A policisztás vesebetegség oka

további információ:ali.ma@wecistanche.com

A PKD1 túlzott expressziója policisztás vesebetegséget okoz

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté és Marie Trude

A mögöttes patogenetikai mechanizmusokautoszomális dominánspolicisztás vesebetegség(ADPKD) tisztázásra vár. Bár bizonyíték van arra, hogy a Pkd1(policisztás vesebetegség 1)A gén haploinsufficiencia és a heterozigótaság elvesztése cisztaképződést okozhat egerekben, paradox módon magas Pkd1(policisztás vesebetegség 1) expresszióját mutatták ki az ADPKD vesében (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség) betegek. Annak megállapításához, hogy a Pkd1(policisztás vesebetegség 1)A funkció növekedése patogenetikai folyamat lehet, egy Pkd1 bakteriális mesterséges kromoszómát (Pkd1-BAC) homológ rekombinációval módosítottak, hogy kizárólag a tartós Pkd1 expressziót célozzák meg, elsősorban a felnőtt vesét. Pkdl transzgén a vesékben 2- a Pkd1 endogén szintjének 15-szorosára. Minden transzgenikus egér reprodukálható módon tubuláris és glomeruláris költségeket és veseelégtelenséget fejlesztett ki, és veseelégtelenségben halt meg. Ez a modell azt mutatja, hogy a vad típusú Pkd1 túlzott expressziója önmagában elegendő a humán ADPKD-hez hasonló cisztogenezis kiváltásához. (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség). Eredményeink feltűnően megnövekedett vese c-myc expressziót tártak fel az összes transzgenikus vonalból származó egerekben, ami azt jelzi, hogy a c-myc kritikus in vivo a Pkd1 downstream effektora.(policisztás vesebetegség 1)molekuláris Dathwavs, Ez a tanulmány nemcsak egy felbecsülhetetlen értékű és első PKD-t hozott létre(policisztás vesebetegség)modell a molekuláris patogenezis és a terápiák értékelésére, de bizonyítékot szolgáltat arra is, hogy a funkció növekedése patogenetikai mechanizmus lehet az ADPKD-ben (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség).

Kattintson a Cistanche-ra a vesebetegségért

Autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség(ADPKD) az egyik leggyakoribb genetikai betegség az emberekben. Többszörös vese ciszta progresszív kialakulása jellemzi, amelyek a nefron minden szegmensét érintik. Egyéb megnyilvánulások közé tartozik a ciszták kialakulása a májban és a hasnyálmirigyben, valamint az intracranialis aneurizmák és a szív- és érrendszeri rendellenességek. ADPKD (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)tipikusan veseelégtelenséghez vezet, amely a késői középkorig végstádiumú vesebetegségig terjed.

Az ADPKD körülbelül 85 százaléka (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)esetek a PKD1 mutációihoz kapcsolódnak(policisztás vesebetegség 1)gén. Ez a PKD1(policisztás vesebetegség 1)gén nagy, 54 kb méretű, és 46 exonból áll. Létrehoz egy 14.2-kb méretű átiratot, és egy 4., egy 302-aminosav-fehérjét, amelyet policisztinnek-1 (4, 9-11) kódol. A humán PKD1 és a policisztin{11}} expresszióját normál és ADPKD-ben elemezték (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)vese. A vesefejlődés során a policisztin-1 könnyen kimutatható a glomeruláris és tubuláris epiteliális sejtekben (áttekintve a 37. hivatkozásban és az abban található hivatkozásokban). Normális felnőtteknél mi és mások kimutattuk, hogy a PKD1(policisztás vesebetegség 1)Az RNS és a fehérje mérsékelt vagy alacsony szinten expresszálódik a gyűjtő- és disztális tubulusokban, míg az ADPKD-ben a szint emelkedett (~{0}}-szeresére). (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)vesék (22, 39). Érdekes módon a policisztin-1 perzisztens vagy fokozott expressziója a vese epiteliális ciszták többségében kimutatható, bár a ciszták jelentős részében a festődés hiányzott (29). A veséken kívül a PKD1(policisztás vesebetegség 1)Az expresszió általában széles körben elterjedt más felnőtt szövetekben, beleértve a hámsejteket és a nemepiteliális sejteket (6, 14, 18, 29, 30, 39).

Több mint 200 különböző PKD1(policisztás vesebetegség 1)mutációkat írtak le, amelyek többsége deléciós-beillesztéses, kereteltolásos vagy nonszensz mutáció. Ezek az előrejelzések szerint a fehérje csonkolt formáit eredményezik, összhangban az egyik allél inaktiválásával.

