A Calpain2a proteáz korlátozza a veleszületett immunitást azzal, hogy a TRAF6-ot célozza meg a Teleost Fishben
Dec 19, 2023
A TNF-receptor-asszociált 6-os faktor (TRAF6) kulcsfontosságú jelátviteli szerepet játszik mind az antibakteriális, mind az antivirális jelátviteli útvonalakban. A TRAF6 szabályozó mechanizmusairól alacsonyabb gerinceseknél azonban kevésbé számoltak be. Ebben a tanulmányban a calpain2a-t a kalciumfüggő proteázok családjába tartozó, egyedülálló hidrolitikus enzimaktivitással rendelkező tagként azonosítjuk, és kulcsfontosságú szabályozóként működik az antibakteriális és antivirális immunitásban teleost halakban. Lipopoliszacharid (LPS) stimuláció hatására a calpain2a leütése elősegíti a gyulladásos citokinek felszabályozását. Mechanikailag a calpain2a kölcsönhatásba lép a TRAF6-tal, és hidrolizálva csökkenti a TRAF6 fehérjeszintjét. Az enzimaktivitás elvesztése után a mutáns calpain2a kompetitív módon gátolja a TRAF6 dimer képződését és auto-ubikvitinációját. A calpain2a leütése szintén elősegíti a sejtes vírusellenes választ. A hidroláz aktivitást nem mutató mutáns calpain2a elnyomja az IFN szabályozó faktor (IRF) 3/7 ubiquitinációját a TRAF6-ból. Összességében ezek az eredmények a calpain2a-t a veleszületett immunreakciók negatív szabályozójaként osztályozzák, mivel a TRAF6-ot célozzák meg teleost halakban.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
A veleszületett immunitás, mint az első védelmi vonal a behatoló kórokozók ellen, fontos szerepet játszik a szervezet bakteriális invázió és vírusfertőzések elleni védelmében. A membránon található mintázatfelismerő receptorok (PRR-ek) azonnal felismerik a kórokozó-asszociált molekuláris mintákat (PAMP)1–3. A három legszélesebb körben vizsgált PRR a veleszületett immunitásban a Toll-like receptorok (TLR-ek), a RIG-I-szerű receptorok (RLR-ek) és a NOD-szerű receptorok (NLR-ek), amelyek felismerik a különböző PAMP-okat, és jelkaszkádokat indítanak el, hogy aktiválják a proinflammatorikus citokineket és vírusellenes faktor4-6. A TNF receptor-asszociált faktor (TRAF) 6 nélkülözhetetlen része a bakteriális invázió és a vírusfertőzések elleni küzdelemnek. A lipopoliszacharid (LPS) által aktivált fontos jelút, a nukleáris transzkripciós faktor-κB (NF-κB) útvonalat részletesen feltérképezték. Az NF-κB jelátviteli útvonalban a legtöbb fehérje funkciót alaposan tanulmányozták1,7. A 88-as mieloid differenciációs faktort (MyD88) először a TLR-ek aktiválják az LPS-re válaszul, és az IRAK4 közvetítőként működik az IRAK1 és IRAK2 aktiválásával, amelyek összekapcsolják a MyD88-at a TRAF68–11-gyel. Az Ubc13 és az Uev1A katalizálja a TRAF6 K63-kapcsolt ubikvitinációját, amely a K63 ubiquitin láncát a TAB2-re és a TAB3-ra viszi át, ami a TAK112–16 aktiválásához vezet. A TRAF6-szabályozott IKK aktivátor 2 (TRIKA2), amely TAK1-ből, TAB1-ből és TAB2-ből áll, aktiválja az IκB kináz (IKK) / foszforiláció inhibitorát17–19. Az NF-κB transzkripciós faktor bejut a sejtmagba, és elősegíti a gyulladásos citokinek termelését20. Amikor a TLR7/9 felismeri a vírust, a MyD88- IRAKs-TRAF6 komplex jeleket továbbít az IFN szabályozó faktor (IRF) 7 felé, elősegíti az IRF7 ubikvitinációját, és aktiválja annak foszforilációját a sejtmagba21,22. Az RLR jelátviteli útvonalon a RIG I és a melanoma differenciálódáshoz kapcsolódó 5. gén (MDA5) aktiválja a mitokondriális antivirális jelátviteli fehérjét (MAVS)23,24. A MAVS aggregálása az RLR jelátvitel kezdetének fontos jellemzője23,25,26. A TRAF2/3/6 az első MAVS27,28 által aktivált tényezők. A TRAF3 aktiválja a TBK1-IRF3 jelátvitelt, a MAVS-TRAF6 komplex pedig az NF-κB jelátvitelt, amely elősegíti az IFN-1 expresszióját27,29.
A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert
A TRAF6 aktiválásának molekuláris mechanizmusát már bizonyították. A dimer formában lévő TRAF6 autoubiquitináción megy keresztül az Ubc13 és az Uev1A katalízise alatt, ami a gyűrűsujj doménhez és a ZF ujjak doménjéhez kapcsolódik. A TRAF6/Ubc13~UB modellje megerősíti a TRAF6 dimer fontos szerepét a K63 ubiquitin lánc aggregációjában és átvitelében30. Ezenkívül arról számoltak be, hogy a gyűrűsujj és a ZF ujjak doménje E2~ub konjugátumokat toboroz a zebradániás TRAF6 kristálymodellben, és felfedezték, hogy a TRAF6 először képes heterodimert alkotni az ugyanabból a TRAF családból származó TRAF5-tel16. A deubiquitinációs család fehérjéi: A20, CYLD, USP2a, USP4 és USP20 a TRAF6-ot célozzák meg, hogy eltávolítsák a K63-kapcsolt ubikvitinációt és csökkentsék a downstream jelátvitelt31–35. Az élesztő két-hibrid rendszer kiszűri az UBE2O és a TRAF6 közötti kölcsönhatást, és megerősíti, hogy ez a kölcsönhatás közvetlenül befolyásolja a TRAF6 MyD8836 általi aktiválását. A TRAF6 downstream jelátviteli folyamatában az ECSIT, mint köztes fehérje kölcsönhatásba lép a TRAF6-tal és a TAK1-gyel, és ez a kölcsönhatás erősíti a TRAF6 és TAK137 kötődését. Az LPS-indukált TLR4 jelátvitelben a PRDX-ek megakadályozzák, hogy a TRAF6 toborozza az ECSIT-et a K63 ubiquitin lánc szállítására, valamint gátolják a TRAF6 által aktivált BECN1-et az autofágia útvonalon38. Az MST4 aktiválja a TRAF6 foszforilációját a Thr463-on és a Thr486-on, és gátolja a TRAF6 dimerizációját és ubikvitinációját39. Emlősökben a TRAF6 fehérjeszabályozási mechanizmusát széles körben tanulmányozták antibakteriális és vírusellenes immunitás terén. A TRAF6 alsóbbrendű gerinceseken végzett kutatását azonban kevésbé tanulmányozzák. A teleost halak immunválasza főként a TLR és RLR útvonalakon alapul, hogy végrehajtsa az immunválaszt a kórokozó fertőzés után. Ezért kulcsfontosságú a TRAF{47}}közvetített jelátviteli útvonalak szabályozási mechanizmusának feltárása. A calpain2 (m-calpain) a kalciumfüggő proteázok családja, amely emlősökben és sok más szervezetben több mint 16 tagból áll40. A calpain fehérjecsalád legkorábbi tanulmánya a sejtmozgással kapcsolatos41. A kalpain elősegíti a sejtvándorlást, és megállapították, hogy gátolja a neutrofilek migrációját, valamint a p38 MAPK és ERK MAPK42 aktiválását. A hidroláz aktivitása a kalpain egyik fontos funkciója. Az immunszabályozásban a kalpain{56}} elősegíti az NF-κB felszabadulását az IkB hidrolizálásával, és aktiválja a jelátviteli útvonalat43. Ebben a tanulmányban megállapítottuk, hogy a calpain2a kölcsönhatásba lép a TRAF6-tal, és negatív szabályozóként működik az antibakteriális és antivirális válaszokban teleost halban, miiuy croakerben (Miichthys miiuy). A calpain2a hidroláz aktivitásán keresztül elősegíti a TRAF6 fehérjeszint lebomlását. Eközben a hidroláz aktivitást nem mutató mutáns calpain2a gátolja a K63 ubiquitin lánc képződését a TRAF6 dimerjének gátlásával. Ez azt mutatja, hogy mind a calpain2a, mind a mutáns calpain2a véget vet a TRAF6 ubikvitinációjának ECSIT/BENC1/IRF3/IRF7-be. A calpain2a leállítja az NF-κB és az IFN jelzési folyamatot a TRAF6 célzásával. Eredményeink egy molekulát biztosítanak a TRAF{75}}közvetített immunszabályozás vizsgálatához alsóbbrendű gerincesekben.
Eredmények
A calpain2a kölcsönhatásba lép a TRAF6-tal, és negatívan szabályozza az NF-κB jelátvitelt.
