Ma a sejtek öregedését a szaporodó sejtek szinte minden típusának gyakori reakciójának tekintik

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

AbsztraktAz öregedésgátló terápia egyik alaptrendje az öregedő sejtek célzott eltávolítása, elemzése. A szívglikozidokról a közelmúltban bebizonyosodott, hogy széles spektrumú szenolitikumok. Itt a szívglikozidok szenolitikus tulajdonságait vizsgáltuk humán mesenchymális őssejtekkel (hMSC) szemben. A szívglikozidoknak nem volt szenolitikus képességük a különböző eredetű öregedő hMSC-kkel szemben. Biológiai és bioinformatikai megközelítések segítségével összehasonlítjuk a szívglikozidokra érzékeny A549 és az érzéketlen hMSC-k öregedési fejlődését. Az analízis hiányát a hatékony káliumimport és a megnövekedett apoptózis rezisztencia közvetíti az öregedő hMSC-kben. Az „antiapoptotikus védelem” gyengülése hajlamosítja a hMSC-ket az elemzésre. Felfedtük, hogy az apoptózis rezisztencia, amelyet korábban az öregedés közös jellemzőjeként ismertek fel, valójában nem az öregedő sejtek általános jellemzője. Ezenkívül csak az apoptózis-prolin öregedő sejtek érzékenyek a szívglikozidok által kiváltott elemzésre. Így feltételezhetjük, hogy az elemzés hatékonysága attól függhet, hogy az öregedő sejtek valóban apoptózis-rezisztenssé válnak-e proliferáló társaikhoz képest.

KulcsszavakŐssejtek. Senolysis·Senescence·Apoptosis·Stress-rezisztencia

További információért kattintson ide

Bevezetés

Manapság a sejtek öregedését a proliferáló sejtek szinte minden típusában, beleértve a rákos sejteket és az őssejteket, valamint egyes poszt-mitózisos sejteket, gyakori reakciónak tekintik különféle stresszes ingerekre [1-3]. Az indukáló faktor eredete szerint a sejtöregedés következő típusai különböztethetők meg: replikatív (a telomerek lerövidült végeinek DNS-károsodása miatt), onkogén által kiváltott (az onkogén jelátvitel aberráns aktiválódására válaszul), stressz által kiváltott ( oxidatív stressz, hősokk, UV és y sugárzás stb. által okozott DNS-károsodás, valamint kemoterápia által kiváltott (a rákos sejtekben aktiválódik kemoterápiás gyógyszerek hatására)[4-7]. Az öregedő sejtek által kifejezett markerek heterogenitást mutatnak a sejttípustól és az öregedés kiváltására használt inzultustól függően. Azonban számos közös jellemző van a legtöbb öregedő sejttípusra. Bármilyen osztódó sejt öregedésének alapvető jellemzője az irreverzibilis proliferációs veszteség [8].cistanche tubulosa kivonatA sejtciklus leállásának visszafordíthatatlanságát a ciklin-dependens kináz (CDK) pl6 és p21 inhibitorok szabályozzák, és gyakran a p53 tumorszuppresszor fehérje szabályozza [8,9]. Az öregedő sejtek másik fontos jellemzője a perzisztens DNS-károsodási válasz aktiválása; sejthipertrófia, amely gyakran a riboszómális biogenezis és a fehérjeszintézis károsodása következtében alakul ki; a lizoszóma lebomlásának zavara és a többi lebontó rendszer diszfunkciója; a specifikus lizoszómális enzim öregedéssel kapcsolatos - -galaktozidáz aktivitásának növekedése; különféle mitokondriális elváltozások; az öregedéssel összefüggő szekréciós fenotípus (SASP) megszerzése, amely proinflammatorikus faktorokból, mátrixbontó enzimekből, reaktív oxigénfajtákból stb. áll; epigenetikai és kromatin tájváltozások, ideértve az öregedéssel összefüggő heterokromatikus gócok kialakulását és a műholdak öregedéssel összefüggő kitágulását [8-10]. Más szóval, az öregedő sejtek megőrzik az anyagcsere-aktivitást és a vitalitást, de működésük jelentősen megváltozik a az eredet sejtek.