Jelentős része azonban olyan missense vagy in-frame mutációk, amelyek az egész génben megtalálhatók, és gyakran egyediek egy adott családra (33, 34). Ahogy a neve is sugallja, ADPKD (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)domináns és a továbbított mutált PKD1(policisztás vesebetegség 1)allél elegendő a betegség kialakulásához. Azonban a vese ciszták fokális jellege ADPKD-ben (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)arra utal, hogy a PKD1 mutációs mechanizmusa(policisztás vesebetegség 1)lehet kettős találat vagy a heterozigótaság elvesztése. Ezt a mechanizmust a PKD1 kimutatása támogatta(policisztás vesebetegség 1)klonális szomatikus mutációk a ciszták jelentős részéből származó sejtekben (3, 21, 32). A heterozigótaság elvesztésének mechanizmusa magyarázhatja az egyes családokban általánosan megfigyelt, széles körben változó fenotípust.

Tanulmányok az egérrel Pkd1(policisztás vesebetegség 1)gén értékes betekintést nyújthat a PKD1 funkció(k)ba, mivel a humán és rágcsáló gén és a géntermék szoros hasonlóságot mutat. Normális fejlődésben a rágcsáló Pkd1 magas szinten expresszálódik a morula stádiumtól kezdve, és minden neurális crest sejt származékban kimutatható. beleértve a felnőtt agyat, az aortaívet, a porcot és a mesenchymalis kondenzációt (16, 17). A Pkd1 deléciót célzó homozigóta mutáns egerekről beszámoltak arról, hogy in utero elpusztulnak, és vese- és hasnyálmirigy-ciszták alakulnak ki (2, 19, 24-26, 40). Az egérmodellek létrehozására irányuló korábbi kísérletek sajnos nem eredményeztek életképes állatokat a születés után. Mindazonáltal a vese ciszták előfordulása ezekben a homozigóta Pkd1 mutáns egerekben összhangban lenne az emberekben egy kéttalálatos mutációs mechanizmus hipotézisével, amely magában foglalja a csíravonal mutációját és a normál allél szomatikus inaktivációját. A Pkd1 célzott delécióra heterozigóta egerek azonban PKD-t is mutattak, alkalmanként máj- és hasnyálmirigy-cisztákkal, a késői felnőttkori megjelenés ellenére, ami alátámasztja a haploinsufficiencia vagy a géndózis csökkentésének mechanizmusát. Ezenkívül a heterozigótaság vagy a haploinsufficiencia elvesztése nem feltétlenül az ADPKD egyetlen mechanizmusa (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)patogenezise. Valójában ezek a mechanizmusok ellentétesek a PKD1 tartós vagy fokozott expressziójával(policisztás vesebetegség 1)az emberi vese ciszták többségében megfigyelhető, hacsak nem termelődnek nem működő fehérjék. A tartós vagy fokozott PKD1 expresszióra vonatkozó megállapítás felveti a kérdést, hogy a funkció növekedése vagy a túlzott expresszió lehet-e operáns. A Pkd1 funkciónövekedés patogenetikai mechanizmusának vizsgálata érdekében izoláltunk és jellemeztünk egy egér Pkd1 bakteriális mesterséges kromoszómát (Pkd1-BAC), amelyet ezt követően Escherichia coliban homológ rekombinációval módosítottunk a Pkd1 megcélzott expressziója érdekében.(policisztás vesebetegség 1)kifejezetten a vesére. Három transzgenikus vonal termelését közöljük, amelyek különböző szinteken expresszálják a Pkd1 transzgént. Minden egér reprodukálható módon számos hasonlóságot mutatott a humán ADPKD-vel, és következetesen korai megjelenésűek voltak, a vese morfológiai és funkcionális változásai gyorsan előrehaladtak, és középkorukra veseelégtelenségben haltak meg. Ezenkívül a jelenlegi tanulmány egy in vivo mechanizmust ír le, amellyel a Pkd1 közvetítheti ezt a PKD fenotípust. Ezek az egerek képviselik a PKD első modelljét, amelyet az ortológ PKD1 egyetlen vese túlzott expressziója hozott létre.(policisztás vesebetegség 1)gén.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

A Pkd1-et tartalmazó BAC-klónok izolálása(policisztás vesebetegség 1)locus. Az E. coli DH10B (RecA; RecBC) baktérium gazdatörzsből származó Pkd1-BAC klónokat egy 129Sv egér pBelo11BAC könyvtárból izoláltuk (Research Genetics). A BAC szuperpoolok szűrését PCR-rel végeztük a következő primerekkel: 5 régió, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (előremutató Pkd1 exon 1) és 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC-3 (fordított) Pkd1 exon 1); és 3 régió: 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC-3 (előre irányuló Pkd1 exon 39) és 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (fordított Pkd1 exon 40). Mindkét amplifikációhoz egy pozitív klónt azonosítottunk, és standard gél- és pulzálómezős gélelektroforézissel (PFGE) elemeztük, majd Southern blottal. Southern blot analízishez hét egér Pkd1 próbát terveztek: 1. genomi exon (516 bp; nukleotidok [nt] 1-516; NCBI hozzáférési szám: U70209), genomi exon 2-3 (220 bp), genomi exon {{ 31}} (8479 bp), cDNS-exon 15-20 (1724 bp; nt 6455-8179), cDNS-exon 25-34 (1315 bp; nt 9415-10730), cDNS-exon 36-45 ( 1655 bp, nt 10963-12618), és genomi exon 45-46 (1640 bp) (16). Számos régiót, köztük ennek az egér Pkd1-BAC-nak a BAC inszert végét, szintén szekvenálták, és megerősítették, hogy ortológok a humán PKD1 génhez és a szomszédos régiókhoz.

