A cirkadián óra szabályozza a ritmikus eritropoetin expressziót az egérvesében

További információ:ali.ma@wecistanche.com

Lina K. Sciesielsk et al

A Cistanche tubulosa megelőzi a vesebetegséget, kattintson ide atermékek és Cistanches

A cirkadián ritmusok generálása sejtautonóm, és egy transzkripciós/transzlációs visszacsatolási hurkon alapul, amelyet a cirkadián óra transzkripciós faktor aktivátorok családja, köztük a CLOCK, BMAL1 és represszorok, például CRY1 és CRY2 vezérel. Jelen tanulmány célja a cirkadián eritropoetin expresszió molekuláris mechanizmusának és hemopoetikus hatásának vizsgálata volt. A cirkadián eritropoetin szabályozásának tisztázására olyan mutáns egereket használtunk, amelyekben a központi cirkadián óragének, az 1. és 2. kriptokróm (Cry-null) homozigóta deléciója volt. A vad típusú kontroll egerek szignifikáns különbséget mutattak aveseeritropoetin mRNS expressziója a cirkadián idő 06 és 18 között. Ezzel párhuzamosan szignifikánsan nagyobb számú eritropoetint termelő sejtvese(RNSscope segítségével) és a keringő eritropoetin fehérje szignifikánsan magasabb szintjét (ELISA-val) a cirkadián idő 18-án detektáltuk. Az ilyen változások megszűntek a Cry-null egerekben, és függetlenek voltak az oxigénfeszültségtől, az oxigéntelítettségtől vagy a hipoxia által kiváltható 2-alfa faktor expressziójától, ami azt jelzi, hogy hogy a cirkadián eritropoetin expresszióját a CRY1 és a CRY2 transzkripciósan szabályozza. A riportergén vizsgálatok azt mutatták, hogy a CLOCK/BMAL1 heterodimer aktivál egy E-box elemet az 5' eritropoetin promoterben. Az RNAscope in situ hibridizáció megerősítette a Bmal1 jelenlétét az eritropoetint termelő sejtekben.vese. Cry-null egerekben szignifikánsan csökkent a retikulociták száma, miközben az eritrocitaszám és a hematokrit nem változott. Így a cirkadián eritropoetin szabályozása normoxiás felnőtt egérbenveseA CLOCK/BMAL1 fő cirkadián aktivátorok és a CRY1/CRY2 represszorok transzkripciósan szabályozzák. Ennek a megállapításnak kihatásai lehetnekvese fiziológiájaés betegségek, laboratóriumi diagnosztika és vérszegénység terápia.

KULCSSZAVAK:kronobiológia; cirkadián ritmus; óra; kriptokróm; eritropoietin; vérképzés; hipoxia-indukálható faktor

Translation Statement A molekuláris órák szinte minden sejttípusban szövetspecifikus faktorokkal együttműködve irányítják a géntranszkripciót. Eddig a cirkadián oszcillációs mechanizmusok avesenem hozták összefüggésbe az eritropoetin (Epo) biológiájával. Itt világossá vált, hogy a cirkadián Epo-expressziót a fő órafehérjék (1. és 2. kriptokróm, Clock és Bmal1) szabályozzák. Mivel az EPO sajátosan hat az eritropoézis komplex szabályozó hálózatán belül, a rekombináns humán EPO optimális felhasználása olyan betegeknél,veseAz elégtelenség magában foglalhatja a fiziológiás cirkadián maximum éjfél körüli fellépését.

A nefrológiában a cirkadián ritmusok nagyrészt feltáratlanok, de nagyon relevánsak, mivel a műszakos munka, az életmódválasztás és az öregedés miatti megzavarásuk a különféle betegségek, köztük a szív- és érrendszeri rendellenességek fokozott kockázatával jár.^1–4A zavart cirkadián órák állatmodelljei szolgáltatják az első bizonyítékot a cirkadián diszreguláció hematopoietikus rendszerre gyakorolt ​​negatív hatására (pl. az elöregedett eritrociták számának növekedésével).^5,6

