Az átalakuló növekedési faktor (TGF-) központi szerepe a vesefibrózis kialakulásában
Mar 26, 2022
Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Ⅰ RÉSZ: Az emberi elsődleges vesefibroblaszt szerepe a TGF{0}}közvetített fibrózist utánzó eszközökben
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee és társai.
1. Bemutatkozás
Vesefibrózis, a számtalan progresszív vesebetegség végső közös útja, az extracelluláris mátrix (ECM) fehérjetermelés fokozódása, a mátrix degradáció csökkenése, a sejt-mátrix kölcsönhatás diszfunkciója, a rezidens sejtek átalakulása és a gyulladásos sejtek beszűrődése jellemzi.Átalakító növekedési faktor-A (TGF-) egy többfunkciós dimer peptid, amely szabályozza a biológiai folyamatokat, például a sejtproliferációt, a differenciálódást és az immunológiai válaszokat [1]. A számos fibrogén faktor közül a TGF- (Átalakító növekedési faktor-) központi szerepet játszik és gyulladáscsökkentő hatású. TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-)- a hiányos egerek masszív gyulladásban pusztulnak el. TGF-et túltermelő transzgénikus egerek- 1(Átalakító növekedési faktor-)gyakorlatilag védve vannak a vese fibrotikus patológiáitól, főként gyulladáscsökkentő hatása révén [2]. A TGF profibrotikus és gyulladásgátló tulajdonságai(Átalakító növekedési faktor-)kétélű kardok a TGF-terápiás alkalmazásában(Átalakító növekedési faktor-)gátlás. Figyelemre méltó erőfeszítéseket tettek a TGF-gátlásra.(Átalakító növekedési faktor-)előrehaladását akadályozó intézkedésekvese-fibrózis[3]. Bár számos megközelítést alkalmaztak a leküzdésrevese-fibrózis, egy kísérleti modell a jelenleg elérhető gyógyszerek értékelésére nem ideális.
cistanche gyógynövény megakadályozzavesebetegségek
Általánosságban elmondható, hogy az állatkísérletek kulcsszerepet játszanak a preklinikai tesztekben a farmakokinetika és a gyógyszerhatékonyság előrejelzésében. Különböző különbségek vannak azonban az állatok és az emberek között, ami arra késztet bennünket, hogy megkérdőjelezzük az állati alapú gyógyszer-hatékonysági és biztonsági tesztek pontosságát. 4. A korábbi jelentések a gyógyszerfejlesztés során végzett preklinikai állatkísérletek alapján értékelték a gyógyszerek nefrotoxicitását és biztonságosságát. Az állatok veseműködése több mint kétszerese az emberi veséknek. Ennélfogva a gyógyszerek gyorsabban metabolizálódnak az állatokban, mint az emberekben, ami megnehezíti a gyógyszertoxicitási vizsgálatok eredményeinek állatkísérletekkel történő tisztázását. Továbbá az állatkísérletek eredményei nem használhatók fel az emberek gyógyszerreakcióinak előrejelzésére, mivel az állatok élettani funkciói eltérőek. Állati alapúvesefibrózisa modelleknek nehézségei vannak az ember reprodukálásábanvesefibrózis; ezért kutatások folynak a jelenlegi akadályok leküzdésére és a kábítószer-felfedező platformok optimalizálására [5].
Az organ-on-a-chip (OoC) technológia új koncepcióként jelent meg ezeknek a problémáknak a megoldására. Ezt a platformot a jelenlegi hiányosságok figyelembevételével alakították ki, és a nefrológia területén ígéretesnek bizonyult [6]. Emellett az OoC-modellek nagy lehetőségeket rejtenek a kísérleti állatmodellek helyettesítésére, megoldást nyújtanak a fajok közötti különbségekre, és segíthetnek véget vetni az állatkínzásnak és az etikai vitáknak [7]. Kevés olyan in vitro modell létezik, amely egyszerre használ primer vesefibroblasztokat endoteliális és epiteliális sejtekkel, amelyek fontos sejtekvesefibrózis. Minden egyes sejt szerepefibróziskülön tanulmányozzák; a sejtek interakciójáról azonban korlátozott ismeretek állnak rendelkezésre.
