A krónikus vesebetegség (CKD) globális prevalenciája a népesség öregedésével növekszik

További információért forduljon a következőhöz: oscar.xiao@wecistanche.com

Háttér:A fibrózis a vese öregedési folyamatának egyik leggyakoribb kóros tünete, és az öregedő vesék fibrózisa a krónikus vesebetegség (CKD) folyamatát is súlyosbítja. A Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) a kínai folklórban gyakran használt botanikai drog. Azonban kevés tanulmány számolt be farmakológiai hatásairól. Ennek a vizsgálatnak a célja a CF etanolos kivonat vesefibrózisra gyakorolt ​​hatásának feltárása volt SAMP8 egerekben, és a potenciálisan aktív vegyületek azonosítása.

Mód:Állatmodellként az öregedésgyorsított egérre hajlamos 8-at (SAMP8) használtuk, és különböző dózisú CF-et adtunk szondán keresztül egy hónapig. A vese öregedésének mértékének megfigyelése egerekben -galaktozidáz festéssel. Masson festést és a Col-lI, a-SMA és FN expressziós szintjeit használtuk az egerek vesefibrózisának értékelésére. Megmértük a Nrf2 útvonal és a Wnt/ -catenin/RAS útvonal fehérje expressziós szintjét a vesében. És a -galaktozidáz ( -gal) által indukált NRK{11}}E sejtek in vitro modellként a CF aktív komponenseinek szűrésére.

További információért kattintson ide

Eredmények:A CF etanolos kivonat szignifikánsan gátolta a vese-galaktozidáz aktivitását és a Coll, a-SMA és FNin SAMP8 egerek expressziós szintjét, és javította a Masson festődést SAMP8 egerekben. A CF jelentősen csökkentette a vizelet fehérje-, kreatinin-, karbamid-nitrogén-, valamint a TNF-a és IL{5}} szérumszintjét SAMP8 egerekben, és jelentősen megnövelte a SOD és a GSH-Px szintjét. Ezenkívül a CF aktiválta az Nrf2 útvonalat, és blokkolta a Wnt/-catenin/RAS útvonalat az egerek veséjében. Ezen kívül 3,4-dihidroxi-fenil-etanol (SDC-0-14,16) és (3,4-dihidroxi-fenil-etanol-8-O-[4-O-transz) -caffeoil- -D-apiofuranozi-(1→3)- -D-glükopiranozil (1→6)]- -D-glükopiranozidot (SDC-1-8) izoláltunk CF-ből , amely csökkentette az NRK-52E sejtek öregedését, és talán az öregedésgátló szerepet játszó CF aktív összetevői.

Következtetések:Kísérleteink rávilágítottak arra, hogy a CF etanol kivonat enyhítheti a vesefibrózist SAMP8 egerekben a Wnt/-catenin/RAS útvonalon keresztül. Az SDC-0-14,16 és az SDC-1-8 pedig az anyagi alapja lehet annak, hogy a CF a vese öregedésével kapcsolatos hatásokat kifejtse.

Kulcsszavak:Öregedés, Corallodiscus flabellata, vese, vesefibrózis, SAMP8, öregedés, Wnt/ -catenin/RAS

