A veleszületett szívbetegség neuroprotekciójának jelenlegi állapota 2. rész

A mikroszkópos képeket ezután képszámításnak vetették alá ImageJ szoftverrel (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). A Hsp60 jelét megszoroztuk "x-szel".

A Hsp60 egy fontos fehérjemolekula, amely fontos biológiai szerepet játszik az emberi szervezetben. Az elmúlt évek kutatásai kimutatták, hogy a Hsp60 jelenléte szorosan összefügg az emberi memóriával.

A Hsp60 egy molekuláris chaperon fehérje, amely főként a fehérje feltekeredésében, kibontásában, stabilizálásában és lebontásában vesz részt. Ezek a folyamatok nagyon fontosak az emberi szervezet normál anyagcseréjéhez és sejtműködéséhez. Ugyanakkor a Hsp60 antioxidáns, gyulladáscsökkentő és immunmoduláló hatással is rendelkezik, valamint nagy szerepet játszik az emberi egészség és az immunrendszer egyensúlyának megőrzésében.

Kutatások kimutatták, hogy a Hsp60 döntő szerepet játszik a memória kialakításában és karbantartásában. A tanulás és a memória folyamata során az agysejtek nagyszámú Hsp60 molekulát termelnek. Ezek a molekulák megvédhetik a sejteket a külső környezet interferenciáitól és károsodásától, hogy biztosítsák a tanulás és a memória zökkenőmentes fejlődését. Ezenkívül a Hsp60 az agysejtek jelátvitelének és a neuronok fejlődésének megváltoztatásával az emberi gondolkodásra és viselkedésre is hatással lehet, és pozitív hatással van a megismerésre és a stresszrezisztenciára.

Bár a Hsp60 szerepe pozitív hatással van az emberi szervezetre, az embereknek azt is fel kell ismerniük, hogy a Hsp60 feleslege és hiánya is negatív hatással lehet az emberi egészségre. Ezért aktívan fel kell tárnunk és tanulmányoznunk kell a Hsp60 mechanizmusát az emberi test különböző fiziológiás és patológiás állapotaiban, hogy jobban megértsük a Hsp60 helyzetét és szerepét az emberi egészségben. Látható, hogy javítanunk kell a memórián, a Cistanche deserticola pedig jelentősen javíthatja a memóriát, mivel a Cistanche deserticola antioxidáns, gyulladáscsökkentő és öregedésgátló hatással bír, ami segíthet csökkenteni az oxidációt és a gyulladásos reakciókat az agyban, ezáltal védi a az idegrendszer egészsége. Ezenkívül a Cistanche deserticola elősegítheti az idegsejtek növekedését és helyreállítását, ezáltal javítva a neurális hálózatok összekapcsolhatóságát és működését. Ezek a hatások javíthatják a memóriát, a tanulási képességet és a gondolkodási sebességet, valamint megakadályozhatják a kognitív diszfunkciók és a neurodegeneratív betegségek kialakulását.

Kattintson a Tudás gombra a rövid távú memória javításához

Az "x" értéket a következőképpen határoztuk meg: ha a kontrollcsoportban a mitokondriális DNS-jelből kivontuk az "x"-re hajtogatott Hsp60-jelet, a mitokondriális DNS-érték nullánál kisebb vagy azzal egyenlő. A H2B hiszton jelét megszoroztuk "y"-vel.

Az "y" értéket a következőképpen határoztuk meg: az "y"-re hajtogatott hiszton-H2B jelet levonva a nukleáris DNS-jelből a kontrollcsoportban, a mag-DNS értéke kisebb, mint nulla. Ha a szorzás következtében a háttérjel magas lesz, a sokszorosított kép kontrasztja minden mintában azonos feltételekhez állítható.

A dsDNS festődés képét, mínusz a megsokszorozott Hsp60 és a H2B hiszton korrigált képét használtuk fel a későbbi elemzésekhez. Az "Adjust-Threshold" funkció használatával ezek a képek binárisak lettek. Kiválasztottunk 2 és 20 µm2 közötti méretű dsDNS pontokat (circularity 0,1-1,0), és a "Részecskék elemzése-elemzése" funkcióval számoltuk meg őket.

2.3. Elektronmikroszkópia

Egy nappal a transzfekció előtt a HeLa sejteket 600 sejt/µL sűrűségben szélesztettük. Az érdeklődésre számot tartó gének expresszióját a HeLa sejtekben elnémítottuk Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával Lipofectamine RNAiMAX transzfekciós reagensben (ThermoFisher Scientific) a szabvány szerint. a gyártó utasításai szerint (10 nM végső RNS-koncentrációval).

Az siRNS leütése után négy nappal a sejteket fixálásnak vetettük alá. A sejttenyészet-mintákat 2% PFA-val és 2% glutáraldehiddel fixáltuk 0.1 M foszfátpufferben, pH 7,4, 37 ◦C-on, majd 4 °C-on helyeztük el. ◦C hűtőben 30 percig. A mintákat 2%-os glutáraldehidben fixáltuk 0,1 M foszfátpufferben egy éjszakán át 4 ◦C-on. A mintákat háromszor mostuk 0,1 M foszfát pufferrel 30 percig, majd 2%-os ozmium-tetroxiddal 0,1 M foszfát pufferben 1 órán át utófixáltuk 4 ◦ C-on.

A mintákat dehidratált, beépített etanolos oldatok formájában átvittük gyantára (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokió, Japán), és 60 ◦C-on 48 órán keresztül polimerizáltuk. A polimerizált gyantákat egy gyémántkéssel ultravékony 70-nm metszetekre vágtuk ultramikrotommal (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Németország), majd rézrácsokra szerelték fel.

