Ⅰ rész: Autoszomális domináns policisztás vesebetegségben szenvedő betegek eritroid progenitor sejtjeiből generált vese organoidok

további információ:ali.ma@wecistanche.com

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice és társai.

Bevezetés

Autoszomális domináns policisztásvesebetegségAz ADPKD a krónikus vesebetegség (CKD) leggyakoribb genetikai oka világszerte, és ez az egyik legelterjedtebb öröklött monogén rendellenesség, amely 1:400-1000 [1] populációt érint. ADPKD (Autoszomális domináns) policisztásvesebetegség) a PKD1 (1-es típusú policisztás vesebetegség) és a PKD2 (2-es típusú policisztás vesebetegség) gének mutációi okozzák, amelyek a policisztint-1(PC1), illetve a policisztint-2 (PC2) kódolják, csilló elváltozásokat és cisztaképződést eredményez. Mindkét fehérje számos molekuláris utat, valamint a szövetek morfogenezisét és funkcióját modulálja. A cisztogenezis hátterében álló pontos molekuláris mechanizmusok azonban továbbra is tisztázatlanok. Jól elfogadott tény, hogy a cisztogenezishez egy csíravonali mutáció, majd egy szomatikus mutáció (második találat) szükséges a normál allélban [2,3]. Ezenkívül az ortológ egérmodellek eredményei alapján kimutatták, hogy további vesekárosodás (harmadik találat) szükséges a gyors és súlyos ciszta növekedéshez érett vesékben [4,5]. Úgy tűnik, hogy az emberekben a legtöbb második találat a vesefejlődés során következik be, ami még a méhen belüli cisztás képződéshez és növekedéshez vezet. Ezért a PKD1 (1-es típusú policisztás vesebetegség) és a PKD2 (2-es típusú policisztás vesebetegség) mutációiból adódó vesebetegség súlyosságát és progressziójának sebességét számos tényező befolyásolhatja, beleértve a gének inaktivációjának időpontját, a vesefejlődést. stádium, környezeti hatás, egyidejű veseelváltozások jelenléte és a genetikai mutációk sokfélesége.

Bár számtalan adat áll rendelkezésre az ADPKD (autoszomális domináns policisztás) patofiziológiai mechanizmusairólvesebetegség) ortológ és nemnortológ egérmodelleket alkalmazó tanulmányokból gyűjtöttük össze, csak néhány olyan tanulmány áll rendelkezésre, amelyek a cisztogenezis humán sejtes modelljére összpontosítanak [6]. 2007-ben Takahashi és munkatársai [Z] sikeresen programozták át a szomatikus sejteket embrionális tulajdonságokkal rendelkező pluripotens őssejtekké, és elnevezték őket "indukált pluripotens őssejteknek" (iPSC). Azóta számos szomatikus sejtforrást iPSC-vé (indukált pluripotens őssejtekké) programoztak át akár állati, akár emberi szövetekből (hiPSC-k) [Z], ez utóbbiak fő forrását pedig a felnőtt fibroblasztok jelentik. 2013-ban Freedman és társai.[8] indukált hiPSC-k (indukált pluripotens őssejtek) az ADPKD (autoszomális domináns policisztás) fibroblasztjaibólvesebetegség) betegeknél, és a policisztin-2 ciliáris expressziójának csökkenését tapasztalták, ami alátámasztja az ilyen sejtek használatát a policisztás betegség (PKD) patofiziológiájának vizsgálatára. A közelmúltban Chen és munkatársai 2016-ban arról számoltak be, hogy eritroid progenitor sejtekből szereztek hiPS sejteket [9].

