A foszfát fehérjefüggetlen szerepe a krónikus vesebetegség progressziójában

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Irene Faria Duayer¹ et al

Absztrakt:Számos tényező hozzájárul ahhozvesefunkcióA krónikus vesebetegségben szenvedők számának csökkenése, és a foszfáttartalom szerepe az étrendben még mindig vita tárgya. Ennek a tanulmánynak az a célja, hogy elemezze azt a mechanizmust, amellyel a foszfát a fehérjétől függetlenül kapcsolódik a CKD progressziójához. Felnőtt München-Wistar patkányokat 5/6-os nefrektómiának (Nx) vetették alá, alacsony fehérjetartalmú étrenddel etettük, és két csoportra osztották. Csak a foszfáttartalom (alacsony foszfát, LoP, 0,2 százalék ; magas foszfát, HiP, 0,95 százalék ) tesz különbséget az étrendben. Hatvan nap elteltével a biokémiai paraméterek ésveseszövettani elemzést végeztek. A HiP-csoport rosszabb veseműködést mutatott, magasabb PTH-, FGF-23-szinttel és részleges foszfátürítéssel. A veseszövet szövettani analízise során nagyobb százalékban mutatták ki az intersticiális fibrózist, az -aktin, PCNA ésvese-makrofágok beszivárgása. Az LoP-csoport a beclin{0}} magasabb expresszióját mutatta a vesetubulus-sejtekben, ami az autofágiás efflux markere a HiP-csoporthoz képest. Eredményeink rávilágítanak a foszfát hatására az indukcióbanveseintersticiális gyulladás és fibrózis, hozzájárulva a vesebetegség progressziójához. A foszfát lehetséges hatása a vesesejtek autofágia mechanizmusának szabályozási zavarára további vizsgálatokat igényel klinikai vizsgálatokkal.

Kulcsszavak:foszfát;diéta; CKDprogresszió;vese-fibrózis; autofágia;apoptózis

Kulcsfontosságú hozzájárulás:A vesevédelem mechanizmusai a foszfátdiéta korlátozásával még nem határozhatók meg. Ebben a vizsgálatban a foszfát túlterhelés a gyulladásos folyamatok aktiválásával és aveseintersticiális fibrózis. A hyperphosphataemia hatása a vesesejtek apoptózisára és az autofágiára további vizsgálatokat igényel.

A Cistanche tubulosa megelőzi a vesebetegséget, kattintson ide a mintaért

1. Bemutatkozás

Krónikusvesebetegség (CKD) közegészségügyi problémának minősül. Prevalenciája az életkorral növekszik, és világszerte 11 és 13 százalék között változik [1]. Bár a CKD általában visszafordíthatatlan állapot, számos megközelítés alkalmazható a betegség progressziójának lassítására, mint például a vérnyomás, a diszlipidémia és a hiperglikémia szabályozása, az angiotenzin-konvertáló enzim gátlók alkalmazása és az alacsony fehérjetartalmú étrend [2–7] . E stratégiák közül az alacsony fehérjetartalmú étrend a leginkább vitatható javaslat a késleltetésrevesefunkció hanyatlása a megfelelőség, a biztonság és a hatékonyság miatti aggodalmak miatt. A fehérje étrendben való csökkentésének előnyeivel kapcsolatos konszenzus hiánya a fehérje- és foszfáttartalom átfedő szerepén múlik az étrendben. Mivel a fehérjeforrások foszfátban gazdagok, a fehérjebevitel csökkentése javasolt a korlátozott foszfátbevitel elérése érdekében. Lehetséges a fehérje korlátozása a foszfát korlátozása nélkül, bár ennek ellenkezője nehéz.

Kísérleti vizsgálatokban az alacsony fehérjetartalmú étrend hatása megvédte a CKD-modelleket a glomeruláris károsodástól és a proteinuriától [8], elősegítve a glomeruláris filtrációs ráta jobb megőrzését [9]. Meg kell jegyezni, hogy az étrendi fehérje és a foszfát erősen korrelál. Ezért, bár néhány kísérleti tanulmány a fehérje restrikció izolált hatásának értékelésére összpontosított, a véletlen foszfát restrikció miatt is torzíthattak. Másrészt a foszfátban gazdag étrend egyéni hozzájárulása a CKD kialakulásához egyértelműen kimutatható [10,11]. A magas foszfáttartalmú étrendről kimutatták, hogy több intersticiálist vált kivesefibrózis és tubuláris atrófia minimális glomerulosclerosissal urémiás patkányokban. Érdekes módon a károsodás a foszfát restrikció után tompult [12]. Megjegyzendő, hogy az étrend fehérjetartalmát nem említették ebben a tanulmányban.