Bevezetés

A krónikus vesebetegség (CKD) globális prevalenciája a népesség öregedésével növekszik, és jelentős terhet jelent a társadalom számára [1-3]. A CKD leggyakoribb patológiás megnyilvánulása a vesefibrózis valamilyen formája[4]. Hasonlóképpen, a vesefibrózis a vese öregedésének egyik jele [2]. Tanulmányok kimutatták, hogy az oxidatív stressz, a gyulladás, a Wnt/-catenin, a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer (RAS) és a rapamicin(mTOR) jelzések mind összefüggésben állnak az öregedés által kiváltott CKD-vel [5]. Az öregedő vesék vesefibrózisa szorosan összefügg a Wnt/-catenin és a RAS jelátviteli útvonal aktiválásával [6]. A Wnts aktiválásakor a citoplazmában lévő -catenin a sejtmagba kerül, ahol a limfoid enhanszer-kötő faktorhoz (LEF)/a T-sejt faktor (TCF) transzkripciós faktorcsaládhoz kötődik, és elindítja a downstream célgének transzkripcióját. Érdekes módon a RAS gén promoter régiója is tartalmaz LEF/TCF kötőhelyeket, ami lehetővé teszi a -catenin számára, hogy elősegítse a LEF-1 kötődését ezekhez a helyekhez[7].cistanche koleszterin,Ezért a Wnt/-catenin/RAS jelátviteli útvonal megcélzása a vesefibrózis lehetséges terápiás stratégiája lehet [8,9]. Az elmúlt években a vesefibrózis természetes termékekkel történő helyettesítése sok tudós figyelmét felkeltette [10]. . Xiaoyan Shen és munkatársai azt találták, hogy a ginsenozid Rgl enyhítette a glomeruláris fibrózist a vese öregedése során azáltal, hogy gátolta az NLRP3 gyulladás aktiválódását SAMP8 egerekben [11]. Ez a tanulmány a C. flabellate(CF) kivonat vesefibrózisra gyakorolt ​​hatását vizsgálta SAMP8 egerekben a Wnt/-catenin/RAS útvonalon.

A Cistanche öregedésgátló hatású

A CF-t mint gyógynövényt Kínában először a "Dian Nan Ben Cao" jegyezték fel. Az egész növényt gyakran használják vérhas, korai magömlés, ondóhólyag-betegség és vesebetegség kezelésére Kína etnikai kisebbségi területein [12]. Jelenleg Laboratóriumunkban végzett farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a CF-kivonat vizelethajtó hatással bír, és javítja a lipopoliszacharid/D-galaktózamin okozta májelégtelenséget és agykárosodást patkányokban [13, 14]. És a fitokémiai vizsgálatok feltárta, hogy a CF fő kémiai komponensei a fenil-etanoid-glikozidok és a flavonoidok [15,16].A vizsgálat célja a CF-kivonat vesefibrózisra kifejtett hatásának vizsgálata SAMP8 egerekben, valamint annak lehetséges mechanizmusának feltárása volt. kísérleti bizonyítékok a vesebetegség CF-vel történő kezelésére, amelyet az ősi könyvek írnak le.

Anyagok és metódusok

A növényi anyag összegyűjtése és kitermelése

A "Yunnan Chinese Herbal Medicine" szerint a CF egész évben betakarítható. A kísérletben használt CF növényeket a kínai Henan tartomány Xixia megyében betakarították szeptemberben. Suiqing Chen professzor, a Henan Kínai Orvostudományi Egyetem professzora azonosította, és a mintákat a laboratóriumi mintakönyvtárban tárolták.cistanche deserticola mellékhatásaiA növényeket (1 kg) visszafolyató hűtő alatt forraljuk 50%-os etanollal (3×12 liter, mindegyik 1 óra), és az elegyet 16 réteg gézzel leszűrjük. Az egyesített szűrleteket rotációs bepárlóban szárítjuk, fagyasztva szárítóval. Végül az 50%-os etanolos CF-kivonat százalékos kitermelése 15,5% volt. A szárított kivonatot további felhasználásig hűtőszekrényben tároltuk. A kiegészítő anyagok felsorolják a CF-kivonat összetevő-megjelölésére vonatkozó releváns adatokat.

Ebben a tanulmányban egy másik, korábban ismertetett elválasztási eljárást alkalmaztak a vízelúciós frakció, 20% etanolos elúciós frakció, 30% etanolos elúciós frakció és 40% etanolos elúciós frakció előállítására CF-ből [13]. A 40 százalékos etanolos frakciót Sephadex LH-20 és szilikagél oszlop segítségével választottuk el, majd félpreparatív, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) tisztítottuk, így végül olyan vegyületeket kaptunk, mint az SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60(p-hidroxi-benzil-alkohol).

