A genetikai tesztelés szerepe a vesebetegségben szenvedő gyermekbetegek diagnosztikai munkafolyamatában: egyetlen intézmény tapasztalata
Oct 18, 2023
AbsztraktCéljaAz öröklött vesebetegségek a gyermekek veseelégtelenségének vezető okai közé tartoznak, ami megnövekedett halálozáshoz, magas egészségügyi költségekhez és szervátültetés szükségességéhez vezet. A következő generációs szekvenálási technológiák segíthetnek a ritka monogén állapotok diagnosztizálásában, lehetővé téve az optimalizált orvosi kezelést és terápiás választást.
Módszerek Klinikai exome szekvenálást (CES) végeztek 191 gyermekből álló csoporton, egyetlen intézményből, majd Sanger szekvenálást az azonosított változatok megerősítésére és a családi szegregációs vizsgálatokhoz. Eredmények Minden betegnél vesebetegség klinikai diagnózisa volt: a fő betegségkategóriák a glomeruláris betegségek (32,5%), ciliopathiák (20,4%), CAKUT (17,8%), nephrolithiasis (11,5%) és tubuláris betegség (10,5%) voltak. A betegek 7,3%-a más betegségekben szenvedett. A CES és Sanger validáción alapuló meggyőző genetikai tesztet a betegek 37,1%-ánál végeztek. A legmagasabb kimutatási arányt a ciliopathiák (74,4%), majd a nephrolithiasis (45,5%) és a tubuláris betegségek (45%) követték, míg a legtöbb glomeruláris betegség és a CAKUT diagnosztizálatlan maradt. Következtetések Az eredmények azt mutatják, hogy a krónikus vesebetegségben szenvedő gyermekek diagnosztikai munkafolyamatában következetesen alkalmazott genetikai vizsgálat (i) megerősítheti a klinikai diagnózist, (ii) korai diagnózist biztosíthat öröklött állapotok esetén, (iii) és a korábban fel nem ismert betegségek genetikai oka. betegségek és (iv) személyre szabott transzplantációs programok.
Kulcsszavak Klinikai exome szekvenálás, Következő generációs szekvenálás,Vesebetegségek, Genetikai tesztelés, Gyermekgyógyászati kohorsz
KATTINTSON IDE, HOGY CISTANCHE FORVÉGSTÁDIUMÚ VESEBETEGSÉG
Bevezetés
A gyermekkori nephropathiák a klinikai megjelenés, az evolúció és a terápiás lehetőségek tekintetében nagyon különböző betegségeket foglalnak magukban [1–4]. A krónikus vesebetegségben (CKD) szenvedő gyermekek hozzávetőleg 30%-a szenved monogén állapotban, ez az arány növekszik, ha a végstádiumú vesebetegségben (ESRD) szenvedő gyermekeket vesszük figyelembe [5, 6]. Sok ilyen gyermek nem diagnosztizálódik a transzplantáció idején [4, 6, 7]. A diagnózis felállítása ezeknél a betegeknél nemcsak egy diagnosztikus ódüsszeia végét jelenti, hanem számos előnnyel jár a prognózis, a kezelés és a kezelés szempontjából.
Úttörő tanulmányok következetesen kimutatták, hogy a következő generációs szekvenálási (NGS) technikák alkalmazása jelentősen javította az öröklött vesebetegségben (IKD) szenvedő betegek diagnosztikai hozamát [8]. Az utóbbi időben az NGS széles körben elterjedt alkalmazása ésszerű időn belül és megfizethető költségek mellett elérhetővé tette a genetikai diagnózist, ami felveti a kérdést, hogy be kell-e építeni a rutin diagnosztikai munkafolyamatba, és mikor [5].