A klinikai forgatókönyv szerint az alacsony fehérjetartalmú étrend csökkentette az urémiás toxinok koncentrációját és megőrizte a maradék vesefunkciót, még a konzervatív kezelésről az inkrementális dialízisre való áttéréskor is [13].ÉtrendifehérjeA restrikció szintén késleltette a CKD progresszióját egy közelmúltbeli metaanalízisben [14]. Mivel azonban a fehérje-korlátozás korrelált az alacsonyabb szérum foszfátszinttel, az étrendnek ez a jótékony hatása részben a foszfát korlátozással magyarázható. Az eddigi legnagyobb prospektív vizsgálat, az MDRD [15], az alacsony fehérjetartalmú diéta csak kis hasznot mutatott közepes veseelégtelenségben szenvedő betegeknél, míg a vesebetegség progresszióját nem befolyásolta a súlyos veseelégtelenségben szenvedő betegeknél. Mindazonáltal ebben a kísérletben nem foglalkoztak az étrend foszfáttartalmával és annak egyéni hozzájárulásával a lassulásban.CKDelőrehaladása továbbra is ismeretlen.

Ismeretes, hogy a foszfát csökkentheti a vesében és a keringésben lévő Klotho [16], egy öregedésgátló fehérje, amely részt vesz a citoprotekcióban és a fibrózis elleni küzdelemben, antioxidatív és antiapoptotikus hatással [17]. Ezenkívül a vesesejtekben a Klotho-hiány miatti hibás autofágiát már kimutatták [18]. Az autofágia egy katabolikus folyamat, amelynek kritikus szerepe van a sejtek homeosztázisának fenntartásában és a sejtek életképességének megőrzésében stresszes körülmények között. Egyes bizonyítékok arra utalnak, hogy összefüggés van az autofágia és a CKD különböző utakon keresztül történő progressziója között, beleértve a TGF-jelátvitelt [19], amely a vesefibrózis kialakulásának erős fibrogén faktora. A TGF- számos biológiai folyamatot befolyásol, szabályozza a sejtproliferációt és -differenciálódást, az apoptózist, és specifikus transzmembrán receptorokhoz kötődik, amelyek SMAD fehérjék által közvetített intracelluláris jelátvitelt indukálnak [20]. Az apoptózis a programozott sejthalál mechanizmusa, amely különbözik a nekrózistól. A foszfátot az apoptózis közvetítőjeként írták le endoteliális [21], oszteoblasztos [22] és peritoneális mesothelsejtek [23] kísérleti modelljeiben. Bizonyíték van arra, hogy az apoptotikus sejthalál részt vesz a progresszióbanvesesérülés [24], de a foszfát hatása a vesesejtek apoptózisára még nem tisztázott.

Mivel még nem teljesen tisztázott az a mechanizmus, amellyel a magas foszfáttartalmú étrend felgyorsítja a CKD progresszióját, feltételeztük, hogy ez összefüggésbe hozható egy diszfunkcionális autofágiás emberrel. Ezért a jelenlegi tanulmányban München-Wistar patkányok két csoportját értékeltük ki étrendjük foszfáttartalma alapján (alacsony 0,2 százalék versus magas0,95 százalék), és teszteltük egy alacsony foszfát diéta aveseszövettani és immunhisztokémiai változások, beleértve az autofágia markert, a beclin-t{0}}.

2. Eredmények

Az alacsony (LoP) és magas foszfáttartalmú diéta (HiP) csoportokból kapott hemodinamikai, morfológiai és biokémiai paramétereket az 1. táblázat tartalmazza. A várakozásoknak megfelelően az 5/6- nefrektómia csökkentette a kreatinin-clearance-t és növelte szérum karbamidban és kreatininben mindkét csoportban. A HiP-csoportba tartozó állatok alacsonyabb vesefunkciót mutattak, amit a magasabb kreatinin és alacsonyabb kreatinin-clearance bizonyít; alacsonyabb hematokritértéket és alacsonyabb végső tömeget is mutattak. A HiP csoportban a szérum és a foszfát frakcionált kiválasztódása, valamint a parathormon (PTH) és a fibroblaszt növekedési faktor-23 (FGF-23) növekedése mutatkozott. Megjegyzendő, hogy a faroknyomás, a kezdeti súly és a vizeletalbumin-kiválasztás hasonló volt a csoportok között.

A szövettani leleteket az 1-3. Glomeruloszklerózist (GS) alig találtak mindkét csoportban. Az intersticiális fibrózis százalékos aránya azonban szignifikánsan magasabb volt a HiP-csoport patkányai között. Ennek megfelelően ezeknél az állatoknál nagyobb százalékban volt - simaizom aktinnal festett terület, és nagyobb volt a makrofágok veseinfiltrációja, az ED-1 expresszió alapján értékelve, amint az a 2. táblázatban látható. Foszforilált SMAD (p-SMAD) expresszió, a TGF-béta útvonal aktiválásának markere, nem különbözött a csoportok között.

A proliferatív sejtnukleáris antigén (PCNA) pozitív sejtek voltak túlsúlyban a HiP csoportban, ami arra utal, hogy a foszfát túlterhelés elősegítette a vesesejtek intenzívebb proliferációját. Ezzel szemben az apoptotikus sejtek száma magasabb volt az LoP csoportban. Hasonlóképpen, a beclin 1-pozitív sejtek szignifikánsan magasabbak voltak a tubulointerstitialis léziókban az LoP csoportban, ami azt jelzi, hogy a magasabb foszfát mennyisége gátolja a regeneratív autofágiás folyamatot.veseszövet.

