Absztrakt
A szinergetikus gátló hatások vizsgálatáhozCistanche sivatagolaFeniletanoid glikozidok (PHG) és glabridin (GLA) a bőr pigmentációján, a PHG -k és a GLA optimális tömeg arányát előzetesen átvizsgáltukin vitrotyrosinase activity inhibition assays, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging, and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS⁺) radical scavenging experiments. További értékeléseket végeztünk három celluláris modell alkalmazásával:

Egy UVB-indukált B16F10 melanogenezis modell a melanin szintézis gátlásának felmérésére a tirozináz aktivitás és a melanintartalom révén;

Lipopoliszacharid (LPS) által indukált Hacat-gyulladásos modell a gyulladásgátló hatások értékelésére az interleukin -6 (IL -6) és a tumor nekrózis faktor- (TNF-) szuppressziójának mérésével;

Egy AAPH (2,2'-azobis (2- amidinopropán) dihidroklorid-indukált HACAT-oxidatív stresszmodell az antioxidáns aktivitás meghatározására szuperoxid-diszmutáz (SOD) és kataláz (CAT) fokozás révén.

Az optimális PHGS/GLA tömeg arányt ezen modellek révén azonosítottuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a PHGS/GLA-oldatok (foszfáttal pufferolt sóoldatban, PBS, pH 6,8) 1: 1, 5: 1 és 10: 1 tömegességi arányban szignifikáns tirozináz-gátlást és szinergikus antioxidáns hatásokat mutattak. A tirozináz gátlási aránya 94,37%, 92,93%és 88,06%volt; A DPPH radikális megsemmisülési aránya elérte a 89,44%, 88,72%és 88,10%; Az ABTS⁺ kiszélesedési aránya 100,13%, 100,01%és 99,87%volt. 25 ug/ml -en a DMEM -ben a PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) nem mutattak citotoxicitást a B16F10 vagy a HACAT sejtek felé. PHGS/GLA (1: 1) DMEM megoldás jelenik megkiváló tirozináz gátlás(23,80% maradék aktivitás), jelentősenCsökkent melanintartalom(30,90%), és felülmúlta az egyéb arányokat és monoterápiákat az IL -6/TNF-felszabadítás és a SOD/CAT aktivitás fokozása során. A PHG -k és a GLA szinergetikus kombinációja hatékonyan enyhült Srokon hiperpigmentáció a melanogenezis gátlásával, csökkentik a gyulladásokat, ésAz antioxidáns kapacitás javítása.

Kulcsszavak
Cistanchesivatagola feniletanoid glikozidok; glabridin; szinergetikus hatás; anti-melanogenezis; antioxidáns; gyulladásgátló; gyógyszerészeti alapanyagok

 

 

 

Cistanchesivatagola kivonMagas szintűFeniletanoid glikozidok a bőrfehérítéshez

Whatsapp minket további részletekért

 

Kísérleti szakasz

1.1 Anyagok, reagensek és műszerek

Egér melanóma sejtekB16F10 (katalógusszám: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

Emberi immortalizált keratinocitákHACAT (katalógus száma: ICELL-H066), ICELL Bioscience Inc., Sanghaj, Kína.

Cistanche feniletanoid glikozidok (PHG)ésGlabridin (GLA), Shaanxi Tianxingjian Biological Chemical Technology Co., Ltd.

Tirozináz, Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)ésL-tirozin, Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Sanghaj, Kína.

1, 1- difenil -2- picryl -hidrazil (DPPH), Tokyo Chemical Industry Co., Japán.

2,2′-Azino-Bis (3- etil-benzotiazolin -6- szulfonsav) diammonium só (ABTS), Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Aszkorbinsav (VC), Tianjin Damao vegyi reagens gyár.

Kálium -perszulfátésvízmentes etanol, Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.

Nátrium -hidroxid, Chengdu Huayi Pharmaceutical Suipent Manufacturing Co., Ltd.

