Az exoszomális MiRNS-ek kifejezett profiljainak szisztematikus azonosítása és összehasonlítása NADC-vel,{0}}például PRRSV-törzzsel fertőzött sertésekben

Egyszerű összefoglaló:Az exoszómák egyedülálló szerepet játszanak a vírusfertőzésben, az antigénprezentációban és a test immunitásának elnyomásában/előmozdításában. A sertés szaporodási és légúti szindróma vírusa (PRRSV) az egyik legkárosabb kórokozó a sertésiparban. Itt a PRRSV NADC{0}}szerű CHsx1401 törzset használtuk a 42-napos sertések mesterséges megfertőzésére, szérumexoszómák izolálására, valamint 33 szignifikánsan eltérően expresszálódó (DE) exoszomális miRNS azonosítására a fertőzési és a kontrollcsoportok között. 18 PRRSV-fertőzéssel és immunitással kapcsolatos DE miRNS-t vizsgáltunk, mint potenciális funkcionális molekulákat, amelyek részt vesznek a PRRSV vírusfertőzés exoszómák általi szabályozásában.

Absztrakt:Az exoszómák olyan biológiai vezikulák, amelyeket a sejtek választanak ki és szabadítanak fel, amelyek az intercelluláris kommunikáció közvetítőiként működnek, és egyedülálló szerepet játszanak a vírusfertőzésben, az antigénprezentációban és a test immunitásának elnyomásában/elősegítésében. A sertés szaporodási és légúti szindróma vírusa (PRRSV) az egyik legkárosabb kórokozó a sertésiparban, és szaporodási rendellenességeket okozhat kocákban, légúti megbetegedéseket sertéseknél, csökkent növekedési teljesítményt és egyéb sertések elhullásához vezető betegségeket. Ebben a vizsgálatban a PRRSV NADC{0}}szerű CHsx1401 törzset használtuk a 42-naposmalacok mesterséges megfertőzésére és szérumexoszómák izolálására. A nagy áteresztőképességű szekvenálási technológia alapján 305 miRNS-t azonosítottak a szérum exoszómákban a fertőzés előtt és után, amelyek közül 33 miRNS expresszálódott szignifikánsan a csoportok között (13 relatíve felfelé és 20 relatíve alulszabályozott). A CHsx1401 genom szekvencia-konzervációs elemzése 8 konzervált régiót azonosított, amelyek közül összesen 16 differenciálisan expresszált (DE) miRNS kötődik a 3-hoz legközelebb eső konzervált régióhoz.0 A CHsx1401 genom UTR-je, beleértve 5 DE miRNS-t, amelyek képesek kötődni a CHsx-hez1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). További elemzések kimutatták, hogy a differenciálisan expresszálódó miRNS-ek célgénjei széles körben részt vesznek az exoszomális funkcióval és a veleszületett immunitással kapcsolatos jelátviteli útvonalakban, valamint 18 DE miRNS-ben (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 stb.), amelyek PRRSV-fertőzéssel és immunitással társultak. mint potenciális funkcionális molekulák, amelyek részt vesznek a PRRSV vírus fertőzés exoszómák általi szabályozásában.

cistanche növény-növelő immunrendszer

Kulcsszavak:PRRSV; szérum exoszóma; miRNS-ek

1. Bemutatkozás

A sertés szaporodási és légúti szindróma vírusa (PRRSV) egy egyszálú pozitív szálú RNS-vírus, amelynek burokszerkezete a Nidovirales rendjébe, az Arteriviridae családba, a Betaarterivirus nemzetségbe tartozik [1,2]. Gömb vagy ellipszoid alakú, 50-65 nm átmérőjű fagyasztó elektronmikroszkóp alatt [3,4]. A PRRSV genom körülbelül 15 kb hosszúságú, 50-es sapkával és 30-as poliA-farokkal, és legalább 10 nyitott leolvasási keretet (ORF) tartalmaz, amelyeket nem lefordított régiók (UTR) szegélyeznek mind az 50-es, mind a 30-as végén [5,6] és nukleokapszid fehérje burkolja be, kétrétegű lipid bevonattal vírusrészecskéket képezve. Az exoszómák az egyrétegű membránszerkezetű vezikulákhoz tartoznak, és ugyanolyan topológiai szerkezetűek, mint a sejtek [7]. A forma elektronmikroszkóp alatt „csésze alakú” vagy „korong alakú” [8,9]. Az exoszómák hosszú ideig létezhetnek a keringési rendszerben, és az exoszómák anyagait a szomszédos sejtek vagy távoli receptorsejtek felszívhatják, majd szabályozhatják a receptorsejteket, hogy részt vegyenek a genetikai anyagok sejtek közötti cseréjében [10,11]. Főleg membránfelszíni anyagokból és hordozott tartalmakból állnak, beleértve a sejtfelszíni receptorokat, membránfehérjéket, oldható fehérjéket, lipideket, RNS-t (mRNS, miRNS, lncRNS és virális RNS stb.), genomi DNS-t, mitokondriális DNS-t [12–14. ]. A mikroRNS-ek (miRNS-ek) 18-25 nukleotidból (nt) evolúciósan konzervált endogén, nem kódoló egyszálú kis RNS-ek osztálya, amelyek gátolják a transzlációs folyamatot azáltal, hogy indukálják a cél-mRNS lebomlását vagy 30 UTR cél-mRNS-hez kötődnek, ami a poszt-transzkripciós géncsendesítésre, majd a génexpresszió szabályozására a transzkripció utáni szinten [15–17]. Becslések szerint a miRNS-ek az emlős gének több mint 60%-át szabályozzák a transzkripciót követően [18,19]. A MiRNS-ek fontos szerepet játszanak az intercelluláris kommunikációban, és potenciális funkcionális molekulaként is használhatók betegségek és vírusfertőzések, átvitel és védekezés során [20]. Egyre több tanulmány kimutatta, hogy a miRNS-ek jelen lehetnek a testnedvekben, például a nyálban, a vizeletben, az anyatejben és a vérben, és a test folyadékkeringési rendszerén keresztül hatnak [21,22]. Az exoszomális miRNS-eket a génexpresszió és metabolizmus endogén szabályozóinak tekintik, és különféle patológiás állapotokat jelezhetnek [23,24].

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Az elmúlt két évtizedben kimutatták, hogy a miRNS-ek döntő szerepet játszanak az immunsejtek fejlődésének, a veleszületett immunválaszoknak és a szerzett immunválaszoknak a szabályozásában. Egyes más miRNS-ek a jelentések szerint károsítják a PRRSV fertőzést a következő módokon, közvetlenül a PRRSV genomot vagy PRRSV receptort célozzák meg, vagy szerepet játszanak a gazdaszervezet veleszületett immunválaszának szabályozásában. A miR{0}} család jelentősen károsíthatja a vírusreplikációt, a miR-26a pedig gátolja az 1-es és 2-es típusú PRRSV törzsek replikációját sertés alveoláris makrofágokban (PAM) az I. típusú interferon (IFN) szabályozásával. útvonalat, ami hatékonyabb, mint a miR-26b [25,26]. A miR-30c-ről és a miR-125b-ről kimutatták, hogy modulálják a gazdaszervezet veleszületett immunválaszát az I. típusú IFN és az NF-κB útvonal megcélzásával [27–29]. A MiR-23, miR-378 és miR-505 antivirális gazdafaktorok, amelyek a PRRSV-t célozzák, és konzervatív célhelyekkel rendelkeznek a 2-es típusú PRRSV törzsekben [30]. Ugyanakkor kimutatták, hogy a miR-506 gazdaszervezet gátolja a PRRSV replikációját azáltal, hogy közvetlenül célozza a PRRSV CD151 receptort a MARC-145 sejtekben [31]. A miR-181 közvetve is gátolja a PRRSV replikációját azáltal, hogy leszabályozza a PRRSV CD163 receptort a vérmonocitákban és a PAM-okban [32]. Ezenkívül a miRNS-ek elősegíthetik a PRRSV replikációját azáltal, hogy megzavarják az alapvető sejtfiziológiát. A MiR-24-3p és a miR-22 közvetlenül a HO-1 30 UTR-jét célozza meg a PRRSV fertőzés során, hogy elkerülje a hem oxigenáz-1 (HO-1) gátlását. hősokkfehérje (más néven HSP32) a PRRSV-n [33,34]. Ismeretes, hogy a sertések fogékonyabbak a PRRSV-re, és kevésbé képesek védekezni ennek a kórokozónak a szervezetbe való bejutása ellen [35]. Jelen tanulmányban az ezzel a vírussal fertőzött sertések veleszületett és szerzett immunitását molekuláris szinten vizsgálták egy, a területen elterjedt törzs felhasználásával. Szérumexoszóma-izolációs készletet, transzmissziós elektronmikroszkópiát (TEM), nanorészecske-követő analízist (NTA) és Western blot-ot (WB) használtunk a szérumexoszómák izolálására és azonosítására PRRSV-fertőzés előtt és után, majd kis RNS szekvenálási analízist, azonosítást, valamint a differenciális expressziós eredmények elemzése bioinformatikai módszerekkel több PRRSV-asszociált szérum exoszóma miRNS kinyerésére, majd az adateredmények azonosítása kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR) segítségével.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatkísérletek

Hat PRRSV antigén és antitest kettős negatív egészséges 42-napos nagy fehér sertés került a sertés tiszta takarmányozási rendszerébe izolálás, egészségügyi ellátás és környezeti alkalmazkodás céljából. Minden sertés szabadon ehetett és ihatott korlátozás nélkül. Amikor megismerték az izolátor körülményeit, a sertéseket orrba oltották 2 ml 105 TCID50/mL PRRSV NADC30-, például CHsx1401-gyel, amelyet az elődök is említettek [36,37]. A sertések vérét a vírusoltás előtt (kontrollcsoport, n=6) és 7 nappal azután (kezelési csoport, n=6) gyűjtöttük a vena cava elülső részéből szérumizolálás céljából. A szérumban lévő sejttörmeléket 3000 g-vel 15 percig végzett centrifugálással távolítottuk el. A vizsgálatunkban szereplő összes állatkísérletet jóváhagyta a Kínai Mezőgazdasági Tudományos Akadémia (CAAS) Állattudományi Intézetének Állat-etikai Bizottsága (Peking, Kína), IAS2022-130.

2.2. A szérum exoszómák izolálása és tisztítása

Az exoszóma izolálását és tisztítását az exoEasy Maxi készlettel (QIAGEN, Hilden, Németország, katalógusszám: 76064) a gyártó protokollja szerint végeztük.

2.3. Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM)

Az extrahált exoszóma szuszpenziókat a formvar szénnel bevont rézhálóra foltoztuk, és az exoszómákat PBS-sel öblítettük, és standard uranil-acetátos festésnek vetettük alá 3 percig szobahőmérsékleten. Szobahőmérsékleten néhány percig tartó szárítás után a rácsot láthatóvá tettük és 100 kV-on fényképeztük transzmissziós elektronmikroszkóppal (HT-7700, Hitachi-High Tech, Tokió, Japán).

2.4. Nanorészecske-követési elemzés (NTA)

Az extrahált exoszómákat 1 × PBS-sel hígítottuk, a térfogatot 10-ről 30 µl-re változtatva. A minta tesztelése után a szérum exoszómák koncentrációját és méretét egy N30E flow nano-analizátorral elemeztük a gyártó utasításait követve (NanoFCM, Xiamen, Kína).

2.5. Western Blot

Az extrahált exoszóma mintákat proteáz inhibitorral (Invitrogen, Waltham, MA, USA) és fenil-metil-szulfonil-fluoriddal (PMSF) kevert RIPA lizátumhoz adtuk, hogy extraháljuk az exoszóma fehérjét, amelyet 30 percig jégen lizáltunk. Ezután a Bradford kit utasításai szerint számszerűsítettük a szérum exoszóma fehérje koncentrációját. Az exoszóma fehérjék termikus denaturáción mentek keresztül. Ugyanennyi fehérjét 12%-os SDS-PAGE gélen választottunk el, majd polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra vittük át (Millipore, Burlington, MA, USA). 5% sovány tejport tartalmazó TBST-be áztattuk, és 1 órán át szobahőmérsékleten lezártuk. A membránt a hígított primer antitestben (anti-CD9 antitest, Abcam, Boston, MA, USA, #ab92726; anti-CD81 antitest, Abcam, Boston, MA, USA, #ab109201) áztattuk egy éjszakán át 4 ◦C-on, és kinyertük. az elsődleges antitest. A membránt a hígított másodlagos antitestbe áztattuk, szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk, majd kinyertük a másodlagos antitestet. A mosott PBST filmet a frissen tartó fóliára fektettük, azonos térfogatú kevert ECL a/b kromogén oldatot adtunk hozzá, és a kemilumineszcenciás képalkotóba helyeztük.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.6. Exoszomális kis RNS szekvenálás és adatelemzések

Az exoszómák teljes RNS-ét Trizollal extraháltuk a gyártó utasításai szerint. Ezt követően 1%-os agaróz gélelektroforézissel detektáltuk az RNS-koncentrációt és az optikai sűrűség (OD) értéket, és detektáltuk az RNS lebomlását és tisztaságát. Eközben az Agilent Bioanalyzer 2100-t használták az RNS integritásának kimutatására. Minőségellenőrzés után az exoszómák teljes RNS-ét használtuk fel. A gyártó utasításai szerint az Illumina® (Illumina, San Diego, CA, USA) NEB NEXT multiplex kis RNS könyvtár előkészítő készletét használtuk. A készlet egy kis RNS cDNS könyvtárat készített és szekvenált úgy, hogy az Illumina Novaseq 6000 platformon 50 nt egyvégű leolvasást hozzon létre. A kis RNS-könyvtár elkészítéséhez szükséges összes eljárást a Novogene (Peking, Kína) végezte el. A minőség-ellenőrzés utáni adatokat a sertés referenciagenomhoz (Sus scrofa 11.1) igazítottuk csokornyakkendővel. Az ismert miRNS-eket a miRbase (v22.0) adatbázis [38] (https://www.mirbase.org, elérve 2022. január 14-én), a miRdeep2 (v0.0.5) [39] és a miRevo (v1.1) azonosította. ) [40], és új miRNS-ek előrejelzésére használták. Ugyanakkor a miRNS-ek differenciális expressziós analízisét a DESeq (v1.24.0) [41] végezte, amely |szeres változást| > 1,6 és p < 0,05. Az igazítást MEGA (V11) [42] segítségével végeztük, majd egybázisú pontozást PHAST (v1.6.9) [43] alkalmazásával, és 10 vírusgén legkonzerváltabb régióinak értékelését végeztük, beleértve a WUH3-at (GenBank hozzáférési szám: HM853973), a VR2332-t ( GenBank hozzáférési szám: U87392), JXA1 (GenBank hozzáférési szám: EF112445), CH-1a (GenBank nyilvántartási szám: AY032626), NADC30 (GenBank hozzáférési szám: HN654459), HUN4 (GenEF6HL5JZ06), 3HL50Z06. 22-1812 (GenBank hozzáférési szám: MN648450), SC/DJY (GenBank hozzáférési szám: MT075480) és Lelystad (GenBank hozzáférési szám: M96262.2). Az RNAhibrid (V2.0) [44] segítségével megjósolták az azonosított miRNS-szekvencia kötődését a CHsx1401 vírusgenom 3 0 UTR-éhez. Mirandát (v3.3a) és RNAhibridet használtak a gén-előrejelzés céljára. A cluster profile [45] R csomagot a célgének GO (Gene Ontology) funkcionális dúsítási elemzéséhez és a KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) útvonal dúsítási analíziséhez használták.