Állatok és adminisztráció

Ebben a vizsgálatban a Tianjin Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem (Tianjin, Kína) első társkórházából származó, hat hónapos hím SAMP8 és öregedéssel felgyorsított egérrezisztens 1 (SAMR1) egereket használtak. Az állatokat szabályozott megvilágítás (12-h fény/sötét ciklus), hőmérséklet (23-25 °C) és páratartalom (45-55 százalék) körülmények között tartották, és standard étrendet és vizet kaptak. libitum. Összesen 48 SAMP8 egeret osztottak négy kísérleti csoportra (n=12/csoport): SAMP8 modell egerek (M), alacsony dózisú CF etanol kivonattal kezelt SAMP8 egerek (CF-L, 387,5 mg/kg, intragasztrikusan), közepes dózisú CF etanol kivonattal kezelt SAMP8 egerek (CF-M, 775 mg/kg, intragasztrikusan), és nagy dózisú CF etanol kivonattal kezelt SAMP8 egerek (CF-H, 1550 mg/ kg, intragasztrikusan). A SAMRI kontroll (Con, n{29}}) és a SAMP8 modellcsoportba tartozó egereket (M) fiziológiás sóoldattal (0,9 százalék) kezeltük. Minden egeret orálisan kezeltünk 1 hónapig. Minden állatkísérletet jóváhagyott a Henani Kínai Orvostudományi Egyetem etikai bizottsága, és az intézményi irányelvek szerint végezték el (Henan, Kína jóváhagyási száma: HACTCM-2018009060-19). A kísérlet során mind a Con, mind az M csoportban egy egér, a CF-H csoportban pedig két egér pusztult el.

Minta kollekció

A kísérlet végén az egereket egyenként metabolikus ketrecekben tartottuk 12- óra vizeletgyűjtésre. Az egereket ezután izofluránnal érzéstelenítettük, és retroorbitális vérzéssel vérmintákat vettünk. Az egyes egerek veséit ezután sebészeti úton eltávolítottuk, és 80 fokon tartottuk az elemzésekig.

Sejttenyésztés és in vitro vizsgálat

A Kínai Tudományos Akadémia Sejtbankjától (Sanghaj, Kína) vásárolt NRK-52E-sejteket tenyésztettünk, hogy megvizsgáljuk a CF-kivonat hatását a D-galaktóz által okozott sejtöregedésre (D-gal, S11050, Yuanye, Shanghai, Kína). Az NRK-52E sejteket a Dulbecco által módosított Eagle-féle Dulbecco táptalajban (DMEM, 12 100 046, Thermo Fisher, Massachusetts, USA) tenyésztettük 10%-os magzati szarvasmarha-szérummal, inkubátorban 37 °C-on, 5 °C-on. százalék , CO.A sejteket 96-lyuklemezeken vagy 6-lyuklemezeken növesztjük 80-85 százalékos összefolyásig, majd különböző gyógyszerkombinációkat tartalmazó táptalajjal kezeljük: Táptalaj plusz D-gal ( 20 mg/mL), táptalaj plusz D-gal plusz CF (10, 25,50, 100 ug/mL) vagy táptalaj plusz D-gal plusz monomer vegyület (10 μM) rendre 48 órán keresztül. Ezt követően a metil-tiazolil-tetrazólium ( MTT) vizsgálatot alkalmaztunk a sejtek életképességének kimutatására, és -galaktozidáz festést a sejtek öregedésének megfigyelésére.

Az öregedéssel összefüggő -galaktozidáz festés

Az egerek fagyasztott veséit 10-μm vastag metszetekre vágták, és az NRK{2}}E-sejteket öregedéssel összefüggő -galaktozidázzal (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kína) festették meg. a gyártó protokolljait követve.

Szövettani elemzés

A vesemetszeteket 4 százalékos pufferolt paraformaldehiddel rögzítettük, a 10-μm vastag paraffinba ágyazott metszeteket pedig Masson-féle trikrómmal (G1006, Service, Wuhan, Kína) festettük meg, és mikroszkóposan megfigyeltük. A Masson trikrómmal festett metszeteiben a kék színű területeket hat véletlenszerűen kiválasztott mezőből kvantitatívan mértük, és Image-Pro Plus 6.0 szoftverrel elemeztük.

Biokémiai mérések

A szérum- és vesehomogenizátummintákat szobahőmérsékletre felengedtük, és a szuperoxid-diszmutáz (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, Kína), a glutation-peroxidáz (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kína), interleukin-1 (IL-1, RK00006, ABklonális, Wuhan, Kína), tumornekrózis faktor- (TNF-, RK00027, ABklonális, Wuhan, Kína), karbamid-nitrogén (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kína), kreatinin (Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kína) egérszérumban, összes vizeletfehérje (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , Kína) az egér vizeletében és az I-es típusú kollagén expressziós szintjei (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, Kína), -simaizom aktin (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, Kína), fibronektin (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, Kína) egér veseszöveteiben egymást követően mértük az assay kit gyártójának protokollja szerint.

