A tirozin-kináz C-Abl potencírozza az interferon által közvetített vírusellenes immunitást a STAT1 foszforilációjával
Nov 06, 2023
ÖSSZEFOGLALÁS
A jelátalakító és a transzkripciós (STAT) család aktivátorának interferon (IFN) által indukált aktiválása fontos esemény az antivirális immunitásban. Itt megmutatjuk, hogy a c-Abl és Arg nem receptor kinázok közvetlenül kölcsönhatásba lépnek a STAT1-gyel, és fokozzák a STAT1 foszforilációját az Y701-en. A c-Abl/Arg a Janus kinázoktól függetlenül közvetítheti a STAT1 foszforilációját IFNg hiányában, és fokozhatja az IFNg által közvetített STAT1 foszforilációt. Ezenkívül a STAT1 dimerizációját, a nukleáris transzlokációt és a downstream géntranszkripciót a c-Abl/Arg szabályozza. A c-Abl/Arg (abl1/abl2) hiány jelentősen elnyomja az antivirális válaszokat a hólyagos szájgyulladás vírussal fertőzött sejtekben. A vivőanyaghoz képest a c-Abl/Arg szelektív inhibitor AMN107 beadása szignifikánsan megnövekedett mortalitást eredményezett humán influenzavírussal fertőzött egerekben. Vizsgálatunk azt mutatja, hogy a c-Abl alapvető szerepet játszik a STAT1 aktivációs jelátviteli útvonalában, és fontos megközelítést biztosít az antivirális immunitás szabályozásában.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
BEVEZETÉS
Az interferonok (IFN-ek) kulcsszerepet játszanak a vírusfertőzés elleni veleszületett immunitásban és az immunfelügyeletben, mivel szabályozzák a Janus-kinázok (JAK-ok), valamint a jelátalakító és a transzkripció aktivátora (STAT) aktiválását, valamint átprogramozzák a sejtes génexpressziót (Stark és Darnell, 2012). Az IFN-eknek a megfelelő receptorukhoz való kötődése három kapcsolódó JAK (JAK1, JAK2 és TYK2) keresztfoszforilációját és STAT-ok toborzását eredményezi, lehetővé téve, hogy ezeknek a STAT-oknak a C-terminális végei közelében lévő egyetlen tirozinmaradékokat JAK-ok foszforilálják. (Platanias, 2005). Az aktivált STAT-ok ezután dimerizálódnak, a sejtmagba vándorolnak, és az IFN-re reagáló gének promótereihez kötődnek, hogy indukálják azok transzkripcióját. A STAT-ok tirozin foszforilációja az IFN jelátvitel JAK-STAT útvonalának alapvető lépése, és részt vesz a STAT dimerizációjában, a nukleáris transzlokációban és a DNS-kötésben (Stark és Darnell, 2012). Így a tirozin foszforilációja STAT aktiváló kapcsolóként működik. A JAK gének egerekben történő célzott megszakításával nyert bizonyítékok arra utalnak, hogy a JAK-ok a legfontosabb STAT tirozin kinázok (Villarino et al., 2017). Ugyanakkor kimutatták, hogy a STAT1, STAT3 és STAT5 tirozinmaradékai JAK-hiányos sejtekben is foszforilálódnak az epidermális növekedési faktor és a vérlemezkékből származó növekedési faktor receptorok által, amelyek belső tirozin kináz aktivitással rendelkeznek (Leaman et al., 1996; Vignais et al. ., 1996). Ezen túlmenően a STAT-ok konstitutív aktiválódását figyelték meg onkogén tirozin-kinázokat, például v-Src, v-Abl és BCR-Abl expresszáló transzformált sejtekben, de hogy a STAT-ok ezeknek a kinázoknak a közvetlen szubsztrátjai-e, azt még meg kell határozni (Danial és Rothman). , 2000; Reddy et al., 2000). A c-abl (abl1) gén által kódolt emlős Abelson kináz c-Abl és az arg (abl2) gén által kódolt Arg Abl-val rokon génfehérje a sejten belüli nem receptor tirozin kinázok családjának tagjai, amelyek több sejtfolyamathoz szükségesek, beleértve a proliferációt, apoptózist, adhéziót, sejtmigrációt és stresszválaszokat (Bradley és Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber et al., 2013; Pendergast, 2002). A c-Abl kináz aktivitása normál fiziológiás körülmények között szigorúan szabályozott. A retrovírus transzdukciós és kromoszómális transzlokációs események a v-Abl vagy BCR-Abl, az Abl onkogén formájának expresszióját eredményezik (Advani és Pendergast, 2002). Ezen túlmenően, a c-abl gén célzott deléciója egerekben az immunrendszer diszfunkciójával kapcsolatos pleiotróp fenotípusokat eredményez, beleértve a nagy perinatális letalitást, a lép- és csecsemőmirigy-sorvadást, a limfopéniát és a fertőzésekre való fokozott fogékonyságot (Schwartzberg et al., 1991). Ezenkívül a BCR-Abl-pozitív krónikus mieloid leukémia (CML) STI571 (imatinib) és AMN107 (nilotinib) Abl-gátlókkal történő kezelése a betegek egy részében immunszuppresszióval jár (Dietz és mtsai, 2004; Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a cAbl szerepet játszik a TCR (T-sejt-receptor) és BCR- (B-sejt-receptor) által közvetített jelátvitel, fejlődés, proliferáció és citokintermelés szabályozásában (Gu et al., 2009; Pendergast, 2002). Silberman és mtsai, 2008). Az Abl-hiányos egerek szintén csökkentett számú T/B-sejteket mutatnak (Gu és mtsai, 2009; Liberatore és Goff, 2009; Schwartzberg és mtsai, 1991). Azonban a c-Abl hiányában vagy gátlásában fellépő károsodott immunitás mögött meghúzódó mechanizmusok továbbra is megfoghatatlanok. Széles körben beszámoltak arról, hogy a JAK-STAT jelátviteli útvonal elengedhetetlen a BCR-Abl-indukált transzformációhoz (Carlesso és mtsai, 1996; Danial és mtsai, 1998; de Groot és mtsai, 1999). Ezért érdemes megvizsgálni, hogy a JAK-STAT is hozzájárulhat-e a c-Abl által érintett veleszületett immunitáshoz. Itt beszámolunk arról, hogy a STAT1 JAK-független módon kölcsönhatásba lép a c-Abl-lel, és azt foszforilálja, ami szabályozza a STAT1 dimerizációját, nukleáris lokalizációját és downstream géntranszkripcióját. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a JAK kináz mellett a c-Abl nélkülözhetetlen a STAT1 teljes aktiválásához és az azt követő IFN által közvetített antivirális válaszokhoz.