Ami az eritropoézist illeti, nemcsak a sejtre gyakorolt ​​hatások, hanem az elsődleges szabályozó, az eritropoetin (Epo) ritmikussága is különösen érdekes, mivel a sportolókat ismételten vádolják rekombináns humán Epo-val (ki) való vérdoppinggal a napszaktól függő különbségek miatt. A keringő Epo-koncentráció és a hematológiai paraméterek.7,8 A humán szérum Epo (S-Epo) szintjének napi változásait először 1981-ben írták le krónikus tüdő- és szénmunkások légúti betegségben szenvedő betegeknél,⁹és ezt követően egészséges alanyokban.^10,11A mai napig számos jelentés magas S-Epo szintet jelez éjszaka (20:00 és 4:00 óra között), és alacsony S-Epo szintet kora reggel (4:00 és 8:00 között). Az S-Epo oszcilláció fázisa és amplitúdója, ha egyáltalán jelen van, az emberi egyedek között változó.^9,10,12,13Az S-Epo szintek átlagosan körülbelül 1.{2}}szeresére változtak a minimumukhoz képest.^14–22Ezt a napi ritmust nem befolyásolja az öregedés,20 edzés,16 vagy a tengerszint feletti expozíció.17 Ezzel szemben az S-Epo napi oszcillációja megszűnt krónikus obstruktív tüdőbetegségben szenvedő betegeknél, akiket nappali hipoxémia bonyolít, myelomában és veseelégtelenségben. és myelodysplasiában.^15,21,23

2009-ben leírtuk a cirkadián Epo mRNS expresszióját az egérvesében az óravezérelt gének promotereinek nagyszabású elemzése során, de nem tudtunk azonosítani sem az EPO génben lévő különálló genetikai elemet, sem a cirkadián oszcillációért felelős transzaktiváló faktort. 24 A közelmúltban a hemorrhagiás sokk patkánymodellje párhuzamos expressziós minták szerint azt sugallta, hogy az óragének (Bmal1 és Per2) részt vesznek az EPO szekréció szabályozásában hipoxia/ischaemia során.²⁵

A cirkadián ritmusok generálása sejtautonóm, és egy transzkripciós-transzlációs visszacsatolási hurkon alapul, amelyet a cirkadián óra transzkripciós faktorok családja vezérel, beleértve a CLOCK, BMAL1, PER1, PER2, CRY1 és CRY2.26 A CLOCK/BMAL1 heterodimer ion aktiválja a CLOCK/BMAL1 trankripciót. A PER1/2 és CRY1/2 cirkadián óragének a promótereikben lévő E-box elemekhez kötődnek. A PER és CRY fehérjék azonban negatív visszacsatolást biztosítanak azáltal, hogy gátolják a CLOCK/BMAL1 aktivitást, ezáltal csökkentve saját expressziójukat. A nettó eredmények a cirkadián génexpresszió oszcillációs mintázatához és a sejt- és szervfiziológiában bekövetkező ritmikus változásokhoz vezetnek.²⁷

A biológiai óra hatásainak megértéséhez eddig különböző típusú mutáns egereket tanulmányoztak, amelyek egymagos óratranszkripciós faktorokkal rendelkeznek.28,29 Itt a Cry1–/–/Cry2–/– kettős mutáns előnyeit használtuk. egerek (Cry-null), amelyek nem képesek kifejezni endogén cirkadián ritmusokat.^26,30A kombinált in vivo és in vitro adatok azt mutatják, hogy a Cry1/2 szabályozza a cirkadián Epo expressziót a CLOCK/BMAL{2}}indukált transzkripció révén a normoxiás vesében.

MÓD

Állatkísérletek

Homozigóta Cry1–/– /Cry2–/– állatokat (Cry-null; hím és nőstény; C57BL/6J-alapú)31 és vad típusú (WT) kontrollokat (For-schungseinrichtungen für Experimentelle Medizin Charité) tenyésztettek és 5 állatig neveltek. 7 hónapig. A WT egerek a Cry-null kolónia tenyésztéséből származtak.

A Cry-null genotípust polimeráz láncreakcióval igazoltuk (S1 kiegészítő táblázat). A beszállításhoz az egereket csoportokban tartották, és ad libitum táplálékot és vizet kaptak egy 12-óra:12-órás világos/sötét ciklusban 14 napig. Az állandó sötétségbe engedés utáni 2. napon az állatokat a cirkadián időpontban (CT) 06. vagy 18. (n ¼ 13–15 minden csoportban és időpontban) leöltük. A szöveteket (máj és vese) gyorsan kinyertük, és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. A hím és nőstény WT és Cry-null állatok egy alcsoportját részletesen elemeztük a testtömeg és a differenciális hemogram alapján.

A vérgáz analízishez az állatokat elaltattuk (fentanil, {0}},075 mg/kg, midazolam, 1,5 mg/kg és medetomidin, 0,75 mg/kg), tracheotomizáltuk, intubáltuk és lélegeztettük. térfogat, 9 ml/kg, légzésszám, 160 perc- 1, pozitív végkilégzési nyomás, 2 cm H2O), a leírtak szerint.32 Polietilén katétert sebészi úton vezettünk be a bal nyaki artériába. 5 perc stabilizálás után a kísérletet a nyaki carotis katéteren keresztül történő gyors kivéreztetéssel befejeztük, vérgázokat elemeztünk (ABL-800; Radiometer; hőmérséklet-szabályozott), és a veséket kimetsszük a post hoc elemzésekhez.