2.7. A miRNS expresszió validálása RT-qPCR-rel

A teljes RNS-t a szérum exoszómáiból Trizol (Invitrogen, Shanghai, Kína) alkalmazásával izoláltuk a gyártó protokollja szerint. Az izolált RNS-t RT-qPCR-rel ellenőriztük mintákon (n=6 csoportonként). A cDNS-t a miRNS 1. szál cDNS szintézis (stem-loop) kit (Vazyme, Nanjing, Kína) utasításai szerint szintetizáltuk, a fluoreszcencia mennyiségi meghatározását ABI 7500 segítségével végeztük el a miRNA univerzális SYBR qPCR master mix (Vazyme, Nanjing, Kína) utasításai. A felhasznált hőciklus-paraméterek a következők voltak: első fokozat: 95 ◦C 30 másodpercig; 2. szakasz: 95 ◦C 5 másodpercig, 60 ◦C 34 másodpercig, és 40 ciklus; 3. szakasz: 95 ◦C 15 másodpercig, 60 ◦C 1 percig és 95 ◦C 15 másodpercig. A miRNS-ek primer szekvenciáit, az U6 gént referenciaként használták [46], és az S1 kiegészítő táblázatban sorolták fel. Minden qRT-PCR-ellenőrzést három biológiai ismétléssel és minden mintánál három ismétléssel végeztünk. Az átiratok relatív abundanciáját a 2-Ct módszerrel számítottuk ki, az adatok elemzéséhez és feltérképezéséhez pedig SPSS-t (v22.0) és GraphPad Prism-et (v8.0) használtunk. p < 0,05 azt jelenti, hogy a különbség statisztikailag szignifikáns.

3. Eredmények

3.1. Az antigén és az antitest relatív értéke vírusfertőzés után

A PRRSV antigén és antitest tesztek eredményeit a fertőzés előtt (0. nap) és után (7. nap) az 1. táblázat tartalmazza. A PRRSV antigén és antitest szerológiai kimutatása a fertőzés előtt negatív volt, és az antigén pozitív volt a fertőzés után, ami azt jelzi, hogy a sertések sikeresen megfertőződtek CHsx1401-gyel.

3.2. A szérum exoszómák izolálása és azonosítása

A szérumból izolált vezikulákat TEM fedezte fel. A legtöbb hólyag középen láthatja a homorú csészealj- vagy korong alakú exoszómákat. Az exoszómák membrán széle látható, és a morfológia viszonylag teljes (1A, B ábra). A nanorészecskék követési analízise azt mutatta, hogy az exoszómák 95,73%-ának átmérője 30–150 nm, főként 72,25 nm körüli, átlagos átmérője pedig 76,22 nm, ami összhangban van az exoszómák méretjellemzőivel (1C. ábra). Ez a mérettartomány hasonló volt a TEM által detektálthoz, és tovább erősítette ezeknek a vezikuláknak az exoszómaként való azonosságát. A Western blot analízis azt mutatta, hogy a szérummintákból izolált vezikulák pozitívak voltak CD9 és CD81 fehérjékre (1D ábra). A fenti jellemzők megfelelnek a Nemzetközi Extrace Vesicles Társaság (ISEV) által a MISEV2018-ban [47] megfogalmazott exoszóma azonosítási szabványoknak.

1. táblázat: (0. nap) és (7. nap) antigén és antitest vírussal.

1. ábra A szérumexoszómák főbb jellemzői. (A, B) mutatják a hólyagok morfológiai jellemzőit TEM segítségével. A skálasávok 500 nm, illetve 100 nm. (C) Az NTA a legtöbb vezikula átmérőjét és koncentrációját mutatja. (D) A Western blot a CD81 és CD9 exoszóma markerek jelenlétét mutatta ki a szérum exoszómákban. Megjegyzés: A Mix in WB eredmények az exoEasy Maxi készlettel izolált minta kevert szuszpenzió

3.3. A szérum exoszómák kis RNS-szekvenálása

Minden minta esetében a tiszta adat elérte a 0,5 Gb-ot, és a Q30-as bázisszázalék 96,20% felett volt. Az egyes minták tiszta leolvasását a sertés referenciagenomjához igazították. A 12 minta közül a kontrollcsoport 10 920 887, 10 248 696, 10 109 117, 10 655 494, 9 217 285 és 9 782 523 leolvasást kapott. A kezelt csoport 11 889 518, 10 593 504, 10 593 504, 12 846 080, 10 105 325, 11 729 451, illetve 9 789 542 leolvasást kapott. Átlagosan az összes tiszta leolvasás 77,96%-a 19–22 nukleotidot (nt) tartalmazott (2A ábra). A minőség-ellenőrzés utáni leolvasások az összes leolvasás több mint 92,59%-át tették ki. A feldolgozott tiszta leolvasásokat a sertés referenciagenomhoz igazították, és a genomon lévő 12 könyvtár feltérképezési aránya több mint 92,30%, a feltérképezett arány pedig 94,98% volt (2B. ábra). Azt jelezte, hogy az elkészített szérum exoszomális miRNS könyvtár jó minőségű és alkalmas további elemzésre. A részleteket az S2 kiegészítő táblázat tartalmazza.

2. ábra: A kisméretű RNS-transzkriptom adatok áttekintése. (A) A szérum exoszóma minták leolvasott számának hossz-eloszlása ​​(nt=nukleotid); (B) 12 minta aránya a referenciagenomra leképezve

3.4. MiRNS-ek differenciált expressziós elemzése

Az azonosított miRNS expresszió kvantitatív elemzése után a miRNS-eket a 2.6. részben leírt küszöbértékek szerint szűrtük. Összesen 305 miRNS-t kaptunk a CHsx1401 törzs beoltása előtt és után (kontroll, n=6; kezelés, n=6). Összesen 33 differenciálisan expresszált (DE) miRNS-t azonosítottak a két csoport között, 13 DE miRNS-t felfelé szabályoztak, és 20 DE miRNS-t csökkentettek a kezelési csoportban (3. ábra és S3 kiegészítő táblázat).

3.5. A miRNS célgének funkcionális dúsítási elemzése

Összesen 7283 célgént jósolt meg 33 DE miRNS, és a célgének funkciói elsősorban a MAPK kaszkád pozitív szabályozásában, a lipid metabolizmus folyamatában, az intracelluláris jelátvitel szabályozásában, az ERK1 és ERK2 kaszkádban stb. koncentrálódtak (4A ábra). ). Ami a molekuláris funkciókat illeti, a differenciálisan expresszálódó miRNS célgének főként a GTP-enzim szabályozó aktivitásra, a kináz aktivitásra, a nukleozid-trifoszfatáz szabályozó aktivitásra és más, a jelátvitelhez és az energiametabolizmushoz kapcsolódó funkciókra összpontosítanak (4B. ábra). Emellett a sejtkomponensek közül a célgének főként szupramolekuláris polimerek, Golgi, autofagoszómák, sejtfelszín, korai endoszómák stb. biológiai funkcióiban vesznek részt (4C. ábra). Ezen komponensek funkciója szorosan összefügg az exoszómák képződésével, ami egyben a szekvenálás pontosságát is magyarázza. A KEGG-útvonal-dúsítási elemzés kimutatta, hogy a célgének szignifikánsan feldúsultak az endocitózisban, a MAPK jelátviteli útvonalban, a Rap1 jelátviteli útvonalban, a szfingolipid jelátviteli útvonalban és a PI3K Akt jelátviteli útvonalban (p < 0,05) (5A ábra) ). Ezzel egyidejűleg a feldúsított útvonalakat osztályozták és elemezték. Az eredmények azt mutatták, hogy a célgén KEGG útvonala elsősorban környezeti információfeldolgozásban, emberi betegségekben és biológiai rendszerekben gazdagodott (5B. ábra).