3. Megbeszélés

Ez a kísérleti tanulmány azt vizsgálta, hogy az étrendi foszfát korlátozás hatékony lépés-e a CKD progressziójának lassításában, függetlenül az egyidejű étrendi fehérje korlátozástól. Megvizsgáltuk a különböző foszfáttartalmú étrendek hatását ({{0}},2 vs. 0,95 százalék) 5/6-veseműtétes állatmodellben, ahol minden állat alacsony fehérjetartalmú étrendben részesült. (12 százalék). Eredményeink azt mutatták, hogy a magas foszfáttartalmú étrend hiperfoszfatémiával járt, annak ellenére, hogy megnőtt a PTH, FGF-23 és ennek következtében a foszfát frakcionált kiválasztódása. Ezenkívül a HiP a vesefunkció károsodását és az intersticiális fibrózis növekedését okozta, ami magasabb aktinexpresszióval, makrofág-infiltrációval és sejtproliferációval, valamint az autofágia gátlásával járt.

A 12 kohorsz vizsgálat metaanalízise, ​​amelyben 25 546 nem dializált krónikus krónikus betegségben szenvedő beteg vett részt, független összefüggést mutatott ki a szérum foszfátszintje között,vesekudarc és halálozás [25]. Ezen túlmenően egy retrospektív kohorsz-vizsgálat 13 772 dialízises incidensben szenvedő beteg bevonásával összefüggést mutatott ki a hiperfoszfatémia és a CKD-ásványi és csontrendellenesség egyéb rendellenességei között a reziduumok meredekebb csökkenésével.vesefüggvény [26]. Azt a mechanizmust, amellyel a foszfát restrikció késlelteti a CKD progresszióját, még nem állapították meg. Egy kísérleti vizsgálat során kimutattuk, hogy a foszfátban dúsított étrend a veseműködés romlásával járt, összehasonlítva az alacsony foszfáttartalmú étrenddel olyan Wistar patkányoknál, amelyeken mellékpajzsmirigy-eltávolítás és 5/6-nefrektómia volt, rögzített mellékpajzsmirigy segítségével. hormon (PTH) kiegészítés [11]. Kusano et al. [10] kimutatta, hogy a vesefunkció védelme alacsony foszfáttartalmú (0,3 százalék) étrenddel járt együtt, függetlenül az urémiás patkányok étrendjének fehérjetartalmától. A normál foszfátot (0,5 százalék) tápláló patkányok azonban csak akkor mutatták ezeket az előnyöket, ha nagyon alacsony fehérjetartalmú (8,4 százalék) táplálékkal etették őket. Összességében ezek az eredmények azt jelzik, hogy az étrendi foszfát szerepe erősebb lehet, mint az étrendi fehérje. Azonban a fent említett tanulmányok egyike sem próbálta megvizsgálni azokat a lehetséges útvonalakat, amelyek szerepet játszhatnak a foszfáttal összefüggő vesekárosodásban.

A foszfát túlterhelés hatása a CKD progressziójában számos tanulmány tárgya volt. Labels et al. először állatmodellben javasolták ezt a lehetőséget, de az étrendi [27] fehérjét nem szabályozták, ami valószínűleg elfedte a foszfát izolált hatását. A foszfátfüggetlen megszorítás feltételezett előnye a CKD forgatókönyvében a fehérje korlátozás helyett nagyon érdekes, mert a szérum foszfát szabályozásának kockázata a korlátozott fehérjebevitellel együtt alultápláltsághoz és magasabb mortalitáshoz vezethet.

A foszfát-diéta tartalma nem feltétlenül határozza meg a szérum foszfátkoncentrációját CKD-s betegekben [28], ami rávilágít a diéta korlátozásának fontosságára ezen elem szérumkoncentrációjától függetlenül. A foszfát kóros hatásai a csontokra és a szív- és érrendszerre motiválják a hiperfoszfatémia kezelésére irányuló beavatkozásokat. A klinikai gyakorlatban a foszfátszint csökkentését célzó beavatkozások diétás korlátozásokból és foszfátmegkötőkből állnak. Bár ennek a megközelítésnek a klinikai végpontokra vonatkozó előnyei megkérdőjelezhetőek voltak egy kis mintás vizsgálatban [29], annak tudatában, hogy a foszfáttöbblet felelős a PTH és FGF túltermeléséért-23, ésszerű fenntartani a lehető legalacsonyabb foszfátszintet a krónikus vesebetegségben szenvedő betegeknél [30].