A metszeteket 2%-os uranil-acetáttal festettük szobahőmérsékleten 15 percig, majd desztillált vízzel mostuk, majd ólomfestő oldattal (Sigma-Aldrich, Tokió, Japán) 3 percig szobahőmérsékleten festettük.

A rácsokat transzmissziós elektronmikroszkóp alatt figyelték meg (JEM{0}}Plus, JEOL Ltd.., Tokió, Japán) 80 kV (zebrahal agy) vagy 100 kV (cella) gyorsítási feszültségen, és a képeket egy töltéscsatolt eszköz (CCD) kamerával (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) rögzítettük. .

2.4. Immunelektron mikroszkópia

Az aranykorongokon lévő mintákat folyékony propánban –175 ◦C-on lefagyasztottuk. A mintákat lefagyasztás után 1%-os etanolos csersavas oldattal és 2%-os desztillált vízzel -80 ◦C-on 24 órán át fagyasztva helyettesítettük.

A mintákat ezután 4 órán át -20 ◦ C-on tartottuk, majd 1 órán át 4 ◦ C-on inkubáltuk. Ezután a mintákat vízmentes etanolban háromszor 30 percig dehidratáltuk. minden alkalommal, majd etanol-gyanta (LR fehér: London Resin Co. Ltd., Berkshire, Egyesült Királyság) 50:50 arányú keverékével 4 °C-on 1 órán át infiltráljuk. A mintákat friss 100%-os gyantára vittük át és 4 ◦C-on 30 percig inkubáltuk, majd ezt a folyamatot háromszor megismételtük.

A mintákat friss, 100%-os gyantára vittük át és 50 ◦ CO/N-en polimerizáltuk. A polimerizált gyantákat ultravékony metszetekre vágtuk 90 nm-en gyémántkéssel ultramikrotómmal (Ultracut UCT; Leica), és a metszeteket nikkelrácsra helyeztük. A rácsokat anti-dsDNS antitesttel (35I9 DNS) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) inkubáltuk 1% BSA/PBS-ben 4 ◦CO/N hőmérsékleten, majd háromszor öblítettük 1% BSA/PBS 1 percig.

Ezt követően 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk őket ezekkel a másodlagos antitestekkel, amelyek {{0}} nm-es aranyrészecskékkel voltak konjugálva (kecske anti-egér IgG poliklonalantitest). PBS-sel történő öblítés után a rácsokat 2% glutáraldehidet tartalmazó 0,1 M kakodilát pufferbe helyeztük.

Ezt követően a rácsokat szárítottuk, majd 2%-os uranil-acetáttal festették 15 percig, majd ólomfesték-oldattal (Sigma-Aldrich) szobahőmérsékleten 3 percig. A rácsokat transzmissziós elektronmikroszkóppal (JEM-1400) figyeltük meg. plusz; JEOLLtd.) 100 kV gyorsítófeszültségen. A digitális képeket CCD kamerával (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) készítettük.

3. Eredmények

3.1. A csökkent TFAM vagy GBA az ektópiás mitokondriális DNS növekedését idézi elő

Először egy példát mutattunk be a mitokondriális eredetű citoplazmatikus DNS kimutatására HeLa sejtekben, amelyekben a TFAM fehérjét az siRNS leütötte (1A. ábra). A TFAM kulcsfontosságú mitokondriális transzkripciós faktor, és a mitokondriális DNS replikációjában és javításában is szerepet játszik [20]. .

Ebben a génben a szekvencia polimorfizmusai összefüggésbe hozhatók a Parkinson-kórral [21,22]. A TFAM fehérje 3 napos leütése után a HeLa sejtek citoplazmájában sok kettős szálú DNS-pontot észleltünk.

A hisztonok pozitív markerei a nukleáris eredetű DNS-nek a citoplazmában, és negatív markerei a mitokondriális DNS-nek és a mitokondriális eredetű DNS-nek a citoplazmában [23]. Ezek a pontok nem lokalizálódnak együtt a hisztonokkal, ami arra utal, hogy nem nukleáris eredetű DNS-ek. Ezen túlmenően ezen citoplazmatikus, méhen kívüli DNS-pontok némelyike ​​nem lokalizálódott együtt a Hsp60-zal, a mitokondriális mátrix markerével, ami azt jelzi, hogy a mitokondriumokon kívül helyezkedtek el (1B, C ábra).

Az elektronmikroszkópos vizsgálat azt is kimutatta, hogy az ektopiás DNS kiszivárgott a mitokondriumokból (2A, B ábra). Összefoglalva, az ektópiás DNS-pontok számának növekedése a citoplazmában a TFAM-leütés következtében a mitokondriális DNS-nek a mitokondriumokból szivárgása miatt következett be. Másodszor, mutattunk egy másik példát a mitokondriumból származó citoplazmatikus DNS kimutatására HeLa sejtekben, amelyekben a GBA fehérjét az siRNS leütötte. (1A. ábra).

A GBA a Gaucher-kór okozója, de a GBA heterozigóta mutációja a Parkinson-kór kockázati tényezője is [24]. A HeLa sejtek citoplazmájában 3 napos GBA fehérje leütés után sok kettős szálú DNS-pontot észleltünk. Néhány DNS-pontot hisztonokkal együtt lokalizáltak, ami arra utal, hogy nukleáris eredetű DNS-ek.

Más DNS-pontok nem lokalizáltak együtt a hisztonokkal, ami arra utal, hogy nem nukleáris eredetű DNS, hanem mitokondriumból származó DNS (1D ábra). Összefoglalva, az ektópiás DNS-pontok növekedése a citoplazmában a GBA-knockdown következtében legalább részben a mitokondriális DNS-nek a mitokondriumokból való kiszivárgásának volt köszönhető.

For more information:1950477648nn@gmail.com