3. ábra MiRNS-ek differenciált expressziója exoszómákban. (A) A miRNS-ek vulkán diagramja a kontroll és a kezelt csoportok között; (B) DE miRNS-ek hierarchikus klaszterezési hőtérképe a kontroll és a kezelési csoportok között.

4. ábra: DE miRNS-ek célgének GO funkciódúsítási elemzése. (A) A DE miRNS-ek célgének biológiai folyamata; (B) a DE miRNS-ek célgének molekuláris funkciói; (C) a DE miRNS-ek célgének sejtkomponensei

5. ábra. A célgének KEGG-útvonal-dúsítási elemzése. (A) Jelentősen dúsított KEGG útvonal a DE miRNS-ek célgénjeivel; (B) a jelentősen dúsított KEGG útvonalak osztályozása.

3.6. A szérum exoszomális miRNS és a PRRSV CHsx1401 genom célzott előrejelzése

Egyetlen bázis phastCons pontszáma szerint a PHAST-val történő összehangolás után összesen nyolc legkonzerváltabb szegmenst (fekete sávok a csúcstérkép felett) kaptunk a vírusgenomok közül (6. ábra). Összesen 31 DE miRNS kötődött a konzervált szegmenshez a konzervált szegmenshez kötődő miRNS előrejelzésével. Közülük a CHsx1401 genom 30 UTR-éhez (14 870-15 020) legközelebb eső konzervált régióban (14 644–15 020 nt) 16 DE miRNS kötődik hozzá, köztük 5 miRNS (ssc-}miR{{15). c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 és ssc-miR-6529), amelyek kapcsolódhatnak a CHsx1401 30 UTR-éhez. Ezen miRNS-ek közül csak az ssc-miR-223 volt szabályozva a fertőzés után, míg más miRNS-ek szabályozása csökkent a fertőzés után. A részletekért lásd az S4 kiegészítő táblázatot.

6. ábra: A CHsx1401 törzs genomjában a PHAST által megjósolt konzervált szegmensek

3.7. Az exoszóma funkcióhoz és a PRRSV-hez kapcsolódó DE miRNS-ek szűrése

A célgének funkcionális dúsítási analízisével számos, az exoszómák és a PRRSV funkciójával kapcsolatos, differenciálisan expresszált miRNS-eket találtak. Közülük 11 DE miRNS, például ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 és ssc-miR-320 vesz részt az exoszóma felvételében, és célgénjeik elsősorban a a Ras géncsalád, az annexin család és az ADP ribozilációs géncsalád. Tizennyolc DE miRNS, köztük az sscmiR-10b, az ssc-miR-124a és az ssc-miR-128, részt vesz az immunrendszerhez kapcsolódó útvonalakban, és célgénjeik főként a MAPK-ban koncentrálódnak. géncsalád, PIK3 géncsalád és protein-foszfatáz géncsalád. Míg 11 DE miRNS vesz részt a vírusinvázióban, a kapcsolódó célgének főként a MAPK géncsaládban és a protein foszfatáz géncsaládban koncentrálódnak. Továbbá több, eltérően expresszálódó miRNS, például új_102. Hat DE miRNS, köztük ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-7137-3p és ssc-miR{{ 25}}, exoszóma funkcióban, PRRSV vírus invázióban és immunrendszerrel kapcsolatos útvonalakban expresszálódnak, amint az a 7. ábrán látható. A részleteket az S5 kiegészítő táblázat mutatja.

7. ábra: Az exoszóma felvételhez, a PRRSV invázióhoz és az immunitáshoz kapcsolódó DE miRNS-ek

3.8. DE miRNS-ek QRT-PCR vizsgálata a két csoport között

Öt DE miRNS-t véletlenszerűen választottunk ki ellenőrzésre. A qRT-PCR eredmények szerint az ssc-miR-19a és ssc-miR-32 expressziója nőtt a kezelt csoportban, míg az ssc-miR-124a, ssc-miR{ A {8}} és az ssc-miR-34c magasabb expressziót mutatott a kontrollcsoportban, összhangban a szekvenálási adatokkal (8. ábra).

8. ábra Öt DE miRNS, qRT-PCR-rel validált

4. Megbeszélés

A PRRSV továbbra is makacs kórokozó a globális sertésiparban, hatalmas gazdasági veszteségeket okozva a világon. Jelenleg a vakcinázást főként a PRRSV megelőzésére és leküzdésére használják, ezek közül a módosított élő vírus (MLV) vakcina a legszélesebb körben alkalmazott [48]. Noha ez a vakcina hatékonyan csökkentette a PRRS-járványok kitörését és előfordulását, nagymértékben növelte a vírus genetikai variációját és diverzitását, és vírusrekombinációhoz vezetett a vadon élő és az élő vakcinavírusok között a terepen [49,50]. Az elmúlt években a rekombináns NADC30-vírushoz hasonló PRRSV-törzs terjedése és elterjedése a sertések szaporodási és légúti szindróma többszöri kitörését okozta Kínában. A vizsgálatban használt CHsx1401 és NADC30 közötti hasonlóság 92,2–99,1% maradt. Azóta Kínában járványtörzs lett. Az exoszómák, mint a sejtkommunikáció közvetítői, széles körben megtalálhatók különféle testnedvekben, és egyedülálló előnyökkel bírnak a betegségek diagnosztizálásában és kezelésében [51,52]. Korábbi jelentések szerint az exoszómák fontos kommunikációs szerepet játszanak az antigénprezentációban [53], az immunválaszban [53,54], a vírusreplikációban [54], a rákban [55], a neurodegeneratív betegségekben [56], az angiogenezisben [57], a tumorsejtekben. migráció [58] és invázió [59], és magas kutatási értékkel bírnak.

Ebben a vizsgálatban nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiát alkalmaztak a szérumexoszómák miRNS expressziós profiljának megalkotására, és 33 DE miRNS-t azonosítottak. Mint mindannyian tudjuk, a gazdaszervezet által kódolt miRNS képes kötődni a vírusgenomhoz, majd szabályozni a vírus replikációját, szintézisét és felszabadulását, hogy korlátozza a fertőzést és befolyásolja a kóros folyamatot [15]. A vírusgenomot célzó miRNS-ek vizsgálatáról is többször beszámoltak állatokon. A gga-miR-454 és a gga-miR-130b csirke fertőző bursalis betegségben a vírusgenomot célozhatja meg a vírusreplikáció gátlására, míg a gga-miR-21 közvetlenül a VP1 vírusfehérjét célozza meg, hogy gátolja. vírusfehérje transzláció [60,61]. A PRRSV vizsgálatokban az ssc-miR-181 specifikusan kötődik az ORF4 virális genomtól lefelé található, erősen konzervált régióhoz, és erősen gátolja a PRRSV replikációját [62]. Ebben a vizsgálatban az ssc-miR-181 expressziós különbsége a két csoport között nem ért el szignifikáns szintet. Vizsgálatunkban kilenc különböző PRRSV vírus genomját hasonlítottuk össze a CHsx1401 törzsével, és azonosítottuk a nyolc leginkább konzervált szegmenst. Azt jósolták, hogy 31 DE miRNS kötődhet a CHsx1401 8 legkonzerváltabb szegmenséhez, és 16 DE miRNS kötődhet a CHsx1401 30 UTR-éhez közeli konzervált szekvenciákhoz. Közülük 5 DE miRNS (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 és ssc-miR{{ 36}}) egyidejűleg kapcsolódhat a CHsx1401 30 UTR-hez. Ezenkívül az ssc-miR-223 fokozott expressziója a PRRSV genom 30 UTR célpontjához kötődik. Az eredmények azt mutatták, hogy a vírus genomjának konzervált szekvenciái kulcsszerepet játszhatnak a vírus patogenitásában, és a különböző PRRSV törzsek genomja közötti konzervált szekvenciákhoz kötődni képes miRNS-ek fontos szerepet játszhatnak a vírus patogenitásának szabályozásában. Egyes eltérően expresszálódó miRNS-ekről korábbi tanulmányok kimutatták, hogy kapcsolatban állnak a PRRSV-vel, sőt közvetlenül részt vesznek a PRRSV szabályozásában is, beleértve az ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30] , ssc-miR-124a [64], let-7f-5p [65], ssc-miR-744 [66] és ssc-miR{{57 }}a [67].