A Cistanche öregedésgátló hatású

Ma már világos, hogy az öregedő sejtek módosíthatják a környező mikrokörnyezetet, mind a szomszédos sejteket, mind a sejtréseket érintve, ami szöveti működési zavarokhoz vezethet, és így összefüggésbe hozható az öregedés és az életkorral összefüggő betegségek előrehaladásával [11,12]. Ezt szem előtt tartva manapság nagyobb figyelem irányul az elöregedett sejtek célzott „megölésére” irányuló stratégiákra[13-15]. Ennek érdekében aktívan fejlődik egy új gyógyszercsoport, a szenolitikumok. A senolitikumok olyan jelátviteli útvonalakat céloznak meg, amelyek hozzájárulnak az öregedő sejtek apoptózissal szembeni rezisztenciájához, így elsősorban az öregedő sejtekben indukálják az apoptózist[16]. A szenolitikumok listája folyamatosan új szerekkel bővül. A legismertebb szenolitikus hatású vegyületek a navitoklax (Bcl{5}} család inhibitora), a dasatinib (több tirozin-kináz inhibitora) és a kvercetin (természetes flavonol), Hsp90 inhibitorok, MDM2 inhibitorok, FOXO{ kombinációja. {8}}p53 interferáló peptid, a BET család fehérjebontója, uPAR-specifikus CAR-T, galaktokonjugált navitoklax és különféle szenolitikus természetes vegyületek[16-24]. A közelmúltban nagy áteresztőképességű gyógyszerszűréssel két független kutatócsoport a szívglikozidokat, különösen az ouabaint, a digoxint és a bufalint széles spektrumú szenolitikumként azonosította [25,26].cistanche tubulosa véleményekÉrdemes megemlíteni, hogy szinte minden deklarált szenolitikumnak vannak korlátai, például nemkívánatos mellékhatások vagy hatástalanság bizonyos sejttípusokkal szemben. A szinte minden posztnatális szervben/szövetben megtalálható mesenchymális őssejteket (MSC) az önmegújulási (szimmetrikus osztódások) és differenciálódási képesség jellemzi, így hozzájárulnak az ott élő szövetek fenntartásához és regenerálódásához [27]. Ezeknek az egyedülálló tulajdonságoknak, valamint a hatékony gyulladáscsökkentő és immunszuppresszív funkcióknak köszönhetően az MSC-ket széles körben alkalmazzák a sejtpótló terápiában különféle betegségek, köztük a diabetes mellitus, sclerosis multiplex, szívinfarktus és így tovább [28]. Differenciált utódaikhoz és más unipotens sejtekhez hasonlóan azonban az MSC-k képesek replikatívan vagy idő előtt öregedni, válaszul az onkogének aktiválódására és stresszes ingerekre [29, 30]. Az MSC-k öregedésének számos nemkívánatos következménye van, köztük a kimerültség. az őssejtek készletének csökkenése, csökkent szövetfenntartás és regeneráció, károsodott differenciálódási képesség, SASP által közvetített öregedési terjedés, csökkent angiogén tulajdonságok, őssejt-rés módosulása [29,31-33]. Figyelembe véve az MSC-k megfelelő működésének biológiai jelentőségét, az öregedő MSC-k tekinthetők az elemzés döntő célpontjának. Ezzel a javaslattal összhangban az elmúlt évben számos olyan áttekintés jelent meg, amelyek kiemelik az öregedő MSC-k eltávolításának lehetséges előnyös eredményeit [29, 31, 34, 35]. Ennek ellenére csak néhány kísérleti adat áll rendelkezésre erről a problémáról [36-40].

A jelen tanulmányban először mutatjuk be, hogy a szívglikozidok, nevezetesen az ouabain és a bufalin nem fejtenek ki hemolitikus aktivitást az endometriumból (END-MSC), zsírszövetből (AD-MSC) származó humán MSC-k (hMSC) ellen. fogpép (DP-MSC-k) és Warton-zselé (WJ-MSC-k). Ezen túlmenően megerősítjük, hogy mindkét szívglikozid képes apoptózist előidézni elsősorban az elöregedett A549-ben és SK-HEP-ben-1, amint azt korábban leírtuk. a pilot vizsgálatokban [25,26]. A Nat/K plusz -ATPáz blokkolása és a kapcsolódó gének expressziós szintje által okozott ionos homeosztázis változásainak felmérésével kiderült, hogy az ouabain-indukált analízis hiányát a kompenzáló K plusz import fokozott hatékonysága közvetítheti az öregedő END-ben. MSC-k az öregedő A549-hez képest. Továbbá fejlett bioinformatika segítségével kimutattuk, hogy az ouabain-indukált analízisre rezisztens END-MSC-k öregedését apoptózis-rezisztens fenotípus megszerzése kíséri, míg az ouabain-érzékeny A549 öregedését nem. Fontos, hogy az antiapoptotikus fehérje MCL-1 aktivitásának blokkolása a szívglikozidos kezelés előtt apoptózis-rezisztens öregedő END-MSC-k elemzését eredményezte. Ezért egyértelmű bizonyítékot szolgáltatunk arra, hogy az apoptózis-rezisztencia nem általános jellemzője az öregedő sejteknek. A kapott adatok alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy az analitikai megközelítések hatékonysága attól függhet, hogy a sejtek valóban apoptózisrezisztenssé váltak-e az öregedés során.

