A thrombomodulin javítja az átalakuló növekedési faktor b1 által közvetített krónikus vesebetegséget a G-proteinhez kapcsolt receptor 15/Akt jelút révén

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8 , Taro Yasuma1,2,8 , Kota Nishihama1 , Corina N. D'Alessandro-Gabazza2 , Masaaki Toda2 , Toshiaki Totoki4 , Yuko Okano1,2 , Akihiro Whida1 , Ryo Liqiang6 Valajiin ,7 Fridman D'Alessandro2, Tetsu Kobayashi3, Yoshiyuki Takei4, Akira Mizoguchi5, Yutaka Yano1,9 és Esteban C. Gabazza2,9

1 Diabetes, Metabolizmus és Endokrinológiai Osztály, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japán; 2 Immunológiai osztály, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japán; 3 Pulmonáris és Kritikus Care Medicine Tanszék, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japán; 4 Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japán; 5 Neurális Regeneráció és Sejtkommunikáció Tanszék, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japán; 6 Central Institute for Experimental Animals, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Japán; és 7 Nefrológiai osztály, Taizhou Kórház, Wenzhou Medical University, Lihai, Zhejiang tartomány, Kínai Népköztársaság.

Kidney International (2020) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041

Copyright ª 2020, International Society of Nephrology. Kiadó: Elsevier Inc. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk a CC BY-NC-ND licenc alatt (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Levelezés: Esteban C. Gabazza, Immunológiai osztály, Mie University School of Medicine, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japán. E-mail: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; vagy Yutaka Yano, Diabetes, Metabolism and Endokrinológia, Mie University Graduate School of Medicine, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japán. E-mail: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT és TY egyaránt hozzájárult ehhez a munkához. 9 YY és EKG társszerzők. 2019. szeptember 1-jén érkezett; felülvizsgálva 2020. április 24-én; elfogadva: 2020. május 7

KULCSSZAVAK: apoptózis; krónikus vesebetegség; G-protein-kapcsolt receptor; rekombináns humán trombomodulin; transzformáló növekedési faktor-b1

A vesefifibrózis a krónikus vesebetegségek gyakori következménye, amely menthetetlenül a végstádiumú vesebetegségig, kizárólag helyettesítő terápiával kezelhető szervi elégtelenséggel járó veseelégtelenségig terjed. Mivel a transzformáló növekedési faktor-b1 a fő szereplő a vesefifibrosis patogenezisében, feltettük azt a hipotézist, hogy a rekombináns thrombomodulin javíthatja a transzformáló növekedési faktor-b1 által közvetített progresszív vesefifibrózist és -elégtelenséget. Hipotézisünk megkérdőjelezésére egy új, glomerulus-specifikus humán transzformáló növekedési faktor-b1 transzgenikus egeret hoztunk létre a rekombináns trombomodulin terápiás hatásának értékelésére. Ez a transzgenikus egér progresszív glomeruláris szklerózist és tubulointersticiális fibrózist fejlesztett ki veseelégtelenséggel. A rekombináns trombomodulinnal végzett terápia négy hétig szignifikánsan gátolta a vesefifibrózist és javította a szervfunkciókat a kezeletlen transzgenikus egerekhez képest. A rekombináns trombomodulinnal végzett kezelés szignifikánsan gátolta a podociták apoptózisát és mezenchimális differenciálódását azáltal, hogy kölcsönhatásba lép a G-proteinhez kapcsolt 15-ös receptorral, aktiválva az Akt jelátviteli útvonalat és fokozva az anti-apoptotikus fehérjék, köztük a survivin expresszióját. Így tanulmányunk erősen sugallja a rekombináns trombomodulin potenciális terápiás hatékonyságát akrónikus vesebetegségés az azt követő szervi elégtelenség.

cistanchetudvesebetegség kezelésérejavítja a veseműködést

Fordítási nyilatkozat

Fibrózis és diszfunkció avesejelenleg világszerte jelentős egészségügyi problémák. Jelenleg nincs jóváhagyott antifibrotikus gyógyszer a vesefibrózis kezelésére. A növekedési faktor-b1 transzformációja a vese fibrogenezisének fő és gyakori hajtóereje számos rendellenesség által okozott krónikus vesebetegségben. Megállapítottuk, hogy a rekombináns thrombomodulin, a disszeminált intravaszkuláris koaguláció kezelésére Japánban jóváhagyott gyógyszer, gátolja a glomeruláris szklerózis, a tubulointerstitialis fifibrosis és a humán transzformáló növekedési faktor-b1 túlzott expressziója által okozott veseelégtelenség progresszióját, ami arra utal, hogy potenciális terápiás értéke van a kezelésben. nak,-nekkrónikus vesebetegségek.

Krónikus vesebetegségjelentős népegészségügyi probléma, amely magas morbiditással és halálozással jár, és a fejlett országok felnőtt lakosságának körülbelül 13 százalékát érinti.1 Az Egészségügyi Világszervezet jelentése szerintkrónikus vesebetegség(CKD) okozta a halálozások 1,5 százalékát világszerte 2012-ben.1 Ezenkívül a legújabb epidemiológiai adatok a krónikus vesebetegségben szenvedő betegek számának globális folyamatos növekedését jelzik.2,3 A legtöbb esetben a kóros folyamat fokozatosan fejlődik, ami végül a betegség végéhez vezet. stádiumú veseelégtelenség, amely kizárólag élethosszig tartó dialízissel vagy vesetranszplantációval kezelhető.4,5 A CKD leggyakoribb oka a diabetes mellitus (DM) és az artériás hipertónia, ezt követi az ischaemia, az ismeretlen etiológiájú glomerulosclerosis, az urológiai obstrukciók és a krónikus fertőzések.6 Az alapbetegségtől függetlenül a CKD végső és gyakori kóros következménye a vese fifibrózisa.7 A vesefifibrózis a vese parenchymalis struktúráinak rendellenes gyógyulása és átépülése, amely hosszan tartó vagy ismétlődő sérülésnek van kitéve, amelyet tubulointerstitialis fifibrosis jelenléte jellemez. glomerulosclerosis és tubuláris atrófia.8 A vesefibrogenezis fő mozgatórugója a növekedési tény változása vagy (TGF)-b1.8,9 A TGFb1 elősegítheti a fifibrózist az extracelluláris mátrix fehérjék és a kemotaktikus faktorok vagy a fibroblasztok proliferációs faktorainak szekréciójának serkentésével, a metalloproteinázok gátlásával és az epiteliális-mezenchimális átmenet elősegítésével.10 Az alapbetegség kezelésén kívül , jelenleg nem elérhető egy jóváhagyott gyógyszer, amely kifejezetten a vesefibrózist célozza meg.6

A thrombomodulin (TM) egy transzmembrán glikoprotein, amely többféle biológiai funkcióval rendelkezik, beleértve a véralvadási rendszer modulálását, az immunválaszt, a gyulladásos reakciókat és a sejttúlélést.11 A TM molekuláris szerkezete egy lektinszerű domént és 6 epidermális növekedési faktor-szerű domént tartalmaz. , egy szerin/treoninban gazdag domén, egy transzmembrán rész és egy citoplazmatikus farok.12 A trombin, a véralvadási rendszer aktiválása során keletkező prokoaguláns faktor, a TM-hez való kötődés után antikoagulánssá és antifibrinolitikus faktorrá válik.13 A TM-trombin komplex növeli a képződést. aktivált protein C (APC), gyulladásgátló és citoprotektív aktivitású antikoaguláns, a protein C aktiválásával. Ezenkívül a TM önmagában is közvetlenül csökkentheti a gyulladásos választ azáltal, hogy gátolja a nagy mobilitású fehérje B aktivitását{10}} (HMGB1) az immunogén dendritikus sejtek, az eozinofilek, a hízósejtek és a komplementrendszer elnyomásával.13–18

Vannak publikált eredmények, amelyek a TM prevenciós hatásait mutatják diabéteszes renopathiában és ischaemia-reperfúziós vesekárosodásban.{1}} Azonban egyetlen tanulmány sem értékelte a rekombináns TM hatását a TGFb1 által kiváltott progresszív vesefibrózisra, amely a vesefifibrózis gyakori hajtóereje számos CKD-t okozó betegség. Feltettük azt a hipotézist, hogy a TM javíthatja a TGFb1-mediált vesefibrózist és a veseelégtelenséget. Ennek a hipotézisnek a megkérdőjelezésére értékeltük a rekombináns TM terápiás hatását egy újonnan kifejlesztett glomerulus-specifikus TGFb1 transzgenikus (TG) egérben, amely progresszíven fejlődik.vesefibrózis és veseelégtelenség.

cistanche a vesére

EREDMÉNYEK

A megnövekedett keringő TM fragmentumok korrelálnak a veseműködési zavarral

A TM, egy endothelsejt membránhoz kötött glikoprotein, töredékekre hasad, elveszíti védő funkcióit az endothel sérülése során.22 A diabéteszes nephropathia endoteliális sérüléssel jár.23,24 A nephropathiában szenvedő DM-ben szenvedő betegek szignifikánsan magas arányt mutattak a nephropathiában nem szenvedő betegekkel összehasonlítva. a TM (4,4 vs. 3,3 pg/ml) és az aktív TGFb1 (0,28 vs. 0,24 ng/ml) keringő szintjei (S1 kiegészítő táblázat, S1A kiegészítő ábra). A TM szignifikánsan korrelál a kreatininnel, az aktív TGFb1-gyel és az oldható podocinnal (S1B kiegészítő ábra). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a funkcionális membránhoz kötött TM elvesztése az aktív TGFb1 fokozott felszabadulásával és a veseműködési zavarral jár.