A PRRSV kikerülheti a gazdaszervezet védelmét azáltal, hogy megzavarja a veleszületett immunválaszt. Ezt a folyamatot számos jelátviteli útvonal szabályozza, köztük a MAPK jelátviteli útvonal, a PI3K Akt jelátviteli útvonal, az autofágia, a kemokin és a TNF jelátviteli útvonal. Jelenleg a MAPK jelátviteli útvonal három fő útvonalat tartalmaz: ERK1/2, JNK és p38 útvonalat. A MAPK kaszkád aktiválása elősegítheti a gazdasejt apoptózisát, segítheti a vírust a gazdaszervezet immunvédelmi válaszának kiszabadulásában, és elősegítheti a PRRSV replikációját [68]. Ezenkívül a c-Jun N-terminális kinázok (JNK-k) és a p38 aktiválása elősegítheti az IL-10 gyulladásos faktor felszabadulását [68–70] és fokozhatja a gyulladásos hatást. Az apoptózis indukálása mellett a PRRSV autofágiát is indukálhat, ami elősegítheti a PRRSV replikációját. A PI3K/Akt aktiválása szükséges a vírus bejutásához és a vírus replikációjának elősegítéséhez, a PRRSV által aktivált Akt pedig a JNK útvonal negatív szabályozásával gátolja a gazdasejt apoptózisát [71]. TNF Más gyulladásos faktorokkal együtt fontos szerepet játszhat a gyulladásos válasz kiváltásában és szabályozásában, de a TNF expresszióját befolyásolja a PRRSV replikáció negatív szabályozása [72]. Jelen tanulmányban a miRNS-ek (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ Az ezekben az útvonalakban gazdag {24}}a-5p stb.) részt vesznek a PRRSV által kiváltott apoptózisban, autofágiában és gyulladásban, és szorosan kapcsolódnak a vírus immunválaszához, az immunelkerüléshez és a replikációhoz.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

A sejt plazmamembránja számos lipid tutajban gazdag, és a szfingolipidben és koleszterinben gazdag szfingolipidek (szfingomielin és glikoszfingolipidek) a lipidtutajok kulcsmolekulái. A lipidek felismerése a vírus egyes fehérjéi által szükséges feltétele lehet a vírus bejutásának [73]. A burokvírusok vírusburok glikoproteineket juttatnak be a lipidtutajokba a vírus bejutásának szakaszában, kölcsönhatásba lépnek a lipidtutajokban található receptorokkal, vagy természetes állapotukból aktivált formába változnak, hogy elindítsák vagy elősegítsék a vírus internalizációját/fúzióját, mint például a HSV, SARS koronavírus és malacjárványos hasmenés vírus [73,74]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a koleszterin eltávolítása a MARC-145 sejtek felszínéről szignifikánsan csökkentette a PRRSV fertőzést, ami azt bizonyítja, hogy a PRRSV fertőzés gátlását specifikusan a sejtes koleszterin eltávolítása közvetíti. A sejtmembrán koleszterinszintjének kimerülése jelentősen gátolta a vírus bejutását, különösen a vírus megtapadását és felszabadulását [75]. A szfingolipid metabolizmus szabályozhatja a membrán szerkezetét és adhézióját, ami nagy jelentőséggel bír a PRRSV vírus inváziójában. Az endocitózis volt a legjelentősebb dúsítás ebben a vizsgálatban. Az endocitózis a célsejtek exoszómafelvételének fontos mechanizmusa. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az exoszóma felvétel energiaigényes és citoszkeleton-függő folyamat, ami rávilágít az endocitózis lehetséges szerepére ebben a folyamatban [76]. Bebizonyosodott, hogy számos útvonal közvetítheti ezt a folyamatot, beleértve a fagocitózist, a makropinocitózist, a klatrint stb. [77,78], amelyek az endocitált anyagok eltérő osztályozásához és szerepeihez vezettek. A differenciálisan expresszálódó exoszomális miRNS-ek feldúsulása ezen az úton azt jelzi, hogy az exoszómák fontos szerepet játszanak a PRRSV-fertőzésben, és az exoszómák tartalomtranszportjának és felvételének szabályozása patofiziológiai változásokhoz vezethet a célsejtekben és -szervekben.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

5. Következtetések

A PRRSV-vel fertőzött sertésekből származó szérum exoszomális miRNS-ek azonosítása és bioinformatikai elemzése révén számos PRRSV-vel kapcsolatos útvonalat és differenciálisan expresszálódó miRNS-t kaptunk ebben a vizsgálatban, mint például az ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 stb., amelyek potenciális funkcionális szerepet játszanak a PRRSV-ben -indukált immunválasz, invázió és exoszóma felvétel. Ezenkívül, mivel egyetlen miRNS több gént is megcélozhat, és egyetlen gént több miRNS is szabályoz, több miRNS több funkciót is ellát a fenti útvonalakon. Bebizonyosodott, hogy egyes miRNS-ek szabályozzák a PRRSV-fertőzést azáltal, hogy kulcsreceptorokra hatnak, vagy közvetlenül a vírus genomját célozzák meg, mint például az ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, legyen-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a stb. Eközben a jelen tanulmány számos olyan miRNS-t is megjósolt, amelyek képesek kötődni a CHX1401 vírusgenom 30 UTR legkonzerváltabb fragmentuma, beleértve az ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} } és ssc-miR-6529, amelyek fontosak lehetnek a vírus patogenitásának szabályozásában.

Hivatkozások

1. Snijder, EJ; Kikkert, M.; Fang, Y. Arterivirus molekuláris biológia és patogenezis. J. Gen. Virol. 2013, 94 Pt 10, 2141–2163. [CrossRef] [PubMed]

2. Lu, Y.; Zhang, Y.; Xiang, X.; Sharma, M.; Liu, K.; Wei, J.; Shao, D.; Li, B.; Tong, G.; Olszewski, MA; et al. A Notch jelátvitel hozzájárul a nagy patogenitású sertés reproduktív és légúti szindróma vírus (HP-PRRSV) fertőzés által kiváltott gyulladásos citokinek expressziójához sertés alveoláris makrofágokban. Dev. Összeg. Immunol. 2020, 108, 103690. [CrossRef] [PubMed]

3. Dea, S.; Sawyer, N.; Alain, R.; Athanassious, R. A sertés szaporodási és légúti szindróma vírusának ultrastrukturális jellemzői és morfogenezise, ​​amelyet a rendkívül permisszív MARC-145 sejtklónban szaporítottak. Adv. Exp. Med. Biol. 1995, 380, 95–98. [PubMed]

4. Dokland, T. A PRRSV szerkezetbiológiája. Virus Res. 2010, 154, 86–97. [CrossRef] [PubMed]

5. Johnson, CR; Griggs, TF; Gnanandarajah, J.; Murtaugh, MP Új szerkezeti fehérje sertés reproduktív és légúti szindróma vírusában, amelyet egy alternatív ORF5 kódol, amely minden arterivírusban jelen van. J. Gen. Virol. 2011, 92 Pt 5, 1107–1116. [CrossRef] [PubMed]

6. Lee, SC; Lee, S.; Yoo, GW; Choi, HW; Nem, YH; Park, CE; Shin, JH; Yoon, IJ; Kang, SY; Lee, C. Egy attenuált sertés szaporodási és légúti szindróma vírustörzs fenotípusos és genotípusos elemzése sertés tenyésztett alveoláris makrofágokban történő sorozatos átoltása után. J. Vet. Sci. 2018, 19, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