Az összes eljárást a Helyi Állatgondozó Bizottság engedélyezte (T0307/08; G0100/17 2021. januári kiegészítéssel), és a német állatvédelmi törvény irányelveinek és előírásainak megfelelően hajtották végre.

RNS készítése és kvantitatív polimeráz láncreakció analízis

A teljes RNS-t a leírtak szerint extraháltuk.33 Összesen 1000 ng teljes RNS-t írtunk reverz transzkriptázzal SuperScript III reverz transzkriptázzal (Thermo Fisher; No. 18080085) és random hexamerekkel (Thermo Fisher; No. SO142), a gyártó utasításai szerint. A kvantitatív polimeráz láncreakciókat StepOnePlus cikluson (Life Technologies) futtattuk, intronokat átfogó primerekkel vagy TaqMan tesztekkel (S2 kiegészítő táblázat). Az abszolút mRNS mennyiségi meghatározását a polimeráz láncreakció templát sorozathígításainak standard görbéjével való összehasonlítással értük el.

Az Epo mRNS expressziójának kimutatása vesében RNS-scope technikával

Az RNAscope assay-t a gyártó protokollja szerint végeztük (ACD; 320536 műszaki megjegyzés). A 10-mm-es vese keresztirányú kriometszeteit C1 próbával festettük meg DapB (negatív kontroll; ACD; No. 310043) vagy Epo (ACD; No. 315501) ellen. A hibridizációs lépések az Amp 4-6 használatával és a piros jelek észlelése kimaradtak. Két független, vak kutató megszámolta az Epo-pozitív sejteket 200-as eredeti nagyítással, 3-8 kriometszetben egy Axioplan 2 képalkotó rendszerben (Zeiss).

A reprezentatív Epo-kvantifikációs képeket és a kettős fluoreszcens festést az RNAscope Multiplex FluorescentDetection Reagent V2 Kit (ACD; No. 323110) segítségével végeztük, a gyártó protokollja szerint. Az 15-mm-es veseközép keresztirányú para metszeteket C1 próbával Bmal1 ellen (ACD; No.438741) és C2 próbával Epo ellen (ACD; No. 315501-C2) festettük. Opaleye 520-at (Akoya BioSciences; No. FP1487001KT) használtunk a C1 szondához, és 650 opálfestéket (Akoya BioSciences; No. FP1496001KT) használtunk a C2 szondához. Eredeti nagyítással - 400 az Epo-pozitív sejteket Bmal1 kolokalizációra leképezték egy Eclipse Ti2imaging rendszerben (Nikon). A 40,6-diamidino-2-fenil-indolt használtuk ellenfestésként.

EPO szérumkoncentráció

A vérmintákat 1 órán át szobahőmérsékleten hagytuk alvadni, majd 20 percig centrifugáltuk 2000 - g-vel. A szérumot eltávolítottuk, és –80 C-on azonnal lefagyasztottuk, amíg el nem végeztük az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatot az Epo-ra (Quantikine; R&D Systems; No. MEP006) hígítatlan mintákkal. Az abszorbanciát iMARK Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad) készülékkel olvastuk le 450 nm-en, 570 nm-en hullámhossz-korrekcióval és 4-paraméter-illesztési standard görbével, a korábban leírtak szerint.³³

Vérsejtszámok

Az EDTA-val antikoagulált vérből származó összes és differenciált sejtszámot a Synlab mérte. állatorvos Berlinben ADVIA2120i (Siemens) automata sejtszámlálóval egérvér számára.

Riportergén vizsgálatok

Humán embrionális vese 293 sejtjeit (DSMZ; No. ACC305; passzázsok száma 3-10; mikoplazma negatív) Dulbecco módosított Eagle táptalajban/Ham F12 (Biochrom; No. FG4815) 10% magzati borjúszérummal (Merck; No.) tenyésztettük. F7524). A sejttranszfekciót lyukonként 167 - 105 sejtet tartalmazó 12-lyuk lemezeken végeztük. Mindegyik lyukat 333 ng plazmid DNS-sel (ebből 10-ből 1 vanília konstrukció) és 1 ml Fugene 6 transzfekciós reagenssel (Promega; No. E2691) transzfektáltuk a leírtak szerint.34 Az összes felhasznált konstrukciót az S3 kiegészítő táblázat tartalmazza. A sejteket 48 órával a Passive Lysis pufferrel (Promega; No. E1941) történő transzfekció után lizáltuk. A luciferáz aktivitást Beetle-Juice és Renilla-Juice kittel (mindkettő pjk GmbH; 102511/102531 sz.) határoztuk meg Lumat LB9501 luminométeren. Mindegyik kísérletet technikai ismétlésben végeztük, és a számításokhoz az átlagértékeket használtuk.