Az elmúlt néhány évben jelentős előrelépés történt az 3-dimenziós organoidok iPSC-ből (indukált pluripotens őssejtekből) [Z,10-12] történő előállítása terén. ElsődlegesveseA tubuláris epiteliális organoidok származhatnak veseszövetből, valamint vizeletből, és ezek az organoidok a személyre szabott betegségmodellezés fontos eszközei, amint azt Schutgens et al. [13]. A következő tanulmányokban Freedman és mtsai.[14] tudtak generálnivesekereskedelmi forgalomban kapható hiPS-sejtvonalból származó organoidok, amelyek protokollt hoznak létre a meta-nefris tömegben jelenlévő sejttípusok létrehozására, amelyek a nefron összes szerkezetét létrehozzák. Ezután a PKD1 (1-es típusú policisztásvesebetegség) vagy PKD2 (2-es típusú policisztás vesebetegség) gének, ezek a kutatók cisztaképződést figyeltek megvesetubulusok. Mindezen fejlett és innovatív technológiák fényében arra törekedtünk, hogy iPSC-ket (indukált pluripotens őssejteket) nyerjünk az ADPKD (Autosomal dominant polycystic) keringő eritroid progenitor sejtjeiből.vesebetegség)betegeket és in vitro teszteljük a vese organoidok fejlődését, hogy összefoglaljuk az organogenezis lépéseit, megpróbálva felidézni néhány, a korai cisztogenezishez kapcsolódó patofiziológiai eseményt.

Kattintson ide a mellékhatások és a vese számára előnyös hatások megtekintéséhez

Módszerek Betegválasztás

Vérmintát vettünk két nem rokon nőbetegtől (PT1 és PT2), akiknél klinikailag ADPKD-vel (autoszomális domináns policisztás vesebetegség) diagnosztizáltak (PT1:66 évesek, eGFR 43,8 ml/perc/1,73 m2 és PT2:56 éves, eGFR 60,2 ml/ min per 1,73 m2), nyomon követték a policisztás vesebetegségben. A Sao Paulo-i Szövetségi Egyetem Nephrológiai Osztályának Ambuláns Klinikáján (UNIFESP) és egy másik mintát vettek egy egészséges nőstényből, amely kontrollként szolgált a technika stabilizálására és normalizálására. Az ADPKD (autoszomális domináns policisztás vesebetegség) diagnózisa a pozitív családi anamnézis és a vese ciszta jelenlétén alapult, Pei és munkatársai ultrahangos diagnosztikai kritériumai szerint.[15] (A családi törzskönyvek az S1A ábrán láthatók). Mindkét betegnek cisztás veséje és mája volt (a mágneses rezonancia képeket az S1B ábrán mutatjuk be). A tanulmányt az Egyetem Etikai Tanácsadó Bizottsága (CEP UNIFESP, "Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo", Nr. 1199.{20}}/2018) felülvizsgálta és jóváhagyta. A vizsgálat célját magyarázó interjú után mind a betegek, mind az egészséges kontroll aláírták a beleegyező nyilatkozatot.

A teljes vérből izolált eritroid progenitor sejtek expanziója Vérmintákat vettünk egy EDTA-t (antikoagulánsként) tartalmazó vakutainer csőben szobahőmérsékleten. Az eritroid progenitor (EP) sejteket ezután RosetteSep módszerrel (15216; Stem Cell Technologies) választották el, amely eltávolította a nem kívánt sejteket, például az érett vörösvértesteket és vérlemezkéket, miközben megtartotta a kívánt EP-populációt. Az EP-k teljes vérben való alacsony koncentrációja miatt a sejteket felszaporították és specifikus citokineket és kiegészítőket tartalmazó tápközegben tenyésztették (X-Vivo táptalaj, Lonza). Az EP sejteket áramlási citometriával azonosították a transzferrin receptor (CD71) és glikoforin A(Gly A) mint GFP-vel jelölt markerek (S2 ábra).

Az eritroid progenitor sejtek újraprogramozása

A kibővített EP sejteket összegyűjtöttük és nukleofektáltuk egy Epi5 Episomal iPSC (indukált pluripotens őssejtek) újraprogramozó készlettel (Thermo Fisher), amely öt újraprogramozási faktor optimalizált keverékét tartalmazza (okt-4, Sox2, Lin28, L-Myc, és Klf4). A transzfekciót (elektroporációt) egy Lonza Nucleo faktorkészletből származó episzómális vektorokkal (vírusmentes, nem integrálódó) végeztük. A transzfekció után a sejteket ReproTeSR-specifikus táptalajba szélesztettük az újraprogramozáshoz (Stem Cell Technologies) standard sejttenyésztési körülmények között (37 °C, 95% CO és 5% O).