Immunhisztokémiai elemzés

Az immunhisztokémiai analízist rutin módszerrel végeztük [17]. A felhasznált antitestek a következők voltak: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), -catenin (17565-1-AP,Proteintech, Chicago, USA), 1-es típusú angiotenzin II receptorok (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, USA), p-nukleáris faktor eritroid 2-kapcsolódó 2. faktor (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság), pc-Fos (ab27793, Abcam, Cambridge, UK ), kötőszöveti növekedési faktor (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, Kína). A metszeteket mikroszkóp alatt figyelték meg (Olympus, Tokió, Japán).cistanche adagolás redditMérje meg a terület területét és integrált optikai sűrűségét (IOD) sárgásbarna kifejezéssel az Image-Pro Plus 6.0 szoftver segítségével, és számítsa ki az átlagos optikai sűrűséget (MOD, MOD=IOD/terület) félig -mennyiségi elemzés.

Western blot analízis

A Western blot assayt egy korábbi tanulmányban leírtak szerint végezték [18]. Röviden, a veseszöveteket lízispufferben homogenizáltuk, és Bradford Protein Assay Kit (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, Kína) segítségével mennyiségileg meghatároztuk. A homogenizátumokat ezután nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézisnek vetettük alá, polivinilidén-fluorid membránra vittük át, és blokkolópufferben (4% zsírmentes száraz tej) blokkoltuk 90 percig. Ezután primer antitestekkel (Wnt4; renin; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; Kelch-szerű ECH-asszociált protein 1 (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, Kína); -aktinnal (AC026, Abclonal, Wuhan, Kína); és gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, Kína)) egy éjszakán át 4 fokon, majd inkubálást egy megfelelő fluo-jelenléttel konjugált másodlagos antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten. . Az érdeklődésre számot tartó fehérjéket Odyssey IR szkennerrel (LI-COR Biosciences, Nebraska, USA) pásztáztuk, és a jelintenzitást az Image Studio szoftverrel számszerűsítettük. A fehérjeszinteket az -aktinnal vagy GAPDH-val szemben normalizáltuk.

UPLC-Q-TOF-MS analízis vesemintákhoz

A veseszöveteket lemértük és jéghideg fiziológiás sóoldatban homogenizáltuk (w/v=1:1). Ezután 1 ml acetonitrilt adtunk 200 µl szövethomogenizált mintához, majd 30 percig ultrahangos extrakciót végeztünk. A kivonatot 12, 000 g-vel és 4 fokon centrifugáltuk 10 percig. A felülúszót a fiolába vittük elemzés céljából. A kromatográfiás elválasztást ultrateljesítményű folyadékkromatográfiával (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, USA) végeztük, az LC rendszer egy Acclaim RSLC 120 C18 oszlopot tartalmazott (2,2 μm, 2,1 × 100 mm; Thermo Scientific).cisztanche kivonat előnyeiA mozgófázis A oldószerből (acetonitril) és vízből állt {{0}},1% hangyasavval (B). Az elválasztás gradiens elúcióval történt a következőképpen: 10-70 százalék A 0-3 perc, 70-78 százalék A 4-13 perc, 78-90 százalék A 14-től 15 perc, 90 százalék -10 százalék A 15 és 16 perc között, és 10 százalék A 16 és 20 perc között. A vizsgálati minta injektált térfogata 2 μL volt. A tömegspektrometriás (MS) analízist ESI forrás felhasználásával a következő körülmények között végeztük: a pozitív üzemmódban a kapilláris feszültség 3,5 kV, a negatív üzemmódban a kapilláris feszültség 3,2 kV volt. A porlasztó nyomása 2,0 bar, a száraz gáz hőmérséklete 230 fok, az áramlási sebesség 8 l/perc.