Statisztikai analízis

In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1.{1}}szorozza meg az interkvartilis tartományt) a 6 cirkadián expressziós gén közül 4-ben. Az adatokat az IBM SPSS Statistics 27 segítségével elemeztük, és egyedi pontokként mutattuk be a mediánnal vagy oszlopokként az átlagot és az SD-t. Mann-Whitney U tesztet vagy Kruskal-Wallis-t Bonferronival post hoc tesztként végeztünk.

EREDMÉNYEK

A cirkadián Epo expresszió ablációja Cry-null egerekben

A cirkadián Epo szabályozás molekuláris mechanizmusának tisztázása érdekében elemeztük az Epo mRNS és fehérje expresszióját WT és Cry-null mutáns egerekben. A WT vesében a kanonikus óragének a napszaktól függő expressziót mutattak, míg a Cry-null egerekben ezt a várakozásoknak megfelelően megszüntették (S1 kiegészítő ábra). Korábban beszámoltunk az Epo mRNS expressziójának cirkadián oszcillációjáról 24 órán keresztül felnőtt WT egérveséknél.24 Most a minimális és maximális értékekre összpontosítva szignifikáns, w{7}}szeres különbséget figyeltünk meg a CT06 (egér alvási periódus; várható minimum) között. ) és CT18 (aktivitási fázis; várható maximum; 1a. ábra). A Cry-null egerek veséjében azonban nem észleltünk szignifikáns különbséget a vese Epo mRNS expressziójában. Nevezetesen, a Cry-null egerekben a vese Epo transzkriptumszintjének abszolút mennyisége mindkét időpontban a CT06 és CT18 WT Epo mRNS medián szintje között volt (1a ábra). Az EPO mRNS a megfelelő májban a kimutatási határ alatt volt (az adatokat nem mutatjuk be).

Az Epo szérumkoncentrációjának napi változásai

A cirkadián Epo mRNS expressziójának keringő Epo fehérjévé történő transzlációjának becsléséhez szérummintákat elemeztünk enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal. Vérmintát vettek a szervminták előtt. A szérum Epo a w2.{2}}-szeresére növelte a CT06 és CT18 között WT egerekben, de ez a különbség megszűnt a Cry-null egerekben (1b. ábra). Figyelemre méltó, hogy az átlagos S-Epo-koncentrációk időbeli átlaga (CT06 és CT18) hasonló volt WT és Cry-null egerekben (22 mU/ml [tartomány, 3-59 mU/ml] vs. 21 mU/ml [tartomány, 7 –50 mU/ml]).

A cirkadián Epo expresszió az artériás vérgáz paraméterei és a pulzoximetria összefüggésében

Annak kiderítésére, hogy a vér és a szöveti oxigénszint lehetséges napi változásai okozhatják-e az Epo-expresszió cirkadián oszcillációját, artériás vérmintákat vettünk, és vérgázelemzéseket végeztünk érzéstelenített, tracheotomizált és mechanikusan lélegeztetett Cry-null és WT egereken CT06 vagy CT18 mellett. amelyek a legalacsonyabb, illetve a legmagasabb cirkadián Epo mRNS-szinteknek felelnek meg (1a. ábra). Nem mutattunk ki szignifikáns különbséget sem az artériás pH-ban, sem a CO2 parciális nyomásában, sem az O2 parciális nyomásában, sem a standard bázisfeleslegben vagy laktátkoncentrációban (2a–e ábra) a CT06 és CT18 vagy WT és Cry-null egerek között. A pulzoximetriával mért oxigéntelítettségi szintek szintén nem mutattak eltérést (2f ábra). Az EPO master regulátor hypoxia-indukálható faktor (HIF) 2a génexpressziója nem különbözött a CT06 és a CT18 között sem WT, sem Cry-null egerekben (3. ábra). Normoxikus körülmények között tehát a cirkadián Epo szabályozást nem az oxigénfeszültség változása okozza.