A gyermekek genetikai diagnózisa különböző szempontok szerint rendkívül fontos. Az első az, hogy releváns lehet a betegség klinikai megközelítésében, tipikus példa a nefrotikus szindrómáké, ahol a podocitákkal kapcsolatos gének szerkezeti változatainak azonosítása az immunszuppresszív terápiák ellen szól, amelyeket egyébként rutinszerűen alkalmaznának több ideig. hónap [9]. A második az, hogy nagyon fontos lehet a gyermek családja és más olyan tagok azonosítása szempontjából, akik a jövő generációkra átvihető változatot hordozzák. Miután egy patogén variánst azonosítottak egy próbaban, a családtagok kaszkádvizsgálata és a variánshordozók genetikai tanácsadása a klinikai genetika szokásos gyakorlatát jelenti [5]. A harmadik az, hogy a patogén változat ismerete elengedhetetlen a transzplantációs kontextusban, ahol a donor rokon lehet. Valójában kritikus fontosságú az azonos variáns(ok) jelenlétének kizárása a szervdonorban, valamint kritikus fontosságú az összes olyan családtag azonosítása, akinek potenciálisan transzplantációra van szüksége. A negyedik az, hogy egyes betegségek a szervátültetést követően nagy kockázatot jelentenek a relapszusra, mint például a fokális szegmentális glomerulosclerosis [10], vagy ezek kimenetele javítható az elvégzendő transzplantáció személyre szabottabb megválasztásával, például primer esetben. hyper oxaluria, ahol a kombinált vese-máj transzplantáció jobb eredményt eredményezhet [11]. Végül, a betegség egyértelmű diagnózisa hasznos lehet a páciens számára, hogy részt vegyen a klinikai vizsgálatokban, és részesüljön az új kezelési lehetőségekből [12, 13].
2018 végén gyermeknefrológusok és genetikusok együttműködésében megkezdtük a genetikai vizsgálatokat olyan monogén állapotok kimutatására, amelyek potenciálisan ESRD-hez és ezáltal transzplantációhoz vezethetnek. Kórházunk a legnagyobb Északnyugat-Olaszországban, körülbelül 5 millió embert számlál. Kiválasztottunk egy "egy méret mindenkinek megfelelő" típusú elemzést, a klinikai exóma szekvenciájával, azaz körülbelül 6700 génnel, amelyek monogén állapotokhoz kapcsolódnak, az elemzést a klinikai gyanúhoz szabott génpanelekre összpontosítva, és ezáltal korlátozva a véletlenszerű leleteket és csökkenti a szekvenciaelemzés idejét.
Összességében ennek a folyamatnak a alkalmazásával a publikált adatoknak megfelelő diagnosztikai hozamot kaptunk, a különböző klinikai gyanúk között némi heterogenitás mellett, ahogy az várható volt. A kapott eredmények megerősítik a rutin genetikai tesztelés és tanácsadás fontosságát a nephropathiában szenvedő gyermek betegek diagnosztikai munkafolyamatában. Valójában a kiváltó variánsok azonosítása kritikus fontosságú klinikai kezelésük és potenciálisan az optimális élődonor-kiválasztás szempontjából.
Anyagok és metódusok
Betegek toborzása
A vizsgálat egy 191 egymást követő gyermekgyógyászati betegből álló diagnosztikai csoporton alapult (életkor a felvételkor 18 év alatti), akiket a Regina Margherita Gyermekkórház Gyermeknefrológiai, Dialízis- és Transzplantációs Osztályai vettek fel, és az Immunogenetikai és Transzplantációs Biológiai Szolgálathoz irányították. genetikai elemzés. A vizsgálatban részt vevő összes beteg írásos beleegyező nyilatkozatot adott, amelyet mindkét szülő aláírt, amikor csak lehetséges.