Kariotipizálás

Annak ellenőrzésére, hogy az újraprogramozási folyamat megőrizte-e a kromoszóma integritását, kariotípus-analízist végeztek az UNIFESP Genetikai Osztályán. A sejteket 100 ul kolhicinnel (0,08 ug/ml) kezelték 5 ml iP-ben. sejttenyésztő táptalajt a sejtciklus leállítására, amelyet 0,075 M hipotóniás KCl-oldat hozzáadása követett a sejtmag duzzanatának indukálására; A sejteket ezután metanol és ecetsav (3:1) keverékével fixáltuk. A metafázisos kromoszómákat összegyűjtöttük, és Wright-festést alkalmaztunk a G-sávok citogén elemzésére (S3 ábra).

iPSC (indukált pluripotens őssejtek) kolónia jellemzése

Az EP sejteket episzómális vektorokkal programozták át, amelyek tipikus iPSC (indukált pluripotens őssejtek) kolóniákat képeztek, és normál kariotípust mutattak (S3 ábra). Az iPSC (indukált pluripotens őssejtek) kolónia jellemzőit összehasonlítottuk egy, a H9 sejtvonalból származó kontrolléval (hESC, Human Ebryonic Stem Cells, WA{7}}9, beszerezhető a Wicell Research Institute-tól, USA) ( 1B. ábra). Mivel az iPSC-k (indukált pluripotens őssejtek) tipikus morfológiát mutattak, a pluripotencia markereket immunfluoreszcenciával azonosították. A sejteket 4 százalékos paraformaldehiddel fixáltuk 30 percig szobahőmérsékleten. Rögzítés után a mintákat háromszor mostuk PBS-sel, blokkoltuk 5 százalékos PSA-ban és 0,3 százalékos Triton-X-100/DPBS-ben, és egy éjszakán át inkubáltuk elsődleges antitestekkel (Cell Signaling, Ma, EUA), nevezetesen OCT4-gyel(1). :400 hígítás) a pluripotencia tesztjeként. A következő napon új tárgylemezt készítettünk, PBS-ben mostuk, és Alexa Fluor másodlagos antitesttel (1:200 hígítás, Cell Signaling) inkubáltuk, és DAPI-t (1:1000, Invitrogen, MA, USA) adtunk hozzá a sejtmaghoz. azonosítás.

1. ábra: iPSC-k előállítása és jellemzése(indukált pluripotens őssejtek). Az iPSC-ket egy egészséges kontroll (HC) és két különböző ADPKD-beteg (PT1 és PT2) kiterjesztett eritroid progenitor (EP) sejtjeiből programozták át.

A. A vese organoidok sematikus lépcsőzetes előállítása B. Az iPSC hasonlósága (a. az iPSC tipikus képe a kereskedelmi H9 embrionális sejtekből. b. iPSC az egészséges kontrollból származó progenitor eritroid sejtekből)

C. Az iPSC telepek morfológiája D. Az EVOS fl invertált digitális fluoreszcens mikroszkóp alatt megfigyelt iPSC pluripotencia jellemzése.

Az OCT4 antitest jelölést pluripotencia markerként használták a HC, PT1 és PT2 telepek pluripotenciájának jellemzésére.

A sejtmagokat DAPI-val jelöltük (skála az 1B. ábrához: 200 μm; skála az 1C. ábrához: 1000 μm; a HC / PT2 skála az 1D. ábrához: 1000 μm; a PT1 skála az 1D. ábrához: 200 μm).