Dipotassium -foszfát, Shanghai Sanpu Chemical Co., Ltd.

L-DOPA, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Cellaszámlókészlet -8 (CCK8), Peking Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton X -100, dimetil -szulfoxid (DMSO), 2,2′-Azobis (2- metil-propionamidin) dihidroklorid (AAPH), ésLipopoliszacharid (LPS), Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

DMEM magas glükóztartalmú tápközeg, Thermo Fisher Scientific (Kína).

Magzati szarvasmarha -szérum (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

Penicillin-streptomycin oldat, Shanghai Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Human IL -6 ELISA KIT, humán TNF-ELISA készlet, ésemberi macska Elisa készlet, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.

Teljes szuperoxid -diszmutáz (SOD) vizsgálati készlet, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Az összes reagens analitikus minőségű volt.

Használt műszerek:

Multiskan fc teljes hullámhosszú mikrotábla-olvasóésHeracell 371 CO2 inkubátor, Thermo Fisher Scientific, USA.

KQ -200 VDB Ultrahangtisztító, Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.

DVKW-D -2 Digitális termosztatikus vízfürdő, Peking Yongguangming orvosi hangszergyár.

DHG -9246 Elektromos termosztatikus robbantó sütő, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.

KN4006B UVB ultraibolya sugárzási eszköz(Besugárzás intenzitása: 8 MW/cm²), Xuzhou Kenuo Medical Instrument Equipment Co., Ltd.

1.2 Módszerek

Először, a PHG-ket és a GLA-t feloldottuk mind a foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS, PH =6.{{0}}. 0 0 1, 0.- Ezután a PHG -ket és a GLA -t összekevertük aM (PHGS): M (GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20 és 1:40, a PHGS/GLA oldatok előkészítéséhez teljes tömegkoncentrációval0.4 g/L, címkézvePHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), illetve.

 

1.3 Biokémiai kísérletek

1.3.1 Tirozináz aktivitás gátlási vizsgálat

Egy 96- kútlemezben,50 μl a tesztminta -oldatból, 50 μl PBS (pH =6. 8), és50 μl L-tirozin oldat (1 g/L)szekvenciálisan hozzáadták. A lemezt 37 fokos vízfürdőben inkubáltuk 10 percig. Majd,5 0 μL tirozináz oldat (0,4 g/L, 200 U/ml -nek egyenértékű)hozzáadtuk, és a lemezt ismét inkubáltuk a 37 fokos vízfürdőben további 10 percig.

Arbutin (ARB)használták pozitív kontrollként, ésPBS (ph =6. 8)üres vezérlésként használták.

Az oldat abszorbanciája490 nmMikroplatációs olvasóval mértük, és az in vitro tirozináz gátlási sebességet (%) az (1) egyenlet alkalmazásával számítottuk ki.

 

 

A képletben:

A _ reakcióaz L-tirozin oldat, PBS és tirozináz oldatban található minta oldat abszorbanciája.

A _ reakcióvezérlésaz L-tirozin oldat és a PBS-t tartalmazó minta oldat abszorbanciája tirozináz oldat nélkül.

A _ üresAz L-tirozin oldat, a PBS és a tirozináz oldatban lévő oldat abszorbanciája a minta nélkül.

A _ üres vezérlésaz L-tirozin oldat és a PBS-t tartalmazó oldat abszorbanciája a minta és a tirozináz oldat nélkül.

1.3.2 A DPPH szabad radikális megsemmisítő tevékenységének meghatározása

Először: {{0}}.0. 2 mmol/L.

Ezután a PHG -ket és a GLA -t 50% -os etanolban oldottuk, hogy előállítsuk a PHG -k és a GLA etanol -oldatait.{{0}}. 0 0 1, 0.- A VC etanololdatait ugyanúgy készítettük.