Anyagok és metódusok

Sejtek

Az END-MSC-ket, a WJ-MSC-ket, a DP-MSC-ket, az AD-MSC-ket, az A549-et és az SK-Help-et a Russian Collection of Cell Cultures-től szereztük be (Citológiai Intézet, Szentpétervár, Oroszország). Az A549 és SK-Help vonalakat kariológiai, tumorogenitási, izoenzim (LDH és G6PD) tesztekkel és STR analízissel hitelesítettük. A sejteket 10% FBS-sel (HyClone), 1% penicillin-sztreptomicinnel (Gibco BRL) és 1% glutaminsavval (Gibco BRL) kiegészített komplett DMEM F12 (Gibco BRL) tápközegben tenyésztettük. Minden sejtet rutinszerűen teszteltünk mikoplazma-szennyeződésre.

Öregedést és stresszt kiváltó állapotok

Az oxidatív stressz által kiváltott öregedés érdekében az END-MSC-ket/WJ-MSC-ket 200 uM/100 uM HO-val (Sigma) kezeltük 1 órán át. A doxorubicin által kiváltott öregedés esetén a DP-MSC/A549-et 1 μM doxorubicinnel (Veropharm) kezeltük 3 napon keresztül. A sejteket minden esetben legkorábban a kezelés után 14 nappal öregedőnek tekintettük. A replikatív öregedés során a 4. passzázsnál korábbi AD-MSC-ket kontrollsejtekként, a 10. után későbbieket pedig öregedőként azonosítottuk. Az etopozid által kiváltott öregedés esetén az A549/END-MSC-ket/SK-Help-et 2 uM/5 uM/3 uM etopoziddal (Veropharm) kezeltük 3 napon keresztül, és legkorábban 7 nappal az öregedés indukciója után analizáltuk. Ebben az esetben a kezelési terv teljesen egybeesett az RNS-seq adatok származási tanulmányában leírtakkal (Wang et al., 2017). Szenolitikus vegyületként két szívglikozidot alkalmaztunk: Ouabaint (Sigma) és Bufalint (Calbiochem).

A kontroll és az öregedő END-MSC vagy A549 közötti stresszellenállás összehasonlítása érdekében a sejteket vagy 400/800 uM H O2-vel (Sigma) kezeltük 1 órán át, vagy 0,3/1 uM staurosporinnal (Sigma). A sejtek életképességét 48 órával a stresszindukció után elemeztük.

Az MCL{0}} aktivitás blokkolása érdekében az END-MSC-ket 10 uM A-1210477(Sigma)-val előkezeltük 3 napon keresztül.

Áramlási citometriai elemzés

A sejt életképességét, proliferációját, sejtméretét, autofluoreszcenciáját, apoptózisi sebességét, kaszpáz 3/7 hasítását, mitokondriális membránpotenciálját és membrándepolarizációját áramlási citometriával mértük. Az áramlási citometriát CytoFLEX (Beckman Coulter) segítségével végeztük, és a kapott adatokat a CytExpert szoftver 2-es verziójával elemeztük.0. A tapadó sejteket kétszer öblítettük PBS-sel, és tripszinezéssel gyűjtöttük össze. A leválasztott sejteket összegyűjtöttük és friss tápközegben újraszuszpendáltuk, majd megszámoltuk és autofluoreszcenciára elemeztük. A sejtek életképességének elérése érdekében 50 ug/ml propidium-jodidot (Life Technologies) adtunk minden mintához közvetlenül az elemzés előtt. A sejtméretet a PI-negatív sejtek citometrikus fényszóródásával határoztuk meg. Az apoptózis indukcióját Annexin-V-APC (Invitrogen) és DAPI (Sigma) együttes festéssel igazoltuk a gyártó utasításait követve. A kaszpázaktivitást a CellEventTM Caspase{11}}/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) segítségével értékeltük a gyártó protokollja szerint. A mitokondriális membránpotenciál elvesztését a JC-1 (Invitrogen) ratiometrikus festékkel értékeltük. A festési eljárást a gyártó protokollja szerint végeztük. A membrándepolarizációhoz DiBAC4(3)fluoreszcens szondát (Invitrogen) használtunk.