A cistanche tubulosa előnyei- erősíti az immunrendszert
Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez
【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
EREDMÉNYEK
Az interferon gamma-aktivált szekvenciájának downstream gének transzkripcióját az Abl kináz szabályozza
Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4-et c-abl/arg kettős kiütésben (DKO) és WT MEF-ben azonosítottak, amelyek közül 960 volt felfelé és 784 leszabályozott (1A ábra, bal). E DEG-ek lehetséges sejtfunkcióinak és kapcsolódó útvonalainak további vizsgálata érdekében génontológiai (GO) elemzést végeztünk (a biológiai folyamat, a molekuláris funkció és a sejtkomponens kifejezésére) (S1A ábra). A c-Abl és Arg által leszabályozott gének főként vírusvédelmi válaszokkal (GO: 0009615, GO: 0051607 és GO: 0045071) és immunválaszokkal (GO: 0002376, GO: 0045087) kapcsolódnak. További elemzések kimutatták, hogy az IFN-specifikus gének (Liu és mtsai, 2012) feldúsultak a csökkentett gének között (1A, jobb oldali és S1B ábra). A differenciális expressziós profilok validálásához az antivirális gének, köztük a cxcl10, psmb9, tap1 és isg15 transzkriptumszintjeit kvantitatív, valós idejű reverz transzkripciós-polimeráz láncreakciós (RT-PCR) tesztekkel határoztuk meg, és a psma5 szintjére normalizáltuk. , amit a c-Abl nem nagyon szabályoz. A WT MEF-ekkel összehasonlítva a c-abl / arg / MEF-ek szignifikánsan alacsonyabb transzkriptumszintet mutattak ezekben a génekben, de a DKO által kiváltott csökkenéseket a c-Abl-mentés dózisfüggő módon teljesen megfordította (1B és S1C ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az IFN-indukált gének egy paneljét a c-Abl és az Arg szabályozza. Az IFN-re adott válaszként az Abl-kinázok által szabályozott kulcsfontosságú transzkripciós elemek vizsgálatára egy luciferáz-riporter rendszert építettünk fel az IFNg által szabályozott tap1/psmb9 megosztott kétirányú promoter alapján (1C. ábra). Ahogy az várható volt, az AMN107 c-Abl/Arg-szelektív inhibitor szignifikánsan gátolta a tap1 promoter (piros) transzkripciós aktivitását (1D. ábra). Nevezetesen, ellentétben az NFkB-ható (kék) vagy IFN konszenzus szekvencia (sárga) elemek deléciójával, az AMN107-kezelésnek alig volt hatása a tap1 promóter aktivitására, amikor a gamma-aktivált szekvencia (GAS) elemet (zöld) törölték (1D ábra). ). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a STAT1-célzott GAS cisz-elem részt vesz a c-Abl által szabályozott tap1 transzkripcióban, ami határozottan arra utal, hogy a STAT1 felelős az IFN-re reagáló génexpresszió c-Abl által közvetített szabályozásáért.
A c-Abl közvetlenül kölcsönhatásba lép a STAT1-gyel
Az IFN-indukált TAP1 expressziót a c-Abl szabályozza, valószínűleg a STAT1-en keresztül, ami arra utal, hogy a STAT1 kapcsolatba hozható a c-Abl-lel. Ennek a hipotézisnek a megerősítésére az MCF-7 sejtek lizátumait anti-c-Abl immunprecipitációnak vetettük alá, majd immunblotot anti-STAT1 antitesttel. A STAT1 jelen volt az anti-c-Abl-ben, de nem volt jelen az IgG immunprecipitátumokban (2A. ábra). Ezután a 293T sejteket Myc-cAbl-vel és Flag-STAT1-gyel vagy Flag-Vector-ral kotranszfektáltuk kontrollként. A Myc-c-Abl jelenléte a Flag-STAT1-et együtt expresszáló, de a Flag-Vector-t nem termelő sejtekből előállított anti-Flag immunprecipitátumokban összefüggést mutatott az ektopikusan expresszált Myc-c-Abl és a Flag-STAT1 között (2B. ábra, bal). Hasonló eredményt kaptunk egy reciprok kísérletben is (2B. ábra, jobbra). Ezenkívül az Abl család másik tagja, az Arg (Abl2), amely N-terminális doménjében (NTD) nagymértékben homológ a c-Abl-lel, szintén kölcsönhatásba lép a STAT1-gyel (S2A ábra).