Ezt követően a PHG -k és a GLA etanololdatait összekevertükM (PHGS oldat): M (GLA megoldás)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:409 etanol -oldat PHG/GLA oldatának beszerzéséhez, különböző tömegességi arányokkal, jelölvePHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

Végül,Minden minta oldat 100 μl -jeés100 μl a DPPH munkaoldathozzáadtuk egy 96- kútlemezhez, egyenletesen keverve és szobahőmérsékleten inkubáltuk sötétben 30 percig. Az abszorbancia517 nmMikroplatációs olvasó segítségével mértük. A VC -t használtuk pozitív kontrollként, és mindegyik kísérletet háromszor megismételtük.

A DPPH szabad gyökök megsemmisülési sebességét (%) kiszámítottuk a (2) egyenlet alkalmazásával.

 

A képletben:

A1a minta oldat abszorbanciája + DPPH működő oldat.

A2az 50% -os etanol + DPPH működő oldat abszorbanciája.

A3a minta oldat abszorbanciája + 50% etanol.

 

1.3.3 Az ABTS⁺ szabad gyökök megsemmisítő tevékenységének meghatározása

Első,1 g (1,82 mmol) ABTSoldottuk ionmentesített vízben, hogy elkészítsük a végső koncentrációval rendelkező ABTS munkamenetet7,4 mmol/L. 0. 5 g kálium -perzulfátoldottuk ionmentesített vízben, hogy előállítsák a kálium -perzulfát -oldatot a végső koncentrációval2,6 mmol/L- Az ABTS munkaoldat és a kálium -perzulfát munkaoldat egyenlő mennyiségét összekevertük, és 12 órán keresztül hagytuk, hogy sötétben reagáljunk az ABTS⁺ működő oldat előkészítésére.

Ezután a PHG -k, a GLA és a VC etanol -oldatai, valamint a PHGS/GLA -etanol oldatokPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), az 1.3.2. Szakaszban leírt módszer szerint állítottuk elő.

Végül,40 μl minden minta oldatbólés160 μl az ABTS⁺ működő megoldáshozzáadtuk egy 96- kútlemezhez, egyenletesen összekeverve, és szobahőmérsékleten sötétben reagáltunk 6 percig. Az oldat abszorbanciája734 nmMikroplatációs olvasó segítségével mértük.

Az ABTS⁺ szabad gyökök megsemmisülési sebességét (%) a (3) egyenlet alkalmazásával számítottuk ki.

 

 

A képletben:

A1a mintaoldat abszorbanciája + abts⁺ működő oldat.

A2az ionmentesített víz abszorbanciája + abts⁺ működő oldat.

A3a minta oldatának abszorbanciája + ionmentes víz.

1.4 Sejt kísérletek

1.4.1 sejttenyészet

A B16F10 és a Hacat sejtek újjáélesztése után DMEM nagy glükóz-tápközegbe oltottuk (10% magzati szarvasmarha-szérumot és 1% penicillin-streptomycin-oldatot tartalmaznak)37 fok, 5% CO2, és70% páratartalominkubátorban 24 órán át. A sejtnövekedés állapotát mikroszkóp alatt figyelték meg, és a közepes változásokat vagy a passzázsot a sejt növekedési állapota alapján elvégezték.

1.4.2 Kísérleti csoportosítás

A logaritmikus B16F10 és a HACAT sejteket 96- kútlemezekbe oltottuk megfelelő sejtsűrűséggel, és 24 órán át tenyésztettük, hogy lehetővé tegyük a sejtek betartását. DMEM tápközeg alkalmazásával készítettük a különböző koncentrációjú mintavételi oldatokat.