Az alacsony fehérjetartalmú étrend a foszfát alacsony biohasznosulását idézi elő, és csökkenti a szérum FGF-23-ot [31,32], amely a nátrium-függő foszfát-visszaszívódás közvetítője a vesetubuláris sejtekben. Ez arra utal, hogy az előrehaladott CKD foszfátszabályozási mechanizmusát valamilyen módon befolyásolhatja a foszfátbevitel, teljesen független módon a fehérjetartalmú étrendtől. Emiatt egy 5/6-veseeltávolítási modellben értékeltük a foszfáttartalmú étrend hatását a CKD progressziójára. Egy korábbi kísérleti tanulmány már kimutatta, hogy a foszfát módosíthatja a nagyon alacsony fehérjetartalmú étrendre (0,3 g/kg) adott antiproteinurikus választ, ami összefüggést mutat a szérum foszfátszintje és a foszfaturia között, valamint a fehérjeszegény étrendre adott antiproteinurikus válaszreakcióval. korlátozott fehérje diéta, függetlenül a vesefunkciótól [33]. Egy keresztezett vizsgálatban, amelyben 11 krónikus vesebetegségben szenvedő beteg vett részt (eGFR 30–55 ml/perc/m2), a szérumfoszfát cirkadián ritmusa megváltozott a magas foszfáttartalmú étrenddel, ami nem magyarázható a vizelet foszfát kiválasztásával, PTH-val vagy FGF-vel. -23 [34]. Ez az eredmény megerősíti a foszfát diéta korlátozásának fontosságát a CKD-s betegekben, mint független terápiás célpontot.

Úgy tűnik, hogy a hemodinamikai állapot nem játszik szerepet a vesefunkció romlásában a HiP csoportban, mivel az artériás nyomás mindkét csoportban hasonló volt. Emellett nem találtunk szignifikáns glomeruláris károsodást modellünkben, ami a fehérje restrikcióval magyarázható. Azonban több intersticiális fibrózist észleltünk a HiP diétás csoportban.

Az intersticiális fibrózis jól korrelál a vesefunkció elvesztésével emberekben és patkányokban.

Egy korábbi tanulmány összefüggésbe hozta a magas foszfáttartalmú étrend által kiváltott vesefibrózis kialakulását a peptidil-prolil-izomeráz Pin 1 segítségével [35], míg más tanulmányok rámutattak az aKlotho-hiány káros szerepéreveseszöveti fibrózis [36,37]. A Klotho genetikai deléciója kísérleti modellekben öregedést, növekedési retardációt és meszesedést okoz [38]. FGF23-A Klotho jelátvitel gátolja a vese foszfát reabszorpcióját. CKD környezetben a Klotho expressziója csökken a vesetubulusokban [39]. Ezenkívül a foszfátban gazdag étrend súlyosbította a klotho-hiányt az ischaemia-reperfúziós akut vesekárosodás modelljében, és tovább elősegítette a fokozott vesekárosodást.veseszöveti fibrózis, ami felgyorsítja a CKD progresszióját [18]. A foszfát diéta hatását a Klotho vese expressziójára már egérmodelleken is kimutatták [40]. Valószínűleg más útvonalak mellett a foszfát túlterhelés rontja a veseműködést azáltal, hogy modulálja a Klotho expresszióját a tubuláris sejtekben; a jövőbeni tanulmányok során tovább kell vizsgálni.

Az apoptózist és a fibrózist citokinek, például TGF- közvetítik [41,42]. Leírtuk a másodlagos hyperparathyreosis és az ebből következő magasabb TGF-expresszió összefüggését a szív remodelling folyamatában [43]. Feltételezhető, hogy összefüggés van a PTH aktiválása és a TGF-jelátvitel között, amely serkenti a fibroblasztok proliferációját, a kollagénszintézist és a fibrózist. Még kísérleti bizonyítékok is vannak a TGF- és PTH-receptorok integrált hatásáról a csontsejtekre, és szabályozzák a csont-remodelling jelátvitelt [44]. A TGF- /Smad jelátvitel szerepevesebetegséget már leírtak. A TGF- kötődik egy transzmembrán receptorhoz, kiváltja a Smads fehérjék foszforilációját, és elősegíti azok transzlokációját a sejtmagba a transzkripciós hatások érdekében. Ezért elengedhetetlenek a TGF-család tagjainak jelátviteléhez. Valójában a Smad2 és Smad3 fehérjék túlzott expresszióját a fibrotikus vesében CKD-s állatmodellekben már kimutatták [45]. Érdekes módon bizonyíték van arra, hogy a Smads-t más, a TGF-től független mediátorok aktiválják, mint például a fejlett glikációs végtermékek [46] és az angiotenzin II [47]. Mivel egy kísérleti modellben a hiperfoszfatémia hatását a CKD progressziójára nem befolyásolta a PTH helyettesítése [11], kíváncsiak vagyunk, vajon a foszfátnak lenne-e közvetlen szerepe a vese Smad jelátvitelében. Modellünkben a hiperfoszfatémia nem befolyásolta a p-Smad expresszióját vesetubuláris sejtekben.

Ez azonban nem zárja ki a TGF-útvonal Smads-foszforilációtól független aktiválásának lehetőségét. További vizsgálatokra van szükség ennek az alternatív útnak a vizsgálatához.