Az iPSC-k (indukált pluripotens őssejtek) azon képessége, hogy mindhárom csírarétegre differenciálódjanak

Az iPSC-ket (indukált pluripotens őssejteket) Matrigel-lel bevont 6-lyuklemezeken (1:10, BD Biosciences, NY, EUA) növesztettük mTeSR1 táptalajban (Stem Cell Technologies, BC, Kanada). Az iPSC-k (indukált pluripotens őssejtek) differenciálódásának megakadályozása érdekében a telepeket manuálisan, mikroszkóp alatt pipettával, mechanikus fragmentálással passzáltuk, vagy Gentle Cell (Life Technologies) segítségével enzimatikus emésztéssel disszociáltuk (S4 ábra). Ezekkel a módszerekkel az iPSC-ket (indukált pluripotens őssejteket) 22 sorozatos passzázson keresztül tartottuk fenn annak biztosítása érdekében, hogy a sejtek megfelelően beépítsék az újraprogramozási faktorokat. Az iPSC-ket (indukált pluripotens őssejtek) ezután STEMdiff Trilineage Differentiation kit (Stem Cell Technologies) segítségével stimuláltuk, hogy a három csírarétegre differenciálódjanak. Öt nap elteltével a sejteket begyűjtöttük a mezoderma és endoderma vonal-korspecifikus markereinek elemzésére, hét nap múlva pedig ektodermára elemeztük őket a STEMdiff Trilineage Differentiation protokoll szerint (S5 ábra).

Mindhárom csíravonal molekuláris jellemzése qRT-PCR-rel

A három csíraréteg tenyészetéből származó teljes RNS-t GE RNA Spin Mini kit (GE Healthcare, USA) segítségével extraháltuk, majd a gyártó utasításai szerint nagy kapacitású fordított transzkripciós készlettel (Applied Biosystems, USA) cDNS-vé alakítottuk. A kvantitatív valós idejű PCR-t (gRT-PCR) egy SYBR Green PCR készlettel (Applied Biosystems, USA) hajtottuk végre a gyártó protokollja szerint. Az mRNS expressziós szinteket a 2^Ct módszerrel számítottuk ki. Belső kontrollként hidroxi-metil-bilán-szintázt (HMBS) és gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenázt (GAPDH), kvantitatív kontrollként pedig az OCT4 expresszióját használtuk. A SOX17 expresszióját az endodermává való differenciálódás azonosítására, a CXCR4-et a mezodermává való differenciálódás azonosítására, a PAX6-ot pedig az ektodermává való differenciálódás azonosítására használták (S6 ábra). Az összes primer szekvenciát az S1 táblázat tartalmazza, és a hatékonysági görbét minden primer párra kiértékeltük.

Immunfluoreszcencia a különböző csírarétegekre

Az iPSC-ket (indukált pluripotens őssejtek) hatüregű lemezeken fedőlemezeken differenciálódásra indukáltuk. A differenciálódás után a fedőlemezeket eltávolítottuk az eredeti üregekből, és egy új lemezre vittük át, ahol a sejteket 4 százalékos paraformaldehiddel rögzítettük, majd a fent leírtak szerint PBS-sel mostuk. Az OCT4 (1:400; Cell Signaling), CXCR4 (1;100; Cell Signaling), PAX6 (1:100; Thermo Fisher) és SOX17 (1:100; R&D Systems) elleni elsődleges antitesteket használtak. A fluoreszcenciát a következőkkel értékelték: egy Alexa Fluor másodlagos antitest (1:200; Cell Signaling).

A vese organoid differenciálódása az iPSC-től (indukált pluripotens őssejtek)