7. Zebrowska, A.; Skowronek, A.; Wojakowska, A.; Widlak, P.; Pietrowska, M. Exoszómák metabolizmusa: Fókuszban a rákos sejtek által kibocsátott és az emberi testnedvekben jelen lévő vezikulák. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3461. [CrossRef]

8. Bebelman, képviselő; Smit, MJ; Pegtel, DM; Baglio, SR Az extracelluláris vezikulák biogenezise és funkciója rákban. Pharmacol. Ott. 2018, 188, 1–11. [CrossRef]

9. Zaborowski képviselő; Balaj, L.; Breakefield, XO; Lai, CP Extracelluláris vezikulák: Összetétel, biológiai jelentősége és vizsgálati módszerek. Bioscience 2015, 65, 783–797. [CrossRef]

10. Almughlliq, FB; Koh, YQ; Peiris, HN; Vaswani, K.; Holland, O.; Meier, S.; Roche, JR; Burke, CR; Crookenden, MA; Arachchige, BJ; et al. A keringő exoszómák biomarkereket azonosíthatnak a metabolikus diszfunkció kockázatának kitett teheneknél. Sci. Rep. 2019, 9, 13879. [CrossRef]

11. Zhang, RC; Du, WQ; Zhang, JY; Yu, SX; Lu, FZ; Ding, HM; Cheng, YB; Ren, C.; Geng, DQ Mesenchymális őssejt-kezelés perifériás idegkárosodás esetén: narratív áttekintés. Neurális Regen. Res. 2021, 16, 2170–2176. [PubMed]

12. Bryzgunova, OE; Zaripov, MM; Skvorcova, TE; Lekcsnov, EA; Grigorjeva, AE; Zaporozhchenko, IA; Morozkin, ES; Ryabchikova, EI; Jurcsenko, YB; Voitsitskiy, VE; et al. Egészséges egyének és prosztatarákos betegek vizeletéből származó extracelluláris hólyagok összehasonlító vizsgálata. PLoS ONE 2016, 11, e0157566. [CrossRef] [PubMed]

13. Camussi, G.; Deregibus, MC; Bruno, S.; Grange, C.; Fonsato, V.; Tetta, C. Exosome/microvesiculum-mediált epigenetikai átprogramozása sejtek. Am. J. Cancer Res. 2011, 1, 98–110. [PubMed]

14. Tamkovich, SN; Tutanov, OS; Laktionov, PP Exoszómák: Generáció, szerkezet, szállítás, biológiai aktivitás és diagnosztikai alkalmazás. Biochem. Mosc. Suppl. Ser. Tagja. Cell Biol. 2016, 10, 163–173. [CrossRef]

15. Bartel, DP MicroRNS-ek: Genomika, biogenezis, mechanizmus és funkció. Cell 2004, 116, 281–297. [CrossRef]

16. Gordino, G.; Costa-Pereira, S.; Corredeira, P.; Alves, P.; Costa, L.; Gomes, AQ; Silva-Santos, B.; A Ribot, JC MicroRNA-181a korlátozza az emberi δ T-sejtek differenciálódását a Map3k2 és a Notch2 megcélzásával. EMBO Rep. 2022, 23, e52234. [CrossRef]

17. Liu, B.; Yan, L.; Chi, Y.; Sun, Y.; Yang, X. A hosszú, nem kódoló RNS AFAP1-AS1 elősegíti a petefészekrák progresszióját a miR-107/PDK4 tengely szabályozásával. J. Ovarian Res. 2021, 14, 60. [CrossRef]

18. Kim, Y.; Lee, DH; Park, SH; Jeon, TI; Jung, CH A mikroRNS-ek és a transzkripciós faktorok kölcsönhatása az autofágia szabályozásában nem alkoholos zsírmájbetegségben. Exp. Mol. Med. 2021, 53, 548–559. [CrossRef]

19. Kazmierczak, D.; Jopek, K.; Sterzynska, K.; Nowicki, M.; Rucinski, M.; Januchowski, R. A mikroRNS expresszió profilja és potenciális szerepe a gyógyszerrezisztens gének szabályozásában cisplatin- és paclitaxel-rezisztens petefészekrák sejtvonalakban. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 526. [CrossRef]

20. Gong, Y.; Wei, X.; Sun, W.; Ren, X.; Chen, J.; Aweya, JJ; Ma, H.; Chan, KG; Zhang, Y.; Li, S. Exosomal miR-224 hozzájárul a hemolimfa mikrobiota homeosztázisához rákfélék bakteriális fertőzése során. PLoS Pathog. 2021, 17, e1009837. [CrossRef]

21. Cheng, Y.; Kou, W.; Zhu, D.; Yu, X.; Zhu, Y. A mellékvesekéreg carcinoma diagnosztizálásának, prognózisának és betegségmegfigyelésének jövőbeli irányai: Új, nem invazív biomarkerek. Elülső. Endokrinol. 2022, 12, 811293. [CrossRef] [PubMed]

22. Gallo, A.; Tandon, M.; Alevizos, I.; Illei, GG A szérumban és nyálban kimutatható mikroRNS-ek többsége exoszómákban koncentrálódik. PLoS ONE 2012, 7, e30679. [CrossRef] [PubMed]

23. Fan, B.; Chopp, M.; Zhang, ZG; Liu, XS A mikroRNS-ek feltörekvő szerepei, mint biomarkerek és terápiás célpontok a diabéteszes neuropátiában. Elülső. Neurol. 2020, 11, 558758. [CrossRef] [PubMed]

24. Wei, H.; Chen, Q.; Lin, L.; Sha, C.; Li, T.; Liu, Y.; Yin, X.; Xu, Y.; Chen, L.; Gao, W.; et al. Az exoszómatermelés és a rakományválogatás szabályozása. Int. J. Biol. Sci. 2021, 17, 163–177. [CrossRef]

25. Jia, X.; Bi, Y.; Li, J.; Xie, Q.; Yang, H.; Liu, W. A sejtes mikroRNS miR{1}}a a veleszületett vírusellenes immunitás aktiválásával elnyomja a sertés szaporodási és légúti szindróma vírusának replikációját. Sci. Rep. 2015, 5, 10651. [CrossRef]

26. Li, L.; Wei, Z.; Zhou, Y.; Jiang, Y.; Yu, L.; Zheng, H.; Tong, W.; Yang, S.; Zheng, H.; Shan, T.; et al. A miR-26a gazdaszervezet elnyomja a sertés szaporodási és légúti szindróma vírusának replikációját az I. típusú interferonok szabályozásával. Virus Res. 2015, 195, 86–94. [CrossRef]

27. Liu, F.; Wang, H.; Du, L.; Wei, Z.; Zhang, Q.; Feng, WH MicroRNA-30c az interferon-alfa/béta receptor béta-láncát célozza meg a 2-es típusú PRRSV fertőzés elősegítése érdekében. J. Gen. Virol. 2018, 99, 1671–1680. [CrossRef]

28. Zhang, Q.; Huang, C.; Yang, Q.; Gao, L.; Liu, HC; Tang, J.; A Feng, WH MicroRNA-30c modulálja az I. típusú IFN-válaszokat, hogy elősegítse a sertés szaporodási és légzőszervi szindróma vírusfertőzését a JAK1 megcélzásával. J. Immunol. 2016, 196, 2272–2282. [CrossRef]

29. Wang, D.; Cao, L.; Xu, Z.; Fang, L.; Zhong, Y.; Chen, Q.; Luo, R.; Chen, H.; Li, K.; Xiao, S. MiR-125b csökkenti a sertés reproduktív és légúti szindróma vírus replikációját az NF-κB útvonal negatív szabályozásával. PLoS ONE 2013, 8, e55838. [CrossRef]

