfedezés egy figyelmen kívül hagyott társadalmi immunitási útvonalat jelent, amely lehetővé teszi a fészektársak számára az immunológiai memória megosztását. Eredményeink arra is utalnak, hogy a méhpempő összetétele érzékeny lehet a hemolimfában szisztémásan keringő idegen anyagokra. Egy hasonló közelmúltbeli tanulmányban a kutatók azt találták, hogy a kettős szálú RNS-sel (dsRNS) táplált ápolónők képesek voltak beépíteni ezeket a molekulákat a méhpempőbe, és átvinni a lárvákba, ahol a dsRNS biológiailag aktív maradt (Maori et al., 2019). A dsRNS aktiválja az antivirális RNS-interferencia (RNAi) útvonalat, amely szekvencia-specifikus géncsendesítést vált ki, és a szintetikus dsRNS-t gyakran használják célzott génkiütési vizsgálatokhoz (Fire et al., 1998). Ezen túlmenően egy másik tanulmány kimutatta, hogy a peszticidekkel táplált ápolónők nyomokban ezekből a mezőgazdasági vegyi anyagokból is képesek a méhpempőjükbe bevinni (Böhme et al., 2018), bár itt a hangsúly azon volt, hogy a hypopharyngealis mirigyek mennyire akadályozzák meg a szisztémás peszticidek méhpempőbe való bejutását. .

Mindazonáltal ezek az eredmények azt mutatják, hogy a méhpempő összetétele érzékeny lehet a dajkaméhek állapotára. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a méhpempő csatornaként szolgálhat az AB számára. 1. ábra. A hemocitométeren megfigyelt, kontroll-diéta és kórokozó-diétás kezelésekből származó méhpempő-minták fluoreszcenciás és világosmezős mikroképei. Az összes mintát (A, kontroll-diétás kezelés; B, kórokozó-diétás kezelés) egyidejűleg készítettük el azonos protokollok alkalmazásával, és azonos mikroszkóp-beállítások mellett figyeltük meg Leica DM6000 segítségével. A bal oldali oszlopok sötét képei TRITC lézerrel készültek a Texas Red hullámhossz fluoreszcenciájának azonosítására, míg a jobb oldali oszlopokban lévő képek ugyanarról a területről készültek, amelyek a méhpempő hemocitométeren történő lerakódását mutatják. Pozitív fluoreszcenciás foltok (fehér nyilak) csak a kórokozó-tápmintákban (B) voltak megfigyelhetők, a kontrolltápmintákban (A) nem. 4 azonnali kérdés.

Először is, hogyan vezet egy kórokozónak való kitettség ahhoz, hogy az ápolónők megemelkedett defenzin-1 szintje legyen a méhpempőben? Az egyik lehetőség az, hogy a P. larvae fragmensei a Toll útvonalon (Gram-pozitív baktériumok esetében) a kórokozó-mintázat-felismerő receptorokhoz kötődnek, és a defenzin-1 nagyobb géntranszkripcióját indukálják, de ennek bizonyítékai némileg ellentmondásosak. Tanulmányok kimutatták, hogy a baktériumoknak kitett felnőtt munkavállalók, beleértve az amerikai tenyésztést is, fokozzák a defenzin-1 expresszióját (Evans és mtsai, 2006; CasteelsJosson és mtsai, 1994), de egy közelmúltbeli tanulmány nem figyelte meg a defenzin-1 expressziója az ápolónő fejszövetében az amerikai tenyésztenyészetnek való kitettség után (López-Uribe et al., 2017).

Mindazonáltal a rovarok AMP-jei, például a defenzin-1 a hemolimfában még hetekig megfigyelhetők a patogén expozíció után (Casteels, 1998), még akkor is, ha az ilyen AMP-gének transzkripciója ez idő alatt alábbhagy (Uttenweiler-Joseph et al., 1998), így csak a génexpresszió mérése során előfordulhat, hogy fontos információk hiányoznak a végső peptidtermékek elérhetőségéről. Alternatív megoldásként a kórokozók expozíciója fokozhatja a defenzin-1 mRNS peptidekké történő transzlációját, vagy növelheti a peptid aktiválásához használt poszttranszlációs módosítások sebességét (Casteels-Josson és mtsai, 1994), de ezt meg kell tenni tovább tanult.

Az eredmények által felvetett második kérdés az, hogy biológiailag releváns-e a plusz 0.68 relatív többszörös változása a defenzinben-1. Hagyományosan sok humán proteomikai tanulmány plusz 1,2-es küszöbértéket választ a jelentős upregulációhoz (Serang és mtsai, 2013; Keenan és mtsai, 2009), így a defenzin -1 nem felel meg ennek a kritériumnak. Azonban a méhpempő defenzin-1 koncentrációjának még szerény növekedése is javíthatja a lárvák rezisztenciáját az amerikai költésekkel szemben. Nemcsak a defenzin{10}} kimutatták, hogy közvetlenül gátolja az amerikai tenyésztenyésztést (Bachanová et al., 2002; Bíliková et al., 2001), hanem a Gram-pozitív baktériumok ellen is hatásos már 1 µmol l- koncentrációban. 1 (Fujiwara et al., 1990). Továbbá ismert, hogy a veleszületett immunrendszer számos összetevője szinergikusan működik, így két komponens együttesen nagyobb patogéngátló hatást fejt ki, mint az egyes komponensek egymástól függetlenül működő komponenseinek összege.