Annak érdekében, hogy betekintést nyerjünk a TRAF{0}}asszociált fehérjékbe a teleost halak veleszületett immunválaszában, jellemeztük a miiuy croaker TRAF6 interaktómát affinitástisztítás és tömegspektrometria segítségével. Címkementes kvantifikáció (LFQ) intenzitás szerint rendezve az adatok egy részét elfogtuk és megjelenítettük (1a. ábra). A TRAF6-asszociált fehérjék közül a calpain2a szabályozhatja a TRAF6 aktivitást, és befolyásolta a TRAF6-közvetített jelátviteli útvonalakat. Először is, a calpain2a és a TRAF6 közötti összefüggést kell megvizsgálni fehérje szinten, megvizsgáltuk a calpain2a és a TRAF6 kölcsönhatását Miiuy croaker vese sejtvonalakban (MKC). Az endogén koimmunprecipitációs kísérletek azt mutatták, hogy a calpain2a kölcsönhatásba lép a TRAF6-tal (1b., c. ábra). Amint azt tranziens transzfekciós és koimmunprecipitációs kísérletek mutatják, a túlzottan expresszált calpain2a és a TRAF6 kölcsönhatásba léptek egymással (1d. és e. ábra). Mindezek azt jelzik, hogy a calpain2a kölcsönhatásba lép a TRAF6-tal, és további kísérletekre van szükség a hatásmechanizmusuk vizsgálatához. Az emberi, egér, zebrahal és croaker calpain2a fehérjék többszörös szekvenciájának összehangolásával a calpain2a evolúciósan konzervált halak és emlősök között (1f. ábra). A calpain2a veleszületett immunitásban betöltött szerepének meghatározásához megvizsgáltuk, hogy a calpain2a összefüggésben áll-e az LPS stimuláció által kiváltott NF-κB aktiválásával. Az epithelioma papulosum cyprinid (EPC) sejteket NF-κB luciferáz riporterrel, belső kontroll renilla luciferáz riporterrel és calpain2a-t kódoló vektorral vagy üres vektorral transzfektáltuk. A calpain2a dózisfüggő módon lényegesen csökkentette az NF-κB riporter aktivitást LPS stimuláció hatására (1g. ábra). Ezenkívül az LPS-stimulációra reagáló proinflammatorikus citokinek, például az IL-1 és az IL-8 promoter jelentősen csökkent a calpain2a-val túlzottan expresszált EPC sejtekben (1h, i. ábra), ami arra utal, hogy a calpain2a potenciális szerepet játszik a gyulladásos jelátvitelben LPS stimuláció által kiváltott útvonalak.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez
【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Az LPS-indukált NF-κB jelátvitel negatív szabályozása a calpain2a által.
A calpain2a NF-κB jelátvitelben betöltött potenciális szerepének vizsgálata érdekében a calpain2a-t MKC-ben transzfektáltuk LPS időgradiensével, és megvizsgáltuk az LPS-re reagáló proinflammatorikus citokineket. A calpain2a túlzott expressziója az IL-1, IL-8 és IL-6 expressziójának csökkenéséhez vezetett (2a. ábra). Ezt követően megterveztünk két calpain2a-specifikus kis interferáló RNS-t (siRNS), amelyek hatékonyan csökkentik a calpain2a-t (2b, d ábra). A calpain2a leütése jelentősen megnövelte az LPS-indukált proinflammatorikus citokinek, köztük az IL-1 és IL-8 mennyiségét az MKC és a Miiuy croaker intestine sejtvonalakban (MIC) (2c, e ábra). Az LPS-stimulált sejtek csoportjában a calpain2a leütése fokozta a sejtproliferációt. Hasonlóképpen, stimuláció hiányában azt találtuk, hogy a calpain2a leütése szintén fokozta a sejtproliferációt (2f. ábra). Annak meghatározására, hogy a calpain2a gátolta-e a fehérjéket az LPS-indukált NF-κB jelátvitelben, a calpain2a jelentősen gátolta a TRAF6 endogén fehérje szintjét, de nem gátolta a MyD88, IRAK4 vagy TAK1 szintjét (2g. ábra). Összefoglalva, a calpain2a és a proinflammatorikus citokin expresszió kinetikája a calpain2a funkcionális részvételére utalt az LPS-indukált NF-κB jelátvitelben.
Az 1. ábra a calpain2a kölcsönhatásba lép a TRAF6-tal, és gátolja az NF-κB jelátviteli útvonalat. a TRAF6 interactome listája a címke nélküli kvantifikációs intenzitás alapján (szakasz). b, c 6 cm2-es edényekbe oltott MKC sejtek. 24 óra elteltével a sejtlizátumokat immunprecipitáltuk (IP) anti-TRAF6 vagy anti-calpain2a affinitásgélekkel. Ezután az immunprecipitátumokat és a sejtlizátumokat IB-vel elemeztük anti-TRAF6 és anti-calpain2a Abs-okkal. d, e 6 cm2-es edényekbe oltott HEK 293 sejteket calpain2a-Flag és TRAF6-Myc plazmidokkal (mindegyik 2 ug) transzfektáltunk. 24 óra elteltével a sejtlizátumokat immunprecipitáltuk (IP) anti-Myc d vagy anti-Flag e affinitás gélekkel. Ezután az immunprecipitátumokat és a sejtlizátumokat IB-vel elemeztük anti-Myc és anti-Flag Abs segítségével. f Az emberi calpain2a (Hu-calpain2), az egér calpain2a (Mu-calpain2), a zebrafish calpain2a (ZF-calpain2a) és a miiuy croaker calpain2a (M-calpain2a) ugyanazok az aminosavak fekete háttérrel vannak kiemelve. A g–I EPC sejteket calpain2a-Flaggal vagy üres vektorral transzfektáltuk az NF-κB, IL-1 és IL-8 luciferáz riporterekkel együtt. A transzfekció után 24 órával a sejteket nem kezeltük (Mock), vagy 6 órán át LPS-sel kezeltük. A luciferáz aktivitás értékét a Renilla luciferáz aktivitással szemben érték el (n=3 csoportonként). Western blot analízist alkalmaztunk az átmenetileg transzfektált calpain2a Flag expressziójának mérésére. A Tubulin expresszióját használtuk terhelési kontrollként. Az adatokat kétutas ANOVA-val elemeztük (g, h, i). **p < 0.01. Minden kísérletet legalább három független kísérletben végeztünk.
A calpain2a kölcsönhatása a TRAF6-tal.
A tartományelemzés a Conserved Domain Database (CDD) NCBI segítségével történt. A calpain2a három domént tartalmaz: egy Calpain család cisztein proteáz (CysPc) doménjét (aa 46-339), egy központi Calpain III nagy alegységdomént (aa 360-499) és egy C-terminális Penta-EF kézi domént ( aa 500-697). Annak meghatározására, hogy a calpain2a mely doménje(i) szükséges a TRAF6-tal való interakcióhoz, három csonkító mutánst hoztunk létre: calpain2a (1-339), calpain2a (340-697) és calpain (500-697). (3a. ábra). A HEK293 sejteket calpain2a-Flag vad típusú (WT), calpain2a-Flag truncation mutánsokkal vagy TRAF6-HA vektorral transzfektáltuk. Azt találtuk, hogy mind a teljes hosszúságú calpain2a, mind a három csonkolt mutáns kölcsönhatásba léphet a TRAF6-tal (3c. ábra). A TRAF6 egy C-terminális TRAF doménből, egy tekercses tekercs doménből, egy cink ujjak doménből és egy gyűrűsujj doménből áll38. Annak vizsgálatára, hogy a TRAF6 mely doménjeire volt szükség a calpain2a-val való interakciójához, TRAF6 csonkolt mutánsok sorozatát készítettük el, beleértve a TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36) }}), és a TRAF6 (400-574). Közben elkészítettük a doménmutánsokat: TRAF6ΔRing (amelyben a gyűrűsujj domén ki van törölve), TRAF6ΔZF (amelyben a cink ujjak doménje ki van törölve), TRAF6ΔCC (amelyben a tekercses domén törölve van) és TRAF6ΔTRAF-C ( amelyben a C-terminális TRAF domén törölve van) (3b. ábra). A calpain2a kölcsönhatásba lép a teljes hosszúságú TRAF6-tal, valamint a TRAF6 csonkolásaival, amelyek C-terminális TRAF-domént, tekercses tekercs-domént, cink-ujj-domént (3d. ábra, f) tartalmaztak, de a gyűrűsujj-doménnel nem (3e. ábra) . A luciferáz vizsgálatok azt mutatták, hogy a calpain2a és ezeknek a csonkolt mutánsoknak a túlzott expressziója jelentősen gátolta az NF-κB és az IL{56}} riporter aktivitását EPC sejtekben (3h. ábra). Továbbá megvizsgáltuk a calpain2a szubcelluláris kolokalizációját a TRAF6-tal. Az EPC sejteket TRAF6-GFP-vel és egy üres vektorral vagy calpain2a-mCherryvel transzfektáltuk. A konfokális mikroszkópos elemzés kimutatta, hogy a TRAF6 zöld jelei átfedésben vannak a calpain2a vörös jeleivel, ami azt jelzi, hogy a calpain2a együtt lokalizálódik a TRAF6-tal az EPC sejtekben (3i, j ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a TRAF6 több doménjének szerkezeti alapja (C-terminális TRAF domén, tekercses tekercs domén, cink ujjak doménje), de nem a gyűrűsujj domén, meghatározó a calpain2a-val való kapcsolat szempontjából (3g. ábra).