Mintaelőkészítés, szekvenálás és bioinformatikai elemzések
A perifériás vérből való nukleinsav-kivonást, a DNS-minőség elemzését, a könyvtár-előkészítést és a szekvenálást a korábban leírtak szerint végeztük [14]. A szekvenálásból nyert nyers adatokat FASTQ-fájlokba konvertálták, majd igazították az Enrichment 3.1.0 vagy a DRAGEN Enrichment Tools (Illumina) eszközhöz, és a TruSight One Expanded v2.{5}} jegyzékben a Homo Sapiens UCSC GRCh37 genom használatával lettek leképezve. hivatkozás az egynukleotidos variánsok, a másolatszám-változatok (CNV) és a fájlok szerkezeti változatainak beszerzésére. A kópiaszám azonosításához 5 különböző beteg szekvenálási adataiból készült alapvonalat használtuk, amelyek mindegyike negatív volt a CNV-re (a tömb összehasonlító genomiális hibridizációs adatai szerint). Ez a megközelítés lehetővé teszi a CNV kimutatását még a szexuális kromoszómákban is, mivel a referenciacsoportot női és férfi egyedekből állították össze, és a vizsgálandó alany nemét mindig az illesztési fázisban határozták meg. A variánshívás és a prioritás meghatározása meghatározott kritériumok szerint történt. Az olvasási illesztést és az érdeklődésre számot tartó gén exonjainak lefedettségét az Integrative Genomics Viewer IGV ellenőrizte és jelenítette meg, amely ingyenesen elérhető a UC San Diego-i Egyetemen (University of California), valamint a Broad Institute of MIT és a Harvard Egyetemen (Boston) (https://software.broadinstitute. org/szoftver/igv/). A végső genetikai jelentésbe bevonandó változatokat az American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) kritériumai szerint osztályozták.
Az in silico génbetegséglista létrehozása
A klinikai gyanú alapján határoztuk meg azokat a géneket, amelyeket figyelembe kell venni a variáns azonosításhoz és a prioritások meghatározásához. In silico génlistákat állítottunk elő (i) különböző adatbázisokból származó adatokkal, a genotípus és a fenotípus közötti korrelációval (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards), valamint (ii) az irodalomból származó adatokkal. A rendelkezésre álló génlistákat évente egyszer frissítik a gén-betegség társulás új bizonyítékai alapján.
Sanger szekvenálás és multiplex ligálástól függő próbaamplifikáció (MLPA)
Sanger szekvenálást és/vagy MLPA elemzéseket végeztek az NGS által azonosított variánsok validálására és a családi szegregációs vizsgálatokhoz. Röviden, a DNS-t a proband perifériás vér egy második független aliquot részéből és a szülőkből extraháltuk. A kérdéses DNS-régiókat PCR-rel amplifikáltuk specifikus kísérleti körülmények között. Az amplifikált régiók tisztaságát és specificitását 0,8 vagy 1,5%-os agaróz géllel ellenőriztük. Az amplifikált PCR-termékeket ezután Sanger-szekvenáltuk ugyanazokkal a primerekkel. A PKD1 variánsok esetében a validálást egy hosszú távú PCR-rel, majd egy beágyazott PCR-rel végeztük, hogy elkerüljük a pszeudogénekből származó következtetéseket.
Eredmények
A genetikai elemzési eredmények visszaküldésének kritériumainak meghatározása
We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 gén, amelyek mindegyike részt vesz a vesebetegségek különböző formáiban [14]. Ehhez a vizsgálathoz olyan alpanelekkel valósítottunk meg elemzést, amelyek a gyanú adott klinikai kategóriájára összpontosítottak (pl. CAKUT, glomerulopathia, tubulopathia stb.), és előzetesen meghatároztuk a gének egy meghatározott csoportját az elemzéshez. Ez a megközelítés korlátozta az elemzett gének számát, leegyszerűsítette az elemzéseket és csökkentette a véletlenszerű leletek számát. Csak akkor, ha a releváns panel(ek)et tartalmazó analitikai mező végén a genetikai eredmény negatív volt, és (i) a klinikai fenotípus nem egyértelműen jelezhető, vagy (ii) átfedésben volt a különböző betegségkategóriákkal, akkor a genetikai elemzést kiterjesztették az ún. "vese teljes lista vagy renomema", egy szuperpanel, amely az alpanelekben szereplő összes gént tartalmazza.