30. Zhang, Q.; Guo, XK; Gao, L.; Huang, C.; Li, N.; Jia, X.; Liu, W.; A Feng, WH MicroRNA-23 gátolja a PRRSV replikációját azáltal, hogy közvetlenül a PRRSV RNS-t célozza meg, és esetleg az I. típusú interferonokat szabályozza. Virology 2014, 450–451, 182–195. [CrossRef]

31. Wu, J.; Peng, X.; Zhou, A.; Qiao, M.; Wu, H.; Xiao, H.; Liu, G.; Zheng, X.; Zhang, S.; Mei, S. A MiR-506 CD151-en keresztül gátolja a PRRSV replikációját MARC-145 sejtekben. Mol. Sejt. Biochem. 2014, 394, 275–281. [CrossRef]

32. Gao, L.; Guo, XK; Wang, L.; Zhang, Q.; Li, N.; Chen, XX; Wang, Y.; Feng, WH MicroRNA 181 elnyomja a sertés szaporodási és légúti szindróma vírus (PRRSV) fertőzését a PRRSV receptor CD163 célzásával. J. Virol. 2013, 87, 8808–8812. [CrossRef]

33. Xiao, S.; Du, T.; Wang, X.; NIH, Nemzeti Egészségügyi Intézet.; Yan, Y.; Li, N.; Zhang, C.; Zhang, A.; Gao, J.; Liu, H.; et al. A MiR-22 a HO-1 gazdafaktor megcélzásával elősegíti a sertés reproduktív és légúti szindróma vírus replikációját. Állatorvos. Microbiol. 2016, 192, 226–230. [CrossRef]

34. Xiao, S.; Wang, X.; NIH, Nemzeti Egészségügyi Intézet.; Li, N.; Zhang, A.; Liu, H.; Pu, F.; Xu, L.; Gao, J.; Zhao, Q.; et al. A mikroRNS miR-24-3p elősegíti a sertés reproduktív és légúti szindróma vírus replikációját a hem oxigenáz-1 expressziójának elnyomásával. J. Virol. 2015, 89, 4494–4503. [CrossRef]

35. Butler, JE; Sinkora, M.; Wang, G.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. A PRRS-járvány hátterében a timociták fejlődésének zavara áll: tesztelhető hipotézis. Elülső. Immunol. 2019, 10, 1077. [CrossRef]

36. Zhou, L.; Wang, Z.; Ding, Y.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. A sertés szaporodási és légúti szindróma vírusának NADC{1}}szerű törzse, Kína. Emerg. Megfertőzni. Dis. 2015, 21, 2256–2257. [CrossRef]

37. Zhou, L.; Yang, B.; Xu, L.; Jin, H.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Három módosított élő vírusvakcina hatékonyságának értékelése a sertés szaporodási és légzőszervi szindróma vírusának NADC30-szerű törzse ellen. Állatorvos. Microbiol. 2017, 207, 108–116. [CrossRef]

38. Wong, N.; Wang, X. miRDB: Online forrás a mikroRNS-célpontok előrejelzéséhez és a funkcionális megjegyzésekhez. Nucleic Acids Res. 2015, 43, D146–D152. [CrossRef]

39. Friedländer, MR; Mackowiak, SD; Li, N.; Chen, W.; Rajewsky, N. miRDeep2 pontosan azonosítja az ismert és több száz új mikroRNS-gént hét állati kládban. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 37–52. [CrossRef]

40. Wen, M.; Shen, Y.; Shi, S.; Tang, T. miREvo: Integratív mikroRNS evolúciós elemzési platform a következő generációs szekvenálási kísérletekhez. BMC Bioinform. 2012, 13, 140. [CrossRef]

41. Anders, S.; Huber, W. Differenciális expressziós elemzés szekvenciaszámlálási adatokhoz. Genome Biol. 2010, 11, R106. [CrossRef] [PubMed]

42. Tamura, K.; Stecher, G.; Kumar, S. MEGA11: Molekuláris evolúciós genetikai elemzés verzió 11. Mol. Biol. Evol. 2021, 38, 3022–3027. [CrossRef] [PubMed]

43. Hubisz, MJ; Pollard, KS; Siepel, A. PHAST és RPHAST: Filogenetikai elemzés tér/idő modellekkel. Rövid. Bioinform. 2011, 12, 41–51. [CrossRef] [PubMed]

44. Krüger, J.; Rehmsmeier, M. RNAhibrid: mikroRNS-célpont előrejelzés egyszerű, gyors és rugalmas. Nucleic Acids Res. 2006, 34, W451–W454. [CrossRef]

45. Yu, G.; Wang, LG; Han, Y.; Ő, QY clusterProfiler: Egy R-csomag a génklaszterek közötti biológiai témák összehasonlításához. OMICS 2012, 16, 284–287. [CrossRef]

46. ​​Que, R.; Ding, G.; Chen, J.; Cao, L. A szérum exoszomális mikroRNS-ek és a hasnyálmirigy-adenokarcinómában szenvedő betegek klinikopatológiai jellemzőinek elemzése. World J. Surg. Oncol. 2013, 11, 219. [CrossRef]

47. Théry, C.; Witwer, KW; Aikawa, E.; Alcaraz, MJ; Anderson, JD; Andriantsitohaina, R.; Antoniou, A.; Arab, T.; Archer, F.; Atkin-Smith, GK; et al. Minimális információ az extracelluláris vezikulák 2018-as tanulmányaihoz (MISEV2018): Az Extracelluláris Hólyagok Nemzetközi Társaságának állásfoglalása és a MISEV2014 irányelveinek frissítése. J. Extracell. Vesicles 2018, 7, 1535750. [CrossRef]

48. Lyoo, K.-S.; Choi, JY; Hahn, TW; Park, KT; Kim, HK Egy módosított élő sertés szaporodási és légúti szindróma vírus vakcinával végzett vakcináció hatása a hízósertések növekedési teljesítményére szántóföldi körülmények között. J. Vet. Med. Sci. 2016, 78, 1533–1536. [CrossRef]

49. Bian, T.; Sun, Y.; Hao, M.; Zhou, L.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Egy rekombináns 2-es típusú sertés szaporodási és légzőszervi szindróma vírus NADC30-szerű és MLV-szerű között: Genetikai jellemzés és patogenitás malacoknál. Megfertőzni. Közönséges petymeg. Evol. 2017, 54, 279–286. [CrossRef]

50. Li, Y.; Ji, G.; Wang, J.; Tan, F.; Zhuang, J.; Li, X.; Tian, ​​K. Egy NADC teljes genomszekvenciája30-, mint a sertés szaporodási és légúti szindróma vírusa, amelyet más törzsekkel való rekombináció jellemez. Genome Nounc. 2016, 4, e00330-16. [CrossRef]

51. Kalluri, R.; Lebleu, VS Az exoszómák biológiája, funkciója és orvosbiológiai alkalmazásai. Tudomány, 2020, 367, eaau6977. [CrossRef] [PubMed]

52. Miao, XY A miRNS-ek exoszómákban betöltött szerepének és terápiás potenciáljuknak a megértésében elért legújabb eredmények. J. Integr. Agric. 2017, 16, 753–761. [CrossRef]

53. Shenoda, BB; Ajit, SK Immunválaszok modulálása antigénprezentáló sejtekből származó exoszómákkal. Clin. Med. Insights Pathol. 2016, 9 (S1 kiegészítő), CPath-S39925. [CrossRef] [PubMed]

54. Li, S.; Li, S.; Wu, S.; Chen, L. Az exoszómák modulálják a vírus replikációját és a gazdaszervezet immunválaszát HBV fertőzésben. BioMed Res. Int. 2019, 2019, 2103943. [CrossRef]

55. Greening, DW; Gopal, SK; Xu, R.; Simpson, RJ; Chen, W. Exoszómák és szerepük az immunszabályozásban és a rákban. Sejt- és fejlődésbiológiai szemináriumokon; Akadémiai Kiadó: Cambridge, MA, USA, 2015; 40. évfolyam, 72–81.