TG egér a teljes hosszúságú humán TGFb1 gén glomerulus-specifikus expressziójával

Kifejlesztettünk egy TG egeret, amely túlzottan expresszálja a teljes hosszúságú humán TGFb1 gént podocitákban. Az egeret úgy hoztuk létre, hogy a humán TGFb1-et a podocin promoter szabályozása alá helyezték egy bakteriális mesterséges kromoszóma (BAC) konstrukcióban (S2 kiegészítő ábra; S3 kiegészítő ábra). 5 alapító egeret kaptunk, amelyek 3 kópiát expresszáltak, és 3 alapító egeret, amelyek 1 kópiát expresszáltak a humán TGFb1 transzgénből. A transzgén expressziója vese-specifikus volt, és az alapítók utódai életképesek voltak (S3 kiegészítő ábra). Az egerek teljes idejű vemhességet vállaltak, és az alom normál méretű volt. Az egerek a várt mendeli arányban születtek.

A TG egerek jellemzésére több mérést is végeztünkvese paraméterei4 hetente 16 hétig (S4 kiegészítő ábra). A TGFb1 plazma és vizelet koncentrációja szignifikánsan megemelkedett a TGFb1- TG egerekben a vad típusú (WT) egerekhez képest a születés utáni korai hetekben, majd magas szinten stabil maradt (1a. ábra). A TGFb1-TG egerek a 20. héten szignifikáns növekedést mutattak a veseszövet hidroxiprolin-tartalmában (190,5 vs. 96.0 mg/vese ), a mezangiális expanzió a 4. héttől (1,9 vs. 1,1 pont), és a kollagén lerakódás a 12. héttől (0,9 százalék vs. 0,1 százalék) a születés után WT társaikhoz képest (1a–f ábra). ). A hagyományos optikai mikroszkóppal a Bowman kapszula alapmembránjának kiszélesedését, a glomeruláris alapmembrán megvastagodását, a mezangiális és intersticiális terekben fokozott kollagénlerakódást és tubuláris atrófiát mutattak ki (1bd ábra). A transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálat glomerulosclerosis-t mutatott ki, beleértve a podociták mikrobolyhos átalakulását és lábfolyamat-kiürülését, csökkent glomeruláris kapilláris endothel fenestrációt, a glomeruláris alapmembrán megvastagodását és megnövekedett mezangiális mátrix lerakódást (2a–i ábra). A nephropathia korai markereinek vizeletben mért koncentrációja Zsírsavkötő fehérje (185,1 vs. 87,0 pg/ml) ill.vese sérülésAz 1. molekula (441,9 vs. 256,9 pg/ml) szignifikánsan megemelkedett a TGFb1-TG egerekben a 4. és a 8. hetes kortól, összehasonlítva az életkoruknak megfelelő WT egereikkel (S5 kiegészítő ábra). A teljes proteinuria és a teljes fehérje-kreatinin arány a vizeletben szignifikánsan megemelkedett a 4., 8., 12., 16. és 2. héten a TGFb1-TG egerekben WT társaikhoz képest (3a. ábra). . A vér karbamid-nitrogénjének plazmaszintje a 4. héttől jelentősen megemelkedett (5,1 vs. 4,1 mg/dl), a kreatinin koncentrációja pedig a 8. héttől (1,1 vs. 0,4 mg/dl) a TGFb1-TG egerekben. WT társaikhoz képest (3b. ábra).

Az rhTM gátolja a glomerulosclerosis és a tubulointerstitialis fifibrosis kialakulását

A fiziológiás sóoldattal (SAL) kezelt TGFb{{0}}TG egerekkel és a rekombináns humán (RH) TM-mel vagy SAL-lel kezelt WT egerekkel összehasonlítva a ritmussal kezelt TGFb1-TG egerek szignifikánsan csökkent mezangiálist mutattak. expanzió/cellularitás (1,3 vs. 3.{{30}} pontszám) és szignifikánsan alacsony tubulointerstitialis kollagénlerakódás és glomerulosclerosis (121,3 százalék vs. 139,7 százalék) (4a–e ábra). Ezekkel a megfigyelésekkel összhangban a hidroxiprolin-tartalom (11,7 vs. 19,9 mg/g), a kollagén I (101,3 vs. 196,7 ng/mg fehérje) és a periosztin (21,7 vs. 40,8 ng/g/g/g) veseszöveti koncentrációi mg fehérje), és a kollagén I relatív mRNS expressziója szignifikánsan csökkent az rhTM-mel kezelt TGFb1-TG egerek veseszöveteiben, összehasonlítva a kontrollegerek veseszöveteivel (4f. ábra, S2 és S3 kiegészítő táblázatok). A transzmissziós elektronmikroszkópia szignifikánsan csökkentette a podociták lábfolyamat-kiürülését és a glomeruláris alapmembrán megvastagodását az rhTM-mel kezelt egerekben a csak SAL-lel kezelt egerekhez képest (S6AB és B kiegészítő ábra). Ezenkívül a profibrotikus citokinek, monocita kemoattraktáns fehérje-1 (45,0 vs. 76,1 pg/mg fehérje), interleukin-13 (612,1 vs. 1002,0 pg/mg fehérje) és aktív TGFb1 veseszöveti koncentrációi (131,0 vs. 151,5 pg/mg fehérje) szignifikánsan csökkentek az rhTM-mel kezelt TGFb1-TG egerekben a kontroll egerekhez képest (S7 kiegészítő ábra). A HMGB1 veseszöveti koncentrációja szintén szignifikánsan csökkent az rhTM-mel kezelt TGFb1-TG egerek veseszöveteiben, összehasonlítva aveseszövetekkontroll egerekből (S7 kiegészítő ábra). A trombin antitrombin komplex plazmakoncentrációja szignifikánsan megemelkedett a TGFb1-TG/SAL csoportban a WT/SAL csoporthoz képest, de nem találtunk különbséget a TGFb1-TG/rhTM és WT/rhTM csoportok között. (S8A kiegészítő ábra). Ahogy az várható volt, az rhTM-mel kezelt TGFb1-TG és WT egerek plazmájában magas volt a TM koncentrációja. Az APC/antitripszin komplex plazmakoncentrációja szignifikánsan csökkent a TGFb1-TG/SAL csoportban a WT/SAL és TGFb1-TG/rhTM csoportokhoz képest (280,5 vs. 384,6 pg/ml) , és nem volt szignifikáns különbség a plazminogén aktivátor inhibitor-1 szintjében (S8A kiegészítő ábra). A C5a szintje a plazmában, vizeletben ésveseszövet(630,1 vs. 1075,0 pg/mg fehérje) és a plazmában oldódó podocin szignifikánsan csökkent az rhTM-mel kezelt TGFb1-TG egerekben a SAL-lel kezelt TGFb1-TG egerekhez képest (S8B kiegészítő ábra). A vizelet podocinszintje magasabb volt a TGFb1-TG/SAL csoportban, mint a WT/SAL és TGFb1-TG/rhTM csoportokban (S9A–C kiegészítő ábra).