A renalorganoidokat a Cruz és munkatársai által leírt protokoll szerint állítottuk elő. [6] néhány adaptációval. Röviden, 50,000 iPSC-t (indukált pluripotens őssejteket) a HC-ből és két ADPKD-s (autoszomális domináns policisztás vesebetegségben) szenvedő betegből egysejtszuszpenziót használtak Accutase leválási oldattal (Stem Cell Technologies). Az egyes sejteket 10 uM Rho-kináz inhibitorral (Y27632, Stem Cell Technologies vagy Stemgent) egészítettük ki. 16 óra elteltével a táptalajt 1 ml mTeSR1 plusz 2,5% Matrigel plusz 10 μuM Y27632-vel helyettesítettük. 20 óra elteltével a táptalajt csak 1 ml mTeSRI-re cseréltük; 14 óra múlva a táptalajt kicseréltük, és a sejteket indukáltuk 6 µM CHIR99021 (AT104; őssejt vagy őssejt GSK-3b inhibitor/Wnt útvonal agonista) plusz Advanced RPMI (Thermo Fisher) plusz Glutamax (Life Technologies) plusz 10 ug/ml antibiotikum (Ampicillin; 1:1000 Gibco; ). Végül 36 órával később a táptalajt Advanced RPMI-t (Thermo Fischer) plusz Glutamax-ot (Thermo Fischer) plusz B27-kiegészítőt (17504-044; Life Technologies) és antibiotikumot tartalmazó DRB táptalajra cserélték. A DRB tápközeget háromnaponta cseréltük 28 napon keresztül. Ez az időtartam (28 nap) elegendő volt ahhoz, hogy az organoidok mikroszkóppal láthatóvá váljanak.

Organoidok molekuláris jellemzése RT-PCR-rel

A félkvantitatív génexpressziót RT-PCR-rel értékelték ki az embriogén folyamat során, amikor a teljes RNS-t megtisztították a 0 napokon (iPSC-k (indukált pluripotens őssejtek)) és a 14., 21., 28. és 35 nappal a differenciálódás indukciója után. A WT1 (fejlődő vese), az AQP1 (proximális cső) és az ECAD (ciszta epitélium marker) expresszióját értékelték. A GAPDH-t belső kontrollként használtuk. Kvantitatív standardként az OCT4 expresszióját használtuk.

Eredmények

iPSC-k (indukált pluripotens őssejtek) kinyerése eritroid progenitorokból (EP-k)

Összefoglaljuk a vese organoidok eritroid progenitorokból történő kinyerésére alkalmazott protokollt. Az EP-ek expanziója körülbelül 20 nap elteltével 1x10 fokos sejteket eredményezett (S2A ábra), majd körülbelül két hónappal később az EP-ket a CD71 és Gly A markerek expressziója alapján azonosították. Az elválasztási módszer hatékonysága kimutatta az expressziót; a sejtek 88 százaléka CD71 pozitív, és 57,4 százalékuk Gly A pozitív (S2B ábra).

Miután ellenőriztük, hogy a sejtek EP-k-e, újraprogramozási faktorokkal (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc és klf4) transzfektáltuk őket, majd egy speciális táptalajban tartottuk az újraprogramozáshoz (ReproTeSR, Stem Cell Technologies). körülbelül öt napig. Az iPSC-k (indukált pluripotens őssejtek) tipikus sejtjellemzőket fejlesztettek ki azáltal, hogy olyan kolóniákat hoztak létre, amelyek morfológiája különbözik az ugyanabban a sejttenyészetben jelenlévő, át nem programozott sejtektől. A sejteket addig figyeltük, amíg nem észleltünk tipikus iPSC (indukált pluripotens őssejtek)-szerű telepeket, amelyek hasonlóak voltak a kereskedelmi H9 sejtvonal telepeihez (Eig 1B). Az iPSC (indukált pluripotens őssejtek) telepeket viszonylag nagyobb méretükről is felismerték. szoros sejttömörítés, jól meghatározott homogén forma és szabályos élek. Az azonosítást megkönnyítette a differenciált sejtekből származó telepek alacsony fokú túlszaporodása feeder-mentes újraprogramozó tápközegben (Eig 1C). Nem találtunk kimutatható különbséget a HC és ADPKD (autoszomális domináns policisztás vesebetegség) betegek (PTl és PT2) iPSC telepei között a telepmorfológia és a pluripotencia markerek tekintetében, amint az 1D. ábrán látható.