EREDMÉNYEK

SBPkdl előállítása(policisztás vesebetegség 1) rAc-BAC homológ rekombinációval. Annak megállapítására, hogy a függvény Pkd1 erősítése önmagában elegendő-e az ADPKD előállításához (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)fenotípus esetén először izoláltunk egy genomikus klónt, amely a teljes Pkdl gént tartalmazza a BAC vektor 129/Sv könyvtárában. Ezt a könyvtárat PCR-rel szkríneltük két primer-készlettel a Pkd1 génre, amelyek az 1. exont az 5'-végen és a 39-40. exonokat a 3'-vég felé ívelték át (1. ábra). A Pkd1 gén pozitív BAC klónját azonosították, amely a teljes szomszédos Tsc2 géntestet tartalmazta. A Pkd1 inszertet részletesen jellemezték annak biztosítására, hogy a genomi szerkezet megegyezzen az endogén Pkd1 genomi szerkezetével(policisztás vesebetegség 1)a 129/Sv egértörzs génje, amelyből az inszert származott, és a C57BL/6J beltenyésztett törzsből. A BAC-ban és ezekben a beltenyésztett törzsekben a Pkd1 lókusz genomiális térképei Southern blot analízissel, négy restrikciós enzimes emésztéssel és hét, a teljes Pkdl gént lefedő próbával, azonosnak tűntek, átrendeződésekre utaló bizonyíték nélkül (1. ábra). Ez a BAC egy ~121-kb inszertet tartalmazott, beleértve a Pkd1 szekvenciájának -37 kb upstream és -39 kb egy downstream szekvenciáját.(policisztás vesebetegség 1)gén elektroforézissel és szekvenálással meghatározott.

Ezt a Pkd1-BAC klónt két egymást követő homológ rekombinációs esemény módosította E. coliban. A Pkd1(policisztás vesebetegség 1)gént a 10. exonban jelöltük meg egy nukleotid helyettesítésével (G-től A-ig), hogy új EcoRI helyet hozzunk létre a cDNS-térkép 2355. pozíciójában. Ezt a csendes pont mutációt a Pkd1 megkülönböztetésére hozták létre(policisztás vesebetegség 1)gén és az endogén eredetű BAC transzkriptuma. Ezenkívül lecseréltük a Pkd1-BACgén 5'-szabályozó elemeit, kihasználva a korábban azonosított "SB" vese epiteliális specifikus elemeit a c-Myc-hez kapcsolódó SBM-ből vagy a c-Myc-hez kapcsolódó SBF-ből. fos) konstrukció-transz-gén, hogy korlátozza az expressziót a vesékre (36, 38) (2a. ábra).

Ezt az új SBPkd1TAc-BAC-ot Notl-el emésztettük, amely egy egyedülálló hely, amely közvetlenül az SB-elemek előtt helyezkedik el, és a ClaI a Tsc2 géntestben, csonkolva a Tsc2 szabályozóelemeket és a géntest 5' felét, hogy biztosítsa a Tsc2 exogén expressziójának hiányát. minden szövetben és a prokarióta BACvektor szekvenciák eltávolítására (1. és 2. ábra). Ezt a 70- kb Notl-Clal linearizált fragmentumot izoláltuk, tisztítottuk, és mennyiségileg meghatároztuk az oocita mikroinjekcióhoz (36).

SBPkd1rAc transzgenikus egerek előállítása és elemzése. Négy transzgénikus alapító, akik az SBPkd1rAc transzgén több másolatát hordozzák, következetesen fejlesztette ki a PKD-t(policisztás vesebetegség). A Southern-analízissel meghatározott négy SBPkdlrAc alapító egérből három SBPkd1rAG transzgenikus vonalat hoztak létre a transzgén 2-9 kópiájával (2b. ábra). A transzgén integritásának jellemzését ezekben a vonalakban 5', belső és 3' próbákkal követtük, amint azt a 2b. ábra reprezentatív példái mutatják. A transzgenikus vonalak az 5'"SB" szondával egy 10,9 kb-os sávot mutattak ki, amely összhangban van azzal, hogy az SBPkd1rAc transzgén fej-farok orientációba integrálódott, és a 3' próbával egy 7{14}}kb sávot mutattak ki. (2b. ábra). Ezenkívül a belső próba kimutatta a transzgén 9.{17}}kb-os endogén Pkd1 sávját, valamint a 69-kb és 2{22}} kb méretű sávokat az EcoRI beillesztési hely miatt. a 10. exonban (2b. ábra). Ezek az egerek a transzgén teljes másolatát tartalmazták a genomiális átfedő szerkezet elemzése alapján.