1. ábra: A c-Abl GAS elemeken keresztül szabályozza az IFN-re reagáló gének promótereit
Ezután a Flag-c-Abl-t expresszáló 293T-sejtekből készített lizátumokat agarózzal konjugált GST-STAT1-gyel vagy önmagában GST-vel inkubáltuk, és a Flag-c-Abl-t a GST-STAT1-ben detektáltuk, de a GST-adszorbátumokban nem (2C. ábra). A sejtlizátumokban lévő egyéb komponensek által közvetített közvetett kötődés kizárására a Flag-c-Abl-t expresszáló 293T-sejtekből előállított anti-Flag immunprecipitátumokat SDS-PAGE-nek vetettük alá (nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis), és a fehérjéket átvittük PVDF (polivinilidén-fluorid) membránt, majd oldható GST-STAT1-gyel vagy GST-vel (kontrollként) blottoljuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a GST-STAT1, de a GST nem, közvetlenül kötötte a c-Abl-t in vitro (2D. ábra). A c-Abl-kötő domén meghatározásához agarózzal konjugált és GST-vel fuzionált teljes hosszúságú vagy csonka STAT1-et (2E. ábra, felső panel) inkubáltunk a Flag-c-Abl-t expresszáló 293T-sejtek lizátumaival. Az adszorbátumok anti-Flag antitesttel végzett immunoblot-analízise kimutatta, hogy a STAT1 577-750. aminosavai, amelyek az SH2 domént és a transzaktivációs domént tartalmazó régiót alkotják, felelősek a c-Abl kölcsönhatásért (2E ábra, alsó panel). . Hasonlóképpen, az anti-Flag antitesttel immunprecipitált Flag-STAT1-et SDS-PAGE-val frakcionáltuk, és PVDF membránra vittük. Ezután a membránt oldható GST-c-Abl SH3-mal vagy GST-c-Abl SH2-vel és csak GST-vel blottoltuk. Az eredmény azt mutatta, hogy a c-Abl SH3 domén volt a STAT1 asszociációért felelős fő domén (2F ábra). Ezenkívül az endogén c-Abl és a STAT1 in situ kölcsönhatását Duolink proximity ligation assay (PLA) segítségével értékeltük. A STAT1:c-Abl komplexeket főként a citoplazmában figyelték meg, és ezeknek a komplexeknek a képződését az IFNg stimuláció jelentősen felerősítette (2G. ábra). Összességében ezek az eredmények közvetlen összefüggést mutatnak a c-Abl és a STAT1 között mind in vitro, mind in vivo.
2. ábra. A c-Abl kölcsönhatásba lép a STAT1-gyel
A c-Abl JAK-független STAT1 foszforilációt közvetít
Annak vizsgálatára, hogy a STAT1 a c-Abl szubsztrátja-e, tisztított His-címkézett STAT1-et inkubáltunk rekombináns c-Abl-vel (amely a 237-643. aminosavak katalitikus doménjét tartalmazza) ATP jelenlétében egy in vitro kináz vizsgálathoz. A reakciótermék immunoblotja anti-foszfotirozinnal és anti-foszfo-STAT1 Y701-gyel azt mutatta, hogy a STAT1-et a c-Abl közvetlenül foszforilezi a tirozin-maradék(ok)nál, beleértve az Y701-et is, in vitro (3A. ábra). Ezt követően azt találtuk, hogy a 293T-sejtekben expresszált Flag-STAT1-et a Myc-c-Abl tirozin foszforilálta, különösen az Y701-en, de nem a kináz-inaktív Myc-c-Abl (K290R) mutáns. Ezenkívül a c-Abl/Arg-szelektív inhibitor AMN107-tel történő kezelés során a c-Abl által közvetített STAT1 foszforiláció csaknem megszűnt, ami azt jelzi, hogy a STAT1 tirozin foszforilációja a c-Abl kináz aktivitásától függ (3B. ábra). A c-Abl által közvetített STAT1 foszforiláció lényegesen károsodott, amikor a STAT1 Y701-et fenilalaninnal helyettesítették, ami azt jelzi, hogy az Y701 az Abl fő foszfotja (3C. ábra). Ezenkívül a STAT1-et Arg is foszforilálta (S2B ábra). A c-Abl által foszforilált specifikus STAT1-maradékok további körülhatárolására a Myc-c-Abl-vel együtt expresszált Flag-STAT1-et folyadékkromatográfiának vetettük alá tandem tömegspektrometriás elemzéssel párosítva. A jól definiált és funkcionálisan fontos STAT1-foszfozit Y701 (Schindler és mtsai, 1992; Shuai és mtsai, 1993) mellett két másik foszfotot, az Y106-ot és az Y665-öt is azonosították (S4A ábra). A WT STAT1-gyel összehasonlítva mind az Y106F, mind az Y701F mutánsok veszélyeztetett tirozin-foszforilációt mutattak (3C. ábra). A STAT1 Y701 foszforilációját azonban nem befolyásolta jelentősen az Y106 és Y665 foszforilációja, ami azt jelzi, hogy az Y106 és Y665 eltérő szerepet játszhat (S4B ábra). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a STAT1 tirozin-maradékai, beleértve a korábban közölt Y701-et is, foszforilálhatók az Abl család kinázaival.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
A JAK-ok elsősorban az IFN által kiváltott STAT1 Y701 foszforilációért felelősek (Villarino et al., 2017). Ahogy az várható volt, a STAT1 Y701 foszforilációját az IFNg indukálta, és jelentősen gátolta a ruxolitinib, a JAK1 és JAK2 bispecifikus inhibitora (3D ábra). Nevezetesen, az Abl gátlása során az Y701 foszforilációjának veszélyeztetettsége is megfigyelhető volt (3D. ábra, 4. sáv), ami azt jelzi, hogy a c-Abl részben hozzájárul az IFNg által kiváltott STAT1 aktivációhoz. Ezenkívül a STAT1 Y701 foszforilációját a DPH, egy sejtpermeábilis c-Abl aktivátor is indukálta kisebb mértékben, mint az IFNg, amelyet az AMN107 teljesen megfordíthat (3E. ábra). A DPH által kiváltott Abl-aktiváció megerősítésére c-Abl Y412 foszforilációt is kimutattunk, amely az Abl-aktiváció indikátora (3E. ábra). Kimutatták, hogy először a JAK2 aktiválása következik be, és ez szükséges a JAK1 későbbi aktiválásához (Briscoe és mtsai, 1996). A JAK2 STAT1 aktiválásra gyakorolt hatásának kizárására a CRISPR-en keresztül létrehoztunk egy jak2-KO MCF-7 sejtvonalat. Csökkent, de kimutatható STAT1 Y701 foszforilációt figyeltek meg a jak2-KO MCF-7 sejtekben a szülői MCF-7 sejtekhez képest, ami hasonlóképpen potencírozható Myc-c-Abl jelenlétében. de nem Myc-c-Abl (K290R) (3F ábra), és tovább csökkent az AMN107 kezelés után. A c-abl/arg/sejtekben a STAT1 IFNg által kiváltott foszforilációja Y701-nél idő- és dózisfüggő módon nagymértékben károsodott (3G. ábra). Mindezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a c-Abl kináz közvetlenül képes foszforilálni és aktiválni a STAT1-et az IFNg-JAK jelátviteli útvonaltól függetlenül, és ami fontos, hogy ez a két kináz szinergikus hatással lehet a STAT1 foszforilációjára Y701-nél.
3. ábra. A STAT1-et c-Abl foszforilezi
4. ábra. A c-Abl elősegíti a STAT1 dimer képződését és a nukleáris importot
A c-Abl által közvetített foszforiláció szabályozza a STAT1 transzaktivációs aktivitását
A STAT-ok tirozin foszforilációja az IFN jelátvitel JAK-STAT útvonalának alapvető lépése, és részt vesz a STAT dimerizációjában, a nukleáris transzlokációban és a DNS-kötésben. Annak vizsgálatára, hogy a c-Abl által közvetített foszforiláció szabályozza-e a STAT dimerizációját, a GFP-STAT1 és a Flag-STAT1 együtt expresszálódott 293T sejtekben Myc-c-Abl jelenlétében vagy hiányában. Megvizsgáltuk a GFP-STAT1 szintjét az anti-Flag immunprecipitátumokban, hogy jelezzék a STAT1 dimerizációt. Ahogy a 4A. ábrán látható, a c-Abl koexpressziója fokozta a STAT1-STAT1 homodimerek képződését. Az MCF-7 sejtek immunfluoreszcens mikroszkópos vizsgálata azt is kimutatta, hogy a c-abl/arg ablációja vagy az AMN107-tel végzett kezelés jelentősen rontotta az IFNg által kiváltott STAT1 nukleáris transzlokációt (4B. és 4C. ábra).