A kísérleti csoportok a következők voltak:

Normál csoport

Modellcsoport

PHGS alacsony dózisú csoport(125 ug/ml)

PHGS közepes dózisú csoport(250 ug/ml)

PHGS nagy dózisú csoport(500 ug/ml)

GLA alacsony dózisú csoport(6,25 ug/ml)

GLA közepes dózisú csoport(12,5 ug/ml)

GLA nagy dózisú csoport(25 ug/ml)

PHGS/GLA (1: 1) csoport(25 ug/ml)

PHGS/GLA (5: 1) csoport

PHGS/GLA (10: 1) csoport

AUVB-indukált pigmentációs modell B16F10 sejtekben, a modellcsoportos sejteket kezeltük30 μl PBS (pH =7. 4)és besugárzva egy UVB ultraibolya sugárzási eszköz alatt3 cm az eszköz alatt-ra110 másodperc- A kísérleti csoportokat előkezelték100 μl különböző mintavételi oldatok1 órán át, mielőtt hozzáadná30 μl PBSés besugárzás az UVB eszköz alatt 110 másodpercig. A normál csoportot folyamatosan kezeltük magas glükóz-DMEM tápközeggel, és az üres csoport nem tartalmazott sejteket, hanem azonos mennyiségű tápközeggel cserélte.

ALPS-indukált gyulladásmodell HACAT-sejtekben, a modellcsoportot kezelték20 UG/ml LPS PBS oldat24 órán át. A kísérleti csoportokat előkezelték100 μl különböző mintavételi oldatokA hozzáadás előtt 24 órán át20 UG/ml LPS oldattovábbi 24 órán át. A normál csoportot folyamatosan kezeltük magas glükóz-DMEM tápközeggel, és az üres csoport nem tartalmazott sejteket, hanem azonos mennyiségű tápközeggel cserélte.

AAAPH-indukált oxidatív stresszmodell HACAT-sejtekben, a modellcsoportot kezelték25 mmol/l aaph oldat24 órán át. A kísérleti csoportokat előkezelték100 μl különböző mintavételi oldatokA hozzáadás előtt 24 órán át25 mmol/l aaph oldattovábbi 24 órán át. A normál csoportot folyamatosan kezeltük magas glükóz-DMEM tápközeggel, és az üres csoport nem tartalmazott sejteket, hanem azonos mennyiségű tápközeggel cserélte.

Minden csoportot beállítottak3 A Wells replikálásaés kulturált37 fok, 5% CO2, és70% páratartalominkubátorban.

1.4.3 Citotoxicitási vizsgálat

A citotoxicitást aCCK8 módszer- A logaritmikus B16F10 és a hacat sejteket emésztettük0. 25% tripszin3 percig. Miután az emésztést leállítottuk a tápközeggel, a sejteket többször pipettáltuk, hogy előállítsák a sűrűségű sejtszuszpenziót1 × 10⁴ sejtek/ml- A sejteket egyenletesen {96- kútlemezekbe oltottuk100 μl / kút, és PBS -t adtunk a perifériás kutakhoz. A sejtek betartása után a minta oldatok különböző koncentrációit adtuk hozzá.3 Csoportonként megismételik a kutak replikálódását, és a sejteket tenyésztettük37 fok, 5% CO2, és70% páratartalom-ra24, 48 és 72 óraA közeg eldobása előtt.

Minden csoport számára,100 μl CCK8 DMEM magas glükóztartalmú tápközeg (10% CCK8-ot tartalmaz)hozzáadtuk és inkubáltuk60 perc- Az oldat abszorbanciája450 nmMikroplatációs olvasó segítségével mértük.

A sejt életképességét (%) a (4) egyenlet alkalmazásával számítottuk ki.

 

A képletben:

A _ kezelta kúttartalmú sejtek, a CCK8 oldat és a minta oldat abszorbanciája.

A _ üresa kúttartalmú tápközeg és a CCK8 oldat abszorbanciája, de sejtek nélkül.

A0a kúttartalmú sejtek és a CCK8 oldat abszorbanciája, de a minta oldat nélkül.

1.4.4 Tirozináz aktivitási vizsgálat

Az L-DOPA módszert alkalmaztuk a tirozináz aktivitás mérésére. A sejtek kezelése után48 óraAmint azt az 1.4.2. Szakaszban leírtuk, a felülúszót eldobtuk, és a kutak kétszer mostunk PBS -sel (pH =7. 4). Majd,50 μl 1% Triton X -100 oldathozzáadták mindegyik kúthoz, és azonnal –80 fokos fagyasztóba helyezték30 perc- A sejteket szobahőmérsékleten felolvasztottuk a lízis indukálására.