Jelen tanulmányban kifejlesztettükfibrózis- humán primer fibroblasztokat használó eszközök utánzása. Megerősítettük, hogy a TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-)A kezelés különféle hatással van avesefibrózismodell. Nevezetesen, a fibroblasztok kulcsszerepet játszanak effektor sejtekként, elősegítik a pro-fibrotikus mikrokörnyezet kialakulását, és növekedési faktorokat és citokineket választanak ki. Ezért ezen új módszer alapján a fibroblasztok ideális sejtmodell rendszert jelenthetnek a vesebetegségek tanulmányozására. Megvizsgáltuk, hogy a fibrotikus vesebetegségből származó fibroblasztok befolyásolják-e a három dimenzióban (3D) tenyésztett sejtek integritását. Végül bemutatunk egy alapelv-tanulmányt, amely bemutatja az emberben rejlő lehetőségeketvesefibrózis-utánzó eszközök mint modell az emberre adott válasz előrejelzésérevesefibrózis.
a cistanche hatásai: vesefertőzés kezelése
2. Eredmények
2.1. Az alfa sima izom aktin(a-SMA) és keratin-8(KRT-8) azonosítása a TGF-fel- 1(Átalakító növekedési faktor-)HK{0}} cellákban
A korai fázisban megvizsgáltuk az ismert markereketfibrózisés a citoszkeleton kétdimenziós (2D) kultúrákban. Immunfluoreszcens festési vizsgálatokat végeztünk a fibrózis és a tubuláris epithelialis-mezenchimális átmenet (EMT) marker -SMA expressziójának és a KRT8 szintnek mint citoszkeleton markernek a becslésére. Az immunfluoreszcens festés azt mutatta, hogy a -SMA expressziója eredetileg gyenge volt, és a KRT8 szintje magas volt az egyrétegű HK-2 epiteliális sejtekben. A TGF nem változott szignifikánsan a fluoreszcencia intenzitásában- 1(Átalakító növekedési faktor-)(5 ng/ml) vagy a HK-2 hámsejtek specifikus inhibitoros kezelése 24 órán keresztül (1. ábra).
1. ábra. Az immunfluoreszcencia azt mutatja, hogy az alfa-SMA és a keratin-8(KRT8) expressziója megmaradt a TGF- 1 kezelésével(Átalakító növekedési faktor-)vagy az inhibitor a HK-2 sejtekben.(A)Az alfa-SMA és (B)CCK-8 expressziója nem volt hatással a HK-2sejtekre a TGF- 1 által(Átalakító növekedési faktor-)(5 ng/ml) vagy az inhibitor. A sejteket eredetileg 1 × 10 fok/lyuk sűrűségben szélesztették (ac) kezeletlen kontroll és (df) 5 ng/ml TGF-fel stimulálva{6}}(Átalakító növekedési faktor-) vagy (gi) 10 μM inhibitor (SB431542) 24 órán át, és 4 százalékos paraformaldehiddel rögzítve. A sejteket ezután anti- -SMA-val és anti-citokeratinnal-8 festettük 20 percig. A sejtmagok azonosítására Hoechst H33342 festékkel együttes festést végeztünk. A mikroképeken látható skálasávok 200 um-t jeleznek.
cisztanche por javítja a veseműködést
2.2. A KRT8 kifejezést csökkentette a TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-)egy Chipen
Ezt követően értékeltük az -SMA és a KRT8 expressziós szintjét 3D-ben tenyésztett HK-2-ban, valamint a TGF-fel kezelt GFP-humán köldökvénás endothelsejtek (HUVEC) teljes hosszát- 1(Átalakító növekedési faktor-)és egy specifikus inhibitor. Ennek elérése érdekében először létrehoztunk egy szövetchip mintázatot, amely két sejttípusból, a HK-2 hámsejtekből és a GFP-HUVEC-ből áll. A konstrukció megerősítése után a szövetchipet TGF-fel tártuk fel- 1(Átalakító növekedési faktor-)(5 ng/ml) vagy specifikus inhibitorral (10 um SB431542) 24 órán át.
Amint a 2A-C. ábrán látható, a -SMA expresszióját a TGF- 1 nem változtatta meg specifikusan.(Átalakító növekedési faktor-)vagy a specifikus inhibitor kezelés. A KRT8 expressziója azonban csökkent a kétsejtes típusú, együtt tenyésztett chipben. Ezenkívül a TGF-ß1 inhibitor hozzáadása növelte a KRT8 expresszióját.