Statisztikai analízis

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; a csoportok közötti összehasonlításhoz az egytényezős varianciaanalízist alkalmaztuk. A 0,05-nél kisebb AP értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények

A CF javította a vesék öregedését és fibrózisát SAMP8 egerekben

A CF SAMP8 egerek vesére gyakorolt ​​hatásának vizsgálatához SA- -gal aktivitást mértünk a vesékben. Az la. ábrán az SA- -gal aktivitás a veseszövetekben szignifikánsan megnövekedett az M csoportban (kék fokozódás). A CF-L és a CF-M beadása szignifikánsan gátolta a -galaktozidáz aktivitást a SAMP8 egerek veséjében, míg a CF-H javulása nem volt szignifikáns. Ezenkívül a modellcsoport vese indexe szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontrollcsoporté (1b. ábra, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

A CF javította a vesefunkciót, az oxidatív stresszt és a gyulladás szintjét SAMP8 egerekben

Emellett az egyes egércsoportok vesefunkciós mutatóit is teszteltük, amelyek között szerepelt az egerek vizeletmennyisége 12 órán keresztül, a szérum Cr és karbamid nitrogénszintje, valamint a vizelet fehérje szintje. Amint a 2a-d ábrákon látható, a modellcsoport vizeletfehérje-, szérum Cr- és szérum-karbamid-nitrogénszintje szignifikánsan magasabb volt, mint a kontrollcsoporté (2a, P ábra).<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">Cisztancse Dzsingisz kánEzt követően azt vizsgálták, hogy a CF kedvezően befolyásolja-e az oxidatív stresszt és a gyulladást a gyorsan öregedő egerek veséjében. A 2e-h ábrán látható, hogy az M csoport veséjében a SOD és a GSH-Pxin szintjei szignifikánsan alacsonyabbak voltak, mint a Con csoportéi, és az IL-1 szintjei szignifikánsan magasabbak voltak, mint a Con csoport. A CF kezelés után a fenti mutatók javultak, különösen a CF-L és a CF-M javító hatása.

A CF aktiválta a Nrf2 útvonalat SAMP8 egerek veséjében

A p-Nrf2 expressziós szintjét veseszövetekben mértük, hogy megvizsgáljuk, hogy az Nrf2 útvonal szerepet játszik-e a CF védő hatásában (3a-c ábra) jelen vizsgálatban. A p-Nrf2 expressziós szintje szignifikánsan csökkent önmagában a SAMP8 csoportban (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

A CF gyengítette a Wnt/-catenin/RAS jelátviteli aktiválást SAMP8 egerek veséjében

A CF fibrózis elleni hatását kifejtő lehetséges mechanizmusának további feltárása érdekében. A fehérje lokalizációját immunhisztokémiai módszerrel végeztük. Amint az a 4a. ábrán látható, a Wnt4 és a

-catenin túlnyomórészt vesetubuláris sejtekben indukálódott. Hasonló eredményeket figyeltek meg, amikor az AGTR1-et, a Wnt jelátvitel downstream útvonalának célpontjait értékelték (4a. ábra). Ezt követően számszerűsítettük a fehérje expressziós szintjét, és az eredmények azt mutatták, hogy a Wnt4, -catenin, renin és AGTR1 fehérjék felhalmozódtak a modellcsoport egereinek veseszövetében, míg a CF jelentősen gátolta ezeket a változásokat (4b-f ábra). ). Továbbá a CTGF expressziós szintjét is meghatároztuk és kvantitatívan elemeztük. A fent említett eredményekkel összhangban a CTGF főként a vesetubulusokban expresszálódott, és a CF jelentősen gátolta a CTGF aktivitását (4d g ábra).

A CF és vegyületei gátolták az NRK{0}}E-sejtek D-gal által indukált öregedését

A D-gal-indukált NRK-52E sejteket a CF bizonyos hatóanyagainak szűrésére használtuk, hogy meghatározzuk a szenilis vesék CF kivonattal történő kezelésének anyagi alapját. Az eredmények azt mutatták, hogy a CF dózisfüggő módon fokozta a sejtek életképességét és a vegyületeket

A CF-ből izolált SDC-0-14,16 és SDC-1-8 jobb hatással volt a sejtproliferációra. Emellett a 25 ug/ml CF és az SDC-0-14,16 és SDC-1-8 vegyületek mind a -galaktozidáz aktivitást gátló hatást mutattak (5. ábra).