Ezenkívül elektromobilitási eltolódási vizsgálatokat alkalmaztunk a STAT1 promoterkötő aktivitásának elemzésére. A STAT1 kötő konszenzus szekvenciát tartalmazó biotinnal jelölt IRF1 promoter régiót használtuk kimutatási próbaként (Aaronson és Horvath, 2002). Ezt a próbát STAT1-et exogén módon expresszáló 293T-sejtek sejtmag-kivonataival inkubáltuk c-Abl-lel vagy anélkül, amelyet az S5A ábra alapján kiegyensúlyoztunk. A 4D. ábrán látható módon számos STAT1-et tartalmazó IRF1-próbához kötött komplexet figyeltek meg a sejtmagkivonatokban (4D. ábra, 1. sáv). A komplexképződés kismértékben növekedett IFNg-kezelés hatására (4D. ábra, 2. sáv), és szignifikánsan nőtt a c-Abl-t ektopikusan expresszáló sejtekben (4D. ábra, 3. sáv). Azonban a WT STAT1-hez képest a c-Abl csak csekély hatást mutatott az Y701F-et tartalmazó STAT1 promoter kötődésére (4D. ábra, 7. és 8. sáv), míg az Y106F és Y665F mutációk szinte nem mutattak különbséget a WT STAT1-hez képest. A STAT1-et és a detektáló próbát tartalmazó komplexek specificitását egy jelöletlen versenytárs próba hozzáadásával igazoltuk (4D. ábra, 9. sáv). Ezenkívül egy anti STAT1 antitest hozzáadása szupereltolódott sáv kialakulását eredményezte (4D. ábra, 11. sáv). Amikor a jelölt próbákat kontrollként 293T-sejtek nukleáris kivonataival inkubáltuk, nem figyeltünk meg komplexeket (4D. ábra, 10. sáv). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a c-Abl által közvetített STAT1 Y701 foszforiláció potencírozza a STAT1 kötődését célpromotereihez.
5. ábra. A c-Abl szabályozza az IFN-hez kapcsolódó génexpressziót
Ezután a fő STAT1-szabályozott gének, köztük a ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 és tap1 IFNg-indukált transzaktivációját WT-ben vagy c-abl/-ben értékelték. arg DKO MCF-7 sejteket RT-PCR-rel. Ahogy az várható volt, a géntranszkripciót jelentősen rontotta a c-abl/arg kimerülése (5A. ábra). Ezenkívül a tipikusan IFNg és IFNa által indukált géneket nem sikerült IFN-ekkel stimulálni AMN107 jelenlétében (5B. és 5C. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a STAT1 transzaktivációs aktivitását a c-Abl pozitívan szabályozza.
A c-Abl elősegíti az IFN-függő vírusellenes hatásokat
A TAP1 és a PSMB9 részt vesz a peptidek előállításában és prezentálásában az MHC I. osztályú antigén feldolgozási útvonalon (Ghannam és mtsai, 2014; Vitale és mtsai, 1998). A korábbi felfedezéseknek megfelelően az ovalbumin JAWS II sejtek által a B3Z sejtek felé történő antigénprezentációját az AMN107 szignifikánsan elnyomta a csökkent IL2 termelés miatt (6A. ábra). A c-Abl, WT és c-abl/arg/MEF-ek, amelyeket sorozathígított IFNg-vel vagy anélkül előkezeltek, a STAT1 szabályozás vírusellenes biológiai következményeinek további felmérése érdekében hólyagos szájgyulladás vírussal (VSV) fertőztük meg. A VSV-fertőzés súlyosabb sejthalált okozott az AMN107-tel kezelt c-abl/arg/MEF-ekben és WT-sejtekben, mint a hordozóanyaggal kezelt WT-MEF-ekben (6B. ábra). Az IFNg-kezelés jelentősen csökkentette a vírusfertőzés által kiváltott sejthalált, de sokkal kevésbé volt kifejezett hatása AMN107 jelenlétében. Ezzel a megállapítással összhangban a MEF-ekben a c-abl/arg abláció az IFN-stimulációval szembeni érzéketlenséget eredményezett, de ezt a hatást a c-Abl-mentés jelentősen megfordította (6B. ábra). Ezután az AMN107-tel vagy anélkül kezelt A549 sejteket GFP-t expresszáló Newcastle-betegség vírusával (NDV) fertőztük meg, és az eredmények azt mutatták, hogy a vírus replikációját az AMN107-kezelés is potencírozta, de a c-Abl-expresszió elnyomta (6C. ábra). Annak a megállapításnak megfelelően, hogy a DNS-transzfekció az endogén IFN-válasz aktiválásához vezet (Park és mtsai, 2003), a pcDNS-vektorral történő transzfekció gátolta a vírusproliferációt. Nevezetesen, a Flag-c-Abl-vel végzett transzfekció kifejezettebb gátló hatást eredményezett a vírusproliferációra, mint az üres vektorral végzett transzfekció (6C. ábra). Ezenkívül az IFNg-kezelésnek csekély, ha egyáltalán volt hatása a vírusfertőzésre az AMN107 c-Abl-szelektív inhibitor jelenlétében (6D. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a c-Abl fontos szerepet játszik a STAT1-közvetített vírusellenes hatásokban. Ezt követően a c-Abl vírusfertőzésben betöltött szerepét vizsgáltuk call/fl, Lck-Cre (c-abl-conditional knockout, c-abl-cKO) egerekben, amelyekben a c-abl specifikusan timocitákban ütött ki (S7A ábra). ), mivel a c-abl gén csíravonal-kiütése a születést követő első két héten belül futáshoz és halálhoz vezet (Koleske és mtsai, 1998; Schwartzberg és mtsai, 1991). Ezután a WT és c-abl-cKO egereket intranazálisan influenza A vírussal (IAV) fertőztük meg. Statisztikailag nem szignifikánsan magasabb mortalitást figyeltek meg a c-abl-cKO egerek között, mint a WT egerek között. Az összes szövetben a c-Abl/Arg kinázokat szisztematikusan elnyomó AMN107-et folyamatosan adagolt WT egerek szignifikánsan megnövekedett IAV-érzékenységet mutattak (6E. ábra). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a c-Abl szükséges az állatok vírusellenes immunitásához.