A csontszövet értékelése során a foszfát túlterhelés az oszteoblaszt-szerű sejtek apoptózisát váltotta ki [22]. Rojas et al. transzplantált betegek csontbiopsziáiban kimutatták, hogy az apoptotikus sejtek száma magasabb az alacsony foszfát- és PTH-tartalmúakban, ami növeli az oszteoblasztokat és megakadályozza az apoptózist [48]. A PTH csontsejt-apoptózisra gyakorolt ​​e gátló hatását korábban már kimutatták [49]. A csontszövetre gyakorolt ​​hatások mellett az apoptotikus utak az akut veseelégtelenséghez is kapcsolódnak [48], és lehetséges közvetítői lehetnek a CKD progressziójának. Modellünkben az apoptózison átesett sejtek nagyobb arányát figyeltük meg az LoP csoportban, statisztikai relevancia nélkül. Ezek a megfontolások a hiperfoszfatémia okozta károsodott apoptózis mechanizmusra utalnak. Ugyanakkor szem előtt kell tartanunk, hogy a foszfát kizárólagos hatását nem lehetett értékelniveseszöveti apoptózist, ha az állatokban PTH és FGF{0}} emelkedés is kialakult.

Jelen tanulmányunkban a magas foszfáttartalmú étrend által okozott vesekárosodás egy másik lehetséges mechanizmusával, az autofágia diszfunkcióval foglalkoztunk az autofagoszómális membrán nukleációjához szükséges szabályozó fehérje, a beclin-1 fehérje mérésével [50]. Az autofágia egy katabolikus folyamat, amely magában foglalja a sejtkomponensek lebomlását a lizoszómákon keresztül [51,52]. A beclin-1 foszforilációt a foszfatidil-inozitol-3-foszfát kináz komplex aktiválásának és az autofagoszóma biogenezis membránhelyeinek toborzásának autofágia-specifikus jelének tekintik [53]. A beclin-1 leütése elnyomja az autofágiát [54], az ischaemia-reperfúzió pedig növeli annak szintjét [55]. A beclin{13}} csökkenése és az mTOR egyidejű felszabályozása csökkenti a rosszindulatú sejtek növekedését, kiemelve az autofágia túlélést elősegítő hatását [52].

A Klotho antifibrotikus hatásai egy felfelé szabályozott autofágia folyamattal is összefüggésbe hozhatók, amely útvonalon keresztül az ischaemiás sérülés gyengült az AKI modellben, és károsodott a magas foszfátszint [18]. Kísérleti vizsgálatok kimutatták, hogy az autofág fluxus mérsékli a makrofágok beszűrődését és a foszfát által kiváltott vesefibrózist. Ezenkívül a foszfátban gazdag környezet in vitro mitofagiát indukál tubuláris sejtekben [56]. Adataink azt mutatták, hogy az étrend foszfáttartalma in vivo is befolyásolta a beclin-1 expresszióját a vesetubulusokban. A HiP diéta a sejtszaporodás növekedésével és az alacsonyabb apoptotikus ráta irányába mutató tendenciával is összefüggésbe hozható, amint azt a PCNA és a TUNEL analízis mutatta. Modellünkben azonban nem tudtuk azonosítani, hogy ez a foszfát túlterhelés közvetlen hatásaként, vagy a PTH és FGF{6}} szintjében a hiperfoszfatémia által kiváltott eltérések miatt következett be. Ezt a megállapítást klinikai forgatókönyvben kell megerősíteni.

Ennek a tanulmánynak a legfontosabb előnye az volt, hogy felmérte az alacsony fehérjetartalmú étrendben a foszfát-megszorításnak a CKD progresszióra gyakorolt ​​hatását, amely magában foglalta annak a szövettani mintázatokra és a molekuláris fenotípusokra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatát.veseszövet. Tudomásunk szerint ez az első olyan tanulmány, amely bemutatja a beclin{0}} expressziójának, a vese tubuláris sejtjeinek autofágia markerének in vivo foszfátdiétával történő modulálását. A fő korlát az volt, hogy a hiperfoszfatémia hatását nem lehetett elválasztani más, CKD-MBD-vel összefüggő rendellenességektől, mint például a PTH és az FGF-23 emelkedése. Nem tudtuk értékelni a közepes foszfáttartalmú étrendet vagy a vese Klotho expresszióját sem. Modellünk azonban a valós állapotot reprodukálja, ahol a HiP-diéta általában hyperparathyreosishoz és magas FGF-23 szinthez kapcsolódik.

4. Konklúziók

Összefoglalva, ez a tanulmány bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy a foszfátdiéta szerepet játszik a CKD progressziójában, esetleg fokozza az intersticiális fibrózist. Továbbá a foszfátban gazdag étrend módosíthatja aveseautofágia folyamat. Egy fehérjefüggetlen útvonal azonosítása, amelyen keresztül a foszfát rontja a veseműködést, fontos utat nyithat olyan új megközelítések kidolgozásához, amelyek a CKD progressziójának klinikai környezetben történő megelőzésére vagy csökkentésére irányulnak.

5. Anyagok és módszerek

Helyi létesítményből származó, felnőtt hím München-Wistar patkányokat vontunk be ebbe a vizsgálatba. A patkányokat 23 ± 1 ◦C-on tartottuk, 60 ± 5 százalékos levegő páratartalom mellett, 12:12- órás világos-sötét ciklusban. Minden állat szabadon hozzáférhetett a csapvízhez, és alacsony fehérjetartalmú (12 százalékos fehérjetartalmú) táplálékkal etették őket. Az állatokat két hónappal később leölték, amikor vért, vizeletet és veseszövetet elemeztek. Minden patkánynál meghatároztuk a farokmandzsetta nyomását, a kreatinin-clearance-t és a napi albumin-ürítést a vizelettel. A kísérleti terv az A. függelékben látható (A1. ábra).