Az iPSC-ket (indukált pluripotens őssejteket) az is jellemezte, hogy képesek a három csírarétegre differenciálódni. A HC sejtekben a csíraréteg fejlődésének előrehaladásának jellegzetes képeit az S5 ábra mutatja. A három csíraréteg fejlődését tipikus morfológia (Eig 2A) és immunfluoreszcens jelöléssel igazoltuk a differenciációs markerek, nevezetesen a FOXA2 endoderm esetében. , simaizom aktin (SMA) a mezodermához és SOX2 az ektodermához (Eig2B-2D). Az antitestek negatív kontrolljait az S7 mutatja. A 2E. ábra az endoderma (SOX17), mezoderma (CXCR4) és ektoderma (PAX6) specifikus markereinek génexpressziós szintjeit mutatja, amint azt RT-PCR-rel kimutattuk.

2. ábra: A három csíraréteg jellemzése. Egészséges kontroll (HC) és ADPKD1 betegek (PT1 és PT2).

A. A három csíraréteg tipikus morfológiája. A csírarétegeket immunfluoreszcens festéssel jellemeztük specifikus antitestek felhasználásával. B. Endoderma (FOXA2),

C. Mesoderm (SMA) és D. Ectoderm (SOX2). A sejtmagokat DAPI-val festettük. Az utolsó oszlopok egyesített képeket mutatnak.

E. Az OCT4 génexpressziója az iPSC-k pluripotenciáját jelzi, a SOX17 az endoderma markere, a CXCR4 a mezoderma, a PAX6 pedig az ektoderma markere (n=2).

Belső kvantitatív kontrollként az iPSC-k általi OCT4 expressziót használtuk. Az OCT4 expressziója nem volt kimutatható a három csíraréteg sejtjeiben (méretarány: 200 μm).

Vese organoidok előállítása iPSC-kből (indukált pluripotens őssejtek)

Háromdimenziós vesestruktúrákat hoztak létre a HC-ből származó iPSC-kből (indukált pluripotens őssejtek), valamint mind az ADPKD-s (autoszomális domináns policisztás vesebetegség) betegekből, az embrionális fejlődést összefoglaló lépéseket követve. A 3. ábra a megfelelő embrionális struktúrák előállításához szükséges lépéseket mutatja be. Az iPSC (indukált pluripotens őssejtek) kolóniákat (3A. ábra) disszociáltuk az Accutase-szal (3B. ábra), hogy egyetlen iPSC-t (indukált pluripotens őssejteket) kapjunk (3C. ábra). A normál embriogén folyamatot figyelembe véve a telepek várhatóan blasztulává, majd gastrulává differenciálódnak, de az iPSC-k (indukált pluripotens őssejtek) spontán differenciálódása a tenyészetben továbbra is kihívást jelent, mivel a sejtek spontán apoptózison mennek keresztül [16]. Ennek a nemkívánatos kimenetelnek a megkerülésére a jelátvitel ROCK inhibitorát (10 μM Rho-kináz inhibitor Y27632) adták hozzá 16 órával az egysejtű szakasz után. A ROCK útvonal gátlása megakadályozza, hogy a sejtek elindítsák a halálozási útvonalakat, lehetővé téve számukra, hogy túléljenek és alkalmazkodjanak a differenciálódási folyamat felé. Az iPSC-k (indukált pluripotens őssejtek) ezután növekedtek, amíg el nem értek az epiblaszt stádiumot, amelyet a szferoid üregek jelenléte jellemez (3D. ábra). Ezután egy erős GSK-3b inhibitor/Wnt útvonal agonistát (CHIR99021) adtunk hozzá, amit DRB táptalaj hozzáadása követett az epiteliális-mezenchimális átmenet indukálására (3E. és 3E. ábra), végül pedig a mezenchim-epiteliális átmenetet 3G ábra); ezek a lépések lehetővé tették a hámképződést és a pretubuláris aggregátumok és vesevezikulák egymás utáni kialakulását (Eig 3H), ami végül lehetővé tette a vese tubuláris organoidok kialakulását (3D. ábra). Mindezek az in vitro embriogenezis lépések hasonlóak voltak mind a HC, mind az ADPKD (autoszomális domináns policisztás vesebetegség) betegek sejtjeiben.