56. Howitt, J.; Hill, AF Exoszómák a neurodegeneratív betegségek patológiájában. J. Biol. Chem. 2016, 291, 26589–26597. [CrossRef]

57. Ribeiro, MF; Zhu, H.; Millard, RW; Fan, G. Az exoszómák az angiogenezis pro- és anti-angiogenezisében működnek. Curr. Angiogenesis 2013, 2, 54–59. [CrossRef]

58. Lan, J.; Sun, L.; Xu, F.; Liu, L.; Hu, F.; Song, D.; Hou, Z.; Wu, W.; Luo, X.; Wang, J.; et al. Az M2 makrofágokból származó exoszómák elősegítik a sejtmigrációt és az inváziót vastagbélrákban. Cancer Res. 2019, 79, 146–158. [CrossRef]

59. Aga, M.; Bentz, GL; Raffa, S.; Torrisi, MR; Kondo, S.; Wakisaka, N.; Yoshizaki, T.; Pagano, JS; Shackelford, J. Az Exosomal HIF1 támogatja a nasopharyngealis carcinoma-asszociált LMP1-pozitív exoszómák invazív potenciálját. Oncogene 2014, 33, 4613–4622. [CrossRef]

60. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Ő, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ gga-miR-454 elnyomja a fertőző bursalis betegség vírus (IBDV) replikációját azáltal, hogy közvetlenül megcélozza az IBDV genomiális B szegmenst és a sejtes citokine jelzés 6 (SOCS6) szuppresszorait. Virus Res. 2018, 252, 29–40. [CrossRef]

61. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Ő, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ MicroRNS gga-miR-130b gátolja a fertőző bursalis betegség vírus replikációját a vírusgenom megcélzásával és a citokin jelátvitel sejtszuppresszoraival 5. J. Virol. 2018, 92, e01646-17. [CrossRef]

62. Guo, XK; Zhang, Q.; Gao, L.; Li, N.; Chen, XX; Feng, WH A microRNS 181 fokozódó expressziója gátolja a sertés szaporodási és légúti szindróma vírus replikációját, és hatással van a vírusfertőzés szabályozására. J. Virol. 2013, 87, 1159–1171. [CrossRef] [PubMed]

63. Cong, P.; Xiao, S.; Chen, Y.; Wang, L.; Gao, J.; Li, M.; Ő, Z.; Guo, Y.; Zhao, G.; Zhang, X.; et al. A sertés alveoláris makrofágok (PAM-sejtek) integrált miRNS- és mRNS-transzkriptómái azonosítják a H-PRRSV és N-PRRSV fertőzéshez kapcsolódó törzs-specifikus miRNS molekuláris aláírásokat. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 5863–5875. [CrossRef] [PubMed]

64. Li, N.; Huang, K.; Chen, Y.; Huang, Z.; Zhang, Y.; Leng, C.; Liu, Y.; Shi, J.; Xiao, S.; Yao, L. MicroRNA ssc-miR-124a antivirális aktivitást mutat a sertés szaporodási és légzőszervi szindróma vírusa ellen a CD163 gazdagének elnyomásán keresztül. Állatorvos. Microbiol. 2021, 261, 109216. [CrossRef] [PubMed]

65. Li, N.; Du, T.; Yan, Y.; Zhang, A.; Gao, J.; Hou, G.; Xiao, S.; Zhou, EM MicroRNA let-7f-5p gátolja a sertés szaporodási és légúti szindróma vírusát azáltal, hogy megcélozza a MYH9-et. Sci. Rep. 2016, 6, 34332. [CrossRef]

66. Zhen, Y.; Wang, F.; Liang, W.; Liu, J.; Gao, G.; Wang, Y.; Xu, X.; Su, Q.; Zhang, Q.; Liu, B. A differenciálisan expresszált nem kódoló RNS azonosítása sertés alveoláris makrofágokban Tongchengből és nagy fehér sertésekből reagált a PRRSV-re. Sci. Rep. 2018, 8, 15621. [CrossRef]

67. Zhou, X.; Michal, JJ; Jiang, Z.; Liu, B. MicroRNS expressziós profilozás PRRSV-vel in vivo fertőzött őshonos kínai Tongcheng sertések alveoláris makrofágjaiban. J. Appl. Közönséges petymeg. 2017, 58, 539–544. [CrossRef]

68. Lee, YJ; Lee, C. A sertés szaporodási és légúti szindróma vírus replikációját elnyomja az extracelluláris szignál-szabályozott kináz (ERK) jelátviteli útvonal gátlása. Virus Res. 2010, 152, 50–58. [CrossRef]

69. Song, S.; Bi, J.; Wang, D.; Fang, L.; Zhang, L.; Li, F.; Chen, H.; Xiao, S. A sertés reproduktív és légúti szindróma vírusfertőzése sertés alveoláris makrofágokban aktiválja az IL-10 termelést az NF-κB és p38 MAPK útvonalakon keresztül. Dev. Összeg. Immunol. 2013, 39, 265–272. [CrossRef]

70. Yin, S.; Huo, Y.; Dong, Y.; Fan, L.; Yang, H.; Wang, L.; Ning, Y.; Hu, H. A c-Jun NH (2)-terminális kináz aktiválása szükséges a sertés szaporodási és légúti szindróma vírus által kiváltott apoptózisához, de nem a vírus replikációjához. Virus Res. 2012, 166, 103–108. [CrossRef]

71. Fan, L. Jelátviteli útvonalak, amelyek szerepet játszanak az apoptózis indukció szabályozásában a gazdasejtekben PRRSV fertőzés után. Virus Genes 2019, 55, 433–439. [CrossRef]

72. Lopez-Fuertes, L.; Campos, E.; Domenech, N.; Ezquerra, A.; Castro, JM; Domínguez, J.; Alonso, F. A sertés reproduktív és légúti szindróma (PRRS) vírusa csökkenti a TNF-termelést a fertőzött makrofágokban. Virus Res. 2000, 69, 41–46. [CrossRef]

73. Teissier É.; Pécheur, EI Lipidek, mint a virális fúziós fehérjék által közvetített membránfúzió modulátorai. Eur. Biophys. J. 2007, 36, 887–899. [CrossRef]

74. Jeon, JH; Lee, C. Sejtes koleszterin szükséges a sertés nidovírus fertőzéséhez. Boltív. Virol. 2017, 162, 3753–3767. [CrossRef]

75. Sun, Y.; Xiao, S.; Wang, D.; Luo, R.; Li, B.; Chen, H.; Fang, L. A sejtmembrán-koleszterin szükséges a sertés reproduktív és légúti szindróma vírusának MARC-145 sejtekben való bejutásához és felszabadulásához. Sci. China Life Sci. 2011, 54, 1011–1018. [CrossRef]

76. Tian, ​​T.; Zhu, YL; Zhou, YY; Liang, GF; Wang, YY; Hu, FH; Xiao, ZD Exoszóma felvétel a klatrin által közvetített endocitózison és makropinocitózison keresztül, valamint a miR-21 szállítás közvetítésével. J. Biol. Chem. 2014, 289, 22258–22267. [CrossRef]

77. Mulcahy, LA; Rózsaszín, RC; Carter, DRF Az extracelluláris vezikulák felvételének útvonalai és mechanizmusai. J. Extracell. Vesicles 2014, 3, 24641. [CrossRef]

78. Zhang, M.; Zang, X.; Wang, M.; Li, Z.; Qiao, M.; Hu, H.; Chen, D. Exosome-alapú nanohordozók, mint biológiailag inspirált és sokoldalú hordozók a gyógyszerszállításhoz: A közelmúlt fejlesztései és kihívásai. J. Mater. Chem. B 2019, 7, 2421–2433. [CrossRef]