A CF javította a veseszövet PCA-analízisét SAMP8 egerekben A főkomponens-analízist (PCA) végeztük a CF SAMP8 egerekre gyakorolt ​​hatásának feltárására. Amint a 6a. ábrán látható, nyilvánvaló csoportosítás volt a kontroll és a modellcsoport között (R2X=0.542; Q2=0.38), ami arra utal, hogy a SAMP8 egerek endogén metabolitjai eltérnek a SAMR1-től. egereket, ami miatt eltérnek a SAMR1 csoporttól. A 6b. ábrán látható módon a különböző CF-csoportok a kontroll- és a modellcsoporttól eltérő osztályokba is csoportosultak, és a CF-csoportok közelebb kerültek a kontrollcsoporthoz, jelezve, hogy

A CF-beavatkozó SAMP8 egerek endogén metabolitjai hasonlóak voltak a SAMR1 egerekéhez.

Vita

Az öregedés fontos szerepet játszik a CKD progressziójában [19]. A CKD fibrózis előrehaladtával az öregedő sejtek pro-fibrotikus faktorokat (TGF-, CTGF stb.) és pro-inflammatorikus faktorokat (IL-1, IL-6, TNF- és így tovább) expresszálnak és választanak ki. ), amelyek öregedéssel összefüggő szekréciós fenotípus faktorok, ezáltal felgyorsítják a vesefibrózist [20, 21]. Jelenleg a hagyományos kínai orvoslás jó eredményeket ért el a vesefibrózis kezelésében, kevesebb mellékhatással [22]. Ez a tanulmány feltárta a CF-kivonat intervenciós hatásait a vesefibrózisra SAMP8 egerekben. A vizsgálathoz kiválasztott egértörzs a SAMP8 volt, amelyet az AKR/egerek élettartama, öregedése és patológiás fenotípusos osztályozása alapján fejlesztettek ki, és kizárólag genetikai eredetű felgyorsított öregedési modell volt [23,24]. Tanulmányok kimutatták, hogy a SAMP8 egerek (9 hónapos) vesepatológiájában bekövetkezett változások közé tartozik a tubulointerstitialis fibrózis és a fokális szegmentális glomerulosclerosis [25]. És azt találták, hogy a SAMP8 egerek vesefibrózisa az életkorral kapcsolatos [6]. Ezért teszteltük a -galaktozidáz aktivitását és

a vesefibrózis szintjét SAMP8 egerekben, és azt találták, hogy a CF-L és a CF-M javította a vesefibrózist és -galaktozidáz aktivitást SAMP8 egerekben (1. ábra). És teszteltük az egerek vizeletkibocsátását is. A korábban publikált tanulmányokkal összhangban, amelyek szerint a két különböző eljárással nyert CF vizelethajtó hatású [13], a kivonat jelentősen megnövelte a SAMP8 egerek vizeletmennyiségét. A jelen tanulmány azt is kimutatta, hogy a CF kiegészítése javította a vesefunkciót, az antioxidáns enzimek aktivitását és a gyulladásos faktorok szintjét SAMP8 egerekben (2. ábra).

A Keap{0}}Nrf2 rendszer az elmúlt években sok tudós figyelmét felkeltette antioxidáns és gyulladáscsökkentő tulajdonságai miatt. Farmakológiai potenciálját a vesebetegségek kezelésében alaposan tanulmányozták nem klinikai és klinikai vizsgálatokban [26]. Az Nrf2 a redox állapothoz és az antioxidáns hatásokhoz kapcsolódó gének fő transzkripciós szabályozója [27]. Tanulmányok kimutatták, hogy foszforiláció szükséges az Nrf2 aktiválásához és a célgén indukciójához [28]. Az Nrf2 aktiválása javította a CKD progresszióját az oxidatív stressz megelőzésével és a celluláris redox homeosztázis fenntartásával [29]. Kulcsfontosságú transzkripciós faktorként az Nrf2 döntő szerepet játszik az oxidatív stressz elleni védekezésben azáltal, hogy szabályozza a downstream antioxidánsait és méregtelenítő enzimeit [30]. Kim et al. beszámoltak arról, hogy a resveratrol, mint erős Nrf2 aktivátor, enyhítette az öregedéssel összefüggő progresszív vesekárosodást [31]. Jelen tanulmányban a CF javította a Nrf2 gyengülését SAMP8 egerek veséjében anélkül, hogy befolyásolta volna a Keapl expressziós szintjét, ami arra utal, hogy a CF nyers kivonat javíthatja a vesék oxidatív károsodását az Nrf2 útvonal aktiválásával (3. ábra).