Miután az előmelegítés előtt37 fok-ra5 perc, 10 μl 10 mmol/l l-dopa oldathozzáadták mindegyik kúthoz és inkubáltuk37 fok, 5% CO2 és 70% páratartalom-ra1 óra- Az abszorbancia475 nmMikroplatációs olvasó segítségével mértük. Minden kísérletet megismételtünkháromszor, és a tirozináz aktivitást (%) kiszámítottuk az (5) egyenlet alkalmazásával.

A képletben:

A _ kísérletA kúttartalmú sejtek abszorbanciája és a mintaoldat UVB besugárzás alatt.

A _ NormálA kúttartalmú sejtek abszorbanciája és a minta oldat UVB besugárzás nélkül.

A _ üresa kúttartalmú tápközeg abszorbanciája, de sejtek nélkül.

 

1.4.5 melanin tartalom mérése

A melanin -tartalom mérésére a NaOH lízis módszert használtuk. A sejtek kezelése után72 óraAmint azt az 1.4.2. Szakaszban leírtuk, a felülúszót eldobták, és a kútokat kétszer mostuk PBS -sel.100 μl NaOH vizes oldat, amely 10% DMSO -t (1 mol/L) tartalmazmindegyik kúthoz hozzáadták, és a lemezt a90 fokos sütő-ra1 óra- Az abszorbancia490 nmMikroplatációs olvasó segítségével mértük. Minden kísérletet megismételtünkháromszor, és a melanintartalmat (%) az (5) egyenlet alkalmazásával számítottuk.

 

1.5 A gyulladásos tényezők és az oxidatív stressz mutatók mérése

A sejtek kezelése után48 óraAz 1.4.2 szakaszban leírtak szerintHacat sejtekMindegyik csoportból centrifugált sejtkaparóval gyűjtöttük össze, és a felülúszót összegyűjtöttük. Az IL -6 és a TNF-koncentrációit az ELISA készletek utasításai szerint mértük.

A sejtek kezelése után48 óra, A hacat sejteket sejtkaparóval gyűjtöttük össze, ismételt fagyasztási-olvadási ciklusoknak vetjük alá, hogy indukáljuk a sejtlízist, és centrifugáltuk12, 000 fordulatszám 10 percig 4 fokon- A felülúszót összegyűjtötték, és aGYEPés koncentrációkMACSKAaz ELISA KIT utasításokkal mértük.

 

1.6 kombinált index mérés

AKombinált index (CI) módszer[20] felhasználtuk annak felmérésére, hogy a PHG -k és a GLA kombinációja különböző tömegtarányokban szinergetikus hatást mutat -e a tirozináz aktivitás gátlásában és az antioxidációban. A kombinált indexet a (6) egyenlet alkalmazásával számítottuk ki.

 

A képletben:

D1ésD2képviselik a két gyógyszernek a megfelelő koncentrációját (g/l) a kombinált kezelésben, amely az eléréséhez szükségesX% tevékenység.

Dxaz egyes anyagok koncentrációját (g/l) ábrázolja, ha önmagában használjákX% tevékenység.

ACompusyn szoftverszámításokhoz használták:

Ci> 1antagonista hatást jelez.

Ci=1additív hatást jelez.

Ci <1szinergetikus hatást jelez.

 

1.7 Adatelemzés

Az összes adatot úgy fejezték ki, hogy"Átlagos ± szórás (x̄ ± s)", és a megbeszélések az átlagértékeken alapultak.

Statisztikai elemzést végeztünkGraphPad Prism 9.5. 0- Egyirányú ANOVA-t (varianciaanalízis) használtunk több csoport összehasonlításához. AP-érték <0. 05statisztikailag szignifikánsnak tekintették.