2. ábra: A calpain2a negatív szabályozza az LPS-indukált NF-κB jelátviteli útvonalat. IL-1, IL-8 és IL-6 mRNS MKC-ben calpain2a-Flaggal vagy üres vektorral transzdukálva és sóoldattal (0) kezelve, vagy LPS-sel provokálva különböző alkalommal (2 óra, 4 óra, 6 óra, 8 óra, 10 óra) (n=3 csoportonként). b, d MKC sejteket és MIC sejteket transzfektáltunk si-calpain2a #1 és si-calpain2a #2 (100 nM) vagy si-ctrl-lel (100 nM). A transzfekció után 48 órával a calpain2a expresszióját qRT PCR-rel mértük (n=3 csoportonként). A calpain2a fehérje szintjét Western blottal határoztuk meg. c, e IL-1, IL-8 mRNS MKC-ben és MIC-ben, stabilan transzdukálva si-calpain2a #1 vagy si-ctrl-lel (kontroll vektor) és sóoldattal kezelve (0) vagy LPS-sel provokálva különböző alkalommal (4 óra, 8 óra) (n=3 csoportonként). f Az MKC sejteket si-ctrl-el vagy si-calpain2a #1-gyel transzfektáltuk. A transzfekció után 36 órával a sejteket LPS-sel stimuláltuk 12 órán keresztül, majd megmértük a sejtproliferációs tesztet (n=3 csoportonként). Skála, 100 μm. g calpain2a-Flag-ot transzfektáltunk MKC-sejtekbe, amelyeket különböző időpontokban (3 óra, 6 óra, 9 óra) LPS-sel fertőztünk. A jelzett Abs-t tartalmazó sejtlizátumok immunblot analízise. A relatív mRNS szintet az -aktint kódoló gén expressziójára normalizáltuk minden mintában. Minden kísérletet legalább három független kísérletben végeztünk. Az adatokat kétutas ANOVA-val (a, c, e, f) vagy egyutas ANOVA-val (b, d) elemeztük. *p < 0,05, **p < 0,01.
3. ábra A calpain2a kölcsönhatása a TRAF6-tal. a, b A miiuy croaker calpain2a, TRAF6 és mutánsok doménszerveződésének sematikus diagramjait használtuk ebben a vizsgálatban. A „+” a TRAF6-tal vagy a calpain2a-val való interakciót jelöli, a „-” azt jelenti, hogy nincs kölcsönhatás. c A HEK293 sejteket ál-, calpain2a-Flag vad típusú (WT) és calpain2a-Flag csonkított mutánsokkal vagy TRAF6-HA-val transzfektáltuk, amint jeleztük. A transzfekció után 24 órával a transzfektált sejteket extraháltuk, és a sejtlizátumokat immunprecipitációnak vetettük alá anti-HA antitesttel, majd IB-vel anti-HA vagy anti-Flag antitesttel. A d–f HEK293 sejteket ál-, TRAF6-HA vad típusú (WT) és TRAF6-HA csonkított mutánsokkal vagy calpain2a-Flag-gal transzfektáltuk, a jelzett módon. A transzfekció után 24 órával a transzfektált sejteket extraháltuk, és a sejtlizátumokat immunprecipitációnak vetettük alá d, f vagy anti-Flag antitesttel, majd IB-vel anti-HA vagy anti-Flag antitesttel. g A TRAF6 és a calpain2a interakciós helye. h Az EPC sejteket TRAF6-HA, calpain2a-Flag vagy calpain2a-Flag csonka mutánsokkal NF-κB és IL-1 luciferáz riporterekkel együtt transzfektáltuk. A transzfekció után 36 órával a luciferáz aktivitási értéket a renilla luciferáz aktivitással szemben érték el (n=3 csoportonként). Az I j EPC sejteket mock, calpain2a-mCherry és TRAF{45}}GFP-vel transzfektáltuk. A DAPI-festett magok kék színnel jelennek meg. A calpain2a-t vörös fluoreszcenciával, a TRAF6-ot zöld fluoreszcenciával detektáltuk. Skála, 10 μm. Minden kísérletet legalább három független kísérletben végeztünk. Az adatokat egyutas ANOVA-val (h) elemeztük. **p < 0,01.
A calpain2a gátolja a TRAF6 fehérje expressziós szintjét proteolitikus aktivitásával.
A calpain2a szabályozó mechanizmusának feltárása érdekében a TRAF6-on először megvizsgáltuk, hogy a calpain2a hatással van-e a TRAF6-ra fehérje szinten. A calpain2a-Myc-et és a TRAF6-Flag-ot együtt transzfektáltuk EPC-sejtekbe, a TRAF6 fehérjeszintje 30 óra elteltével részben lebomlott (4a. ábra). Amint a 4b. ábra mutatja, a calpain2a dózisfüggő módon elősegítette a TRAF6 lebomlását. A calpain2a jelenlétében nem befolyásolta a TRAF6 mRNS szintjét, ami azt jelzi, hogy a calpain2a csak a TRAF6 fehérje szintjét befolyásolja. Eközben az inhibitor cikloheximid (CHX) vizsgálat kimutatta, hogy a calpain2a felgyorsíthatja a TRAF6 fehérje felezési idejét (4c. ábra). A calpain2a túlzott expressziója MKC sejtekben az endogén TRAF6 destabilizálódását eredményezte (4d. ábra). Annak vizsgálatára, hogy a TRAF6 calpain2a által közvetített lebomlása függ-e az ubiquitin-proteaszómától, az autofagoszómától, a lizoszómális útvonaltól vagy másoktól, az EPC sejteket az ezeket az útvonalakat gátló reagensekkel kezelték: MG132, 3-MA és NH4Cl. A TRAF6 calpain2a által közvetített destabilizációját azonban nem fordította meg az MG132 proteaszómális gátló, az autofágiás inhibitor 3-MA vagy a lizoszómális inhibitor NH4Cl (4e. ábra). Ezután az EPC sejteket a következő reagensekkel kezeltük: E-64 (kalpain-inhibitor, amely inaktiválja a kalpain-hidroláz aktivitást) és PMSF (nem specifikus szerin-proteáz-inhibitor). Azt találtuk, hogy a calpain inhibitor E-64 megakadályozta a TRAF6 fehérjeszinten történő lebomlását (4f. ábra). A 4g. ábrán látható módon az E-64 szintén megfordította az endogén TRAF6 fehérjeszintek calpain2a általi lebomlását.
A 4. ábra a calpain2a gátolja a TRAF6 fehérje expresszióját. a Az üres vektorok vagy calpain2a-Myc plazmidok TRAF6- Flag-gel együtt végzett időgradiens kísérletét EPC sejtekben végeztük. A sejtlizátumokat IB-nek vetettük alá anti-Myc, anti-Flag és anti-Tubulin Abs. Az RNS-t a sejtekből extraháltuk és reverz átírtuk, majd a TRAF6-ot és az aktint PCR primerekkel amplifikáltuk. b Az EPC sejteket egy éjszakán át 12-lyuklemezekre oltottuk, és TRAF6-Flaggal és calpain2a-Myc-cel (0.3, 0.6 vagy {{) együtt transzfektáltuk. 18}},9 ug) 48 órán keresztül. A TRAF6-Flag és calpain2a-Myc fehérjék expresszióját Western-blottal mutattuk ki. A sejtekből RNS-t extraháltunk és reverz transzkripciót végeztünk, majd a TRAF6-ot és az aktint PCR primerekkel amplifikáltuk. c calpain2a-Myc vagy üres vektorokat TRAF6-Flag-gel együtt transzfektáltunk EPC sejtekbe. A transzfekció után 36 órával a transzfektált sejteket cikloheximiddel (CHX) kezeltük 2 vagy 4 órán át. d Az MKC sejteket calpain2a-Flag vagy üres vektorokkal transzfektáltuk. A transzfekció után 48 órával a sejtlizátumokat IB-nek vetettük alá anti-TRAF6, anti-Flag és anti-Tubulin Abs. e, f EPC sejteket transzfektáltunk a jelzett plazmidokkal MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 vagy 75 μM) vagy PMSF jelenlétében vagy hiányában 6 percig. h az immunblot analízis elvégzése előtt. g MKC sejteket calpain2a-Flaggal transzfektáltunk E{{50}} (50 vagy 75 µM) jelenlétében vagy hiányában 6 órán keresztül, mielőtt az immunblot analízist elvégeztük volna. h calpain2a-Flag és calpain2a-ΔCysPc-Flag TRAF6-HA-val együtt transzfektáltunk EPC sejtekbe. A transzfekció után 48 órával a sejtlizátumokat IB-nek vetettük alá a jelzett Abs-okkal. I calpain2a-Flag és calpain2a-ΔCysPc-Flag kotranszfektáltunk MKC sejtekbe. A transzfekció után 48 órával a sejtlizátumokat IB-nek vetettük alá anti-TRAF6, anti-Flag és anti-Tubulin Abs. j IL-1, IL-8 mRNS az MKC-ben, stabilan transzdukálva calpain2a-Flaggal és calpain2a-ΔCysPc-Flaggal, és fiziológiás sóoldattal kezelve (0) vagy LPS-sel fertőzve 4 órán keresztül (n=3 csoportonként). A relatív mRNS szintet az -aktint kódoló gén expressziójára normalizáltuk minden mintában. Minden kísérletet legalább három független kísérletben végeztünk. Az adatokat kétutas ANOVA-val (j) elemeztük. **p < 0,01.