1. ábra|A humán transzformáló növekedési faktor b1 (TGFb1) transzgenikus (TG) egérben progresszív vesefibrózis alakul ki. (a) A TGFb1 fehérje koncentrációját a plazmában és a vizeletben enzim immunvizsgálattal, a szövet hidroxiprolin tartalmát pedig kolorimetriás vizsgálattal mértük. (b–d) A veseszövet metszeteit (b) periodinsav–Schiff-szel (¼ 20 mm-es oszlopok) és (c,d) Masson-trichrome-mal (¼ 10{{) festették. 40}} mm), majd (e,f) pontozási rendszerrel vagy a WinROOF képalkotó szoftverrel (Mitani Corporation, Tokió, Japán) számszerűsítettük. A veseszövetek értékeléséhez szükséges egerek száma: vad típusú (WT) egereknél, n ¼ 4 a 4., 12. és 20. héten; TG egereknél n ¼ 7 4 hetesnél, n ¼ 8 16 hetesnél és n ¼ 9 20 heteseknél. A plazma- és vizeletvizsgálathoz szükséges egerek száma: WT egereknél n ¼ 12 a 4. héten, n ¼ 8 8. héten, n ¼ 7 12. héten és n ¼ 4 16. és 20. héten; TG egereknél n¼ 24 a 4. héten, n¼17 a 8. és 12. héten és n¼9 a 16. és 20. héten. Az adatokat medián interkvartilis tartományban fejezzük ki. Statisztikai elemzés Mann-Whitney U teszttel. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****p="">< 0,0001.="" ns,="" nem="" jelentős.="" a="" kép="" megtekintésének="" optimalizálásához="" tekintse="" meg="" a="" cikk="" online="" változatát="" a="" www.kidney-international.org="">

2. ábra|Transzmissziós elektronmikroszkópos leletek a transzformáló növekedési faktor b1-indukálta vesefifibrózis modellben. Az egerek veséinek rögzítését, kezelését és eltávolítását a Módszerekben leírtak szerint végeztük. (a,b) Podociták mikrobolyhos átalakulása és (a,b,d,e,g) lábfolyamat kiürülése (fehér nyílhegyek), (c–e) csökkent glomeruláris kapilláris endothel fenestráció (sárga nyílhegyek), (f) glomeruláris bazális membrán (csillagok), és (h,i) fokozott mezangiális mátrix lerakódás (fehér nyilak). CL, kapilláris lumen. A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a www.kidney-international.org címen.

Az rhTM javítja a veseműködést

Az L-zsírsav-kötő fehérje szintje (197.0 vs. 313,4 pg/ml),vesekárosodás molekula1 (299,9 vs. 596,2 pg/ml), a vér karbamid-nitrogéntartalma (12,9 vs. 34,8 mg/dl), a kreatinin (0,5 vs. 1,4 mg/dl) és az albumin-kreatinin arány szignifikánsan csökkent RhTM-mel kezelt vesefibrózisban szenvedő TGFb1-TG egerek kezeletlen TG társaikhoz képest (5. ábra). A vizelet összfehérje és a teljes fehérje kreatinin aránya is csökkent az rhTM-mel kezelt TGFb1-TG egerekben a kezeletlen társaikhoz képest (5. ábra).

Az rhTM csökkenti a glomeruláris sejtek apoptózisát

A terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített dUTP nick-végjelölő festés azt mutatta, hogy az rhTM-mel kezelt TGFb1-TG egerek glomerulusaiban szignifikánsan csökkent az apoptotikus sejtek száma, összehasonlítva a SAL-lel kezelt TGFb1- TG egerek glomerulusaival (kiegészítő kiegészítés). S10A és B) ábra). A kaszpáz-3 hasítása szintén szignifikánsan csökkent az rhTM-mel kezelt TGFb1-TG egerek veseszöveteiben, összehasonlítva a SAL-lel kezelt TGFb1-TG egerek veseszöveteivel (S10C kiegészítő ábra). Azvese szöveteiAz rhTM-mel kezelt TGFb1-TG egerekből származó, a SAL-lel kezelt TGFb1-TG egerekből származó egerekből származó B-sejtes limfóma 2 (Bcl-2) mRNS-szintje szignifikáns emelkedést mutatott, B. - extra nagy sejt limfóma (Bcl-XL), az apoptózis ismétlődésének bakulovírus-gátlója, amely 5-öt (BIRC5, más néven survivin) és BIRC6-ot (Apollon) tartalmaz megnövekedett Bcl{12}}–Bax aránnyal (S11 kiegészítő ábra). ).

3. ábra|A humán transzformáló növekedési faktor b1 (TGFb1) transzgenikus (TG) egér veseműködési zavara van. (a) Az összfehérjét és (b) a vér karbamid-nitrogénjét (BUN) kolorimetriás módszerekkel, a kreatinint pedig enzimes módszerrel mértük. A plazma- és vizeletvizsgálathoz szükséges egerek száma: vad típusú (WT) egereknél, n ¼ 12 a 4. héten, n=7 a 8. és 12. héten és n=4 a 16. és 2. héten {21}} hét; TG egereknél: n =24 a 4. héten, n=17 a 8. és 12. héten, és n=9 a 16. és a 2{23}}. héten. Az adatokat medián ± interkvartilis tartományban fejezzük ki. Statisztikai elemzés Mann-Whitney U teszttel. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****="" p=""><>

Az rhTM gátolja a podociták apoptózisát

A podociták rhTM-mel történő előkezelése szignifikánsan csökkentette a TGFb1 jelenlétében tenyésztett podociták apoptózisát, amelyet a subG1 fázisban lévő sejtek száma (3,2% vs. 5,2%), a terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített dUTP nick-végjelölő sejtek (pozitív sejtek) határoz meg. 1.0 vs. 5,4 cell/Fifield) és a kaszpáz-3 hasítás mértéke (0,9 vs. 1,1 arány) (6a–e ábra). Az antiapoptotikus faktorok szűrése tenyésztett podocitákban azt mutatta, hogy az rhTM szignifikánsan növeli a Bcl-2 antiapoptotikus faktor mRNS expresszióját a kezeletlen sejtekben tapasztalt expresszióhoz képest (S12 kiegészítő ábra). A BIRC5 antiapoptotikus faktor mRNS expressziója szintén nőtt az rhTM-mel kezelt sejtekben a kezeletlen sejtek expressziójához képest (S12 kiegészítő ábra). A Bax proapoptotikus faktor mRNS expresszióját szignifikánsan csökkentette az rhTM-kezelés a kezelés nélküli kezeléshez képest (kiegészítő S12 ábra). Az rhTM-kezelés szintén jelentősen gátolta az annexin V expresszióját és a terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített dUTP nick-végjelölő festődést hidrogén-peroxid jelenlétében tenyésztett podocitákban (kiegészítő S13A-E ábra) és magas glükóz körülmények között (kiegészítő S14A-E ábra). ) tovább erősíti az rhTM antiapoptotikus tulajdonságát a podocitákon. Az antiapoptotikus protein kináz B (Akt) útvonal feltárása25 kimutatta, hogy az rhTM fokozta az Akt foszforilációját a hidrogén-peroxid vagy TGFb1 jelenlétében tenyésztett humán primer podocitákban (S15A és B kiegészítő ábra). Ezután podocitákat izoláltunk minden egércsoportból, és Western blottal értékeltük az Akt foszforilációt. A TGFb{{30}}TG/rhTM csoportból izolált podocitákban szignifikánsan megnövekedett az Akt foszforilációja a kezeletlen csoport podocitáihoz képest (1,1 vs. 0,7 arány) (S16A és B kiegészítő ábra).

GPR15 közvetítés

Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy a TM aktiválja az intracelluláris utakat azáltal, hogy kölcsönhatásba lép a fibroblaszt növekedési faktor receptor 1-gyel (FGFR1) ésG-protein kapcsolt receptor15 (GPR15).26,27 A podociták expresszálják az FGFR128-at, de nem világos, hogy expresszálják-e a GPR15-öt. Itt izoláltunk podocitákat az egyes egércsoportokból, és megmutattuk, hogy a podociták GPR15-öt is expresszálnak (S17A-E kiegészítő ábra). Azt találtuk, hogy az egészséges kontrollból és egy glomerulosclerosisban szenvedő beteg podocitái is expresszálják a GPR15-öt (S18 kiegészítő ábra). Annak tisztázására, hogy az FGFR1 vagy a GPR15 közvetíti-e a podociták apoptózisára kifejtett rhTM-gátló aktivitást, értékeltük az rhTM antiapoptotikus aktivitását TGFb{12}}kezelt podocitákban FGFR1 inhibitor jelenlétében vagy a sejtek kis interferáló RNS-sel (siRNS) történő transzfektálása után. FGFR1 vagy GPR15 ellen. A podociták FGFR1 inhibitorral (kiegészítő S19A és B ábra) vagy FGFR1 siRNS-sel (13,2% vs. 7,9%) (7a és b ábra) végzett előkezelés nem tudta megszüntetni az rhTM gátló hatását a podociták apoptózisára. A sejtek GPR15 siRNS-sel történő transzfekciója azonban teljesen megszüntette az rhTM gátló aktivitását (14,6% vs. 13,8%)podociták apoptózisa(7a–c ábra).