Például a bakteriális növekedést gátló vizsgálatok kimutatták, hogy az AMP-k és a lizozim együttesen nagymértékben fokozzák egymás hatékonyságát (Chalk et al., 1994). Kimutatták, hogy a lizozim az apolipoprotein-III-val (ApoLp-III) szinergikusan küzd a kórokozók ellen (Zdybicka-Barabas és mtsai, 2013), egy lipidszállító fehérjével, amely anti-patogén funkcióval rendelkezik a rovarokban (Whitten et al., 2004; Kim és Jin, 2015), amely a méhpempőben található (Furusawa et al., 2008; Han és mtsai, 2011; Zhang és mtsai, 2014; Fujita és mtsai, 2013). Végül, a fiatal mézelő méh lárváinak érő immunrendszere nehézségekbe ütközhet a defenzin{13}} termelésével, amikor amerikai tenyésztenyészet támadja meg őket, mivel a vizsgálatok kimutatták, hogy ez a kihívás alig vagy egyáltalán nem indukál defenzin-1 expressziót a lárvákban (Romanelli et). Cremer et al., 2011, 2007; Serang és mtsai, 2013; Keenan és mtsai, 2009, bár kivételként lásd Bachanová et al., 2002). Így a kitett ápolóktól származó további defenzin{20}} kiegészítheti a lárvák e döntő fontosságú AMP hiányát. Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy a méhpempőben lévő defenzin{21}} mérsékelt növekedése is biológiailag releváns lehet a kolónia legsebezhetőbb tagjainak védelmében.

Ez a tanulmány azt is bebizonyította, hogy a Vg fehérje kritikus szerepet játszik a mézelő méhek immunitásában. A kórokozó mintázat-felismerő receptor szerepének köszönhetően, amelyet állati taxonok széles körében dokumentáltak (Salmela és mtsai, 2015; Du és mtsai, 2017; Garcia et al., 2010; Knight, 2019; Li et al. al., 2008, 2009; Liu és mtsai, 2009; Zhang és mtsai, 2011), valamint a tojásképzésben betöltött szerepét, a Vg-t a hordozó fehérjeként azonosították, amely immunelicitorokat szállít a királynő tojásaiba (Salmela et al. al., 2015). Hasonlóképpen, az ápolónők esetében a legújabb eredmények arra utalnak, hogy a Vg kulcsszerepet játszik a lenyelt kórokozóknak a hypopharyngealis mirigyekbe történő szállításában (Harwood et al., 2019). A Vg-t a nővérek hypopharyngealis mirigyei veszik fel, hogy aminosav-donorként használják fel a méhpempő előállításához (Amdam et al., 2003), a Vg pedig baktériumokat szállíthat a mirigyekbe, hogy beépüljön a zselébe. Így a Vg szerepet játszhat a mézelő méhekben a kolóniaszintű TGIP minden szakaszában, az első oltástól és a méhpempőbe való bedolgozástól a királynőhöz vagy lárvákhoz való eljuttatásig, végül a királynő petefészkébe történő szállításig.

Ez a tanulmány kimutatta, hogy a méhpempő összetételét megváltoztathatja a kórokozó által okozott fertőzés, mind a kórokozó-fragmensek beépülése, mind az AMP-defenzin-1 megnövekedett szintje révén. A méhpempőben lévő kórokozó-fragmensek átvitelének képessége azt jelenti, hogy a transzgenerációs immunrendszer aktiválása a mézelő méhekben az egész kolónia szintjén működhet. A szaporodó nőstényről az utódokra történő immunkiváltó vertikális átvitelen túl a mézelő méheknek összetettebb útvonaluk is lehet, amely a felnőtt utódoktól (ápolónővérektől) a szaporodó nőstényektől a leendő utódokig, valamint a felnőtt utódoktól az éretlenekig terjedő horizontális úton haladhat. utódok. Ennek az lenne az előnye, hogy a lárvákat a fészken kívülről forrásokat gyűjtő dolgozók kollektív immunológiai tapasztalataiból felhalmozott immunkiváltó anyagok nagyobb tárházával oltják be, így a lárvák ellenállóbbá válnak azokkal a kórokozókkal szemben, amelyekkel valószínűleg találkoznak, amikor kilépnek a fészekből. .

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Siiri Fuchsnak, Salla Lohinak, Mati Leponieminek, Franziska Dickelnek, Maarit Nurminennek, Marianne Teichmannnak és Taina Starknak az adatgyűjtésben és elemzési konzultációban nyújtott segítségüket. Köszönjük Austin Cyphersmithnek a mikroszkóppal kapcsolatos technikai segítségét is.

Versengő érdekek

A GH és a GA nem nyilatkozik egymással versengő vagy pénzügyi érdekeltségükről. A HS és a DF feltalálóként szerepel az ehető méhek vakcinára vonatkozó szabadalomban (WO2017017313A1). Ez a szabadalom a Dalan Animal Health Inc.-hez tartozik, ahol a DF tudományos igazgatóként szolgál. Az ebben a cikkben bemutatott kutatást függetlenül végezték, a Dalan Animal Health Inc. vagy bármely más kereskedelmi vállalkozás pénzügyi, anyagi vagy elemzési erőforrásai nélkül.

Szerzői hozzájárulások

Koncepció: GH, HS, GA; Módszertan: GH, HS; Érvényesítés: GH; Formális elemzés: GH, HS; Vizsgálat: GH, HS; Források: HS, DF, GA; Adatkezelés: GH; Írás – eredeti tervezet: GH; Írás - áttekintés és szerkesztés: GH, HS, DF, GA; Vizualizáció: GH; Felügyelet: GA; Projekt adminisztráció: DF, GA; Finanszírozás: GH, DF, GA

Finanszírozás

A GH-t az Arizona State University Graduate Research and Support Program (LM51097GH) támogatta. A DF-et Business Finland támogatással (2348/31/2017) és Finn Akadémia támogatásával (6303369) támogatták. A GA-t a Norges Forskningsråd (262137) támogatta.

For more information:1950477648nn@gmail.com