Annak meghatározása, hogy a TRAF6 lebomlása függ-e a calpain2a hidroláz aktivitásától. A calpain2a emlősökön végzett korábbi szerkezeti és biokémiai vizsgálatait kihasználva a calpain2a cisztein-, hisztidin- és aszparagin-maradékait alaninná (calpain2a C105A, H262A, N286A és 3 A) mutáltuk, ami elvesztette a katalitikus-44-triád koordinációt. Megfigyeltük, hogy ez a mutáció nem befolyásolta a TRAF6 lebomlását (kiegészítő 1a ábra). Tehát mutáltuk a proteáz domént, amely a calpain2a (calpain2a-ΔCysPc) Calpain család cisztein proteáz (CysPc) doménje. Sem a túlzottan expresszált TRAF6-ot, sem az endogén TRAF6-ot nem befolyásolja a calpain2a-ΔCysPc (4h, i. ábra). Az IL-1 és IL-8 proinflammatorikus citokinekre azonban egyidejűleg hatással van a vad típusú vagy mutált calpain2a LPS-stimuláció hatására (4j. ábra). A hidroláz aktivitással nem rendelkező mutáns calpain2a nem befolyásolja a TRAF6 fehérje szintjét, de a hidroláz aktivitással nem rendelkező mutáns calpain2a továbbra is befolyásolta a downstream proinflammatorikus citokinek expresszióját. Ez indította el vizsgálatunkat azon lehetséges mechanizmusok feltárására, amelyek révén a calpain2a szabályozza a TRAF6-ot. Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a calpain2a szabályozza az NF-κB jelátvitelt azáltal, hogy elnyomja a TRAF6 fehérjeszintek expresszióját, a kalpain-hidroláz aktivitásán keresztül.
A calpain2a gátolja a TRAF6 ubiquitin-ligáz aktivitását.
Ezt követően megvizsgáltuk azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek révén a calpain2a negatívan szabályozza a TRAF6-aktivált NF-κB jelátvitelt, és hogy a calpain2a és a TRAF6 kölcsönhatása az enzimaktivitás elvesztése után módosítja-e az ubiquitin ligáz aktivitását. Az MKC sejteket LPS-sel kezeltük, majd immunprecipitáltuk a TRAF6-ot. A tisztított rekombináns fehérjékkel végzett ubiquitinációs vizsgálat megerősítette, hogy a calpain2a és a calpain2a-ΔCysPc csökkentette a TRAF6 ubikvitinációját (5a. ábra). Amint az 5b, c ábrán látható, mind a calpain2a, mind a calpain2a-ΔCysPc szignifikánsan csökkentette a TRAF6 WT és K63 ubiquitinált fehérjéit. A calpain2a és calpain2a-ΔCysPc koncentráció-gradiensei dózisfüggő módon csökkentették a TRAF6 WT és K63 ubiquitinált fehérjéit. A calpain2a-ΔCysPc továbbra is megakadályozta a TRAF6 K63 ubiquitin lánc aggregációját anélkül, hogy befolyásolta volna a TRAF6 fehérje szintjét (5d, e ábra). Ezután MKC sejteket transzfektáltunk Myc-címkézett TRAF6 expresszálására Flag-címkézett calpain2a-ΔCysPc jelenlétében vagy hiányában, majd immunprecipitációs kísérleteket végeztünk egy anti-Myc antitesttel és immunblottal elemeztük anti-UB-val. A TRAF6 ilyen ubiquitinációját a calpain2a-ΔCysPc lényegesen gyengítette (5f. ábra). Az LPS által stimulált TRAF6 K63-kapcsolt ubiquitin láncot szállít a TAK1-hez, amely serkenti a TAK1 autofoszforilációját és aktiválja az NF-κB18-at. A TAK1 WT és K63 ubiquitin fehérjéi szignifikánsan megnövekedtek TRAF6 jelenlétében, míg a TAK{49}}-hez kapcsolt ubiquitináció gátolt volt calpain2a-ΔCysPc jelenlétében (5g. ábra, h). Ezek az adatok alátámasztják, hogy a hidroláz aktivitást nem tartalmazó mutáns calpain2a hasonlóan gátolja a TRAF6 ubiquitin ligáz aktivitását anélkül, hogy befolyásolná a TRAF6 fehérje szintjét.
A cistanche tubulosa előnyei- erősíti az immunrendszert
A calpain2a gátolja a TRAF6 homo-oligomerizációját.
A TRAF6 által szintetizált Lys63 ubiquitin lánc kulcsszerepet játszik a jelátvitelben. Beszámoltak arról, hogy a TRAF6 dimerizációja elengedhetetlen az ubiquitin lánc szintéziséhez16. A dimerizációs modell szorosan kapcsolódik az Ubc13 K63 ubikvitinációt előidéző kombinációjához16, 30. Annak ellenőrzésére, hogy a TRAF6 halak alkothatnak-e dimereket, különböző címkékkel ellátott TRAF6 plazmidokat használtunk: Myc-címkézett TRAF6 és HA-címkézett TRAF6 a ko-IP kísérletekhez. Az IP-vizsgálatot anti-HA antitesttel hajtottuk végre, a HATRAF6 kölcsönhatásba lép a Myc-TRAF6-tal (6a. ábra). A calpain2a TRAF6-dimer kölcsönhatásban kifejtett gátló hatásának feltárása érdekében a Flag-címkézett calpain2a-t, a HA-címkézett TRAF6-ot és a Myc-címkézett TRAF6-ot átmenetileg expresszálták HEK293 sejtekbe. Ahogy az várható volt, a TRAF6-dimer kölcsönhatás csökkent calpain2a jelenlétében (6b. ábra). Ugyanakkor a TRAF6 calpain2a általi lebomlásának elkerülése érdekében. Transzfektáltuk a Flag-címkével ellátott calpain2a-ΔCysPc-t, és azt találtuk, hogy a TRAF6-dimer kölcsönhatás fokozatosan csökkent calpain2a-ΔCysPc jelenlétében (6c. ábra). Amint a 6d. és e. ábrákon látható, azt találtuk, hogy a HA-TRAF6 fokozott WT és K63 ubiquitinációt mutat a Myc-TRAF6-ban. Míg a HEK293 sejteket calpain2a-val és calpain2a-ΔCysPc-vel együtt transzfektáltuk, a fokozott ubikvitináció elnyomott. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy mind a vad típusú calpain2a, mind a mutáns calpain2a, amelyből hiányzik a hidroláz aktivitás, gátolja a TRAF6 homooligomerizációját és auto-ubiquitinációját.
A calpain2a gátolja a TRAF6 ubiquitinációjának eljutását az ECSIT-hez és a BECN1-hez.
Amint az 5d. ábrán látható, azt találtuk, hogy a calpain2a zavarja a TRAF6-tól a TAK1-ig terjedő ubiquitilációs folyamatot. Beszámoltak arról, hogy az ECSIT a TAK1 és TRAF6 adapterfehérjeként működött, hogy elősegítse az NF-κB jelátvitelt LPS-stimulációval37. Annak ellenőrzésére, hogy az ECSIT rendelkezik-e az említett funkciókkal teleoszta halakban, többszörös szekvencia-illesztést hajtottunk végre az ECSIT fehérjékben emberben, egérben és croakerben (kiegészítő 1b. ábra). Az EPC sejteket NF-κB luciferáz riporterrel transzfektáltuk, az ECSIT szignifikánsan fokozta az NF-κB riporter aktivitást LPS stimuláció után (kiegészítő 1c. ábra). Az MKC sejtekben az ECSIT túlzott expressziója a TNF- mRNS szintjének felszabályozásához vezetett (1d. kiegészítő ábra). Miután ECSIT-et és TRAF6-ot transzfektáltunk HEK293 sejtekben, azt találtuk, hogy a TRAF6 kölcsönhatásba lép az ECIST-szel (7a. ábra). Hasonlóképpen, az ECSIT-et és a TAK1-et együtt transzfektáltuk, és a két fehérje kölcsönhatást is fenntartott (7b. ábra). Ezt követően annak ellenőrzésére, hogy a calpain2a-ΔCysPc gátolja-e a TRAF6-ECSIT komplex kialakulását, a három plazmidot HEK293 sejtekbe transzfektáltuk, és megállapítottuk, hogy a calpain2a-ΔCysPc megakadályozta a TRAF6-ECSIT komplex kialakulását (7. ábra). ). Az ubiquitin lánc transzmissziós folyamatának ellenőrzése az NF-κB jelátvitelben. Amint a 7d. ábrán látható, a TRAF6 elősegítheti az ECSIT ubiquitinációját; a várakozásoknak megfelelően a calpain2a-ΔCysPc gátolta azt a folyamatot, amellyel a TRAF6 továbbította az ubiquitin láncot az ECSIT-be. A BECN1 fontos fehérje az LPS-indukált autofágiában. Megerősítették, hogy a K63 ubikvitináció módosíthatja és aktiválhatja a BECN1-et. Az A20 deubiquitináló enzim eltávolítja a BECN1 ubikvitinációját és gátolja az LPS által okozott autofágiát, és a TRAF6 az E3 ligáz, amely felelős a BECN1 ubikvitinációjáért ebben a jelben47. Amint a 7e. ábrán látható, a TRAF6 kölcsönhatásba lép a BECN1-gyel, és elősegítette a BECN1 ubikvitinációját. Ezután a BECN1, TRAF6, calpain2a és calpain2a-ΔCysPc sejteket transzfektáltuk HEK293 sejtekbe, a TRAF6 elősegítette a BECN1 ubikvitinációját. A calpain2a-ΔCysPc gátolta azt a folyamatot, amellyel a TRAF6 továbbította az ubiquitin láncot a BECN1-be (7f. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a vad típusú calpain2a és a mutáns calpain2a, amelyből hiányzik a hidroláz aktivitás, gátolják a TRAF6 ubikvitinációs képességét LPS-indukált autofágiában és NF-κB jelátvitelben.