4. ábra|A rekombináns humán thrombomodulin (rhTM) gátolja a glomerulosclerosis és a tubulointerstitialis fifibrosis kialakulását. A veseszövet metszeteit (a, b) periodikus sav-Schiff-fel és (c, d) Masson trikrómmal festettük, majd (e) pontozási rendszerrel vagy a WinROOF képalkotó szoftverrel számszerűsítettük. (e) A vad típusú (WT)/sóoldat (SAL) csoport átlagértékét 100 százaléknak vettük. Statisztikai elemzés Mann-Whitney U teszttel. (f) A szövetek hidroxiprolintartalmát kolorimetriás módszerrel, a kollagén I-a1 (Col1a1) és a periosztin koncentrációját enzim immunoassay-vel, az mRNS expresszióját pedig reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakcióval mértük. Statisztikai elemzés Kruskal Wallis varianciaanalízissel és korrigált Dunn-teszttel. n=8 minden csoportban. Rudak {{10}} (a,c) 50 mm és (d) 20 mm. Az adatokat medián ± interkvartilis tartományban fejezzük ki. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001.="" tg,="" transzgenikus;="" tgfb1,="" transzformáló="" növekedési="" faktor="" b1.="" a="" kép="" megtekintésének="" optimalizálásához="" tekintse="" meg="" a="" cikk="" online="" változatát="" a="" www.kidney-international.org="">

Az rhTM gátolja a podociták EMT-jét

A TGFb1-TG/SAL egerekben szignifikánsan megnövekedett a podocin és a-simaizom aktin (a-SMA) pozitív festődése (1,4 százalék vs. 11,2 százalék) a TGFb1-TG-hez képest /rhTM egerek (8a. és b. ábra). Ezután in vitro primer humán podocitákat tenyésztettünk, amelyeket rhTM-mel előkezeltünk, mielőtt TGFb1 fehérjét adtunk a táptalajhoz. Az a-SMA fibroblasztszerű morfológiája és fokozott expressziója elnyomott az rhTM-mel kezelt podocitákban a kezeletlen sejtekhez képest (S20A kiegészítő ábra). Ezenkívül az rhTM gátolta a fibronektin és a vimentin mRNS expresszióját, bár fokozta az E-cadherin mRNS expresszióját a podocitákban a kezeletlen sejtekben történő expresszióhoz képest (S20B kiegészítő ábra). A SMAD család 2-es tagjai (Smad2) és Smad3 kritikus szerepet játszanak a TGFb1-közvetített epiteliális-mezenchimális átmenetben (EMT).29 Az rhTM-kezelés jelentősen elnyomta a Smad2 és Smad3 aktiválódását TGFb1-TG egerekben. összehasonlítva a kezeletlen TG egerekkel (8c. ábra) és a TGFb1 jelenlétében tenyésztett humán podocitákkal (kiegészítő S20C ábra).29 rhTM-mel (TGFb1-TG/rhTM) kezelt TG egerekben szintén kisebb az a-SMA expressziója. (3,7 százalék vs. 17,2 százalék) a tubuláris epiteliális sejtekben a kezeletlen társaikhoz képest (S21A és B kiegészítő ábra).

5. ábra|A rekombináns humán thrombomodulin (rhTM) javítja a vesekárosodást és a veseműködési zavarokat. A kreatinint enzimes módszerrel mértük; összfehérje kolorimetriás módszerrel; valamint vér karbamid-nitrogén (BUN) és albumin, vesekárosodás molekula 1 (KIM-1), L-zsírsav-kötő fehérje (L-FABP) és teljes transzformáló növekedési faktor b1 (TGFb1) enzimes immunvizsgálattal. n=8 minden csoportban. Az adatok medián±interkvartilis tartományban vannak kifejezve. Statisztikai elemzés Kruskal-Wallis varianciaanalízissel és nem korrigált Dunn-teszttel. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****="" p="">< 0,0001,="" #p="0.06." ns,="" nem="" szignifikáns;="" sal,="" sóoldat;="" tg,="" transzgenikus;="" wt,="" vad="">

A GPR15 közvetíti az rhTM gátló hatását az EMT-re

A podociták FGFR1 siRNS-sel történő transzfekciója nem tudta megszüntetni az rhTM gátló aktivitását mind az I-a1, mind az a-SMA kollagén relatív mRNS-expressziójára a TGFb1--vel kezelt podocitákban (S22 kiegészítő ábra). A sejtek GPR15 siRNS-sel történő transzfekciója azonban jelentősen megszüntette az rhTM gátló hatását mind az I-a1, mind az a-SMA kollagén relatív mRNS-expressziójára a TGFb{10}}kezelt podocitákban (S22 kiegészítő ábra).

VITA

TGFb1 és a glomeruláris sejtek sérülése

A CKD-t okozó rendellenességek gyakori következménye a vesefibrózis.8,30,31 A TGFb1 a vese fibrogenezisének gyakori hajtóereje a CKD-vel összefüggésben, amelyet olyan betegségek okoznak, mint a DM, az artériás magas vérnyomás és az autoimmun betegségek.10 A glomerulusból és a tubulointersticiális terekből származó sejtek képes kiválasztani a TGFb1 látens formáit, amelyek a szövetsérülés során túlzottan aktiválva vese hegesedéshez vezethetnek.32 Mivel a TGFb1 serkentheti saját szekrécióját, a fibrotikus folyamat általában ördögi körré válik.8 A TGFb patogén folyamatának korai eseménye 1- közvetítettevese fifibrózisa podociták és a glomeruláris endothelsejtek sérülése.33–35 Az oldható TM plazmaszintje az endothel károsodás markere. A TGFb1 vesekárosodásban betöltött szerepével összhangban itt szignifikáns korrelációt találtunk az aktív TGFb1 és az oldható TM, az oldható podocin és a kreatinin között a DM-ben szenvedő betegek plazmájában. Áthallás a glomeruláris endothel sejtek és a podociták között avesekárosodásproteázok lokális expressziójához vezet, ami glomeruláris bazális membrán degradációt okoz.34–36 Ez magyarázhatja az oldható podocin kimutatását és szignifikáns korrelációját a szolubilis TM-mel DM-es betegeinkben.

6. ábra|A rekombináns humán thrombomodulin (rhTM) elnyomja a podociták apoptózisát, amelyet a transzformáló növekedési faktor b1 (TGFb1) indukál. (a) rhTM-et adtunk a podociták tápközegéhez 1 órával azelőtt, hogy apoptózist indukáltunk 10 ng/ml TGFb1-gyel 48 órán keresztül. (b) A sejtek százalékos arányát a subG1 fázisban társcitometriával detektáltuk. (a,b) n=3 minden csoportban. (c,d) A DNS-fragmentált sejtek számát terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített dUTP nick end-labeling (TUNEL) analízissel mértük (n=3 sóoldatban [SAL]/SAL és rhTM/SAL csoportokban); n=6 SAL/TGFb1 és rhTM/TGFb1 csoportokban), és (e) a kaszpáz-3 hasítás mértékét Western blottal mértük (n=4 mindegyik csoportban). Rudak=100 mm. Az adatokat medián ± interkvartilis tartományban fejezzük ki. Statisztikai elemzés Mann-Whitney U teszttel. *P < 0,05.="" dapi,="" 40="" ,6-diamidino-2-fenil-indol;="" hpf,="" nagy="" teljesítményű="" field;="" ns,="" nem="" jelentős.="" a="" hisztogramok="" a="" maximális="" százalékban="" (a="" maximális="" érték="" százalékában)="" jelennek="" meg,="" minden="" görbét="100" százalék="" módba="" skálázva.="" a="" kép="" megtekintésének="" optimalizálásához="" tekintse="" meg="" a="" cikk="" online="" változatát="" a="" www.kidney-international.org="">

Podocita-specifikus humán TGFb1 túlzott expresszióval összefüggő vesefibrózis

Egy olyan gyógyszer, amely ellensúlyozni tudja a TGFb1 hatását, ideális lenne a vesefibrózis blokkolására. Itt létrehoztunk egy TG egeret, amely túlzottan expresszálja a humán TGFb1 gént a glomerulusban, amely spontán és progresszív glomeruláris szklerózist és tubulointersticiális fifibrózist hoz létre veseelégtelenséggel már 4 héttel a születés után. A modell előrehaladott glomerulopathiát mutat podociták és glomeruláris endoteliális sejtek sérülésével; glomeruláris bazális membrán megvastagodása és mezangiális expanzió intersticiális hegesedéssel; a veseszövet sérülésének és veseműködési zavarának megnövekedett markerei; és megnövekedett TGFb1 a plazmában,veseszövet, és a vizelet. A fehérjék, a TGFb1 vizelettel történő kiválasztódásának növekedése és a komplementrendszer aktiválódása magyarázatot adhat az intersticiális hegesedés egyidejű kialakulására jelen modellünkben.37–40 További kísérletek megnövekedett apoptotikus sejteket és Smad fehérjék aktiválódását tárták fel a kezeletlen TGFb{ veseszövetében. {3}}TG egerek WT egerekkel összehasonlítva. Összességében ezek az eredmények arra mutatnak rá, hogy ez az új TGFb1-TG egér megfelelő modell a gyógyszerkutatáshozvese fifibrózis.