Az öregedéssel összefüggő -galaktozidáz festés

Az öregedéssel összefüggő -galaktozidáz (SA- -Gal) festést öregedés -galaktozidáz festőkészlettel (Cell Signaling Technology) végeztük a gyártó utasításai szerint. A képek kvantitatív elemzését a MatLab csomag alkalmazásával állítottuk elő a korábban leírt algoritmus szerint[41]. Minden kísérleti ponthoz legalább 50 véletlenszerűen kiválasztott sejtet elemeztünk.

Western blot

A Western blottingot a korábban leírtak szerint végeztük [41]. Az SDS-PAGE elektroforézist, a nitrocellulóz membránra való átvitelt és az ECL (Thermo Scientific) detektálással végzett immunblotot a szabvány gyártói protokollok (Bio-Rad Laboratories) szerint végeztük. A következő fehérjék elleni antitesteket használtunk: glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) (14C10 klón), foszfo-p53(Ser15), p21(12D1 klón), foszfo-Rb (Ser807/811) , HMGB1 (D3E5 klón), valamint torma-peroxidázzal konjugált kecske antinyúl IgG. A hígítási arány 1:1000 volt az összes elsődleges antitestnél és 1:7000 a másodlagos antitesteknél. Az összes antitestet a Cell Signaling cégtől vásároltuk. A Scion Image 4.0 (Scion Corporation) segítségével kiválasztottuk és meghatároztuk a sávok háttérből kivont sűrűségét az összes gélben és blotban.

Transzkriptomikai elemzés

Az elemzés során a következő három Gene Expression Omnibus (GEO)RNS-seq adatkészletből vett mintákat használtunk: GSE102639 (GSM2742113-GSM2742114 és GSM2742121-GSM2742122, ennek megfelelően a kontroll és az öregedő A549 sejtekhez); GSE122081 (GSM3454482-GSM3454484 és GSM3454500-GSM3454502 a kontroll- és öregedő IMR-90 sejtekhez, ennek megfelelően); és a GSE160702 adatkészletünk (GSM{14}}GSM4877898 és GSM{16}}GSM4877910 a vezérlő és az öregedő END-MSC-ekhez). Az összes adatkészlet adatait azonos módon dolgozták fel.

A nyers beolvasási adatok minőségi szűrésen és adaptervágáson mentek keresztül a BBtools csomagból (38.75-ös verzió) származó FilterByTile és BBDuk szkriptek segítségével, az alapértelmezett beállításokkal. A fennmaradó olvasmányokat a FastqPuri csomag (1.0.7-es verzió) trimeszter-szkriptjének használatával is kiszűrtük és levágtuk.cistanche UKA vágási műveletet az olvasás mindkét végére alkalmaztuk, ha azok N-t tartalmaztak, vagy minőségük a 27-re beállított minőségi küszöb alatt volt, minden 25 bázisnál rövidebb leolvasást elvetettünk. A vágás minőségének ellenőrzése a FastQC szoftverrel (0.11.7 verzió) és a FastqPuri szkriptekkel történt. Az összes művelet után a kiolvasások a kezdeti adatok legalább 90 százalékát teszik ki.

Az átiratok mennyiségét a Salmon lightweight leképezés (1.1.0 verzió) segítségével becsültük meg, amely szelektív igazítási módban fut. A csalók listáját a Gencode humán referenciagenom GRCh38.p13 (33. kiadás) alapján hozták létre, és tovább használták az index összefűzött transzkriptom és genom Gencode referenciafájlokon (33. kiadás) történő felépítéséhez, 21 kmer-mérettel. A leképezési műveleteket futtatták további jelzőkkel——numBootstraps 30——flitterek——gcBias——leképezések érvényesítése. Az így kapott leképezési arány 70 százalék körüli volt.