Pkd1(policisztás vesebetegség 1)funkció növekedése felnőtt SBPkdlrAc transzgenikus egerekben. Az SBPkdlrAG transzgén és a Pkd1 gén expresszióját különböző szervekben vizsgáltuk. A transzgénből és/vagy endogén génből származó transzkriptumszintek mennyiségi meghatározását Northern blot analízissel végeztük (3a. ábra). Ahogy az várható volt, a transzgén és az endogén gén transzkriptumai hasonló hosszúságúak voltak (14,2 kb). A kontroll GAPDH expressziója alapján az összes SBPkd1TAG egérvonal veséi következetesen megnövelték a transzkriptum expressziót a hasonló korú felnőtt vesék (n=3) normál Pkdl szintjéhez képest. A különböző transzgénikus vonalak vesetranszgénje és endogén expressziója 2--tól 15--szeres tartományt mutatott a kontroll vese endogén Pkd1-szintje felett (3a. ábra). Különösen a 39-es transzgenikus vonal (n {{11} }) magasabb Pkd1-et mutatott(policisztás vesebetegség 1)szinten, mint a 3. (n=3) és a 41. (n =4) sor. Ezenkívül a Northern blot analízissel mért Pkd1 expressziós szintek korreláltak az 1. és 2. exonban lévő primerek felhasználásával valós idejű PCR-rel (3b. ábra).

A transzgén expressziós szintjét konkrétan valós idejű PCR-rel és szemikvantitatív RT-PCR-rel határoztuk meg a három transzgénikus vonalban felnőtt korban, primerek felhasználásával az 5' nem transzlált régióban (B, -globin promoter) és a Pkd1 2. exonjában.(policisztás vesebetegség 1)(3b. ábra). Az SBPkdlrAc expresszióját transzgenikus egerekben összehasonlították az S16 riboszomális fehérje géntermékével, mint belső standarddal. A szemikvantitatív RT-PCR amplifikációhoz használt körülmények a lineáris tartományon belül voltak. A valós idejű PCR-rel és szemikvantitatív RT-PCR-rel végzett transzgénexpresszió következetesen és specifikusan az összes transzgénikus vonal közül a legmagasabb expressziót mutatta a vesében a többi szervhez képest (3b. és c. ábra). Az egyes minták veseexpressziós szintjei reprodukálhatók voltak bármelyik kimutatási technikával. A Pkd1 legmagasabb szintjei(policisztás vesebetegség 1)A transzgén vese expresszióját a 39. és 41. vonalra mértük. Annak ellenőrzésére, hogy a megnövekedett Pkd1(policisztás vesebetegség 1)expressziója a transzgénből vagy az endogén génből származott, a három transzgénikus vonalból származó egerek azonos csoportját hasonlítottuk össze a renális Pkd1 transzgén expressziójára és a renális Pkd1 teljes (transzgén és endogén) expressziójára valós idejű PCR-rel. Érdekes módon a 39. és 41. vonal a 3. vonalhoz viszonyítva azt mutatta, hogy a megnövekedett Pkdl transzgén veseexpressziója hasonló vagy meghaladta a Pkd1 teljes renális expresszióját, ami arra utal, hogy a transzgén specifikusan felelős ezért az indukált expresszióért. Különböző szervekben (beleértve a szívet, a tüdőt, az agyat, a májat, a hasnyálmirigyet és a lépet) az SBPkd1rAg transzgén nagyon gyenge expressziót mutatott, amelyet alkalmanként a lépben és a tüdőben észleltek, míg más szervekben alig vagy nem észlelhető expressziót mutattak (3b. ábra). A valós idejű PCR-rel végzett számszerűsítés a veseexpresszióhoz viszonyítva 10--1,000-szer alacsonyabb transzgén expressziót mutatott az extrarenális szövetekben (3c. ábra). Az SBPkdlrA transzgén "SB" szabályozó elemei preferált renális expressziót biztosítottak; ezt a szervi eloszlást akkor is meghatározták, amikor c-myc-hez (SBM) és c-fos-hoz (SBF) kapcsolt transzgénekben használták (36, 38).

C-myc, a Pkd1 downstream effektora(policisztás vesebetegség 1)jelátviteli útvonalak SBPkdlrAc egerekben. Az SBPkdlrAg transzgenikus egerek intracelluláris patogenetikai mechanizmusába való betekintés érdekében a következő lépésben a c-myc vese expressziós szintjének nyomon követésére törekedtünk a c-myc deregulációra vonatkozó korábbi megfigyeléseink alapján humán ADPKD-ben. (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)vesék (22). A vesék elemzését mindhárom transzgenikus vonalból (3 (n =4), 39 (n =7) és 41 (n=4), valamint a kontrollokból végeztük. (n=4). Ahogy a 3d. ábrán látható, az SBPkd1TAG egerekben indukált endogén c-myc jelentős mértékben kifejeződik a hasonló korú kontroll egerekhez képest. Érdekes módon a c-myc expresszió szintje egyes SBPkd1-c vesékben. különösen a 39. vonal elérte a renális c-myc expresszióval előállított PKD SBM transzgenikus egérmodellben megfigyelt szinteket.