7. ábra|A G-protein-kapcsolt receptor (GPR15) közvetíti az apoptózis rekombináns humán thrombomodulin (rhTM) gátlását podocitákban. A humán primer podocita sejteket fibroblaszt növekedési faktor receptor 1 (FGFR1) kis interferáló RNS-sel (siRNS), GPR15 siRNS-sel vagy kódolt siRNS-sel transzfektáltuk 48 órán át, majd rhTM-et adtunk a sejttenyészethez 1 órával a transzformáló b1 növekedési faktorral való kezelés előtt. (TGFb1). Az apoptotikus sejteket (a) társcitometriával értékeltük, majd (b) mennyiségileg meghatároztuk. (c) Sejtlizátumokat készítettünk Western-blothoz. n{{10}} minden csoportban. Az adatokat medián ± interkvartilis tartományban fejezzük ki. Statisztikai elemzés Mann-Whitney U teszttel. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="">

8. ábra|Az epiteliális-mezenchimális átmenet gátlása rekombináns humán trombomodulinnal (rhTM). (a) A podocint és az a-simaizom aktint (a-SMA) a Módszerekben leírtak szerint festettük. (b) Az a-SMA festésre pozitív területet a WinROOF képfeldolgozó szoftverrel számszerűsítettük. n=3 vad típusú (WT)/sóoldat (SAL) és WT/rhTM csoportokban és n=5transzformáló növekedési faktor-b1 – transzgenikus(TGFb{{0}}TG)/SAL és TGFb1-TG/rhTM csoportok. (c) Az összes (t) és foszforilált (p) SMAD családtag (Smad) fehérjét Western blottal értékeltük ki. n=8 minden csoportban. Az adatokat medián ± interkvartilis tartományban fejezzük ki. Statisztikai elemzés Kruskal-Wallis varianciaanalízissel és korrigált Dunn-próbával. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0,08." a="" kép="" megtekintésének="" optimalizálásához="" tekintse="" meg="" a="" cikk="" online="" változatát="" a="" www.kidney-international.org="">

Az rhTM enyhíti a vesefifibrózist

Kimutattuk, hogy az rhTM enyhíti a humán TGFb1-et a tüdőben túlzottan expresszáló egerekben kialakult tüdőfibrózist az alveoláris hámsejtek apoptózisának elnyomásával.41 Klinikai vizsgálatok azt is kimutatták, hogy az rhTM-kezelést követően az idiopátiás tüdőfibrózis javult.42hTM43 szervfibrózis kezelésére. Feltételeztük, hogy az rhTM hatásos a TGFb{4}}-hoz kapcsolódó vesefibrózisban. Ennek a hipotézisnek a tesztelésére vese-specifikus TGFb1-TG egereket kezeltünk rhTM-mel.44 Az rhTM 4 hetes beadása jelentősen gyengítette a vese sérülését, diszfunkcióját és fifibrózisát. Az rhTM-mel kezelt egerek vizeletben alacsony összfehérje-, albumin-, TGFb1-, C5a-szintet mutattak, és csökkent a profibrotikus citokinek, C5a és HMGB1.45 veseszintje. Az rhTM-kezelés gátolta a podociták apoptózisát és EMT-jét is. Az rhTM azonban nem fejtett ki hatást a trombin antitrombin komplexére, amely egy véralvadási aktivációs marker, bár növelte az APC, egy gyulladásgátló és anti-apoptotikus hatású antikoaguláns faktor képződését.23 Érdemes megjegyezni, hogy a trombin, a prokoaguláns enzim paradox módon elősegíti az antikoagulációt alacsony fokú protrombotikus állapotokban a TM/trombin komplex kialakításával, ami növeli az antikoaguláns APC képződését. A trombin azonban főként prokoagulánsként működik túlzott protrombotikus állapotok (pl. szepszis) esetén.46 A trombinnak ez a kettős és paradox hatása megmagyarázhatja az rhTM látszólagos hatástalanságát a koagulációs aktiváció gátlásában alacsony fokú protrombotikus állapotban lévő modellünkben. . Összességében ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy az rhTM enyhíti a progresszív fifibrózist és az érrendszeri diszfunkciót.vesea glomeruláris sejtek EMT túlélésének meghosszabbításával vagy megelőzésével, valamint a gyulladás, a komplement aktiváció és a növekedési faktor aktivitás közvetlen vagy közvetett elnyomásával, a protein C útvonal aktiválásával és a HMGB1 expresszió csökkentésével. A megnövekedett keringő TM lektinszerű doménnel rendelkező egerek diabéteszes nephropathiájának javulása és a lektinszerű domént nem tartalmazó egerek betegségének romlása alátámasztja az rhTM vesefibrózisra kifejtett jótékony hatását.20,21

A podocita apoptózis gátlása

A podociták kritikus szerepet játszanak a glomeruláris filtrációs gát fenntartásában és a hasított membrán kialakításában, hogy megakadályozzák az esszenciális keringő fehérjék elvesztését.47Vese sérülésreaktív oxigénfajták, magas glükóz vagy gyulladásos mediátorok, köztük a TGFb1 által okozott podociták apoptózisát indukálják, ami podocita deplécióhoz vezet, ami végül veseműködési zavarhoz vezethet.47 A szerin/treonin kináz transzmembrán transzmembrán I-es és II-es típusú receptorkomplexum megkötése és aktiválása után , a TGFb1 intracelluláris jeleket bocsát ki a Smad transzkripciós faktorok családján vagy Smad-független jelátviteli útvonalakon keresztül.48 A Smad-dependens útvonal aktiválása akkor következik be, amikor az aktivált TGFb1 receptor foszforilálja a Smad2-t és a Smad3-at, amelyek a Smad4-gyel a sejtmagba transzlokálódnak.49 A Smad2/ A Smad3/Smad4 komplex serkenti a proapoptotikus faktorok transzkripcióját és csökkenti a sejt apoptózishoz vezető antiapoptotikus faktorokét.49 Ezzel összhangban a Bax proapoptotikus faktor magas veseszintjét és a Bcl2 és Bcl-XL antiapoptotikus faktorok alacsony szintjét találtuk. TGFb1- TG egerekben. A TM képes gátolni különböző sejttípusok apoptózisát.21,41,49 Ezzel összhangban azt találtuk, hogy az rhTM gátolja a podociták hidrogén-peroxid, magas glükóz vagy TGFb1 által indukált apoptózisát, és ez a megállapítás magyarázhatja az rhTM jótékony hatását CKD-ben. . Ezenkívül az rhTM megbillentette az egyensúlyt az apoptózis gátlása felé a Bax expressziójának csökkentésével, a Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 és BIRC6 expressziójának növelésével, valamint az Akt útvonal aktivációjának fokozásávalvese szövetei. Összességében ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy az rhTM serkenti a podocita túlélését azáltal, hogy előnyben részesíti az Akt aktivációt és az antiapoptotikus faktor expresszióját.

cistanche krónikus vesebetegség esetén

Az EMT gátlása

A podociták EMT-je szintén hozzájárul a vesefifibrózishoz. Az EMT-n átesett podociták extracelluláris mátrixfehérjéket szabadítanak fel, amelyek a TGFb{0}}asszociált vesefibrogenezis során halmozódnak fel és rakódnak le.50 A TGFb1 a Smad2/Smad3/Smad4 komplex receptor-mediált aktiválása révén elősegíti az EMT-t. A foszforilált Smad3 elősegíti az EMT-t azáltal, hogy serkenti a mátrix fehérjék transzkripcióját és csökkenti az epiteliális markerek expresszióját.51 Ezzel összhangban megnövekedett podociták EMT-t találtunk TGFb1-TG egerekben és TGFb1 jelenlétében vagy alatt tenyésztett podocitákban. oxidálószeres vagy magas glükóztartalmú körülmények között. Korábbi jelentések azt sugallták, hogy az rhTM elnyomja az EMT-t.52,53 Itt azt találtuk, hogy az rhTM gátolja a podociták és a tubulointersticiális epiteliális sejtek EMT-jét TGFb1-TG egerekben. Úgy tűnik, hogy a Smad fehérje aktiválásának gátlása az rhTM EMT-re gyakorolt ​​jótékony hatásának mechanizmusa, mivel az rhTM-mel kezelt TGFb1-TG egerek és primer podociták a Smad2 és Smad3 szignifikánsan csökkent foszforilációját mutatták a kezeletlen állapotokhoz képest. Ezek az eredmények alátámasztják a TM gátló hatását az EMT-re.