Első lépésként meghatároztuk az NGS eredmények értelmezésének kritériumrendszerét. A klinikai exome szekvenálás (CES) és az adatok összehangolása után az elemzési folyamatot meghatároztuk a releváns változatok szűrésére. Konkrétan, klinikai gyanú alapján az azonosított változatokat a különböző betegségek makrokategóriáira jellemző in silico génlisták alapján szűrtük. Az illesztési mechanizmust nem befolyásoló szinonim változatokat vagy az illesztési régión belül nem leképező intron variánsokat kizártuk, csak a nem szinonim, értelmetlen, kereteltolásos és illesztést befolyásoló változatokat figyelembe véve. Tíz, csak ritka variánst (gyakorisága kevesebb, mint 1% a populációban) és olyan variánsokat vettek figyelembe, amelyek allélgyakorisága a páciensben legalább 0,2 és lefedettsége legalább 20 leolvasás. A fennmaradó variánsokat annotáltuk és tovább kurátoroztuk (i) az öröklődés módja, (ii) nukleotid konzerváció, (iii) fehérjehatás, különböző adatbázisok felhasználásával a pontszámok ellenőrzésére, és (iv) irodalom, ha van ilyen. Ekkor a beszűrt változatokat egy úgynevezett "technikai jelentésben" sorolták fel. A technikai jelentést egy orvosgenetikus értelmezte, hogy elkészítse a végső genetikai jelentést a páciens és családja számára. A genetikai konzultáció során családi szegregációs vizsgálatokat javasoltak, hogy (i) megerősítsék a probandban lévő változatokat, és (ii) a nem okozati jellegű változatokat a családban való szegregációjuk alapján vonják be/kizárják (1. ábra).
Ezen kritériumok elfogadásával a genetikai jelentések három különböző kategóriáját tudtuk meghatározni. Először is egy "meggyőző jelentés", amely tartalmazta a patogén (C5) és a valószínű patogén (C4) változatokat. Az ismeretlen jelentőségű (C3) variánsokról szóló jelentések csak akkor tekinthetők meggyőzőnek, ha teljes mértékben kompatibilisek a klinikai képpel, és ha a családi szegregációs vizsgálatok megerősítették lehetséges szerepüket. Másodszor, egy „bizonytalan jelentés”, amely a CES által azonosított C3 variánsokat tartalmazta, amelyek még nem vagy nem validálhatók a családi szegregációs vizsgálatok keretében, vagy olyan C4/C5 variánsokat, amelyek nem voltak teljesen összhangban a klinikai fenotípussal. Harmadszor, egy „nem meggyőző jelentés”, amely (i) negatív CES-elemzést tartalmazott, ami azt jelenti, hogy az NGS nem azonosított változatokat; (ii) egyetlen variáns recesszív génekben; és (iii) a klinikai fenotípussal nem összhangban lévő C3 variánsok, amelyeket akkor azonosítottak, amikor az elemzést valamennyire kiterjesztettékvesebetegséggel kapcsolatos gének(1. ábra).
A felvett kohorsz főbb jellemzői
Ez a tanulmány egy 191 (0–18 éves) gyermekbetegből álló csoportot ír le, akiket a Gyermeknephrológiai Osztály egymást követően utalt be genetikai elemzésre 2018 novembere és 2022 májusa között, és évente átlagosan 50 új beteget vonnak be. . A genetikai vizsgálat kritériumai a következők voltak: (i) a vesebetegség pozitív családi anamnéziséhez társuló nefropátia vagy (ii) monogén állapot klinikai gyanúja, vagy (iii) a monogén állapot kizárásának szükségessége (mint a nefrotikus szindrómák esetében, ahol megkülönböztetés történt monogén és nem monogén betegségek klinikailag jelentősek a prognózis és a kezelés szempontjából).