A tubuláris struktúrák jelenlétét specifikus markerek immunfluoreszcenciával történő expressziójával igazoltuk: NHE3 és AQP1 a proximális tubulusok esetében (Eig4A) és NPHS2 a glomerulusokban (Eig 4B). Ezzel szemben az AQP2 jelölést nem észlelték (Eig 4B), ami megerősíti, hogy ez A módszertan csak a metanephric tömeg kialakulását tette lehetővé, az ureterbimbóé azonban nem. Az ECAD marker nem volt kimutatható forskolin hiányában (4B. ábra).

A progenitor vese fejlődési folyamata során kifejeződő specifikus markerek jelenlétének ellenőrzésére az összes mintát (HC, PT1 és PT2) a teljes differenciálódási folyamat öt pontján gyűjtöttük: 0. nap (iPSC-k (indukált pluripotens szár) sejtek)), a 14., 21., 28. napon, majd a 35. napon (7 nappal a ciszta indukciója után). A génexpresszió időbeli lefutása differenciálódást mutatott az embriogenezis folyamata során, amint azt az 5A-5C. ábra mutatja. Az OCT4 pluripotencia markert kifejezték az iPSC-k (O nap), de szintje 14 nap alatt csökkent, és a differenciálódást követően nagyon alacsony szintet ért el. Ezzel szemben a metanefris mesenchyma (WT1) és a proximális tubulus (AQP1) specifikus markereinek expressziója fokozatosan nőtt, amikor a differenciálódási folyamat a 14. napon megindult, és a 21. napon elérte a platót. Az 5D. ábra az ECAD, egy cisztogenezis expresszióját mutatja. marker, a 35. napon, azaz 7 nappal a forskolinnal történő ciszta-indukció után. Forskolin hiányában az ECAD expressziója nagyon alacsony volt, még ADPKD (Autosomal dominant polycystás vesebetegség) betegekben is. Amikor azonban forskolint adtunk hozzá (28. nap), mindkét beteg fokozott ECAD-expressziót mutatott; de ugyanezt a mintát nem figyelték meg a HC organoidban, amely alacsony ECADexpresszió mellett még forskolin jelenlétében is megmaradt.

A forskolinnal stimulált organoidokból képződött ciszták jelenléte nyilvánvaló volt ADPKD-s (Autosomal dominant polycystás vesebetegség) betegeknél, amint azt az Eig6 mutatja. A felső panelen az organoidok képei láthatók a 28. napon, a forskolin (Eig6Aa) hozzáadása előtt. Az Eig6Ab (panoráma nézet-4X) és a 6Ac (20X megtekintés) mutatja az organoidokat a 35. napon a A forskolin cisztaszerű struktúrák jelenlétét mutatja mindkét beteg mintájában (PT1 és PT2), de a HC mintában nem. A ciszták jelenlétét immunfluoreszcens festéssel is igazoltuk (6B. ábra). ECAD jelölést nem észleltünk a HC organoidban, de egyértelműen megfigyelhető volt mindkét beteg organoidjaiban. Érdekes módon ciszta lumen jelenléte is megfigyelhető.

3. ábra Cső alakú organoidok előállítása.

A HC, PT1 és PT2 csoportokból generált iPSC-kből származó epiteliális tubuláris vese organoidok fáziskontrasztos képei 28 napon belül. Az első 36 órában az iPSC-ket 3D tenyészetben tartottuk fenn.

Ezután disszociáltuk, egyetlen sejtekké transzformálták őket, és Y-27632-el kezelték őket, ami lehetővé tette a sejtek újjászervezését és túlélését, epiblaszt szferoidokat termelve (d).

Ezután CHIR99201-et és DRB-t adtunk hozzá, aktiválva a Wnt/-catenin útvonalat, és lehetővé téve a tubuláris organoidokká való differenciálódást (I).

Az ADPKD-betegekből és a HC donorból származó szferoidok morfológiája hasonló. (A és f skála: 1000 μm; skála b, cd, e, g, h és i esetén: 200 μm).

RÉSZVÉTELHEZ KATTINTS IDEⅡ