Receptor közvetítés az rhTM védőaktivitásban

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a GPR15 vagy az FGFR1 közvetíti a TM.26,27,54 citoprotektív aktivitását. Megvizsgáltuk, hogy ezek a receptorok közvetítik-e az rhTM apoptózissal és EMT-vel szembeni védőaktivitását. Míg a GPR15 fehérje siRNS általi leszabályozása teljesen megszüntette az rhTM szuppresszív aktivitását a podociták TGFb1- által közvetített apoptózisára, sem az FGFR1 siRNS, sem annak inhibitora nem szüntette meg, ami arra utal, hogy a GPR15 közvetíti az rhTM védőaktivitást. Az rhTM-kezelést követően tenyésztett podocitákban és TGFb1-TG egerekből izolált podocitákban az Akt fokozott foszforilációja figyelhető meg, ami az intracelluláris Akt útvonal érintettségére utal. Egy munka, amely azt mutatja, hogy az rhTM aktiválja az Akt útvonalat az endothel sejtekben, alátámasztja ezt a megállapítást.55 Az Akt jelátviteli útvonal aktiválása tovább erősítheti az rhTM hatást a GPR15 felszíni expressziójának növelésével.56 Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy az rhTM megvédi a podocitákat az apoptózistól a TGFb{-nkban. {13}}TG egerek a GPR15/Akt tengely aktiválásával, ami az antiapoptotikus faktorok fokozott expressziójához és a proapoptotikus faktorok csökkent expressziójához vezet.57 Másrészt korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a C3a és C5a anafilatoxinok GPR-jeik révén hozzájárulhatnak a CKD a podociták sérülésével, és hogy az APC endothel protein C receptora és proteáz által aktivált receptora 1.23,58–61 révén gátolja a podocita apoptózist és a vesefibrózist. Itt azt találtuk, hogy az rhTM gátolja a komplementrendszert és növeli az APC képződését. Ezért a GPR15/Akt útvonal aktiválásán kívül a komplement faktorok gátlása, valamint a protein C és receptorai fokozott aktivációja is megmagyarázhatja az rhTM jótékony hatását a mi TGFb1-kapcsolatunkban.vesefifibrózis modell.

Ezenkívül a GPR15 leszabályozása, de az FGFR1é nem, blokkolta az rhTM gátló hatását az EMT-re, ami arra utal, hogy a GPR15 is közvetíti ezt az rhTM védőaktivitást. A Smad fehérjék gátlása szerepet játszik az EMT-szuppresszióban, mivel az rhTM-kezelés gátolta mind a Smad2, mind a Smad3 foszforilációját TGFb1-TG egerekben és tenyésztett podocitákban. A Smad fehérje GPR15-ön keresztüli gátlásának pontos mechanizmusa azonban nem világos. Egyes bizonyítékok azt mutatják, hogy az Akt útvonal áthalmozhatja a Smad jelátviteli útvonalat, és szabályozhatja azt,62–64, és hogy az Akt megakadályozhatja a Smad3 foszforilációját azáltal, hogy közvetlenül kölcsönhatásba lép a nem foszforilált Smad3-mal, hogy a sejtmagon kívül megkösse, ami a transzkripció és az EMT gátlásához vezet.62– 64 Ezen jelentések alapján elképzelhető, hogy az rhTM GPR15-höz való kötődése után aktiválódó Akt megköti a nem foszforilált Smad3-at, ami podocita EMT gátláshoz vezet. Érdemes megjegyezni, hogy ez az Akt által közvetített jótékony hatás csak nem rosszindulatú sejtekben figyelhető meg.65–67 Rosszindulatú sejtekben a TGFb1 kölcsönhatása receptoraival közvetlenül aktiválhatja a foszfoinozitid 3-kináz/Akt/Csiga útvonalat, és okozhat EMT.65–67 Összességében vizsgálatunk eredményei alátámasztják a GPR15 receptor szerepét, amely az rhTM podocitákra gyakorolt ​​jótékony hatásait közvetíti.

Következtetés

Összefoglalva, itt közölünk először egy új, transzgenikus TG egeret, amely túlzottan expresszálja a teljes hosszúságú humán TGFb1 gént kifejezetten olyan glomerulusokban, amelyek spontán és progresszív glomeruláris szklerózist, tubulointersticiális fibrózist ésveseelégtelenségés a megállapított vesefibrózis/veseelégtelenség enyhítése a GPR15-tel való rhTM kölcsönhatás révén, amely gátolja a podociták apoptózisát és mezenchimális átalakulását.

MÓD

A TGFb1 BAC TG egér létrehozása

A teljes hosszúságú humán TGFb1 gént az egér podocin promoter szabályozása alatt expresszáló TGFb1-BAC-TG egeret 392 C57BL/6J egérembrióba (CLEA Japan, Inc., Tokió, Japán) pronukleáris injekcióval hoztuk létre. Felmértük a BAC TG konstrukció TG alapítóit és csíravonal átvitelét Southern blotting segítségével (kiegészítő anyagok és módszerek).

Kísérleti állatok

A TGFb1-TG egereket több mint 10 generáción keresztül tenyésztették C57BL/6 háttérben, mielőtt a kísérletekben felhasználták volna. Kontrollállatként WT alomtársakat használtunk. Valamennyi állatot meghatározott kórokozómentes környezetben tartottunk, és 12-órás világos-sötét ciklusnak vetettük alá 22 fok és 26 fok, illetve 40 százalék és 70 százalék közötti környezeti hőmérsékleten és páratartalom mellett, ad libitum hozzáféréssel. élelmiszerhez és vízhez a Mie Egyetem állatházában (kiegészítő anyagok és módszerek).

Etikai nyilatkozat

A Rekombináns DNS-kísérletek biztonsági bizottsága (jóváhagyási szám: I-629; dátum: 2013. szeptember 19.) és a Mie Egyetem Állatvizsgálati Bizottsága (jóváhagyási szám: 27-4; dátum: 2015. augusztus 19.) jóváhagyta a vizsgálati protokollokat. Valamennyi állatkísérletet a Mie Egyetem intézményi irányelveinek megfelelően és az Országos Egészségügyi Intézet (https://olaw.nih.gov/) által közzétett laboratóriumi állatok gondozásának nemzetközileg jóváhagyott elveit követve végezték.

A klinikai vizsgálathoz minden beteg és egészséges alany írásos beleegyezését adta, a vizsgálati protokollt pedig a Mie Egyetem Klinikai Vizsgálatok Etikai Bizottsága hagyta jóvá (1043. és 2194. számú jóváhagyás).

Kísérleti terv

Jellemzésére avesefifibrosis modellt, a 20-23 g tömegű, 4 hetes hím TGFb{{0}}TG egereket (n=24) és hím WT egereket (n=12) 3 csoportba soroltuk. 8 TGF b1-TG egérrel és 4 WT egérrel minden csoportban. Az egyes WT- és TGFb1-TG-csoportok egereit a 0., 8. vagy 16. héten elaltatták, hogy vizelet-, vér- és vesemintát vegyenek a fifibrózis és a vesefunkciós paraméterek időbeli változásainak értékeléséhez.

Az rhTM terápiás hatékonyságának értékeléséhez (az rhTM-et az Asahi Kasei Pharma Corporation, Tokió, Japán biztosította) vesefibrózisban, TGFb1-TG egerekben (n= 8) vagy WT alomtársakban (n {{2) }}) rhTM-mel (3 mg/kg) kezeltük ip injekcióval, hetente háromszor az egerek leölése előtti 4 hét során. Negatív kontroll egerekként TGFb1-TG egereket (n =8) vagy WT alomtársakat (n= 8) ​​használtunk, amelyek azonos mennyiségű fiziológiás SAL-t kaptak ip injekcióval.

A jelen tanulmány protokollja követte az Animal Research: Reporting of In vivo Experiments (ARRIVE) állatkísérletekre vonatkozó irányelveit. Az egereket véletlenszerűen besorolták, és a paramétereket mérő kutatókat elvakították a kezelési csoportoktól.

Biokémiai elemzés

Az összfehérje (BCA protein assay kit; Pierce, Rockford, IL), a TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), a monocita kemoattraktáns fehérje-1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), a trombin antitrombin komplex (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Kanada) mértük kereskedelmi forgalomban lévő enzim immunoassay kittel a gyártó utasításait követve (Kiegészítő anyagok és módszerek).

Sejttenyésztés

A humán podocita primer sejteket a CELPR OGEN-től (Torrance, CA) vásároltuk. A humán podocita primer sejteket Dulbecco módosított Eagle táptalajban tenyésztettük párásított, 5 százalékos CO2 atmoszférában 37 °C-on. A táptalajt 10 százalékos hővel inaktivált magzati szarvasmarha-szérummal (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 NE/ml penicillinnel, 100 mg/ml sztreptomicinnel és L-glutaminnal (kiegészítő anyagok és módszerek) egészítettük ki.