A PKD-hez hasonló vese anomáliák SBPkd1raG egerekben(policisztás vesebetegség). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>A 6. ábrán minden vonalra több tubuláris (T) és glomeruláris ciszta (G) alakult ki (4d, f és g ábra). A cisztákat a kortikális és a velős régióból származó tubulusokban, valamint a papillából gyűjtő tubulusokban figyelték meg (3. ábra). 4d és e). A transzgenikus egerek tubuláris epiteliális hiperpláziát (nyílhegy) mutattak, amely cisztás és nem cisztás tubulusokat is magában foglal, és gyakori hipertrófiát (4g. és h ábra), de a súlyosság az egyes egerek között változott. Gyakran figyeltek meg intersticiális fibrózist (F), perivaszkuláris limfoid infiltrátumokat és proteines gipszet (P) (4d. és e. ábra).

A megnövekedett Pkd1 lokalizációs helyének pontosabb meghatározása(policisztás vesebetegség 1)expresszióját a vesében, in situ hibridizációt végeztünk a korábban használt exon 36-45 próbával (16). A hibridizációs jelet specifikusan a cisztát és a hiperplasztikus tubulusokat borító hámsejtekre, valamint a glomeruláris cisztákra lokalizáltuk. Ezenkívül a nem cisztás vagy enyhén tágult tubulusok epitéliumán is látható volt némi jel, amely valószínűleg azonosította azokat a tubulusokat, amelyek jövőbeli cisztás változásokon mennek keresztül (4i. és j. ábra).

Születéskor (n =8), születés utáni 10. napon (P10) (n =3), P20(n =5), P35(n {) transzgenikus egereken veseszövettani elemzést is végeztek {7}}), és P45(n=3) összehasonlítva az azonos korcsoportba tartozó negatív alomtársakkal (n 2-4). Érdekes módon minden újszülött transzgenikus egér tubuláris és glomeruláris dilatációt mutatott a kontroll negatív alomtársakhoz képest (4k és l. ábra), ami azt jelzi, hogy a vese anomáliái a méhen belül kezdődtek, ahogy azt SBM egerekben és ADPKD-ben is megfigyelték. (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)betegek. A tubuláris és glomeruláris dilatáció mérete és száma az életkor előrehaladtával nőtt. A P35-re a transzgenikus egerek súlyosabb hiperpláziát és a glomerulosclerosis bizonyítékát mutatták. Megváltozott veseélettani funkciók SBPkd1TAG egerekben. Az összes transzgenikus egér veseélettani funkciói a PKD-hez hasonló tulajdonságokat mutattak(policisztás vesebetegség), míg a nem transzgenikus alomtársaknál soha nem alakult ki a betegség. A születés után néhány hónapon belül az érintett állatok krónikus veseelégtelenségben szenvedtek. Ezeknek az állatoknak a vesefunkciós paramétereit a szérum- és vizeletszintek, a vér karbamid-nitrogén- (BUN) és kreatininszintje, a vizelet ozmolalitása, a vizeletfehérje és az ionkiválasztás mérésével követtük (1. táblázat). A kontrollokhoz képest a három vonalból származó összes egér koncentrációs hibákat mutatott, ami gyakori megállapítás az ADPKD-ben, és ennek következtében csökkent a vizelet BUN-, kreatinin-, fehérje- és vaskoncentrációja. Az egyes vonalakból származó transzgenikus SBPkd1TAG alapítókat és utódokat (n 6) minőségileg ellenőriztük a proteinuria szempontjából vizeletmintákon SDS-PAGE segítségével (5. ábra). A 2 hónaposnál idősebb egerek nem szelektív proteinuriát mutattak, amely az életkorral előrehaladt. Ezenkívül a szérum BUN és szérum kreatinin szintje megemelkedett, ami veseelégtelenséget mutatott (2. táblázat). Mivel a krónikus veseelégtelenség általában a hematológiai paraméterek megváltozásához vezet, ezeket 3-14 hónapos SBPkd1TAG transzgenikus egereken vizsgáltuk (2. táblázat). Ezek a transzgenikus egerek vérszegények voltak, amit a jelentősen csökkent vörösvérsejtszám bizonyít, a hemoglobin és a hematokrit elérte a normál szintek felét. A többi vörösvértest-paraméter, például a retikulociták százalékos aránya nem változott, amint az várható volt, ha veseelégtelenség okozta. Ezek az állatok következetesen 5.{12}}.8 hónapos korukban (n 42) haltak meg veseelégtelenségben a 39-es transzgenikus vonal esetében, későbbi életkorban pedig 14.6 3.1 hónapos korukban (n 20) és 11 .7 6.5 hónap (n 7), a 3. és 41. sor esetén.