5.1. Analitikai technikák

Hatvan nappal Nx után az állatokat nátrium-tiopentállal (50 mg/ttkg) érzéstelenítettük, és vérmintákat vettünk. A szérum kreatinin koncentrációját kolorimetriás módszerrel határoztuk meg. A szérum albumint, foszfátot, karbamidot, kalciumot és hematokritot standard módszerekkel mértük. A PTH-t ELISA-val mértük (Immutopics, San Clemente, CA, USA). Az FGF-23-t ELISA készlettel (KAINOS, Japán) mértük a gyártó protokollja szerint. A glomeruláris szűrést kreatinin-clearance alapján számítottuk ki a szérum és a vizelet kreatininszintje alapján, ml/perc-ben kifejezve, a következő képlettel számítva: vizelet kreatinin (mg/dL) × vizelet társ (mL/perc)/szérum kreatinin (mg/dL). A vizelet albumint radiális immundiffúzióval határoztuk meg.

- a bal harmadavesea bal veseartéria két vagy három ágának lezárásával. Az áloperált patkányok érzéstelenítésen estek át, és manipulálták a veseköveket, a vesetömeg csökkenése nélkül. Miután felépültek az érzéstelenítésből, az állatokat visszahelyezték eredeti ketrecükbe, amelyeket a következő 24 órán keresztül felmelegítettek.

A foszfát frakcionált kiválasztását (FEP) a vizelet és a szérumfoszfát (mg/dl), a vizelet és a szérum kreatinin (mg/dl), százalékban kifejezve, a következő képlettel: (vizelet/szérumfoszfát)/ (vizelet/szérum) kreatinin) × 100.

5.2. Kísérleti csoportok

Az állatokat két csoportra osztották a táplálék foszfáttartalma szerint, az alábbiak szerint: Alacsony foszfáttartalmú étrend (LoP): n=20; az állatok TD-90016, 12 százalékos fehérje diétát kaptak, 0,2 százalékos foszfátkoncentrációra módosítva. Magas foszfáttartalmú étrend (HiP): n=19; az állatok TD-90016, 12 százalékos fehérje étrendet kaptak, 0,95 százalékos foszfátkoncentrációra módosítva.

5.3. Szövettani technikák

A maradékvesein situ perfundáltuk a megfigyelt MAP-on sóoldattal, majd Duboscq-Brasil oldattal rögzítés céljából. A mérést követően két középkoronális veseszeletet utólag rögzítettünk pufferolt 4%-os formaldehidben. A veseszövetet ezután paraffinba ágyaztuk, és a korábban leírtak szerint hisztomorfometriára és immunhisztokémiára készítettük elő [57].

Az összes morfometriai értékelést 4-µm vastag metszetekben egyetlen megfigyelő végezte, aki nem látta a csoportokat. Minden egyes patkány esetében megbecsülték a glomerulosclerosis (GS) súlyosságát a Schiff periodikus savval (PAS) megfestett metszetekben úgy, hogy minden egyes glomerulushoz (patkányonként legalább 120-at vizsgáltak) egy pontszámot rendeltek a csomó terület szklerózisos frakciójának becsléséhez. , és levezetjük a GS indexet (GSI) minden patkányra a korábban leírtak szerint [58]. Az intersticiális expanzió mértékének felméréséhez a vesekéreg intersticiális fibrózis által elfoglalt területének százalékos arányát (IF százalék) pontszámláló technikával megbecsültük a Masson-festett metszetekben [59].

5.4. Immunhisztokémia

Négy µm vastag, paraffinba ágyazott vesemetszeteket rögzítettünk 6 százalékos szilánnal bevont üveglemezekre. A metszeteket paraffinmentesítettük, rehidratáltuk, majd citrát pufferben melegítettük az antigénvisszanyerés fokozása érdekében. Előinkubáltuk 5 százalék normál nyúl (ED-1) vagy ló (-aktin) szérummal Tris-puffered sóoldatban (TBS) vagy kazein alapú Protein Block oldatban (Protein Block; DAKO Corporation, Santa Clara, CA, USA (PCNA, pSmad és Beclin esetében)), a nem specifikus kötődés megakadályozására. Az elsődleges antitesttel egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. A negatív kontrollokat az elsődleges antitest elhagyásával végeztük.

A következő elsődleges antitesteket használtuk: monoklonális egér anti-patkány ED-1 antitest (Serotec, Oxford, Egyesült Királyság), makrofágok kimutatására; egér monoklonális anti-alfa sima (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), -aktin kimutatására; poliklonális anti-Beclin 1 antitest (Boster, Pleasanton, CA, USA), autofágia elemzéshez. Mosás után a metszeteket biotinilált anti-egér IgG-vel (H plus L) (Vector, Burlingame, CA, USA) 45 percig inkubáltuk, majd VECTASTAIN® ABC-AP Kit, Vector® Red (Vector, Burlingame, CA) , USA) 30 percig. Ezután gyorsvörös festékoldattal metszeteket fejlesztettek ki.