Statisztikai analízis

Az adatok medián±interkvartilis tartományban vannak kifejezve. A változók közötti statisztikai különbséget Kruskal-Wallis varianciaanalízissel, post hoc analízissel, Dunn-teszt segítségével számítottuk ki. Mann-Whitney U tesztet használtunk a két csoport közötti különbségek értékelésére. A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism 8.0.1 verziójával végeztük (GraphPad Software, San Diego, CA). A statisztikai szignifikancia értéke P <>

KÖZZÉTÉTEL

Az EKG, a CND-G és az YY szabadalmaztatták a TGFb1-TG egeretvesefibrózisjelen tanulmányban használt. A CND-G és az YY a japán Oktatási, Kulturális, Sport-, Tudományos és Technológiai Minisztériumtól kapott támogatást jelen tanulmány elkészítéséhez. Az EKG, a TY, a CND-G és az MT támogatást kapott a Shionogi Pharmaceuticalstól. Az összes többi szerző nem nyilatkozott egymással versengő érdekekről.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a kutatást részben a Japán Oktatási, Kulturális, Sport-, Tudományos és Technológiai Minisztérium (Kakenhi no. 17K09824 a YY esetében; Kakenhi no. 17K08442 a CND-G esetében), részben pedig a Shionogi támogatása támogatta. & Co, Ltd., Japán. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmány megtervezésében, az adatok elemzésében, a kiadásról szóló döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Ennek a munkának egy része absztrakt formában jelent meg.

A SZERZŐ HOZZÁJÁRULÁSAI

AT elkészítette a betegségmodellt és megírta a kézirat első vázlatát. TY, KN, TT, RI és CND-G készítette a betegségmodelleket és mért paramétereket. AM és SW végezte a transzmissziós mikroszkópos vizsgálatot. MT, YO és AU mérte a paramétereket és végezte el az in vitro kísérleteket. YT, LQ, TK és VFD biztosítottak szellemi hozzájárulást. YY és EKG kijavította a kézirattervezetet, és megtervezte a tanulmányt.

cistanche veseelégtelenség tüneteire

KIEGÉSZÍTŐ ANYAG

Kiegészítő fájl (PDF) Kiegészítő anyagok és módszerek.

S1 táblázat. A tantárgyak jellemzői.

S2 táblázat. Primerek egérszövetek RT-PCR-éhez.

S3 táblázat. Primerek humán podociták RT-PCR-hez.

S1 ábra. Az oldható thrombomodulin fragmentumok korrelálnak a TGFb1-gyel és a kreatininnel DM-ben szenvedő betegekben.

S2 ábra. Humán TGFb1 – bakteriális mesterséges kromoszóma (BAC) konstrukció. S3 ábra. Alapító egerek, amelyek a teljes hosszúságú humán TGFb1 gént expresszálják.

S4 ábra. A glomerulus-specifikus transzformáló növekedési faktor b1 transzgenikus egér jellemzése.

S5 ábra. A humán TGFb1 transzgenikus egér fokozott vesekárosodás markerekkel rendelkezik.

S6 ábra. A rekombináns humán thrombomodulinnal (rhTM) végzett terápia csökkenti a podociták lábfolyamatból való kiürülését és a glomeruláris alapmembrán megvastagodását.

S7 ábra. A rekombináns humán trombomodulinnal (rhTM) kezelt TGFb1 transzgenikus egerekben alacsony a profibrotikus faktorok és a HMGB1 koncentrációja a veseszövetben. S8 ábra. A rekombináns humán thrombomodulinnal (rhTM) végzett terápia fokozza az aktivált protein C képződését, gátolja a komplementrendszert, csökkenti a keringő oldható podocint, bár nincs hatással a TGFb1 transzgenikus egerek koagulációs rendszerére.

S9 ábra. A rekombináns humán thrombomodulinnal (rhTM) végzett terápia csökkenti a podocin vizeletkoncentrációját.

S10 ábra. A rekombináns humán thrombomodulinnal (rhTM) végzett terápia csökkenti a glomeruláris sejtek apoptózisát.

S11 ábra. A TGFb1-túlexpresszióval összefüggő vesefifibrózis kezelése rekombináns humán thrombomodulinnal (rhTM) gátolja az apoptózist a veseszövetben.

S12 ábra. A rekombináns humán thrombomodulin (rhTM) növeli az antiapoptotikus faktorok expresszióját a podocitákban.

S13 ábra. A rekombináns humán thrombomodulin (rhTM) elnyomja a podociták hidrogén-peroxid által kiváltott apoptózisát.

S14 ábra. A rekombináns humán thrombomodulin (rhTM) elnyomja a podociták magas glükózszint által kiváltott apoptózisát.

S15 ábra. A rekombináns humán thrombomodulin (rhTM) fokozza az Akt útvonalak aktiválódását a podocitákban.

S16 ábra. A rekombináns humán trombomodulinnal (rhTM) végzett terápia növeli az Akt foszforilációt a TGFb1-TG egerekből származó podocitákban.

S17 ábra. Az egerek mindegyik kezelési csoportjából származó podociták GPR15 mRNS-t expresszálnak.

S18 ábra. A GPR15 festése egészséges egyén és fokális szegmentális glomerulosclerosisban szenvedő beteg podocitáiban.

S19 ábra. A fibroblaszt növekedési faktor receptor-1 nem vesz részt a rekombináns humán thrombomodulin (rhTM) podocitákban történő gátló aktivitásában.

S20 ábra. A rekombináns humán thrombomodulin (rhTM) gátolja a podociták epiteliális-mezenchimális átmenetét.

S21 ábra. A rekombináns humán thrombomodulinnal (rhTM) végzett terápia gátolja az a-simaizom aktin expresszióját a vesetubulusokban.

S22 ábra. A G-protein-kapcsolt receptor (GPR15) közvetíti a rekombináns humán thrombomodulin (rhTM) gátló hatását a podociták epiteliális-mezenchimális átmenetére.

Kiegészítő hivatkozások.

IRODALOM

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, et al. Krónikus vesebetegség. Gerely. 2017;389:1238–1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli M és mtsai. A globális vese egészségügyi állapotának felmérése. JAMA. 2017;317:1864–1881.

3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J és mtsai. Globális veseegészségügy 2017-ben és utána: ütemterv az ellátás, a kutatás és a politika hiányosságainak megszüntetésére. Gerely. 2017;390:1888–1917.

4. Ackland P. Krónikus vesebetegség prevalenciája, kimutatása, értékelése és kezelése. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK, et al. Krónikus vesebetegség kezelése. Kidney Int. 2012;81:351–362.

6. Dr. Breyer, Susztak K. A krónikus vesebetegség terápiájának következő generációja. Nat Rev Drug Discov. 2016;15:568–588.

7. Liu Y. Vesefibrózis: új betekintés a patogenezisbe és a terápiába. Kidney Int. 2006;69:213–217.

8. Liu Y. A vesefibrózis sejtes és molekuláris mechanizmusai. Nat Rev Nephrol. 2011;7:684–696.

9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K et al. Az endoteliális TGF-béta jelátvitel korlátozása elegendő az endoteliális-mezenchimális átmenet és a fifibrózis csökkentéséhez CKD-ben. J Am Soc Nephrol. 2015;26:817–829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, et al. TGF-béta1/p53 jelátvitel a vesefibrogenezisben. Cell Signal. 2018;43:1–10.

11. Conway EM. A trombomodulin és szerepe a gyulladásban. Semin Immunopathol. 2012;34:107–125.

12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. A trombomodulin és a vaszkuláris endotélium: betekintés a funkcionális, szabályozási és terápiás szempontokba. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.

13. Morser J. A trombomodulin a véralvadást a gyulladáshoz és az immunitáshoz köti. Curr Drug Targets. 2012;13:421–431.

14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. A trombomodulin gátolja az eozinofilek és a hízósejtek aktiválódását. Cell Immunol. 2015;293:34–40.

15. Takagi T, Taguchi O, Toda M és mtsai. Az allergiás bronchiális asztma thrombomodulin általi gátlását dendritikus sejtek közvetítik. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:31–42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Dual modulating functions of thrombomodulin in the alternative komplement pathway. Biosci Trends. 2016;10:231–234.

17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T és munkatársai. A trombomodulin modulálja a dendritikus sejteket a nagy mobilitású fehérje B1 antagonizmusa és egy független mechanizmus révén. Allergol Int. 2014;63:57–66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A et al. A thrombomodulin lektinszerű doménje megzavarja a komplement aktivációt és védelmet nyújt az ízületi gyulladás ellen. J Thromb Haemost. 2006;4:1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT és munkatársai. Az oldható trombomodulin védi az ischaemiás veséket. J Am Soc Nephrol. 2009;20:524–534.