Az Epo expresszió cirkadián be- és kikapcsolása a vese Epo-t termelő sejtekben

Annak vizsgálatára, hogy a cirkadián Epo mRNS expresszióját további renális Epo-termelő sejtek (REPC) bekapcsolása vagy kizárólag a sejtenkénti Epo expresszió növelése közvetíti-e, RNAscope in situ hibridizációt alkalmaztunk a vese középső keresztirányú metszetein (példa az S2 kiegészítő ábrán). WT egerekben a REPC-k száma szignifikánsan megnőtt a CT06 (medián, 5; tartomány, 0–25) és a CT18 (medián, 22; tartomány, 5–82; 4) között.{{ 11}}szeres; P ¼ 0,010). Ezzel szemben a Cry-null vesék hasonló számú REPC-t mutattak a CT06-nál (medián, 18; tartomány: 2–33) és a CT18-nál (medián, 15; tartomány: 4–87; nem szignifikáns; 1c. ábra). Úgy gondoltuk, hogy a Cry-null egerek növekedési korlátozást mutatnak az inzulinszerű növekedési faktor 1 (IGF1) jelátvitelének károsodása miatt, ami folyamatosan növekvő testtömeg- és szervméret-különbséget eredményez a Cry-null és a WT egerek között.30 Ahogy használtuk viszonylag fiatal állatoknál a Cry-null egerek abszolút vesetömege csak valamivel volt alacsonyabb, mint a WT egerekben (–12 százalék a Cry-null egerekben), de a relatív vese-testtömeg arány nem különbözött (S3 kiegészítő ábra) . Így úgy tűnik, hogy az Epo mRNS expressziójának cirkadián növekedését további REPC-k bekapcsolása szabályozza.

A minimális EPO promoter aktiválása a CLOCK/BMAL1 által

A cirkadián Epo expresszióért felelős szabályozó szekvenciák azonosítására (4a. ábra) luciferáz riporter gén vizsgálatokat végeztünk humán embrionális vese 293 sejtekben. A humán embrionális vese 293-as sejtvonalát nem a vese eredete, hanem az endogén cirkadián óra hiánya miatt választották ki. Így a CLOCK/BMAL1 stimuláló hatását alacsony, nem rezgő CLOCK/BMAL1 háttérben lehetett tesztelni. A CLOCK/BMAL1 túlzott expressziója szignifikánsan stimulálta a minimális humán EPO promoter aktivitását (4b. ábra, I vs. II). Ha az E-box motívum (–36 és –31 bp a transzkripciós starthelyhez képest) mutációt szenved,35 ez a hatás tompul (4b. ábra, III).

Annak vizsgálatára, hogy a megfigyelt cirkadián szabályozás sejttípus-függő-e, számos EPO-t expresszáló sejtvonalat szűrtünk endogén óraaktivitásra egy luciferázriporter Bmal1 promoter által közvetített oszcillációinak megfigyelésével. Az endogén ritmusúak közé tartoztak a humán hepatóma eredetű HEP3B sejtek, a humán neuroblasztóma eredetű KELLY sejtek és a PDGFRbþ egér vesesejtek (korábban EPO-t expresszáló egérsejtvonal, FAIK1-10).36,37 A 3 sejtvonal közül csak A KELLY sejtek EPO promoter által vezérelt luciferáz oszcillációt mutattak (S4A kiegészítő ábra). Bár a PDGFRbþ sejtek erős cirkadián ritmust mutattak a Bmal1 promoter aktivitásában, nem észleltünk EPO promoter által közvetített oszcillációt, ami az EPO promoter által vezérelt riporterkonstrukció alacsonyabb amplitúdójára utal (S4B kiegészítő ábra).

A Bmal1 és az Epo kolokalizációja a Cry-null versus WT egerek veséjében

Annak érdekében, hogy tovább tisztázzuk (i) a vese Epo-termelés cirkadián szabályozását a vese Epo-termelő sejtek toborzásával, valamint (ii) a Bmal1 és az Epo expresszió kolokalizációját, RNAscope in situ hibridizációt végeztünk. Az Epo és a Bmal1 kolokalizált, és a kis nagyításon végzett mikroszkópos vizsgálat különbségeket mutat a REPC-k toborzásában (5. ábra), amint azt az 1c. ábra számszerűsíti.