Megvizsgáltuk egy 3D tubuláris kapillárisszerű hálózat kialakulását TGF-fel- 1(Átalakító növekedési faktor-)kezelés HUVEC-ben, mivel az endothel sejtek spontán módon 3D tubuláris kapillárisszerű hálózatot alkothatnak. Kulturális viszonyainknak megfelelően a vastag vonalak kialakulása jelentősen csökkent. A kapillárisszerű vékony vonalak azonban megnövekedtek a TGF-ben- 1(Átalakító növekedési faktor-)kezelt GFP-HUVEC-ekkel. A TGF esetében- 1(Átalakító növekedési faktor-)inhibitor kezelés a 3D-s tenyésztésű chipen, a vastag és vastag vonalak teljes hossza fordított tendenciát mutatott a TGF-re- 1(Átalakító növekedési faktor-)kezelés. A vastag vonal hosszának növekedését figyelték meg a kezeletlen kontrollcsoporthoz képest. Hasonló mintázatot figyeltek meg a vastag vonal átmérőjében a GFP-HUVEC-ben a TGF- 1 után(Átalakító növekedési faktor-)kezelés és gátló kezelés. A GFP-HUVEC átmérőjét elnyomta a TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-)kezelés, de a vonal vastagságától függetlenül nőtt az inhibitor hatására, mind a kontrollokhoz, mind a TGF-hez képest{0}}(Átalakító növekedési faktor-). A vastag vonal teljes hosszát és átmérőjét drámaian megnövelte a TGF{0}} gátló kezelés a kezeletlen kontrollhoz és a TGF{1}} kezeléshez képest. Nevezetesen, a kapott eredmények azt mutatták, hogy a TGF-ben megnövekedett az apró erek sűrűsége.(Átalakító növekedési faktor-)-kezelt csoport a nem kezelt társaikhoz képest. Ezzel szemben a vastag erek sűrűsége a TGF-ben- 1(Átalakító növekedési faktor-)A kezelt csoport alacsonyabb volt, mint a kezeletlen kontrollcsoportban (2D, E ábra).
2. ábra: KRT8 expresszió HK-2-ban, valamint a HUVEC-k teljes hossza és átmérője.(A) Az immunfluoreszcencia azt mutatja, hogy a -SMA expressziója megmaradt, és a KRT8 expressziója drámaian csökkent a TGF- 1 kezelés hatására.(Átalakító növekedési faktor-)HK-ban-2. A sejteket szélesztettük, és 5 ng/ml TGF-fel stimuláltuk{2}}(Átalakító növekedési faktor-)vagy 10 μm inhibitorral (SB 431542) 24 órán át, és 4 százalékos paraformaldehiddel rögzítve. A sejteket anti- -SMA-val és anti-citokeratinnal-8 festettük 20 percig. A sejtmagok azonosítására Hoechst H33342 festékkel együttes festést végeztünk. A -SMA(ac) expressziója nem változott, de a KRT8(df) HK-2 sejtekben és a GFP a HUVEC (gi) expressziójában szignifikánsan megváltoztatta a TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-)(5 ng/mL) és az inhibitor (B, C). A HUVEC-k teljes hosszában a vékony ér nőtt, de a vastag eret csökkentette a TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-). Az átmérőt megnövelték a vékony és vastag edényekben is. Ezeket az eredményeket az SB431542 inhibitor (D, E) megfordította. A skálasávok a mikrográfokon 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
mire használják a cistanche-t: krónikus vesebetegségek kezelésére
2.3. TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-)A többrekeszes szerkezetű chip három sejttípusát érinti
A TGF tanulmányozása- 1(Átalakító növekedési faktor-)A javasolt 3D chip válaszreakcióit minden egyes kompartmenten külön-külön végeztük el (3. ábra). Ebben az elemzésben elsődleges humán vese fibroblasztokat használtunk. A mintákat FACS segítségével elemeztük, és megerősítették, hogy pozitívak a fibroblaszt marker antitestre. A három sejttípus TGF-fel történő inkubálása után- 1(Átalakító növekedési faktor-)24 órán keresztül immunfestést végeztünk az -SMA és a KRT8 expressziójának értékelésére. Az a-SMA expresszióját a TGF-1-kezelés fokozta, míg a TGF- 1-val ellentétes eredményeket figyeltek meg.(Átalakító növekedési faktor-)inhibitor kezelés. Ezzel szemben a KRT8 expresszióját csökkentette a TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-)és ellentétes választ mutatott a TGF-re(Átalakító növekedési faktor-)inhibitor (4A-C. ábra).