20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K et al. A thrombomodulin lektinszerű doménje komplement gátláson keresztül javítja a diabéteszes glomerulopathiát. Thromb Haemost. 2012;108:1141–1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL és mtsai. A trombomodulin 1-es domén javítja a diabéteszes nefropátiát egerekben az anti-NF-kappaB/NLRP3 gyulladás által közvetített gyulladáson, az NRF2 antioxidáns aktivitásának fokozásán és az apoptózis gátlásán keresztül. Diabetologia. 2014;57:424–434.

22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Soluble thrombomodulin activity and soluble thrombomodulin antigen in plasma. J Thromb Haemost. 2005;3: 976–982.

23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, et al. Az exogén aktivált protein C gátolja a diabéteszes nephropathia progresszióját. J Thromb Haemost. 2012;10:337–346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. A cukorbetegség javulása S proteinnel. Cukorbetegség. 2016;65:1940–1951.

25. Havasi A, Borkan SC. Apoptózis és akut vesekárosodás. Kidney Int. 2011;80:29–40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK és munkatársai. Az FGFR1 közvetíti a rekombináns trombomodulin domén által indukált angiogenezist. Cardiovasc Res. 2015;105:107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S et al. A trombomodulin ötödik epidermális növekedési faktor-szerű régiója a GPR15-tel való kölcsönhatás révén enyhíti az LPS által kiváltott szepszist. Thromb Haemost. 2017; 117:570–579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W et al. A podocita citoszkeletonokhoz nélkülözhetetlen gének genomszintű azonosítása egysejtű RNS szekvenálás alapján. Kidney Int. 2017;92:1119–1129.

29. Vigolo E, Marko L, Hinze C és mtsai. A kanonikus BMP jelátvitel a tubuláris sejtekben az akut vesekárosodás utáni felépülést közvetíti. Kidney Int. 2019;95:108–122.

30. Nangaku M. Krónikus hipoxia és tubulointerstitialis sérülés: a végső közös út a végstádiumú veseelégtelenséghez. J Am Soc Nephrol. 2006;17: 17–25.

31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Krónikus vesebetegség és szövődményei. Alapellátás. 2008;35:329–344, vii.

32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA, et al. A fibrotikus mátrix fehérjék és a transzformáló növekedési faktor-béta (TGF-béta) izoformák vese expressziója TGF-béta transzgenikus egerekben. J Am Soc Nephrol. 1999;10:271–280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, et al. A Myo1c motorfehérje szabályozza a transzformáló növekedési faktor-béta-jelzést és a fifibrózist a podocitákban. Kidney Int. 2019;96:139–158.

34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L és munkatársai. Az endotelin receptor-A a glomeruláris endoteliális felszíni réteg lebomlását közvetíti az aktivált podociták és a glomeruláris endoteliális sejtek közötti patológiás áthalláson keresztül. Kidney Int. 2019;96:957–970.

35. Fu J, Lee K, Chuang PY és mtsai. Glomeruláris endoteliális sejtsérülés és keresztbeszéd diabéteszes vesebetegségben. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F287– F297.

36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA és mtsai. A módosított pásztázó elektronmikroszkópia kóros áthallást tár fel az endothel sejtek és a podociták között a membranoproliferatív glomerulonephritis egérmodelljében. Sci Rep. 2018;8:10276.

37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D és mtsai. A proximális tubuláris sejtek elősegítik a fifibrogenezist a peritubuláris myofibroblasztok TGF-béta1-közvetített indukciója révén. Kidney Int. 2002;61:2066–2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL, et al. Vesetubulus-sérülés: a krónikus vesebetegség hajtóereje. Kidney Int. 2018;93:568–579.

39. Loefflfler I, Wolf G. A növekedési faktor-béta transzformációja és a vesebetegség progressziója. Nephrol Dial Transplant. 2014;29 (1. melléklet):i37–i45.

40. Murakami K, Takemura T, Hino S és mtsai. Vizelet transzformáló növekedési faktor-béta glomeruláris betegségben szenvedő betegeknél. Pediatr Nephrol. 1997;11:334–336.

41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H és mtsai. A sejt apoptózisának gátlása és a tüdőfibrózis enyhítése trombomodulinnal. Am J Pathol. 2017;187:2312–2322.

42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y és társai. Rekombináns humán thrombomodulin az idiopátiás tüdőfibrózis akut exacerbációjában. Mellkas. 2015;148:436–443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T és társai. Thrombomodulin az idiopátiás pulmonalis fifibrosis akut exacerbációihoz: a koncepció vizsgálata. Pulm Pharmacol Ther. 2014;29:233–240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Optimális betegválasztás véralvadásgátló terápiához szepszisben: bizonyítékokon alapuló javaslat Japánból. J Thromb Haemost. 2018;16:462–464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X és mtsai. A nagy mobilitású csoportdoboz 1 (HMGB1) szerepe a vesebetegségek patogenezisében. Acta Pharm Sin B. 2016;6:183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T és társai. A trombin dózisfüggő eltérő hatásai allergiás bronchiális asztmában. J Thromb Haemost. 2013;11:1903–1915.

47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL et al. Új betekintés a podocita biológiájába a glomeruláris egészségben és betegségekben. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang YE. Smad-függő és Smad-független útvonalak a TGF-béta család jelátvitelében. Természet. 2003;425:577–584.

49. Schuster N, Krieglstein K. Mechanisms of TGF-beta-mediated apoptosis. Cell Tissue Res. 2002;307:1–14.

50. Greka A, Mundel P. Podocyták sejtbiológiája és patológiája. Annu Rev Physiol. 2012;74:299–323.

51. Isaka Y. A TGF-béta jelátvitel megcélzása vesefifibrosisban. Int J Mol Sci. 2018;19:2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK és társai. A thrombomodulin befolyásolja a nem metasztatikus vastag- és végbélrákos betegek túlélését az epithelialis-mezenchimális átmeneten (EMT) keresztül. PLoS One. 2016;11:e0160550.

53. Zheng N, Huo Z, Zhang B és mtsai. A thrombomodulin csökkenti a tüdőráksejtek tumorigén és metasztatikus potenciálját az E-cadherin fokozásával és az N-cadherin expressziójának leszabályozásával. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476:252–259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C és társai. A 15-ös G-protein-kapcsolt receptor közvetíti a trombomodulin angiogenezist és citoprotektív funkcióját. Sci Rep. 2017;7:692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH és mtsai. A rekombináns trombomodulin anti-autofágiás hatást fejt ki az endothel sejtekben, és érelmeszesedés-ellenes hatást fejt ki az apolipoprotein E hiányos egerekben. Sci Rep. 2017; 7: 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B és mtsai. PI3K/Akt jelátvitel által közvetített fehérje felszíni expresszió, amelyet a 14-3-3 kölcsönható motívum érzékel. FEB J. 2009;276:5547–5558.

57. Sanchez-Capelo A. A TGF-béta1 kettős szerepe az apoptózisban. Cytokin Growth Factor Rev. 2005;16:15–34.

58. Griffifin JH, Zlokovic BV, Mosnier LO. Aktivált protein C, proteáz által aktivált receptor 1 és neuroprotekció. Vér. 2018;132:159–169.

59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T et al. Az aktivált protein C védelmet nyújt a diabéteszes nefropátia ellen azáltal, hogy gátolja az endothel és a podocita apoptózist. Nat Med. 2007;13:1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, et al. Az anafilatoxinok szerepe az egészségben és a betegségekben. Mol Immunol. 2009;46:2753–2766.

61. Morigi M, Perico L, Corna D és munkatársai. A C3a receptor blokád megvédi a podocitákat a diabetikus nefropátia sérülésétől. JCI Insight. 2020;5: e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, et al. Az Akt közvetlenül kölcsönhatásba lép a Smad3-mal, hogy szabályozza a TGF-béta által kiváltott apoptózissal szembeni érzékenységet. Nat Cell Biol. 2004;6:366–372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Jelátviteli útvonal együttműködés a TGF-béta-indukált epiteliális-mezenchimális átmenetben. Curr Opin Cell Biol. 2014;31:56–66.

64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. A PKB/Akt modulálja a TGF-béta jelátvitelt a Smad3-mal való közvetlen interakción keresztül. Nat Cell Biol. 2004;6: 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N és társai. A TGF-béta elősegíti a PI3K-AKT jelátvitelt és a prosztataráksejtek migrációját a p85alfa TRAF6-közvetített ubiquitilációján keresztül. Sci Signal. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Z, Weber JC, Han Z és mtsai. Az Akt jelátvitel dichotómiás hatásai emlőrákban. Mol Rák. 2012;11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S és mtsai. A FAM83A jelátvitel a PI3K/AKT/Snail útvonalon keresztül epiteliális mezenchimális átmenetet indukál NSCLC-ben. Öregedés (Albany NY). 2019;11:6069–6088.