ÁBRA. 1. Egy egér Pkd1-BAC sematikus ábrázolása és részletes restrikciós térképelemzése.

A Pkd1 genomiális DNS-emésztési mintái(policisztás vesebetegség 1)A -BAC-t a Pkd1-hez hasonlították(policisztás vesebetegség 1)lókusz a 129Sv és C57Bl/6J beltenyésztett egértörzsekben. Hét próbát állítottak elő, amelyek az egér Pkd1 gén nagy részét tartalmazták:

(a) exon 1, (b) exon 2-3, (c) exon 7-15, (d) exon 15-20, (e) exon 25-34, (f ) exon 36-45 és (g) 45-46 exon, a-tól g-ig jelölve a genomiális Pkd1-en(policisztás vesebetegség 1)reprezentáció és az egyes blotok felett.

Southern blot analízis a Pkd1-BAC és az egér Pkd1 genomiális DNS restrikciós emésztéseit (BamHI, EcoRI, HindIII és KpnI) követően(policisztás vesebetegség 1)lókuszok mind a hét szondával azonos mintázatot mutattak. M: HindIII marker; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.

VITA

Itt egy egér Pkd1-BAC izolálását és jellemzését mutatjuk be. Ez a Pkd1(policisztás vesebetegség 1)A gént megjelölték, és a szabályozó elemeket két egymást követő homológ rekombinációs eseménnyel specifikusan a vesékbe történő expresszió céljára cserélték ki. Ezzel az új SBPkd1TAG génnel előállított transzgenikus egerekben a Pkd1 expressziója 2--15--szeresére nőtt, és reprodukálhatóan fejlődtek ki a PKD-re jellemző korai vesemorfológiai változások. A veseelégtelenség középkorban nyilvánul meg, és az egerek idő előtt elpusztulnak veseelégtelenségben. Eredményeink azt is jelzik, hogy az ezért a fenotípusért felelős Pkd1 túlzott expressziós mechanizmust a c-myc in vivo jelátviteli aktiválása közvetíti. Ez a tanulmány azt mutatja, hogy az egér Pkd1 funkciója a vesékben elegendő a PKD vese fenotípusának előállításához. Mivel az egér Pkd1 gén nem duplikálódik, mint az emberben (27), közvetlenül azonosítottunk és izoláltunk egy BAC klónt, amely a teljes Pkd1 gént tartalmazza. A 129/Sv egér Pkd1-BAC teljes jellemzése, közvetett összehasonlítás két másik beltenyésztett egértörzzsel, megerősítette a Pkd1 lókusz integritását. A Pkd1-BAC inszert 37-39 kb-nyi upstream és downstream szekvenciát tartalmazott a Pkd1 géntől. Elemzésünk kimutatta, hogy a Pkd1 gén ebben a BAC-ban egy jóhiszemű egér vad típusú lókusz volt, amely további vizsgálatokhoz szolgálhat. Bár erős bizonyíték van arra, hogy cisztaképződés ADPKD-ben (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)a heterozigótaság elvesztése lehet a normális PKD1 szomatikus inaktiválása után(policisztás vesebetegség 1)allél (3, 21, 32), arra is utaló bizonyíték van, hogy a cisztás tubuláris epitéliumban tartós vagy akár megnövekedett policisztin-1 expresszió (22, 29). Ez utóbbi megfigyelés felveti a kérdést, hogy a Pkd1 túlzott expressziója önmagában elég közeli oka-e a cisztogenezisnek. Humán PKD1-et hordozó transzgenikus egerekben(policisztás vesebetegség 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 és SLC9A3R2 gének esetében csak az egerek kisebb részében alakult ki ciszta, és egyiknél sem volt kimutatható transzgénexpresszió felnőttkorban a transzgén 30 kópiája ellenére (31). Azokban a transzgenikus egerekben nehéz volt megállapítani a Pkd1 túlzott expressziójának egyértelmű szerepét a cisztogenezisben. Modellünk különbözik, mivel a Pkd1 önmagában két-kilenc vad típusú másolatát, egymás melletti gének nélkül integráltuk transzgenikus egerekbe. Mivel a Pkd1 gén alapvető funkciókat tölt be különböző szervekben vagy szövetekben, amint azt számos, a Pkd1 gén ablációjával rendelkező egérnél leírták, a Pkd1 szisztémás túlzott expressziója további zavaró hatásokhoz vezethet. Következésképpen a Pkd1 funkcióerősítés szerepével foglalkoztunk egy olyan megközelítéssel, amely a Pkd1-et kifejezetten a vesékre célozza. Homológ rekombinációval először a Pkd1 upstream szabályozó régióját helyettesítettük az "SB" vese-korlátozott szabályozó elemekkel, ezzel megakadályozva a felnőttkorban a Pkd1 esetében általában megfigyelhető csökkent génexpressziót, valamint a lehetséges másodlagos visszacsatolási hurok szabályozást (36, 38). Másodszor, a rágcsáló Pkd1 transzgént (Pkd1TAG) a 10-es exonban néma pont mutációval jelöltük meg, de nem illesztettünk be epitóp címkét annak biztosítására, hogy egy teljesen működőképes "vad típusú" fehérje konzervált szerkezettel és integritással jöjjön létre. Ebből a módosított BAC-ból egy SBPkd1TAG fragmentumot tisztítottunk meg a Tsc2 géntől és a BAC vektortól, hogy megakadályozzuk a Tsc2 gén általi interferenciát, amely szintén cisztás fenotípust indukálhat (8, 20, 28), valamint hogy elkerüljük a Tsc2 gén gátló hatását. prokarióta szekvenciák (5).