Az antivirális válasz negatív szabályozása a calpain2a által.
Az RLR útvonalon a TRAF6 E3 ligázként működik, amelyet a MAVS toborzott, hogy aktiválja az NF-κB-t, az IFN-ek és citokinek termelését. Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a calpain2a szerepet játszott-e a TRAF6 megelőzésében az IFN által közvetített vírusellenes folyamatban. Az EPC sejtekben IFN-1, ISRE és IRF3 promoter által vezérelt luciferáz riporterek expresszálódnak. Azt találtuk, hogy a calpain2a lényegesen csökkentette ezeket a promóter által vezérelt luciferáz aktivitásokat dózisfüggő módon Ploy(I:C) stimuláció hatására, és a Siniperca megcsalja a rhabdovírus (SCRV) fertőzést (8a, b ábra). A calpain2a leütése jelentősen fokozta a Ploy(I:C) és az SCRV által kiváltott génexpressziót, beleértve a Viperint, az Mx1-et és az ISG15-öt (8c, d ábra). A calpain2a leütése a sejtek életképességének magasabb expresszióját eredményezte SCRV fertőzés esetén MKC sejtekben (8e. ábra). Amint a 8f. ábrán látható, a sejtproliferációs vizsgálatok kimutatták, hogy a calpain2a leütése fokozta a sejtproliferációt SCRV fertőzés esetén. A calpain2a túlzott expressziója élesen elősegítette a vírus szaporodását, amit az SCRV fertőzés utáni vírusreplikáció tükröz (8g. ábra). A calpain2a és a calpain2a-ΔCysPc lényegesen csökkentette az IFN-1, ISRE és IRF3 promoter által vezérelt luciferáz riportereket Ploy(I:C) stimuláció és SCRV fertőzés hatására (2a, b kiegészítő ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a calpain2a negatívan szabályozhatja az RLR jelátviteli útvonalat a TRAF6 gátlásán keresztül, ezáltal gátolva az IFN aktiválódását.
Az 5. ábra a calpain2a gátolja a TRAF6 ubiquitin-ligáz aktivitását. a calpain2a-Flaggal és calpain2a-ΔCysPc-Flaggal transzdukált és nem fertőzött (-) vagy LPS-sel (+) provokált MKC-sejtekben az endogén TRAF6 ubiquitinációja, anti-ubiquitinnel végzett immunoblot analízissel értékelve, immunprecipitációt követően anti-TRAF6 analízissel és input jelzett Abs-szal. b, c A HEK293 sejteket TRAF6-HA-val és WT-ubiquitin-His-szel vagy K63O ubiquitin-His-szel (amelyben csak a 63-as lizin található) calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag vagy üres vektorral együtt transzfektáltuk. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk és Ni-NTA agarózzal tisztítottuk. d, e HEK293 sejteket TRAF{{30}}HA-val és WT-ubiquitin-His-szel vagy K63O-ubiquitin-His-szel (amelyben csak a 63-as lizin található) együtt calpain2a-Flaggal ({{45) transzfektáltuk }},5 ug, 1 ug), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0,5 ug, 1 ug) vagy üres vektor. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk és Ni-NTA agarózzal tisztítottuk. f Túlexpresszált TRAF6 ubiquitinálása calpain2a-ΔCysPc-Flaggal transzdukált MKC sejtekben, anti-ubiquitinnel végzett immunblot analízissel értékelve anti-Myc-vel végzett immunprecipitáció és bemeneti immunblot analízissel jelzett Abs-okkal. g, h HEK293 sejteket kotranszfektáltunk TAK1-Myc-vel, TRAF6-HA-val és WT-ubiquitin-His-szel vagy K63O-ubiquitin-His-szel (amelyben csak a 63-as lizin található) calpain2a-Flaggal együtt. , calpain2a-ΔCysPc-Flag vagy üres vektor. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk és Ni-NTA agarózzal tisztítottuk. Az összes immunprecipitátum és bemeneti immunblot analízis anti-Myc, anti-Flag, anti-HA és anti-Tubulin Abs segítségével. Minden kísérletet legalább három független kísérletben végeztünk.
A calpain2a elnyomja az IRF3 és IRF7 ubikvitinációját a TRAF6-ból.
Beszámoltak arról, hogy a MAVS-TRAF3/6 komplex által kiváltott antivirális szignálban a TRAF6 aktivitása szükséges az IRF3 és az NF-κB48 aktiválásához. Amint a 9a, b ábrán látható, a TRAF6 elősegíti az IRF3 WT-hez és K{9}}-hoz kapcsolódó ubikvitinációját, és ezt a fokozódást gátolja a calpain2a-ΔCysPc expressziója. Eközben, amikor a vírus TLR-függő jelátviteli jelet vált ki, a TRAF6 szorosan kapcsolódik az IRF7-hez, és elősegíti az IRF7 ubiquitinációját az aktivált vírusellenes faktorokkal együtt22, 49, 50. A TRAF6 elősegíti az IRF7 WT-hez és K{21}}hoz kapcsolódó ubikvitinációját, és ezt a fokozódást gátolja a calpain2a-ΔCysPc expressziója (9c., d. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a vad típusú calpain2a és a mutáns calpain2a, amelyből hiányzik a hidroláz aktivitás, gátolja az IRF3 és IRF7 TRAF{29}}közvetített ubikvitinációját.
Vita
A TRAF6 a Tumor necrosis factor (TNF) receptor-asszociált faktorok (TRAF) család hét tagjának egyike, amelyet jeladapterként azonosítottak, és jelátvitelt fejt ki51,52. A TRAF család tartalmazza a gyűrűsujj domént, amely az E3 ligáz aktivitást birtokolja. A HECT doménnel rendelkező E3 ligázok elősegítik a szubsztrát poliubiquitinációját, és a Ring doménnel rendelkező E3-ak E2~ub-t igényelnek a poliubiquitináció átviteléhez53,54. Az Ubc13/Uev1A dimer Ub-kötő enzimről bebizonyosodott, hogy részt vesz a TRAF6 poliubikvitináció aggregációjában16. Míg az egér TRAF6 K124-ét kiiktatják, a TRAF6 elveszti a K63 auto-ubiquitinációs aktivitását, és a mutáció ezen a helyen megszünteti a TRAF6-közvetített NEMO ubikvitinációját, valamint a TAK1, IKK és NF-κB55 aktiválását. . Pontos, mert a PRDX1 a K124-ben található TRAF6 Ring Finger doménhez kötődik, és kiküszöböli a TRAF638 mindenütt jelenlétét. Beszámoltak arról, hogy a TRAF6 ubiquitinációja szorosan összefügg N-terminális doménjének (gyűrűsujj és ZF ujjak doménjének) dimerizációjával. Az Ubc13-mal több N-terminális interakciós hely mutálódott, és az Ubc13 nem tudta továbbítani a poly~ub-t a TRAF616-nak. A calpain2a és a TRAF6 mutánsok közötti kölcsönhatás azt mutatta, hogy a TRAF6 legtöbb doménje kölcsönhatásba lép a calpain2a-val, kivéve a gyűrűsujj domént. A calpain2a és a TRAF6 ZF ujj doménje közötti kölcsönhatás miatt azt feltételeztük, hogy a calpain2a gátolja az auto-ubiquitinációt a TRAF6 dimerizációjának blokkolásával. Ezt követően ellenőriztük a TRAF6 különböző címkéinek kölcsönhatását. A hidroláz aktivitást nem mutató mutáns calpain2a expressziójának növekedésével a TRAF6 különböző címkéinek kölcsönhatása gyengült. A HA-címkézett TRAF6 elősegíti a Myc-címkézett TRAF6 ubikvitinációját, a mutáns calpain2a pedig gátolja a HA-címkézett TRAF6 által fokozott ubikvitinációt. A TRAF6-TAK1 jelátviteli folyamat közbenső termékeként az ECSIT a TRAF6 C-terminális doménjéhez (CC domén és TRAF-C domén) kötődik, és bebizonyosodott, hogy részt vesz az NF-κB jelátvitelben37. A proinflammatorikus citokinek expressziója csökkent az ECSITKD THP-1 sejtekben. Az ECSIT ECSITKD THP-1 sejtekben történő túlzott expressziója után azonban az olyan gének, mint az IRF7, IL-1 és CD44, jelentősen megnövekedtek37. A PRDX1 a TRAF6 gyűrűsujj doménjéhez kötődik, és gátolja az ECSIT és a BECN1 ubikvitinációját az NF-κB és autofágia jelekben azáltal, hogy gátolja a TRAF6 poliubiquitináció kialakulását38. Teleost halakban megerősítettük az ECSIT által aktivált NF-κB jelátviteli útvonalat, kölcsönhatásba léptek a TRAF6-tal és a TAK1-gyel, és továbbították a TRAF6 által termelt poliubiquitin láncot. A calpain2a a TRAF6 ZF doménjéhez, CC doménjéhez és TRAF-C doménjéhez kötődött, ami gátolta a TRAF6-ECSIT interakcióját. Megerősítettük, hogy a hidroláz aktivitást nem mutató mutáns calpain2a megakadályozta a poliubiquitin láncot a TRAF6-tól az ECSIT-ig és a BECN1-ig.