A vesefibrózist a túlzott extracelluláris mátrix (ECM) lerakódás jellemzi, ami hegek kialakulásához vezet a vese parenchymában [32]. Úgy gondolják, hogy a transzformáló növekedési faktor (TGF-) kulcsfontosságú citokin a fibroblasztok túlaktiválásában [33, 34]. Természetesen csak a TGF-jelátviteli útvonal megcélzása nem elegendő a vesefibrózis csökkentésére. Egyes tanulmányok kimutatták, hogy a CTGF, a Wnt/-catenin, a renin-angiotenzin rendszer, az oxidatív stressz és így tovább szerepet játszanak a vesefibrózisban [35-37]. A Wnt/-catenin egy evolúciósan konzervált jelátviteli útvonal, amely részt vesz a szöveti homeosztázis szabályozásában, a szervek fejlődésében és a sérülések helyreállításában[38]. Cisternas et al. tárgyalta a Wnt jelátvitel pro-fibrotikus hatását mind a vázizomban, mind a vesében [39]. Egyre több bizonyíték támasztja alá, hogy a Wnt/-catenin jelátviteli út döntő szerepet játszik a sérülést követő vese fibrotikus elváltozások kialakulásának és progressziójának szabályozásában [40-42]. A Wnt/-catenin jel viszonylag csendes az egészséges felnőttek veséjében, és akkor aktiválódik, amikor a vesék különféle károsodásoknak vannak kitéve [43].

Emlősökben a Wnt családnak legalább 19 családtagja van, amelyek kritikusak a vese fejlődéséhez. Ezen családtagok közül legalább 15 eltérően szabályozott az öregedő vesében, köztük a Wnt4 [6]. A jelen vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy a Wnt4 fehérje expressziós szintje a SAMP8 egerek veséjében szignifikánsan magasabb volt, mint a SAMR1 egerekben, amit Western blot és immunhisztokémiai elemzések is igazoltak (4a, d és f ábra). Véletlenül a -catenin fehérje expressziós szintje is megemelkedett. Ezenkívül mind a Wnt4, mind a -catenin expresszálódott a vese tubuláris epiteliális sejtjeiben, amint azt az immunhisztokémiai analízis kimutatta (4a és f ábra). A Wnt/-catenin vesefibrózist váltott ki több fibrogén gén, például RAS komponensek, mátrix metalloproteináz-7 (MMP-7), plazminogén aktivátor inhibitor 1 (PAI-1) és csiga [37] indukálásával. ]. Zhou et al. A Wnt/-catenint a fő upstream regulátorként írta le, amely szabályozza az összes vizsgált RAS komponens expresszióját a vesékben [44]. Zhou és munkatársai egy 5/6-os nefrektómiás (5/6 NX) patkánymodellt használtak a RAS fő összetevőinek expressziós szintjének kimutatására az agyban és a vesében, mint például az angiotenzinogén, az angiotenzin-konvertáló enzim és az angiotenzin II AT{25 }}receptor jelentősen felszabályozott volt. A fokozott expressziós szintet gátolta a Wnt központi blokkolója, amely egy adeno-asszociált vírusvektor, amely túlzottan expresszálja a DKK1 gént [45]. Hasonlóképpen, a jelen tanulmány azt találta, hogy az AGTR1 még mindig expresszálódik a vese tubuláris epitéliumában, és a renin és az AGTRl expressziós szintje a SAMP8 egerek veseszövetében szignifikánsan magasabb volt, mint a SAMR1 egerekben (4a és dg ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a Wnt/-catenin/RAS jelátviteli útvonal aktiválódott a SAMP8 egerek veséjében, és a CF hatékonyan gátolta ennek az útvonalnak az aktiválását.