Négy különböző SBPkd1TAG transzgenikus alapító egeret és három független vonalat állítottak elő specifikus vese Pkd1-gyel(policisztás vesebetegség 1)- fokozott kifejezésmód. Különösen feltűnő a fenotípus teljes penetranciája ezekben a transzgenikus egerekben. Az SBPkd1TAG alapítója és az egérvonalak számos fiziopatológiai jellemzőt osztottak meg az ADPKD-vel (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség). Ezek közé tartozik a ciszták kialakulása a kéregben, a velőben és a glomerulusokban, valamint a hámhiperplázia, az intersticiális fibrózis és a fokális intersticiális gyulladás.

Mivel a PKD(policisztás vesebetegség)A fenotípust minden transzgénikus alapító egérben következetesen megfigyelték, és a transzgén integrációja az egér genomjába véletlenszerű jelenség, a fenotípus nem a kromoszómális pozícióhatásból, hanem csak a megnövekedett Pkd1 expresszióból ered. Valójában a Pkd1 transzgén expressziója az összes vonalban vese-korlátozottnak bizonyult, amint azt korábban megfigyeltük más, az "SB" elemek által szabályozott transzgéneknél (36, 38). Ezenkívül ezt a megnövekedett Pkd1 expressziót a transzgén okozta, nem pedig egy közvetett endogén Pkd1 aktiváció. Eredményeink tehát egyértelmű bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy egy vad típusú funkcionális Pkd1 funkciója több vese cisztát is termelhet. Fontos, hogy ezek az SBPkd1TAG egerek alkotják az első egérmodellt, amelyet a humán PKD1 gén egérortológjának egyetlen túlzott expressziója hozott létre.

Az SBPkd1TAG egerek azt mutatják, hogy a Pkd1(policisztás vesebetegség 1)a túlzott expresszió a vese cisztogenezisének elsődleges patogenetikai mechanizmusa. Fontos, hogy a vesékben a legmagasabb transzgén expressziós szintek korrelálnak a fenotípus progressziójával és súlyosságával. Azt is megállapítottuk, hogy a Pkd1 túlzott expressziója az SBPkd1TAG fenotípus kialakulásában valószínűleg a c-myc in vivo aktiválódását jelzi. Elképzelhető, hogy ez az aktiválás akár közvetlenül is történhet a policisztin-1 C-terminális farkán keresztül, amely proteolitikus hasításon és nukleáris transzlokáción megy keresztül (7). Mivel a c-myc fokozott vese-expressziója felnőtt egerekben kimutatták, hogy PKD-t indukál, nagyon következetes lenne a c-myc támogatása a Pkd1 jelátviteli útvonalak fő downstream effektoraként. Ez az eredmény korrelált az összes humán ADPKD veséjében megnövekedett c-myc expresszióra vonatkozó korábbi megállapításainkkal is (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)elemezte (22). Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a c-myc a Pkd1 elsődleges közvetítője(policisztás vesebetegség 1)cisztogenezis. A Pkd1 funkciónövekedési modellből származó eredményeink, valamint az egér Pkd1 haploinsufficienciája és funkcióvesztése azt mutatják, hogy a Pkd1 bármilyen diszregulációja cisztogenezishez vezethet (2, 19, 23–26, 31, 40).

Súlyos Pkd1(policisztás vesebetegség 1)a Pkd1 által kiváltott egyensúlyhiány egerekben(policisztás vesebetegség 1)az abláció vagy a transzgenikus túlzott expresszió a vese ciszták korai megjelenését és gyors progresszióját okozta, és a tubulusok nagy részét érintette. Ezzel szemben az enyhébb Pkd1 egyensúlyhiány, mint például a haploinsufficientia, a PKD lassabb progressziójához vezetett, több fokális cisztával. Egy hasonló fenotípus látszólagos paradox fejlődése ellentétes policisztin-1 diszreguláció révén a közös eredménnyel magyarázható, nevezetesen egy relatív fehérjekoncentráció-egyensúlyzavarral, amely megváltoztathatja egy aktív policisztin multiprotein komplex kialakulását vagy működését. Összességében a mi és más kutatók eredményei azt állítják, hogy a cisztaképződés mechanizmusa ADPKD-ben (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség)Valószínűleg három patogenetikai mechanizmusból fakad: a funkció növekedése, a funkció elvesztése és a géndózis hatásai. Az új SBPkd1TAG egerek a vese cisztogenezisének erőteljes modelljét alkotják, amely jelentős betekintést nyújthat a PKD patofiziológiájába(policisztás vesebetegség), Pkd1(policisztás vesebetegség 1)jelátviteli útvonalak és kölcsönhatásban lévő partnerek. Ennek a modellnek a tanulmányozása új terápiás stratégiák kidolgozásához is vezethet a Pkd1 multimer komplexen belüli normál fehérjeegyensúly helyreállítására.