Hematológiai leletek Cry1/Cry2-hiány esetén (i) a cirkadián Epo-expresszió hiányának hematopoetikus hatásainak és (ii) a funkcionális óra nélküli egerek esetleges egyéb hematológiai rendellenességeinek értékelésére vérsejtszámokat elemeztünk. Az Epo mRNS expressziójának és az S-Epo koncentrációjának napszaki különbségeit nem tükrözték a perifériás retikulocita számok szignifikáns különbségei a CT06 és a CT18 között WT egerekben. A retikulocitaszám azonban szignifikánsan alacsonyabb volt mind a CT06-nál, mind a CT18-nál a Cry-null állatokban, összehasonlítva a WT egerekkel (6a. ábra). Nem volt szignifikáns különbség az eritrocitaszámban vagy a hematokrit értékekben WT és Cry-null egerekben. Mindkét paraméter azonban nem változott a CT06 és CT18 között mindkét törzsben (6b. és c. ábra), és nem felelt meg a Cry-null egerek alacsonyabb perifériás retikulocitaszámának (6a. ábra). Annak tesztelésére, hogy a károsodott IGF1 jelátvitel miatti táplálkozási hiányosságok (pl. vas és folsav) szerepet játszanak-e a csökkent retikulocita, de normál vörösvértestszám eltérésében Cry-null egerekben, a vörösvértestek méretét és alakját elemezték, de nem mutattak szignifikáns különbséget. Cry-null és WT egerek között (S5 kiegészítő ábra).

Nevezetesen, a Cry-null egerek átlagos vérlemezkeszáma általában magasabb volt, mint a WT egerekben, de a vérlemezkeszám nem különbözött szignifikánsan a CT06 és a CT18 között mindkét törzsben (6d. ábra). Ezzel szemben a fehérvérsejtszám (WBC) szignifikánsan különbözött a CT06 és a CT18 között WT-ben, de nem a Cry-null egerekben. A WBC-szám medián értéke a Cry-null egerekben hasonlóan magas volt, mint a WT egerekben a CT06-nál (6e. ábra).

VITA

Itt bemutatjuk, hogy a cirkadián Epo expresszió transzkripciós szinten szabályozott. Az Epo mRNS és S-Epo koncentrációjának elemzése aritmiás Cry1 és Cry2 hiányos egerekben az "Epo órája" keresését a CLOCK és BMAL1 céltranszkripciós faktoraikra irányította át, amelyeket a CRY1 és CRY2 elnyom. a CLOCK/BMAL1 ritmikus elnyomásának elvesztéséhez, ami állandó Epo-transzkriptumszinteket eredményezett, amelyek a CT06 és CT18 medián szintjei között voltak WT egerekben (1a. ábra). Az RNAscope által végzett in situ hibridizáció azt jelzi, hogy a cirkadián oszcillációt az Epo mRNS expressziójának bekapcsolásával érik el az intersticiális sejtekben (1c. ábra), és az RNAscope segítségével végzett in situ hibridizáció a Bmal1 expresszióját is feltárta REPC-ben (5. ábra).

Ennél is fontosabb, hogy a szignifikánsan magasabb S-Epo szintek a CT18-nál megerősítik, hogy a cirkadián, transzkripciós Epo-szabályozás a keringő Epo-fehérje cirkadián oszcillációiban alakul át normoxikus körülmények között (1b. ábra). Az S-Epo szintek valódi maximuma valamivel később várható, mint a CT18, mivel az EPO fehérje de novo szintézise w80-120 percet igényel,38 és a cirkadián időket a maximális Epo mRNS szint alapján választottuk ki. 24 Azt találtuk, hogy a cirkadián Epo-szabályozást valószínűleg egy E-box motívum transzkripciós aktiválása közvetíti az 5' EPO promoterben a CLOCK/BMAL1 által (4. ábra és S4 kiegészítő ábra), ami összhangban van a BMAL1 fehérje és a BMAL1 fehérje között leírt pozitív korrelációval. S-Epo szintek az akut vérzés patkánymodelljében.²⁵