A monoklonális egér antiproliferációs sejtmag antigén (Dako, Dánia) és a foszfor-smad2 (Ser465/467) antitest (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) esetében az endogén peroxidáz gátlást 3 százalékos hidrogén-peroxid oldattal és metanollal végeztük 30 percig. min. A metszeteket ezután egy éjszakán át inkubáltuk az elsődleges antitesttel párásított kamrában 4 °C-on. Másnap a metszeteket biotinilált anti-egér IgG-vel (H plus L) vagy biotinilált anti-patkány IgG-vel (H plus L) (Vector, Burlingame, CA, USA) 45 percig inkubáltuk, majd VECTASTAIN® ABC-vel inkubáltuk. HRP Kit (Vector, Burlingame, CA, USA) 30 percig. Ezután a metszeteket egy 3-amino-9-etil-karbazol szubsztrát kromogén (AEC) (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) felhasználásával fejlesztettük ki. Valamennyi metszetet desztillált vízben öblítettünk, majd Mayer-féle Hemalum oldattal (Merck, Darmstadt, Németország) ellenfestettük Kaiser-féle glicerin-zselatinnal (Merck, Darmstadt, Németország).

Az ED-1, p-Smad, Beclin és PCNA intersticiális vesesűrűségének becsléséhez a pozitív sejtek/mm2 számát vak módszerrel, 400-szoros nagyítással értékeltük. Az -aktin értékeléséhez egy pontszámlálási technikát alkalmaztunk, mikroszkóppal, amelyhez egy 100-pontos okulár csatlakozik egy videomonitorhoz. 25 mezőt elemeztünk 3200-as nagyítás mellett. Az eredményeket százalékban fejeztük ki a teljes területre vonatkoztatva.

5.5. Apoptózis

Az apoptózist a vese tubuláris sejtjeiben a TUNEL technikával (TdT által közvetített X-dUTP Nick-végjelölés) határoztuk meg az Apoptag plusPeroxidase in Situ Apoptosis Detection Kit (S7101, Millipore Sigma, MA, USA) utasításai alapján. Az apoptotikus sejteket 25 mezőben elemeztük, 1000-szeres nagyítással, hogy megkapjuk a sejt/mm2-ben kifejezett végső értéket.

5.6. Statisztikai analízis

Az LoP és HiP csoportok közötti különbségeket független Student-teszttel vagy Mann-Whitney teszttel vizsgáltuk ennek megfelelően. A változók közötti kapcsolatokat Spearman korrelációs együtthatóval vizsgáltuk. Az adatokat átlag ± SE formában adjuk meg, hacsak másként nem jelezzük. A p-értéke<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">

Finanszírozás:Ezt a tanulmányt a Sáo Paulo Research Foundation (FAPESP – Grant #. 2010/05409-6) támogatta. Moysest, Jorgettit, Zatzt és Eliast a CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnol6gico) támogatja, de ennek a pénzügyi támogatásnak nem volt szerepe a dolgozat megírásában.

Az intézményi felülvizsgálati bizottság nyilatkozata:Ezt a vizsgálatot a helyi etikai felülvizsgálati bizottság ajánlásaival összhangban végezték el. A protokollt a Comite detica em Pesquisa do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da USP hagyta jóvá (CEUA, folyamat #090/10 és a jóváhagyás dátuma: 2010. augusztus 10.). Minden kísérleti eljárás szigorúan követte a laboratóriumi állatok manipulálására és gondozására vonatkozó nemzetközi szabványokat.

Adatelérhetőségi nyilatkozat:A jelen tanulmányban bemutatott adatok a megfelelő szerzőtől kérésre rendelkezésre állnak.

Köszönetnyilvánítás:A szerzők köszönetet mondanak Wagner Domingueznek szakértő technikai segítségéért. Érdekellentét: A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Hivatkozások

1. Hill, NR; Fatoba, ST; Oké, JL; Hirst, JA; O'Callaghan, CA; Lasserson, DS; Hobbs, FD A krónikus betegségek globális prevalenciájavesebetegség – szisztematikus áttekintés és metaanalízis. PLoS ONE 2016, 11, e0158765.

2. Wen, CP; Chang, CH; Tsai, MK; Lee, JH; Lu, PJ; Tsai, SP; Wen, C.; Chen, CH; Kao, CW; Tsao, CK; et al. Cukorbetegség koraiveseaz érintettség 16 évvel lerövidítheti a várható élettartamot. Kidney Int. 2017, 92, 388–396.

3. Kakinuma, Y.; Kawamura, T.; Bills, T.; Yoshioka, T.; Ichikawa, I.; Fogo, A. Az angiotenzin-gátlás vérnyomás-független hatása a krónikus veseelégtelenség vascularis elváltozásaira.VeseInt. 1992, 42, 46–55.

4. Sült, LF; Gyümölcsöskert, TJ; Kasiske, BL Lipidcsökkentés hatása a vesebetegség progressziójára: metaanalízis.VeseInt. 2001, 59, 260–269.