A 6. ábra a calpain2a csillapítja a TRAF6 autoubiquitinációját. a HEK293 sejteket TRAF6-Myc-vel, TRAF6-HA-val vagy üres vektorral transzfektáltuk. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk, és az IP-t HA antitesttel analizáltuk. b A HEK293 sejteket TRAF6-Myc-vel, TRAF6-HA-val, üres vektorral vagy calpain2a-Flag-gal transzfektáltuk. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk, és az IP-t HA antitesttel analizáltuk. c A HEK293 sejteket TRAF6-Myc-vel, TRAF6-HA-val, üres vektorral vagy különböző koncentrációjú calpain2a-ΔCysPc-Flag-gal transzfektáltuk. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk, és az IP-t HA antitesttel analizáltuk. d, e HEK293 sejteket TRAF6-Myc-vel, TRAF6-HA-val és WT-ubiquitin-His-szel vagy K63O-ubiquitin-His-szel (amelyben csak a 63-as lizint tárolják) calpain2a-Flaggal együtt kotranszfektáltuk. , calpain2a-ΔCysPc-Flag vagy üres vektor. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk és Ni-NTA agarózzal tisztítottuk. Az immunprecipitáció és bemeneti immunblot elemzés anti-Myc, anti-Flag, anti-HA és anti-Tubulin Abs segítségével. Minden kísérletet legalább három független kísérletben végeztünk.
A 7. ábra a calpain2a gátolja az ECSIT és a BECN1 TRAF6-közvetített ubikvitinációját. a HEK293 sejteket ECSIT-Myc-cel, TRAF6-Flag-gal vagy üres vektorral transzfektáltuk. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk, és az IP-t Flag antitesttel analizáltuk. b A HEK293 sejteket TAK{10}}Flaggal, ECSIT-Myc-cel vagy üres vektorral transzfektáltuk. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk, és az IP-t Myc antitesttel analizáltuk. c A HEK293 sejteket TRAF6-Myc-vel, ECSIT-HA-val, üres vektorral vagy különböző koncentrációjú calpain2a-ΔCysPc-Flag-gal transzfektáltuk. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk, és az IP-t Myc antitesttel analizáltuk. d A HEK293 sejteket kotranszfektáltuk ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitin-His, calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag vagy üres vektorral együtt. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk és Ni-NTA agarózzal tisztítottuk. A HEK293 sejteket BECN1-Flag, TRAF6-Myc vagy üres vektorral transzfektáltuk. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk, és az IP-t Myc antitesttel analizáltuk. f HEK293 sejteket kotranszfektáltunk BECN1-HA-val, TRAF6-Myc-vel, WT-ubiquitin-His-szel, valamint calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag vagy üres vektorral. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk és Ni-NTA agarózzal tisztítottuk. Az immunprecipitáció és bemenet anti-Myc, anti-Flag, anti-HA és anti-Tubulin Abs. Minden kísérletet legalább három független kísérletben végeztünk.
Megfigyeltük, hogy a calpain2a hidroláz aktivitással rendelkezik, mint a kalciumfüggő proteázok családjába tartozik. az m-kalpain (calpain-2) pozitív szabályozó szerepet játszik a HepG2 májsejtek NF-κB jelátviteli útvonalában. A 26 másodperces proteaszóma megközelítéstől függetlenül a calpain2a hidrolizálja az IkB-t, hogy felszabadítsa az NF-κB transzkripciós faktort. A kalpain fehérje specifikus inhibitora megakadályozza az IkB 56 lebomlását. A kalpain esetében azonban kevés tanulmány létezik a halak veleszületett immunválaszáról. MKC sejtekben a calpain2a túlzott expressziója gátolta az LPS által indukált NF-κB downstream proinflammatorikus citokineket. Ez a jelenség ellentétes volt a HepG2 májsejtek eredményeivel. Lehetséges, hogy a kalpain fehérjecsalád fajspecifikussága eltérő hatásokat váltott ki. Hasonlóképpen a calpain fehérje E-64 specifikus inhibitorát alkalmaztuk, hogy megakadályozzuk a calpain2a hidrolizálását a TRAF6-ban. A hidroláz aktivitást nem tartalmazó mutáns calpain2a gátolja a TRAF6 ubiquitin ligáz aktivitását anélkül, hogy befolyásolná annak fehérjeszintjét. Nem találtunk enzimaktív helyet a calpain2a számára. Az emlősökön végzett korábbi vizsgálatok szerint a három hely: cisztein (C105A), hisztidin (H262A) és aszparaginmaradék (N286A). Kísérleteink azonban megerősítik, hogy a miiuy croaker calpain2a három aktív helye nem befolyásolja a TRAF6 fehérjeszintek expresszióját, de a hidroláz domént nem tartalmazó mutáns calpain2a igen. Ezért úgy döntöttünk, hogy a teljes enzimaktiváló szerkezeti domént mutáljuk. Bár a calpain2a fehérje viszonylag konzervált emlősökben és alacsonyabb rendű gerincesekben, a specifikus enzimaktivitási helyek további vizsgálatot érdemelnek.
cistanche növény-növelő immunrendszer
Összefoglalva, a calpain2a-t az LPS-indukált NF-κB jelátvitel és a vírus által kiváltott IFN-aktiváció negatív szabályozójaként azonosítottuk (9e. ábra). A tömegspektrometriában a calpain2a kölcsönhatásba léphet a TRAF6-tal, és ezt a jelenséget endogén koimmunprecipitációs kísérlettel mutattuk ki. Azt találtuk, hogy a calpain2a részt vesz az LPS által kiváltott NF-κB jelátviteli útvonal szabályozásában. Ezenkívül a TRAF6 fontos szerepet játszik az antivirális jelátviteli útvonalakban is. SCRV-t és Ploy(I:C)-t használtunk az IFN jelátviteli útvonal stimulálására, és megállapítottuk, hogy a calpain2a az IFN jelátvitelt is gátolja a fehérjeszint szabályozásával és a TRAF6 autoubiquitinációjával. Mivel a TLR3 képes felismerni a vírusfertőzések által termelt kettős szálú RNS (dsRNS) szerkezetet. Inkább a TRAF6-közvetített IFN jelátviteli útvonal calpain2a szabályozásának tisztázása érdekel bennünket, de nem zárjuk ki a calpain2a és a TLR3 jelátviteli útvonal közötti lehetséges kapcsolatot. A calpain2a hidrolitikus módon elősegítette a TRAF6 lebomlását, és kölcsönhatásba lép a TRAF6-tal, hogy gátolja a dimerek képződését és az auto-ubiquitinációt. Ez a gátlás megakadályozta a TRAF6 és az ECSIT kölcsönhatását, valamint az ubiquitinációs átviteli folyamatot a TRAF6-ról az ECSIT-re, BECN1-re, IRF3-ra és IRF7-re. Jelenlegi eredményeink hozzájárulnak a negatív szabályozási mechanizmusok megértéséhez azáltal, hogy a TRAF6-ot célozzák a veleszületett immunválaszokban. Ezen túlmenően, ez a kutatás rámutat a TRAF6 homooligomerizációjának és autoubiquitinációjának kulcsszerepére a halak veleszületett immunválaszának folyamatában. Ezzel egyidejűleg a calpain2a-t szabályozó mechanizmus fehérjeként javasolják, amely gátolja a TRAF6 immunválaszát, és megakadályozza a normális és rendezett jelutak kialakulását. A betekintések hasznosak a gerincesek immunológiájának és a gerincesek immunrendszerének fejlődésének megértésében.