Bizonyíték van a CLOCK/BMAL1 és a HIF útvonalak közötti kétirányú szabályozásra a közvetlen fehérje-fehérje kölcsönhatás révén.^39,40A HIF2a, az EPO-promóter fő aktivátorának 41,42 fokozódása az óragének expressziós szintjének megváltozását eredményezte humán hepatóma sejtekben.43 Ezenkívül a BMAL1 dimerizálódik HIF1a és HIF2a fehérjékkel,^44,45,és a HIF-aktivitás cirkadián óraszabályozása szövetspecifikus módon szabályozott.39 Az akut hipoxiának kitett egerekben (4 óra 6 százalékos és 21 százalékos O2-nál) az EPO mRNS-e túlzottan megnövekedett, de már nem mutatott cirkadián különbségeket. .46 Így valószínűleg a normoxikus körülmények a legmegfelelőbbek a cirkadián Epo-szabályozás molekuláris mechanizmusának boncolgatására. Rágcsálóknál azonban napi változásokról számoltak be a vér és a szövetek oxigénszintjében.39,47 Patkányoknál a vese oxigenizációjának napi ritmikus változásai alacsony tartományban, zD3 százalékban, sötétben tetőznek (¼ rágcsáló aktivitás). .47 Ilyen különbségeket nem tudtunk kimutatni kísérleteinkben, amelyekben állatszabályozási okokból csak érzéstelenített, tracheotomizált és mechanikusan lélegeztetett egereket tudtunk vizsgálni. Az artériás pH, a CO2 parciális nyomás és az O2 parciális nyomás, a standard bázisfelesleg vagy a laktát, valamint az oxigéntelítettség elemzése azonban nem mutatott jelentős különbséget a WT és a Cry-null egerek között mindkét CT-n (2. ábra). Ezenkívül a Hif2a transzkriptum szintje a vesében is hasonló volt minden körülmények között (3. ábra). Normoxikus körülmények között tehát úgy tűnik, hogy a cirkadián Epo szabályozás független az oxigénfeszültség napi változásaitól. További figyelmet érdemel azonban az a kérdés, hogy a nagy magasság vagy a hipoxia (alacsony pO2) milyen mértékben befolyásolja az Epo-termelés cirkadián oszcillációját. A humán S-Epo szintek általában magasabbak nagy magasságban, míg a fázis és az amplitúdó változatlan,17,22 és a normobár hipoxiának kitett egészséges önkéntesekben az S-Epo koncentrációja kifejezett oszcillációt mutat.⁴⁸

A cirkadián Epo szabályozás valószínűleg a klinikai nefrológia és hematológia szempontjából a legrelevánsabb, de a laboratóriumi diagnosztika szempontjából is, mint például az erythropoiesis-stimuláló szerekkel végzett dopping vérvizsgálata. A keringő Epo-koncentrációk doppingelemzésekben történő értékeléséhez figyelembe kell venni a vérvétel időpontját (külső időpont) és a személy kronotípusát (belső idő).49,50

Az eritropoézisben a burst-formáló egységek – eritroid az első vonalspecifikus sejtek, ezt követik a kolóniaképző egységek – eritroid, amelyek az Epo receptor bőséges expresszióját mutatják. Az Epo-val végzett 2 napos tenyésztés után az egérkolóniaképző egységek – eritroid – eritroblaszt telepeket hoznak létre. Miután 7 nap elteltével elérik az ortokromatikus eritroblasztok stádiumát, a sejtek kihúzzák magjaikat, hogy olyan retikulocitákká váljanak, amelyekben nincs Epo-receptor.51 Figyelembe véve azt az időt, amelyre a telepképző egységek – az eritroid – retikulocitákká vagy akár teljesen érett eritrocitákká érnek, valószínűleg nem meglepő, hogy nem figyeltek meg különbséget a CT06 és a CT18 között WT egerekben (6a–c ábra). Nevezetesen, a teljes retikulocitaszám szignifikánsan magasabb volt a WT-ben, mint a Cry-null egerekben (6a. ábra), ami arra utal, hogy a retikulocitákká való differenciálódás károsodott a Cry-null egerekben. Korábbi adatok azt mutatják, hogy a korai eritroid progenitor sejtek a DNS-szintézis cirkadián mintázatát is mutatják. Az rhEpo in vivo beadása fokozza az eritroid telepek számának cirkadián ritmusát.52 Az alacsonyabb retikulocitaszám a Cry-null egerek viszonylag magas általános S-Epo-koncentrációja ellenére a cirkadián DNS-szintézis eritroid progenitorok szintjén történő megszüntetésének következménye lehet. A magas S-Epo-szint és a csökkent eritropoézis ilyen konstellációját figyelték meg egerekben, akiknél a tobozmirigy melatonintermelése genetikailag megszűnt (C3H/HeN egerek, amelyek nem rendelkeznek sebességkorlátozó N-acetil-transzferázzal53), ami az eritroid progenitor sejt belső cirkadián aktivitása mellett érvel. szint.

Figyelemre méltó, hogy a Cry-null egerek körülbelül 80 százalékkal csökkentik az IGF1-szintet, ami az IGF1 jelátvitel csökkenéséhez, valamint a testtömeg és a szervméret 30 százalékos csökkenéséhez vezet a WT-hez képest, ami egy életen át súlyosbodik. a kísérletek viszonylag fiatalok voltak (átlagéletkor,^21–29 hét) mérsékelt hatást mutattak a teljes testre és az abszolút vesesúlyra Cry-null egerekben, de a vese-testtömeg arány normális volt (S3 kiegészítő ábra). Ez utóbbi tény lényeges lehet az Epo fehérjeszintézis kapacitása szempontjából (1b. ábra).