6. ábra: A c-Abl elősegíti az IFN-függő antivirális hatásokat
VITA
Az IFNg az egyik legfontosabb immunmoduláló citokin, és létfontosságú szerepet játszik a vírusfertőzések elleni veleszületett immunitásban. A kanonikus IFNg-jelátvitel során az IFNg-stimuláció hatására a JAK1 és a JAK2 az aggregált IFNg-receptorok (IFNGR-ek) citoplazmatikus farkába toboroznak, és szekvenciális autofoszforilációs és transzfoszforilációs események révén aktiválódnak (Stark, 2007; Villarino et al.7). Ezután a STAT1 az IFNGR-hez kötődik azáltal, hogy SH2 doménjét társítja az IFNGR felismerő szekvenciájához (Y440DKPH444), amelyen belül az Y440-et JAK-ok foszforilezik (Greenlund és mtsai, 1995). Az Y701-nél a JAK-ok általi foszforilációját követően a STAT1 dimerizálódik és a sejtmagba transzlokálódik, ahol elősegíti egy sor IFNg-re reagáló gének transzkripcióját (Aaronson és Horvath, 2002; Stark és Darnell, 2012). A Stat1 abláció egerekben az IFN-re adott transzkripciós válaszok hiányát és az IFN által kiváltott antimikrobiális és antivirális aktivitások hiányát eredményezi a sejtekben (Meraz és mtsai, 1996). A Stat1/egerek fokozott érzékenységet mutatnak a spontán és kémiai (3-metilkolantrén) által kiváltott daganatok kialakulására (Kaplan és mtsai, 1998), valamint túlérzékenységet mutatnak bizonyos gyulladásos patológiákkal szemben (Bettelli et al., 2004; Villarino et al. ., 2010). Ezenkívül a STAT1 jelátvitel megvédi a T-sejteket a természetes ölősejtek által közvetített citotoxicitástól (Kang et al., 2019).Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a STAT1 a veleszületett immunaktivációt és a tumorimmunitást közvetíti.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Schlatterer et al. arról számoltak be, hogy a c-Abl, de az Arg nem, neuronvesztést indukálhat a STAT1 aktiválásának és interferontermelésének ösztönzésével. A c-Abl-függő STAT1 aktivációért felelős pontos mechanizmus azonban nem tisztázott (Schlatterer et al., 2012). Itt megmutatjuk, hogy a c-Abl megköti és foszforilálja a STAT1-et, és közvetlenül in vitro kölcsönhatásba lép a STAT2-vel (2. és 3. ábra, S8A, S9A és S10A). A STAT1 Y701-et kizárólag a JAK kinázok foszforilezik, amelyek szabályozzák a STAT1 dimer képződését (Schindler és mtsai, 1992; Shuai és mtsai, 1993) és a nukleocitoplazmatikus ingadozást az IFNg jelátvitel során (Mao et al., 2005; Mertens és mtsai. Zhong et al., 2005). Vizsgálatunk váratlanul azt találta, hogy a c-Abl, a JAK-okon kívül egy másik kináz is, függetlenül attól, hogy hozzájárul a STAT1 Y701 foszforilációjához (3. ábra). Bár a c-Abl által közvetített Y701 foszforiláció nem olyan erős, mint a JAK-oké, szükségesnek tűnik, hogy az Y701 elérje a maximális foszforilációt, mivel a c-abl/arg/sejtekben az IFNg-ingerre és az IFNg-re súlyosan károsodott Y701 foszforilációt figyeltek meg. Az indukált STAT1 Y701 foszforilációt az AMN107 gátolta 1,25 mM-től 5 mM-ig, dózisfüggő módon (3G és S11A ábra). Az Y701 foszforilációját azonban nem nagyon befolyásolja az Y106 és Y665, a c-Abl másik két foszforilációs állapota, ami azt jelzi, hogy a STAT1 Y701 potencírozott foszforilációja nem a c-Abl által közvetített, több helyű STAT1 foszforiláció eredménye. a JAK fokozott aktivitásának tulajdonítható. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a JAK1 konstitutív aktivációját és a JAK2 változó aktiválódását figyelték meg a BCR-Abl-t expresszáló sejtekben (Chai és mtsai, 1997; Henderson és mtsai, 1997; Shuai és mtsai, 1996). Ezenkívül kimutatták, hogy a BCR-Abl szerény mértékben aktiválja a STAT1-et és a STAT2-t a JAK1, JAK2 és JAK3 tirozin foszforilációja révén (Henderson és mtsai, 1997). A jelenlegi bizonyítékok alátámasztják, hogy az Abl-nek és a JAK-nak kifejezett szinergikus hatása lehet a STAT1 foszforilációjára az Y701-nél (3E. ábra).