A csoportot a klinikai gyanú alapján osztották fel, 6 különböző betegség makrokategóriát figyelembe véve: vese- és húgyúti veleszületett rendellenességek (CAKUT; n=34), ciliopathiák (n=39), glomerulopathia (n=62), nephrolithiasis (n=22), tauopathiák (n=20) és egyéb betegségek, amelyek szindrómás fenotípusokat is tartalmaztak (n=14). A CAKUT és a tubulopathiák kivételével, amelyek egyenlő eloszlást mutattak a nők és a férfiak között, az összes többi kategóriában a férfiak előfordulása volt megfigyelhető (2a. ábra). A toborzás életkorát tekintve nem mutatkozott szignifikánsan eltérő megoszlás a különböző csoportok között, az átlagéletkor 6,7 és 10 év között változott az "Egyéb betegségek" és a glomerulopathiák esetében. A medián életkort tekintve azonban a CAKUT betegségek mutatták a legalacsonyabb értéket (4,6 évesek), a veleszületett fenotípus mellett. Etnikai szempontból a vizsgált betegség makrokategóriától függetlenül a legtöbb beteg európai volt, ezt követi az afrikai, és csak néhány beteg volt ázsiai, latin-amerikai vagy keresztezett (2b. ábra). A kohorszban csak 8 betegnek voltak rokon szülei.
1. ábra Genetikai adatelemzési folyamat és a variánsok felvételének kritériumai. A változat azonosítására és priorizálására elfogadott elemzési folyamat sematikus ábrázolása, beleértve az összes szűrési és kiszűrési feltételt. Az eredményül kapott változatokat a végső genetikai jelentés tartalmazza. Lehetőség szerint változat(ok) validálási és családi szegregációs vizsgálatokat végeztek. A genetikai jelentéseket a jelzett kritériumok alapján meggyőző, bizonytalan vagy nem meggyőző kategóriába sorolták. Ezen osztályozás alapján számítottuk ki a következő generációs szekvenálási (NGS) munkafolyamatunk diagnosztikai sebességét. 1 kg: 1000 genom adatbázis; Alt fr: megváltozott frekvencia; C3: ismeretlen jelentőségű változat; C4: valószínű patogén variáns; C5: patogén változat; AR: autoszomális recesszív
Végül, ha figyelembe vesszük a vesebetegségek családi anamnézisét, külön-külön figyelembe véve a férfiakat és a nőket, a pozitív és negatív esetek közötti megoszlás heterogenitása nyilvánvaló volt a különböző betegségkategóriákat figyelembe véve. Összességében a felvett kohorsz nagy részét és a nemtől függetlenül nem jellemezte a pozitív családi anamnézis, amint azt a CAKUT, glomerulopathiák, tauopathiák és más vesebetegségek mutatják. A ciliopathiákban és a nephrolithiasisban azonban az esetek jelentős hányada pozitív családot mutatott be, a nőstények és a férfiak közötti megoszlás eltérő volt (22 esetből 13 ciliopathia és 12 esetből 5 nephrolithiasis; 2c. ábra).
Klinikai szempontból a kohorsz meglehetősen heterogén volt, beleértve a különböző elsődleges betegségeket (2d. ábra). Közülük a leggyakrabban visszatérő klinikai gyanú a policisztás vesebetegség (n=27), CAKUT (n=25), nefrotikus szindróma (n=19), fokális szegmentális glomerulosclerosis (FSGS; n) volt. =14) és Alport-szindróma (n=13; 2d. ábra).
A Wecistanche támogató szolgáltatása – Kína legnagyobb ciszterna exportőre:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel.:+86 15292862950
Vásároljon további specifikációkért:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
KATTINTSON IDE, HOGY TERMÉSZETES SZERVES CISTANCHE KIVONATOT SZEREZZE MEG 25% ECHINACOSIDET ÉS 9% AKTEOZIDOT A VESEFERTŐZÉSRE