IRODALOM

1. Blouin, MJ, H. Beauchemin, A. Wright, MEDe Paepe, M. Sorette, A.-M. Bleau.B. Nakamoto. C.-N, Ou, G. Stamatovannopoulos és M. Trudel 2000. Sarlósejtes betegség genetikai korrekciója: betekintések transzgenikus egérmodellek használatával. Nat. Med. 6:177-182.

2. Boulter, C., S. Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle és R. Sandford. 2001. Szív- és érrendszeri, csontváz- és vesehibák egerekben a Pkd1 célzott megzavarásával(policisztás vesebetegség 1)gén.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:12174-12179.

3. Brasier, JL és EPHenske.1997.Loss of thepolicisztás vesebetegségA 16p13 kromoszóma (PKD1) régiója a vese ciszta sejtjeiben támogatja a ciszta patogenezisének funkcióvesztési modelljét. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connors, WRDackowski, LRPetry, TJVan Raay, JM Millholland, M. Venet, G. Miller, RM Hakim, GMLandes, KW Klinger, F. Qian, LF Onuchic, T. Watnick, GG Germino és NA Doggett.1995.A genomiális szekvencia elemzése aautoszomális domináns policisztás vesebetegség(PKD1) gén előrejelzi a leucinban gazdag ismétlődés jelenlétét. Zümmögés. Mol. Genet.4:575-582.

5. Chada, K, J. Magram, K. Raphael, G. Radice, E. Lacy és F. Costantini.1985. Idegen -globin gén specifikus expressziója transzgenikus egerek eritroid sejtjeiben. Nature 314:377-380.

6. Chauvet, V, F. Qian, N. Boute, Y. Cai, B. Phakdeekitacharoen, LF Onuchic, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O. Devuyst, GG Germino és M.-C. Gubler.2002. A PKD1 kifejeződése(policisztás vesebetegség 1)és PKD2(policisztás vesebetegség 2)transzkriptumok és fehérjék az emberi embrióban és a normál vesefejlődés során. Am. J. Pathol 160:973-983.

7.Chauvet, V., X. Tian, ​​H. Husson, DHGrimm, T. Wang, T. Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo és MJ Caplan.2004. A mechanikai ingerek a policisztin-1 C-terminális hasítását és nukleáris transzlokációját váltják ki. J. Clin. Investig. 114:1433-1443.

8. Cheadle, JPMP Reeve, JR Sampson és DJ Kwiatkowski.2000. Molekuláris genetikai fejlődés a gumós szklerózisban. Zümmögés. Genet.107:97-114. 9. Konzorcium, EPKD1993. A 16-os kromoszómán lévő szklerózis gumós gén azonosítása és jellemzése. 75. sejt:1305-1315.

10. Consortium, EPKD1994. A policisztás vesebetegség 1. génje egy 14 kb-os transzkriptumot kódol, és a 16. kromoszóma duplikált régiójában található. 77. sejt:881-894.

11. Konzorcium, IPKD1995. Policisztás vesebetegség: a PKD1 teljes szerkezete(policisztás vesebetegség 1)gén és fehérje. 81. cella:289-298.

12. Couillard, M., R. Guillaume, N. Tanji, V. DAgati és M. Trudel.2002. A c-myc által kiváltott apoptózis policisztás vesebetegségben független a FasL Fas kölcsönhatástól. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, ME és M. Trudel.1994. A transzgenikus SAD egér: az emberi sarlósejtes glomerulopathia modellje. Kidney Int. 46:1337-1345.

14. Geng, L., Y. Segal, B. Peissel, N. Deng, Y. Pei, F. Carone, HGRennke, AM Glücksmann-Kuis, MC Schneider, M. Ericsson, STReeders és J. Zhou. 1996. A policisztin, a PKD1 azonosítása és lokalizációja(policisztás vesebetegség 1)géntermék. J. Clin. Investig. 98:2674-2682.

15. Gong, S., XWYang, C. Li és N. Heintz.2002. Bakteriális mesterséges kromoszómák (BAC) rendkívül hatékony módosítása új, R6Ky replikációs origót tartalmazó inga-vektorok felhasználásával. Genome Res. 12;1992-1998.