3. ábra Mintakép a gyártás és a kísérleti ütemterv készülék sematikus bemutatásával.(A) A felső két képen az elrendezés látható. A bal oldali kép a készülék felülről lefelé néző átfogó fotóját mutatja. Az alsó képek a keresztmetszetet mutatják. A folyadékvezetők méreteit részletező sematikus nézet. (B) Ez az ábra a kísérleti ütemezést írja lefibrózis-utánzó eszközök. Az egyes lyukak négylépéses betöltési folyamata. Az egyes hidrogélmintázati területek elhelyezkedése, valamint a közeg elhelyezése felülről lefelé és izometrikus keresztmetszetben. (1) Összesen 1,5 uL hidrogél 1 kerül spontán módon a központi csatornába. (2) A központi csatorna 5 ul hidrogéllel van feltöltve. (3) Összesen 10 uL hidrogél 3 van mintázva a tartály alján. (4) Összesen 200 μL médiát adnak ki. Piros skálasáv=9 mm.
Amint az a 4D-G ábrán látható, a kapillárisszerű vékony vonal hosszát jelentősen megnövelte a TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-)kezelés a GFP-HUVEC-ben. A vastag vonal vastagsága azonban csökkent a TGF-ben- 1(Átalakító növekedési faktor-)kezelt HUVEC-eket. Az átmérő átlagosan csökkent a vékony és vastag erek esetében a HUVEC-ekben. A TGF esetében- 1(Átalakító növekedési faktor-)A 3D-s tenyésztésű chipen végzett inhibitor kezelés során a vastag és vastag vonalak teljes hossza ellentétes tendenciát mutatott a TGF- 1 kezeléssel. Továbbá a vastag vonal hossza megnőtt a kezeletlen kontrollcsoporthoz képest.
4. ábra: 3D-ben tenyésztett HK-2 és HUVEC-k változása primer vesefibroblasztokkal.Az összes sejtet 3D chipenként 5 × 10 fokos sűrűséggel szélesztettük, és 5 ng/ml TGF-fel stimuláltuk- 1(Átalakító növekedési faktor-)vagy 10 μm inhibitorral (SB 431542) 24 órán át, és 4 százalékos paraformaldehiddel rögzítve. (A) A 3D chipben lévő sejteket anti-o -SMA-val és anti-citokeratinnal-8 festették. A TGF- 1(5 ng/mL) szignifikánsan növelte az -SMA (ac) expresszióját, és csökkentette a KRT8(df) expresszióját. A HUVEC-ek teljes hossza; A vékony ereket drámaian megnövelte, a vastag ereket pedig csökkentette a TGF-ß1(Átalakító növekedési faktor-)(D, E). Az átmérőt csökkentettük vékony és vastag edényeknél (F, G). Ezeket az eredményeket az SB431542 inhibitor megfordította. A skála a mikrográfokon 100 μm.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Modulálja a gyulladásos mediátort és a növekedési faktorokat
Ezt követően a gyulladásos citokineket és növekedési faktorokat vizsgáltuk a felülúszóban; IL-1, FGF-2, TGF- 2(Átalakító növekedési faktor-)és TGF- 3(Átalakító növekedési faktor-)a fehérjeszekréció drámaian magasabb volt a 3D-s tenyésztésű chipekben, mint a jól tenyésztett 2D fibroblasztokban, annak ellenére, hogy a teljes sejtszámuk azonos volt. Azonban a TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-) a szintek hasonlóak voltak, mivel a 2D-s vagy 3D-s tenyésztésű modelleket hasonló koncentrációjú TGF-fel kezelték- 1(Átalakító növekedési faktor-)(5A-E. ábra). Különösen az FGF-2 felszabadulása a humán primer vesefibroblasztokból 20,9 ± 0},4 pg/nap/5×10 fokos sejt a 2D egyrétegű tenyészetből és 3094,8±0,2 pg/nap/5×10 fokos sejt, beleértve a HUVEC-eket és a 3D-tenyésztett chip HK-2-át a kezeletlen kontrollban. Az FGF-2 szekréciója a TGF- 1 által(Átalakító növekedési faktor-)A stimuláció 31.0±0,2 pg/nap/5×10 fokos sejt volt a 2D tenyészetben és 3683,9± 0,8 pg/nap/5×10 fokos sejt a 3D-ben -tenyésztett chip. A 2D egyrétegű tenyészetben az FGF-2 fehérjetermelés növekedése párhuzamos volt a TGF- 1 3D-s tenyésztésű chip modelljének növekedésével.(Átalakító növekedési faktor-)kezelés (5B. ábra).