A vörösvértestek méretének vagy alakjának (MCV, MCH és MCHC; S5 kiegészítő ábra) elemzése azonban nem utalt táplálkozási hiányosságokra (pl. vas és folsav) a csökkent retikulocitaszám és a normál eritrocitaszám közötti eltérés magyarázatára a Cry- null egerek (6a és b ábra). Az Epo és az IGF1 jelátvitel szinkronizálja a sejtek proliferációját és differenciálódását az eritropoézis során a GATA-1/GATA-1 transzkripciós komplexum barátjával való kölcsönhatás révén.54 Ebben a folyamatban az Epo aktiválja a celluláris AKT útvonalat, és ezáltal növeli a GATA-1, az eritropoézis fő transzkripciós szabályozója affinitása a GATA kofaktor barátjához-1. Ez a mechanizmus azonban gátolt, ha az IGF1 jelátvitel megszűnik.54 Így a Cry-null egerekben a relatíve magasabb Epo pozitív hatása a vörösvértestek differenciálódására meghaladhatja az itt vizsgált viszonylag fiatal Cry-null egerek csökkent IGF1 aktivitását.

A teljes cirkadián aritmiának a vérképzésre gyakorolt ​​általános hatását tovább világítja a vérlemezke- és fehérvérsejtszám elemzése. A Clock domináns-negatív formáját (ClockD19/D19) expresszáló egerek korábbi eredményei azt mutatták, hogy a trombopoietin (a megakariopoézis elsődleges szabályozója) és receptora Mpl expressziójának megzavarása az érett csontvelői megakariociták és a keringő vérlemezkék számának növekedéséhez vezet. 55 A leírt jelentős cirkadián oszcilláció a vérlemezkék számában 20 csúcsponttal (ZT) WT egerekben, valamint magasabb vérlemezkeszám ZT08-nál ClockD19/D19 egerekben,55 ami a vérlemezkeszám cirkadián oszcillációjának hiányát eredményezte egérmodellünkben (6d. ábra). Egy másik fontos eredmény a Cry-null egerekben a keringő fehérvérsejtek napi időbeli különbségeinek elvesztése, ellentétben a WT egerekkel (6e. ábra), ami összhangban van a CLOCK/BMAL1 által az érett fehérvérsejtek termelésére kifejtett aktivitással.^56,57

Adataink értelmezéséhez figyelembe kell venni az egerek és az emberek nappali-éjszakai aktivitásának különbségeit: A CT06 időpont emberben nagyjából az éjfélnek (alvási fázis), míg a CT18 nagyjából a délnek (aktivitási fázis) felel meg. Ennek az ellenkezője igaz az éjszakai egerekre, de mindkét organizmus ugyanazt a cirkadián Epo expressziós mintázatot mutatja (alacsony CT/ZT06-nál, magas CT/ZT18-nál). Ez azt jelzi, hogy további mechanizmusok (pl. metabolikus faktorok) módosíthatják az Epo expresszió ritmusát mindkét organizmusban. Az Epo csúcsszintek és az Epo receptor expresszió közötti szinkronizálás korai eritroid progenitorokban (burst formáló egységek – eritroid, sőt kolóniaképző egységek – eritroid sejtek)⁵² azt sugallja, hogy az rhEpo-kezelésben részesülő betegek (pl. végstádiumú vesevérszegénységben vagy hematológiai rendellenességekben) előnyös lenne a normál cirkadián fiziológiát utánozni, ha éjszaka alkalmaznának hypot. A CRY1 (Online Mendeli Inheritance in Man *601933) vagy CRY2 (Online Mendelian Heritance in Man *603732) funkcióvesztéses mutációkkal rendelkező embereknél még nem jelentettek vérképzőszervi rendellenességeket. A klinikai jelentések a CRY1 variánsokat elsősorban figyelemhiányos/hiperaktivitási rendellenességekkel társítják, melyeket gyakran álmatlanság, szorongás, depresszió vagy késleltetett alvási fáziszavar kísér.^58,59Ez további vizsgálatot érdemel, mert az ilyen betegségeket vérszegénység vagy vérképzőszervi rendellenességek súlyosbíthatják.

Összefoglalva, ez a tanulmány az első bizonyíték arra, hogy a cirkadián Epo-expressziót a normoxikus felnőtt egérvesében transzkripciós szinten szabályozza az 5'EPO-promóterben lévő E-box elem CLOCK/BMAL1-közvetített aktiválása. Mivel az EPO sajátosan hat az eritropoézis komplex szabályozási hálózatán belül, a repo optimális alkalmazása veseelégtelenségben szenvedő betegeknél magában foglalhatja azt is, hogy az éjszakai fiziológiás cirkadián maximumát megelőzően alkalmazza.