Az Y701 mellett az Y106 és Y665 foszforilációját egyidejűleg azonosították (3C és S4A ábra). Ezek a foszfositok nem vettek részt a STAT1 Y701 foszforilációjában vagy a STAT1 homodimerizációjában (S4B és S4C ábra). Murphy és munkatársai azonban azt találták, hogy a monomerek NTD-jei (N-terminális fehérje interakciós domén, 1-136. aminosav) közötti kölcsönhatás szükséges a nem foszforilált teljes hosszúságú STAT molekulák dimerizációjához (Ota et al., 2004). A STAT1 mutánsok (F77A és/vagy L78A) nem képeznek nem foszforilált dimereket, és ezek a mutánsok fenotípus-perzisztens foszforilációt mutatnak az IFN-nel kezelt sejtekben, és ellenállnak a TC45- által közvetített defoszforilációnak in vitro (Mertens et al., 206). Az NTD-ben található Y106, amely az F77 és az L78 közelében van, felelős lehet a STAT1 foszforilált dimer állapotban tartásáért és a STAT1 ionizáló sugárzás alatti fenntartásáért a sejtmagban (S6A és S6B ábra). Ezenkívül az SH2 domén kölcsönhatásba lép a foszforilált tirozin tartalmú doménnel, amikor IFN foszforilált homodimer képződést indukál (Shuai et al., 1994). Az SH2 doménben található Y665 befolyásolhatja a dimerizációt. A c-Abl által közvetített foszforilációs helyek (Y106 és Y665) funkciói további vizsgálatokat igényelnek.
A JAK-okhoz hasonlóan a c-Abl által közvetített foszforiláció szabályozza a STAT1 dimer képződését (beleértve a STAT1- STAT1 homodimer és a STAT1- STAT2 heterodimer képződését (4A, S12A és S12B ábra)), a nukleáris transzlokációt, a DNS-kötést és IFN-stimulált gének transzkripciója. Az Abl megzavarása hozzájárult a vírus proliferációjának fokozásához és a vírus által kiváltott sejthalál növekedéséhez (6B., 6C. és 6D. ábra). Ezenkívül azt találtuk, hogy az ionizáló sugárzás (IR) a STAT1 nukleáris transzlokációját indukálta a c-Abl inhibitor hiányában (S6A és S6B ábra). Az IR közvetlenül aktiválja a c-Abl-t (Pendergast, 2002), majd ezt követően a STAT1-függő IFNg jelátvitelt, ami egy mögöttes mechanizmus lehet, amellyel a sugárterápia IFN-lépcsős, veleszületett és adaptív immuntámadást indít el a daganat ellen (Burnette et al. ., 2011), és erősebb veleszületett immunstátuszt kínál az IR-ingerekre adott válaszként. A WT alomtársakhoz képest azok az egerek, amelyekben a c-abl feltételesen ki volt ütve a timocitákból, magasabb, de statisztikailag nem szignifikáns mortalitást mutattak. Nevezetesen, az AMN107 c-Abl/Arg inhibitort szisztematikusan beadott egerek mortalitása magasabb volt (6E. ábra), ami azt jelzi, hogy a c-Abl expressziója számos szövetben hozzájárult az állatok vírusellenes immunitásához. Ezekből az adatokból azt sugalljuk, hogy az endogén Abl látens bazális rezisztenciát kínál a vírusfertőzéssel szemben, és az ionizáló sugárzás által stimulált aktivált Abl pajzsolja a sejteket. A legtöbb CML-ben szenvedő betegben az Abl-kinázok konstitutívan aktiválódnak. Az STI571 és AMN107 Abl kináz inhibitorok jelentik a CML kezelés első számú kezelését. Azonban gyakran megfigyelhető felső légúti fertőzés és immunszuppresszió, amelyet a STAT által közvetített immunszabályozási útvonal elnyomása okozhat (Hochhaus és mtsai, 2016; Mattiuzzi és mtsai, 2003). Eredményeink elméleti alapot adtak a terápia optimalizálásához.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Összefoglalva, a c-Abl tirozin-kináz in vivo és in vitro kapcsolatban áll a STAT1-gyel, elősegíti a STAT1 foszforilációját Y701-nél a JAK-októl függetlenül, fokozza a transzaktivációt és közvetíti a fertőzés elleni veleszületett immunválaszt, különösen a c. -Abl-hoz kapcsolódó stressz. Eredményünk kiegészítő megközelítést kínál a STAT1 aktiválásához, amely hozzájárul az IFN downstream jelátviteli útvonal szabályozásával kapcsolatos ismeretek gyarapodásához.
IRODALOM
Aaronson, DS és Horváth, CM (2002). Útiterv azoknak, akik nem ismerik a JAK-STAT-t. Tudomány 296, 1653–1655.
Advani, AS és Pendergast, AM (2002). BcrAbl változatok: biológiai és klinikai vonatkozások. Leuk. Res. 26, 713–720.
Bettelli, E., Sullivan, B., Szabó, SJ, Sobel, RA, Glimcher, LH és Kuchroo, VK (2004). A T-bet elvesztése, de nem a STAT1, megakadályozza a kísérleti autoimmun encephalomyelitis kialakulását. J. Exp. Med. 200, 79–87.
Bradley, WD és Koleske, AJ (2009). A sejtmigráció és morfogenezis szabályozása Abl-család kinázokkal: kialakuló mechanizmusok és élettani összefüggések. J. Cell Sci. 122, 3441–3454.
Briscoe, J., Rogers, NC, Witthuhn, BA, Watling, D., Harpur, AG, Wilks, AF, Stark, GR, Ihle, JN és Kerr, IM (1996). A JAK1 kináz-negatív mutánsai képesek fenntartani az interferon-gamma-indukálható génexpressziót, de nem vírusellenes állapotot. EMBO J. 15, 799–809.