5. ábra: 2D- és 3D-kultúrás modellek összehasonlítása, mint vesefibrózist utánzó platformok.A sejteket 2D lyukonként vagy 3D chipenként 5 × 10 fokos sűrűséggel szélesztettük, és 5 ng/ml TGF-fel stimuláltuk{5}}(Átalakító növekedési faktor-)vagy 10 um inhibitorral (SB 431542) 24 órán át. Primer humán vesefibroblasztokat használtunk a 2D-s tenyésztésben és a 3D-s tenyésztési modellben. A fibroblasztokat 8×10* sűrűségben használták, HUVEC-kkel és HK-val-2 tenyésztve. Az elsődleges humán vese fibroblaszt-HUVEC arány vagy F:H arány 1:5 volt az értékeléshez.fibrózis.HK-2 sejteket használtunk 2×104 sűrűségben. Az (A)IL-1, (B)bázis fibroblaszt növekedési faktor (FGF-2) és (CE)TGF-béta 1, 2 és 3 kimutatását a felülúszóban a citokinek és multiplex gyöngy immunoassay. Mindegyik oszlop az átlagot ± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Átalakító növekedési faktor-).
A cistanche tubolosa előnyei: vesebetegségek kezelése
Ezenkívül megbecsültük a pro-inflammatorikus citokinek, például az IL-1, IL-6, IL-8 és a TNF- mRNS expresszióját. Az eredményeket jelentősen csökkentette a rekombináns humán TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-)kezelés a 3D-tenyésztett chipben, mint a TGF- gyulladáscsökkentő tulajdonsága(Átalakító növekedési faktor-). Azt találtuk, hogy az mRNS-expressziót a TGF{0}}(Átalakító növekedési faktor-)inhibitor (SB431542). Ezenkívül az IL-6, IL-8 és TNF-inhibitor által közvetített expressziója specifikusan csökkent a kezeletlen kontrollhoz képest (6A-D ábra). A VEGF, egy fibrotikus faktor mRNS szintjét szignifikánsan megnövelte a TGF- 1(Átalakító növekedési faktor-)kezelés. A VEGF mRNS szintjét a TGF- 1 inhibitor csökkentette (6E. ábra), míg az antifibrotikus hatású IL-10 mRNS-expressziója csökkent a TGF- 1 által kiváltott fibrotikus állapotokban. . Ezzel szemben az I-10mRNS expressziója megnőtt a TGF- 1inhibitor kezelés hatására (6F. ábra).
6. ábra. A valós idejű PCR a 3D chip teljes mRNS expresszióját mutatja.A sejteket 3D chipenként 5 × 10 fokos sűrűséggel szélesztettük, és 5 ng/ml TGF-fel stimuláltuk- 1(Átalakító növekedési faktor-)vagy 10 um inhibitort (SB431542) 24 órán át. A 3D-vel tenyésztett chipből kivont teljes RNS. Az (A)IL-1, (B)TNF-, (C)IL-6 és (D)IL-8 mRNS expressziója a TGF{ gyulladásgátló hatását jelenti. {10}}(Átalakító növekedési faktor-)kezelés. Az (E)VEGF mint angiogén faktor expressziója megnövekedett. Az (F)IL-10 expresszióját mint antifibrotikus faktort szignifikánsan csökkentette a TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Átalakító növekedési faktor-).