A CTGF többféle biológiai funkciót fejt ki, beleértve a kemotaktikus sejtek mitózisának elősegítését, adhéziót, valamint a sejtproliferációt és az ECM-szintézist [35,46]. A CCN2(CTGF) modulálta a Wnt jelátvitelt azáltal, hogy az alacsony sűrűségű lipoprotein receptorral rokon fehérjéhez kötődve 5/6 (LRP5/6) tovább közvetíti a fibrózist [39, 47]. Más tanulmányok géncsendesítést alkalmaztak annak felfedezésére és megerősítésére, hogy az Nrf2 szabályozza a Wnt útvonalat a CTGF expressziós szintjének szabályozásával, ami befolyásolja a vese intersticiális betegségeit. Ezenkívül az Nrf2 szabályozta a CTGF transzkripciós szintjét főként a c-Fos CTGF transzkripciós szabályozón keresztül [48]. Az immunhisztokémiai analízis kimutatta, hogy a CTGF és a pc-Fos főként a vese tubuláris hámsejtjeiben expresszálódik, és a pc-Fos a glomerulusokban is megoszlott. A kvantitatív elemzés azt mutatta, hogy mindkét fehérje expressziós szintjét gátolta a CF (3b. és e., 4a. és c. ábra). Végül a PCA analízissel tovább ellenőriztük, hogy a CF javította a vesekárosodást SAMP8 egerekben (6. ábra). A jelen tanulmány bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy a CF nemcsak aktiválta a Nrf2 jelátvitelt, hanem az Nrf2-re is támaszkodott az oxidatív stressz és a gyulladás egyensúlyában, gátolta a Wnt/-catenin/RAS jelátvitelt, valamint javította a vese öregedését és a vese fibrogenezisét. Ebben a kísérletben azonban következetlen javulást tapasztaltunk a CF Masson- és SA{27}}gal-festésre gyakorolt ​​hatásában. Feltételezik, hogy ennek oka lehet a vese öregedésének és a vesefibrózisnak a SAMP8 egerekben tapasztalt következetlen előrehaladása. Ebben a kísérletben az egereknél a vese öregedésének mértéke súlyosabb lehet, mint a fibrózis. Ezért a CF-H javító hatása a vese öregedésére SAMP8 egerekben nem volt olyan nyilvánvaló, mint a vesefibrózisé.

Redukáló monoszacharidként a D-galaktózt széles körben használják különféle, életkorral összefüggő betegségekben in vivo és in vitro. Úgy találták, hogy a D-gal öregedést és sérülést okoz az NRK-52E-sejtekben [49], indukálja a humán vese proximális tubuláris epiteliális sejtjeinek (HKC-8 sejtjeinek) öregedését, és növeli két vese expressziós szintjét. fibrózis marker proteinek FN és a-SMA [6]. Ebben a vizsgálatban a D-gal-t használták NRK-52E sejtek in vitro indukálására. MTT vizsgálat és -galaktozidáz festés segítségével a CF-ből izolált vegyületek kimutatására azt találták, hogy az SDC-0-14,16 és SDC-1-8 fokozta a D-gal által kiváltott sejtek életképességét és gátolta a D-gal-indukált sejt öregedés (5. ábra). Ezek azt sugallták, hogy az SDC-0-14,16 és az SDC-1-8 lehet a CF anyagi alapja a vese öregedésének késleltetésében. Az SDC-1-8 a fenil-etanol-glikozidok egyike. Azt találták, hogy a fenil-etanol-glikozidok meghosszabbítják a Caenorhabditis Elegans [50] élettartamát, öregedésgátló, [51] és neuroprotektív hatással [52-54]. Ezek irányt adnak a CF farmakológiai hatásaival foglalkozó nyomon követési vizsgálatunkhoz.

Következtetések

Összefoglalva, az in vivo vizsgálatok azt mutatták, hogy a CF csökkentette a vesefibrózist idős egerekben. Néhány potenciális hatóanyagot találtak in vitro kísérletekben. Ezek az eredmények farmakológiai alátámasztást adtak a vesebetegségek CF-kezeléséhez, és irányt adtak a CF hatóanyagainak további kutatásához.

Ez a cikk Cao et al. BMC Complementary Medicine and Therapies (2022), 22:52