Carlesso, N., Frank, DA és Griffin, JD (1996). A transzkripciós (STAT) fehérjék jelátalakítóinak és aktivátorainak tirozil-foszforilációja és DNS-kötő aktivitása Bcr/Abl-vel transzformált hematopoietikus sejtvonalakban. J. Exp. Med. 183, 811–820.
Chai, SK, Nichols, GL és Rothman, P. (1997). JAK-ok és STAT-ok konstitutív aktiválása leukémiás betegekből származó BCR Abl-t expresszáló sejtvonalakban és perifériás vérsejtekben. J. Immunol. 159, 4720–4728.
Colicelli, J. (2010). ABL tirozin kinázok: a funkció, a szabályozás és a specifitás alakulása. Sci. Jel. 3, re6.
Danial, NN, Losman, JA, Lu, T., Yip, N., Krishnan, K., Krolewski, J., Goff, SP, Wang, JY és Rothman, PB (1998). A Jak1 és a v-Abl közvetlen kölcsönhatása szükséges a v-Abl által kiváltott STAT-ok aktiválásához és proliferációjához. Mol. Cell Biol. 18, 6795–6804.
Danial, NN és Rothman, P. (2000). Az Abl onkogének által aktivált JAK-STAT jelzés. Oncogene 19, 2523–2531.
de Groot, RP, Raaijmakers, JA, Lammers, JW, Jove, R. és Koenderman, L. (1999). A STAT5 BCR-Abl általi aktiválása hozzájárul a K562 leukémia sejtek transzformációjához. Blood 94, 1108–1112.
Dietz, AB, Souan, L., Knutson, GJ, Bulur, PA, Litzow, MR és Vuk-Pavlovic, S. (2004). Az imatinib-mezilát gátolja a T-sejt-proliferációt in vitro és a késleltetett típusú túlérzékenységet in vivo. Vér 104, 1094–1099.
Dong, Q., Li, C., Qu, X., Cao, C. és Liu, X. (2017). A differenciális génexpresszió globális szabályozása c-abl/arg onkogén kinázok által. Med. Sci. Monit. 23, 2625–2635.
Ghannam, K., Martinez-Gamboa, L., Spengler, L., Krause, S., Smiljanovic, B., Bonin, M., Bhattarai, S., Grutzkau, A., Burmester, GR, Haupl, T. , et al. (2014). Az immunproteaszóma alegységek felszabályozása myositisben aktív gyulladást jelez antigénprezentáló sejtek, CD8 T-sejtek és IFNGamma részvételével. PLoS One 9, e104048.
Greenlund, AC, Morales, MO, Viviano, BL, Yan, H., Krolewski, J. és Schreiber, RD (1995). Stat toborzás tirozin-foszforilált citokin receptorok által: rendezett, reverzibilis affinitás által vezérelt folyamat. Immunity 2, 677–687.
Greuber, EK, Smith-Pearson, P., Wang, J. és Pendergast, AM (2013). Az ABL család kinázainak szerepe a rákban: a leukémiától a szolid daganatokig. Nat. Rev. Cancer 13, 559–571.
Gu, JJ, Ryu, JR és Pendergast, AM (2009). Abl tirozin kinázok a T-sejt jelátvitelben. Immunol. Rev. 228, 170–183.
Henderson, YC, Guo, XY, Greenberger, J. és Deisseroth, AB (1997). A bcr-abl lehetséges szerepe a JAK1 kináz aktiválásában. Clin. Cancer Res. 3, 145–149.
Hochhaus, A., Saglio, G., Hughes, TP, Larson, RA, Kim, DW, Issaragrisil, S., le Coutre, PD, Etienne, G., Dorlhiac-Llacer, PE, Clark, RE, et al. (2016). A frontvonal nilotinib és az imatinib hosszú távú előnyei és kockázatai krónikus myeloid leukémiában krónikus fázisban: 5-a randomizált ENESTnd vizsgálat éves frissítése. Leukémia 30, 1044–1054.
Kang, YH, Biswas, A., Field, M. és Snapper, SB (2019). A STAT1 jelátvitel megvédi a T-sejteket az NK-sejtek által közvetített citotoxicitástól. Nat. Commun. 10, 912.
Kaplan, DH, Shankaran, V., Dighe, AS, Stockert, E., Aguet, M., Old, LJ és Schreiber, RD (1998). Interferon gamma-függő tumormegfigyelő rendszer bemutatása immunkompetens egerekben. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7556–7561.
Koleske, AJ, Gifford, AM, Scott, ML, Nee, M., Bronson, RT, Miczek, KA és Baltimore, D. (1998). Az Abl és Arg tirozin kinázok alapvető szerepe a neurulációban. Neuron 21, 1259–1272.
Leaman, DW, Pisharody, S., Flickinger, TW, Commane, MA, Schlessinger, J., Kerr, IM, Levy, DE és Stark, GR (1996). A JAK-ok szerepe a STAT-ok aktiválásában és a c-fos génexpresszió stimulálásában epidermális növekedési faktorral. Mol. Cell Biol. 16, 369–375.