5. Ishidoya, S.; Morrissey, J.; McCracken, R.; Reyes, A.; Klahr, S. Az angiotenzin II receptor antagonista enyhíti az egyoldali ureterelzáródás által okozott vese tubulointerstitialis fibrózist.VeseInt. 1995, 47, 1285–1294.

6. Audigier, JC; Kanjanbuch, T.; Ma, LJ; Brown, NJ; Fogo, AB A meglévő glomerulosclerosis regressziója az aldoszteron gátlásával. J. Am. Soc. Nephrol. 2005, 16, 3306–3314.

7. Nath, KA; Kren, SM; Hostetter, TH Étrendi fehérje korlátozás patkányok megállapított vesekárosodásában. A glomeruláris kapilláris nyomás szelektív szerepe a progresszív glomeruláris diszfunkcióban. J. Clin. Investig. 1986, 78, 1199–1205.

8. Brenner, BM; Meyer, TW; Hostetter, TH Az étrendi fehérjebevitel és a progresszív jellegevesebetegség: A hemodinamikailag közvetített glomeruláris károsodás szerepe a progresszív glomeruláris sclerosis patogenezisében az öregedésben, a veseablációban és az intrinsic vesebetegségben. N. Engl. J. Med. 1982, 307, 652–659.

9. Bellizzi, V. Fehérjeszegény diéta vagy táplálkozási terápia krónikus betegségbenvesebetegség? Blood Purif. 2013, 36, 41–46.

10. Kusano, K.; Segawa, H.; Ohnishi, R.; Fukushima, N.; Miyamoto, K. Az alacsony fehérje- és alacsony foszfortartalmú étrend szerepe a krónikus betegség progressziójábanvesebetegség urémiás patkányokban. J. Nutr. Sci. Vitam. 2008, 54, 237–243.

11. Neves, KR; Graciolli, FG; dos Reis, LM; Pasqualucci, CA; Moyses, RM; Jorgetti, V. A hiperfoszfatémia káros hatásai a szívizom hipertrófiára, a vesefunkcióra és a csontokra veseelégtelenségben szenvedő patkányokban.VeseInt. 2004, 66, 2237–2244. [CrossRef] [PubMed]

12. Finch, JL; Lee, DH; Liapis, H.; Ritter, C.; Zhang, S.; Suarez, E.; Ferder, L.; Slatopolsky, E. A foszfát restrikció jelentősen csökkenti a mortalitást urémiás patkányokban, akiknél megállapított vaszkuláris meszesedés. Kidney Int. 2013, 84, 1145–1153.

13. Cupisti, A.; Blasco, P.; D'Alessandro, C.; Giannese, D.; Sabatino, A.; Fiaccadori, E. A maradék vesefunkció védelme és táplálkozási kezelés: Első lépés stratégia az urémiás toxinok csökkentésére végstádiumú vesebetegségben szenvedő betegeknél. Toxins 2021, 13, 289.

14. Yan, B.; Su, X.; Xu, B.; Qiao, X.; Wang, L. Az étrendi fehérjekorlátozás hatása a krónikus betegség progressziójáravesebetegség: szisztematikus áttekintés és metaanalízis. PLoS ONE 2018, 13, e0206134. [CrossRef] [PubMed]

15. Klahr, S.; Levey, AS; Beck, GJ; Caggiula, AW; Hunsicker, L.; Kusek, JW; Striker, G. Az étrendi fehérjekorlátozás és a vérnyomásszabályozás hatása a krónikus vesebetegség progressziójára. Az étrend módosítása a vesebetegség vizsgálati csoportjában. N. Engl.

J. Med. 1994, 330, 877–884. [CrossRef]

16. Hu, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Adams-Huet, B.; Paek, J.; Hill, K.; Shelton, J.; Amaral, AP; Faul, C.; Taniguchi, M.; et al. A klotho és a foszfát a patológiás urémiás szív-remodelling modulátorai. J. Am. Soc. Nephrol. 2015, 26, 1290–1302.

17. Hu, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Zhang, J.; Pavlenco, A.; Liu, S.; Sidhu, S.; Huang, LJ; Moe, OW Az eritropoetin receptor a Klotho által kiváltott citoprotekció downstream effektora. Kidney Int. 2013, 84, 468–481.

18. Shi, M.; Flores, B.; Gillings, N.; Bian, A.; Cho, HJ; Yan, S.; Liu, Y.; Levine, B.; Moe, OW; Hu, az MC alphaKlotho az autofágia aktiválásával enyhíti az AKI CKD-vé való progresszióját. J. Am. Soc. Nephrol. 2016, 27, 2331–2345.

19. Ding, Y.; Kim, S.; Lee, SY; Koo, JK; Wang, Z.; Choi, ME Az autofágia szabályozza a TGF-béta expressziót és elnyomjaveseegyoldali ureterelzáródás által kiváltott fibrózis. J. Am. Soc. Nephrol. 2014, 25, 2835–2846.

20. Moustakas, A.; Souchelnicskyi, S.; Heldin, CH Smad szabályozása TGF-béta jelátvitelben. J. Cell Sci. 2001, 114, 4359–4369.