A 8. ábra a calpain2a gátolja az SCRV vagy Poly(I:C) által kiváltott IFN aktivációt. ab EPC sejteket különböző koncentrációjú calpain2a-Flag vagy üres vektorral transzfektáltuk az IFN-1, ISRE és IRF3-pro luciferáz riporterekkel együtt. A transzfekció után 24 órával a sejteket álfertőzöttük vagy SCRV-vel vagy Poly(I:C)-vel fertőztük 12 órán keresztül (n=3 csoportonként). Western blot analízist alkalmaztunk az átmenetileg transzfektált calpain2a-Flag expressziójának mérésére. A Tubulin expresszióját használtuk terhelési kontrollként. c, d Viperin, Mx1, ISG15 mRNS az MKC-ben, stabilan transzdukálva si-calpain2a #1 vagy si-ctrl-lel (kontroll vektor) és sóoldattal kezelve (0), vagy SCRV-vel vagy Poly-val (I: C) fertőzve. 24 óra. A relatív mRNS szintet az -aktint kódoló gén expressziójára normalizáltuk minden mintában (n=3 csoportonként). e, f MKC sejteket si-ctrl-el vagy si-calpain2a #1-gyel transzfektáltunk. A transzfekció után 24 órával a sejteket SCRV-vel stimuláltuk 24 órán át, majd megmértük a sejt életképességi tesztet és sejtproliferációs vizsgálatot (n=3 csoportonként). Skála, 100 μm. g MKC sejteket calpain2a-Flaggal vagy pcDNA3.1-gyel transzfektáltunk, majd SCRV-vel fertőztük 24 órán át (n=3 csoportonként). A qRT-PCR analízist az intracelluláris és a felülúszó SCRV RNS expressziójára végeztük. Minden kísérletet legalább három független kísérletben végeztünk. Az adatokat egyutas ANOVA-val (a, b), kétutas ANOVA-val (c, d, e, f) vagy kétirányú Student-féle t-teszttel (g) elemeztük. *p < 0,05, **p < 0,01.
Mód
Sejttenyésztés.
A humán embrionális vese (HEK) 293 sejtvonalakat és az Epithelioma papulosum cyprini (EPC) sejtvonalakat az American Type Culture Collection-től vásároltuk, és laboratóriumunkban tartottuk. A Miiuy croaker (M. miiuy) vese sejtvonalakat (MKC) és a Miiuy croaker intestine sejtvonalakat (MIC) a miiuy croaker57,58 vese- és bélszöveteiből tenyésztettük ki. A Miiuy croaker vese sejtvonalakat és a Miiuy croaker bélsejtvonalakat 26 fokos párásított inkubátorban tenyésztettük, amely 0,5% CO2-t tartalmazott L-15 tápközegben (HyClone, USA), 15% FBS-sel (Gibco) kiegészítve. 100 U/ml penicillin (Gibco, USA), 100 ug/ml sztreptomicin (Gibco, USA) és 20 U/ml heparin (Solarbio, Kína). Az Epithelioma papulosum cyprini sejteket 26 fokon tenyésztettük párásított inkubátorban, amely 5% CO2-t tartalmazott 199-es tápközegben (Hyclone), amelyet 10% FBS-sel, 2 mM L-glutaminnal, 100 U/ml penicillinnel és 100 mg/ml sztreptomicinnel egészítettünk ki. Humán embrionális vese 293 sejteket 37 fokon tenyésztettünk 5% CO2-t tartalmazó párásított inkubátorban, Dulbecco módosított Eagle táptalajban (DMEM) (Invitrogen), amelyet 10% FBS-sel, 2 mM L-glutaminnal, 100 U/ml penicillinnel és 100 mg-mal egészítettünk ki. /ml sztreptomicin.
A 9. ábra a calpain2a gátolja az IRF7 és IRF3 TRAF6-közvetített ubikvitinációját. b A HEK293 sejteket IRF3-Myc, TRAF6-HA és WTubiquitin-His vagy K63O-ubiquitin-His (amelyben csak a 63-as lizin található) calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-vel együtt kotranszfektáltuk. -Zászló vagy üres vektor. 24 órával a transzfekció után a sejteket lizáltuk és Ni-NTA agarózzal tisztítottuk. c, d A HEK293 sejteket IRF7-Myc, TRAF6-HA és WT-ubiquitinHis vagy K63O-ubiquitin-His (amelyben csak a 63-as lizin található) calpain2a-Flaggal, calpain2a-val együtt transzfektáltuk. -ΔCysPc-Flag vagy üres vektor. A transzfekció után 24 órával a sejteket lizáltuk és Ni-NTA agarózzal tisztítottuk. Az összes immunprecipitátum és bemenet anti-Myc, anti-Flag, anti-HA és anti-Tubulin Abs. Minden kísérletet legalább három független kísérletben végeztünk. e Modell, amely részletezi a calpain2a szerepét a TRAF{39}}közvetített jelátviteli útvonalakban. LPS és vírus hatására a TRAF6 aktiválható, homo-oligomerizáció és auto-ubikvitináció. A BECN1, ECSIT, IRF7 és IRF3 mindenütt megtalálható a TRAF6 által, és aktiválják a downstream jeleket. A calpain2a negatív szabályozóként a TRAF6-ot célozza meg, hogy gátolja a TRAF{49}}közvetített jelátviteli útvonalakat.
Hivatkozások
1. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Kórokozó felismerés és veleszületett immunitás. Cell 124, 783–801 (2006).
2. Takeuchi, O. & Akira, S. Mintafelismerő receptorok és gyulladás. Cell 140, 805–820 (2010).
3. Wu, J. & Chen, ZJ Citoszolikus nukleinsavak veleszületett immunérzékelése és jelzése. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).
4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. Toll-like receptors. Curr. Biol. 21, R488–R493 (2011).
5. Schlee, M. Patogén RNS mesterérzékelői - RIG-I-szerű receptorok. Immunobiology 218, 1322–1335 (2013).
6. Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, KS NLR fehérjék: a veleszületett immunitás szerves tagjai és a gyulladásos betegségek mediátorai. J. Leukoc. Biol. 83, 13–30 (2008).
7. Akira, S. & Hemmi, H. Patogen-asszociált molekuláris minták felismerése TLR család által. Immunol. Lett. 85, 85–95 (2003).
8. Kawai, T. & Akira, S. A mintázatfelismerő receptorok szerepe a veleszületett immunitásban: frissítés a Toll-szerű receptorokon. Nat. Immunol. 11, 373–384 (2010).
9. Kawagoe, T. et al. Toll-szerű receptor-függő válaszok szekvenciális szabályozása IRAK1 és IRAK2 segítségével. Nat. Immunol. 9, 684–691 (2008).
10. Suzuki, N. & Saito, T. IRAK-4–egy közös NF-kappaB aktivátor a veleszületett és szerzett immunitásban. Trends Immunol. 27, 566–572 (2006).
11. Kawai, T. & Akira, S. TLR jelzés. Sejthalál különbség. 13, 816–825 (2006).
12. Deng, L. et al. Az IkappaB kináz komplex TRAF6 általi aktiválásához dimer ubiquitin-konjugáló enzimkomplexre és egyedi poliubiquitin láncra van szükség. Cell 103, 351-361 (2000).
13. Ninomiya-Tsuji, J. et al. A TAK1 kináz képes aktiválni a NIK-I kappaB-t, valamint a MAP kináz kaszkádot az IL-1 jelátviteli útvonalon. Nature 398, 252–256 (1999).
14. Takaesu, G. et al. A TAB2, egy új adapterfehérje, a TAK1 MAPKKK aktiválását közvetíti azáltal, hogy összekapcsolja a TAK1-et a TRAF6-tal az IL-1 jelátviteli útvonalon. Mol. Sejt. 5, 649–658 (2000).
15. Qian, Y., Commane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. A TRAF6 és TAB2 IRAKm által közvetített transzlokációja az NF-kappa BJ interleukin-1- által indukált aktivációjában Biol. Chem. 276, 41661–41667 (2001).
16. Yin, Q. et al. E2 kölcsönhatás és dimerizáció a TRAF6 kristályszerkezetében. Nat. Struktúra. Mol. Biol. 16, 658–666 (2009).
17. Wang, C. et al. A TAK1 az MKK és az IKK ubiquitin-függő kináza. Nature 412, 346–351 (2001).
18. Ajibade, AA, Wang, HY & Wang, RF A TAK1 sejttípus-specifikus funkciója a veleszületett immunjelátvitelben. Trends Immunol. 34, 307–316 (2013).
19. Zhang, J., Clark, K., Lawrence, T., Peggie, MW & Cohen, P. Az IKKbeta aktiválásának váratlan fordulata: A TAK1 aktiválja az IKKbeta-t autofoszforilációval történő aktiváláshoz. Biochem. J. 461, 531–537 (2014).
20. Emmerich, CH et al. A kanonikus IKK komplex aktiválása K63/M1- kapcsolt hibrid ubiquitin láncokkal. Proc. Natl Acad. Sci. 110, 15247–15252 (2013).
21. Kawai, T. et al. A Toll-szerű receptorokon keresztül történő interferon-alfa indukció az IRF7 közvetlen kölcsönhatását jelenti a MyD88-cal és a TRAF6-tal. Nat. Immunol. 5, 1061–1068 (2004).
22. Kitagawa, Y. et al. A humán parainfluenza vírus 2-es típusú V fehérje gátolja az IRF7 TRAF6-közvetített ubikvitinációját, hogy megakadályozza a TLR7- és TLR9- függő interferon indukciót. J. Virol. 87, 7966–7976 (2013).
23. Kawai, T. et al. IPS-1, egy adapter, amely RIG-I- és Mda5-közvetítette I-es típusú interferon indukciót vált ki. Nat. Immunol. 6, 981–988 (2005).
24. Zust, R. et al. A ribóz 2'-O-metiláció molekuláris aláírást biztosít a saját és nem saját mRNS megkülönböztetéséhez, az Mda5 RNS-érzékelőtől függően. Nat. Immunol. 12, 137–143 (2011).
25. Seth, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ A MAVS azonosítása és jellemzése, egy mitokondriális antivirális jelátviteli fehérje, amely aktiválja az NF kappaB-t és az IRF-et 3. Cell 122, 669–682 (2005).
26. Xu, LG et al. A VISA egy adapterfehérje, amely a vírus által kiváltott IFN béta jelátvitelhez szükséges. Mol. Sejt. 19, 727–740 (2005).
27. Yoshida, R. et al. A TRAF6 és a MEKK1 kulcsszerepet játszik a RIG-I-szerű helikáz antivirális útvonalban. J. Biol. Chem. 283, 36211–36220 (2008).
28. Liu, S. et al. A MAVS több ubiquitin E3 ligázt toboroz, hogy aktiválja az antivirális jelátviteli kaszkádokat. Elife 2, e00785 (2013).
29. Ivashkiv, LB & Donlin, LT Az I. típusú interferonválasz szabályozása. Nat. Rev. Immunol. 14, 36–49 (2014).
30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. A TRAF6 által támogatott ubiquitin transzfer mechanizmusa. Proc. Natl Acad. Sci. 115, 1783–1788 (2018).
31. Boone, DL et al. Az ubiquitin-módosító A20 enzim szükséges a Toll-szerű receptor válaszok leállításához. Nat. Immunol. 5, 1052–1060 (2004).
32. Kovalenko, A. et al. A CYLD tumorszuppresszor negatívan szabályozza az NF kappaB jelátvitelt deubiquitinációval. Nature 424, 801–805 (2003).
33. Ő, X. et al. Az USP2a negatívan szabályozza az IL-1béta- és vírus-indukált NF-kappaB aktivációt a TRAF6 deubiquitinálásával. J. Mol. Cell Biol. 5, 39–47 (2013).
34. Xiao, N. et al. Az ubiquitin-specifikus proteáz 4 (USP4) a TRAF2-t és a TRAF6-ot célozza meg a deubiquitináció érdekében, és gátolja a TNFalpha által kiváltott rákos sejtek migrációját. Biochem. J. 441, 979–986 (2012).
35. Yasunaga, J., Lin, FC, Lu, X. & Jeang, KT Az ubiquitin-specifikus peptidáz 20 a TRAF6-ot és az 1-es típusú humán T-sejtes leukémia vírust célozza meg, hogy negatívan szabályozza az NF-kappaB jelátvitelt. J. Virol. 85, 6212–6219 (2011).
36. Zhang, X., Zhang, J., Zhang, L., van Dam, H. & ten Dijke, P. Az UBE2O negatívan szabályozza a TRAF6-közvetített NF-kappaB aktivációt a TRAF6 poliubiquitináció gátlásával. Cell Res. 23, 366–377 (2013).
37. Wi, SM et al. A TAK1-ECSIT-TRAF6 komplex kulcsszerepet játszik a TLR4 jelben az NF-kappaB aktiválásában. J. Biol. Chem. 289, 35205–35214 (2014).
38. Min, Y., Kim, MJ, Lee, S., Chun, E. & Lee, KY A TRAF6 ubiquitin-ligáz aktivitásának PRDX1 általi gátlása az NFKB aktiváció és az autofágia aktiváció gátlásához vezet. Autofágia 14, 1347–1358 (2018).
39. Jiao, S. et al. Az MST4 kináz korlátozza a gyulladásos válaszokat a TRAF6 adapter közvetlen foszforilációja révén. Nat. Immunol. 16, 246–257 (2015).
40. Baudry, M. & Bi, X. Calpain-1 and Calpain-2: The Yin and Yang of Synaptic Plasticity and Neurodegeneration. Trends Neurosci. 39, 235–245 (2016).
41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. A sejtmigráció szabályozása: a kalpainok behatolnak. J. Cell Sci. 118, 3829–3838 (2005).
42. Katsube, M. et al. A különböző jelátviteli útvonalak és a sejtmigráció kalpain által közvetített szabályozása humán neutrofilekben. J. Leukoc. Biol. 84, 255–263 (2008).
43. Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL. A kalpain-gátlás hatása az IkB alfa degradációra PBMC-k aktiválása után: a kalpain hasítási helyek azonosítása. Neurochem. Res. 29, 1443–1451 (2004).
44. Tompa, P. et al. A kalpain hasítás szekvenciális meghatározóiról. J. Biol. Chem. 279, 20775–20785 (2004).
45. Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL A peptid szubsztrátspecifitásának meghatározása a mu-calpain esetében peptidkönyvtár-alapú megközelítéssel: a primed side interakciók jelentősége. J. Biol. Chem. 280, 40632–40641 (2005).
46. DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Calpain hasítási előrejelzése többszörös kernel tanulással. PLoS One. 6, e19035 (2011).
47. Shi, CS és Kehrl, JH TRAF6 és A20 szabályozza a Beclin lizinhez kapcsolódó 63-ubiquitinációját-1 a TLR4-indukálta autofágia szabályozására. Sci. Jel. 3, ra42 (2010).
48. Loo, YM & Gale, M. Immune Signaling by RIG-I-like Receptors. Immunity 34, 680–692 (2011).
49. Ling, T. et al. A TARBP2 gátolja az IRF7 aktiválódását azáltal, hogy elnyomja az IRF7 TRAF6-közvetített K63- ubiquitinációját. Mol. Immunol. 109, 116–125 (2019).
50. Zhou, Z. et al. A Zebrafish otud6b negatívan szabályozza az antivirális válaszokat az irf3 és irf7 K63--hoz kapcsolódó ubikvitinációjának elnyomásával. J. Immunol. 207, 244–256 (2021).
51. Kobayashi, T., Walsh, MC & Choi, Y. A TRAF6 szerepe a jelátvitelben és az immunválaszban. Mikrobák fertőznek. 6, 1333–1338 (2004).
52. Wu, H. & Arron, JR TRAF6, adaptív immunitáson, veleszületett immunitáson és oszteoimmunológián átívelő molekuláris híd. Bioessays 25, 1096–1105 (2003).
53. Pickart, CM & Eddins, MJ Ubiquitin: struktúrák, funkciók, mechanizmusok. Biochim. Biophys. Acta. 1695, 55–72 (2004).
54. Pickart, CM & Fushman, D. Polyubiquitin láncok: polimer fehérje jelek. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 610–616 (2004).
55. Lamothe, B. et al. A helyspecifikus Lys-63-kapcsolt tumornekrózis faktor receptorhoz kapcsolódó 6-os faktor auto-ubiquitinációja az I-kappa B kináz aktiválásának kritikus meghatározója. J. Biol. Chem. 282, 4102–4112 (2007).
56. Han, Y., Weinman, S., Boldogh, I., Walker, RK & Brasier, AR Tumor necrosis factor-alpha-inducible IkappaBalpha proteolysis mediated by cytosolic m-calpain. Az ubiquitin-proteaszóma útvonallal párhuzamos mechanizmus a nukleáris faktor-kappa B aktiválásához. J. Biol. Chem. 274, 787-794 (1999).
57. Chu, Q. et al. A circRasGEF1B erősen konzervált cirkuláris RNS fokozza a vírusellenes immunitást azáltal, hogy szabályozza a miR-21-3p/MITA útvonalat alsó gerincesekben. J. Virol. 95, e02145–20 (2021).
58. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. Az ACKR4a autofágiát indukál, hogy blokkolja az NF-kappaB jelátvitelt és apoptózist, hogy elősegítse a Vibrio harveyi fertőzést. iScience 26, 106105 (2023).
59. Sepulcre, MP et al. A lipopoliszacharidok (LPS) felismerésének és jelátvitelének fejlődése: A halak TLR4 nem ismeri fel az LPS-t, és negatívan szabályozza az NF kappaB aktiválását. J. Immunol. 182, 1836–1845 (2009).
60. Zheng, W., Chu, Q. & Xu, T. A hosszú, nem kódoló RNS NARL szabályozza az immunválaszokat mikroRNS-közvetített NOD1 downreguláción keresztül teleost halakban. J. Biol. Chem. 296, 100414 (2021).
61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Exon-Intron Circular RNS circRNF217 elősegíti a veleszületett immunitást és az antibakteriális aktivitást Teleost halakban a miR-130-3p csökkentésével Funkció. J. Immunol. 208, 1099–1114 (2022).
62. Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. Rhabdovírus-indukálható mikroRNS-210 modulálja az antivirális veleszületett immunválaszt a STING/MITA megcélzásával halakban. J. Immunol. 201, 982–994 (2018).
63. Bi, D. et al. A lipopoliszacharid felismerése és az NF-kappaB aktiválása a NOD1 citoszolikus érzékelővel Teleost Fishben. Elülső. Immunol. 9, 1413 (2018).
64. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. & Xu, T. IRF3 és IRF8 szabályozza az NF-kappaB jelzést MyD88 célzásával a Teleost Fishben. Elülső. Immunol. 11, 606 (2020).
65. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k gátolja az NF-kappaB jelátvitelt azáltal, hogy a MyD88-at célozza meg az ATG5-közvetített autofágiás lebomlással teleost halakban. J. Biol. Chem. 298, 101730 (2022).