A további adatfeldolgozás az R 3.6.3-as verziójával történt a Tidyverse csomaggyűjteményével (1.3-as verzió.{5}}). A becsült génszámokat, metaadatokat és átirat-tartományokat R-be töltöttük, és génszintre összegeztük a tximeta (verzió 1.4.5) segítségével. Az eredményül kapott számlálási mátrixot úgy szűrtük, hogy az összes mintában legalább 5 becsült számot tartalmazó sorokat tartalmazzon, a kapott mátrix 20 400 gént tartalmazott.

A PCA és a hőtérkép megjelenítéséhez az olvasási számokat a DESeq2 csomagból (1.26-os verzió.{3}}) származó naplótranszformáció segítségével normalizáltuk.cistanche wirkungA hőtérképeket génszűrő (verzió 1.38.0) és heatmap (verzió 1.0.12)R csomagok felhasználásával készítettük. Az osztódási minták öregedési változó alapján történő validálása során a normalizált olvasási számokat a „Celluláris öregedés” (GO 0090398) génontológia kifejezéshez kapcsolódó gének alapján végezték. A differenciális expressziós analízist és a log fold-változások becslését a DESeq2 segítségével számítottuk ki a tervezési képlet kontroll-ling utolsó változójára a sejtek öregedésének állapotára, az ouabain kezelési reakcióra és a jelzett tényezők kölcsönhatására. A differenciális expressziós tesztelés megerősítése érdekében naplózott hajtásváltozás-korrekciót alkalmaztak a tenyércsomagból származó adaptív zsugorodás-becslő kombinációjával (1.8-as verzió.0), és egy további 0,667-es log hajtásváltozási küszöböt adtunk meg. Az eredményül kapott zsugorított becsléseket tovább használták a génrangsoroláshoz és a génkészlet-dúsítási elemzés futtatásához klaszterprofil (3.14.3-as verzió) és fuse (1.12.0-s verzió)R csomagok használatával, a Benjamin-Hochberg-módszer szerint többszörös összehasonlításra korrigált p-értékekkel. Az Affymetrix microarray mintákat a kontroll és az öregedő AD-MSC-khez a GEO adatbázisból (GSE66236) szereztük be, és Phantasus webalkalmazással dolgoztuk fel log2 és kvantilis számlálások normalizálásával. A génkészlet-dúsítási elemzést egy biztosíték (1.12.0 verzió) R csomag használatával végeztük.

RNS extrakció, reverz transzkripció és valós idejű PCR

Az RNS extrakciót, a reverz transzkripciót és a valós idejű PCR-t az előző tanulmányunkban leírtak szerint végeztük [32]. Az RNS extrakcióhoz (ExtractRNA reagent), a reverz transzkripcióhoz (MMLV RT kit) és a valós idejű PCR-hez (HS SYBR kit) használt reagenseket az Evrogentől szereztük be. A génexpressziós szinteket a valós idejű PCR BioRad CFX-96 erősítő (BioRad) segítségével értékeltük ki a következő futó programmal minden vizsgált génre: 40 olvadási ciklus 10 másodpercig 95 fokon, lágyítás 15 másodpercig 57,5 ​​fokon. és szintézis 15 másodpercig 72 fokon. A reakciók specifitásának szabályozására olvadásgörbe-analízist alkalmaztunk. A kapott adatok alábbi elemzését a Bio-Rad CFX Manager szoftverrel (BioRad) végeztük, a standard 2deltaCt kvantifikációs módszerrel, referenciaként a GAPDH kifejezést használva. A primer szekvenciákat az 1. táblázat tartalmazza.

Statisztikai analízis

A két csoport közötti különbség szignifikanciájának megállapításához Student-féle t-próbát vagy Welch-t-próbát alkalmaztunk. A csoportok közötti többszörös összehasonlításhoz ANOVA-t használtunk Tukey HSD-vel. Hacsak másképp nem jelezzük, minden kvantitatív adat átlag±SD-ként jelenik meg, és a csillagok a szignifikáns különbségeket jelzik a következők szerint: ns, nem szignifikáns,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Eredmények

A H2O2-kezelt END-MSC-k idő előtti öregedésbe lépnek

A jelen tanulmányban desquamált endometriumból (END-MSC) izolált humán mesenchymális őssejteket használtunk, amelyek megfelelnek az ISCT által a hMSC-k meghatározására javasolt minimális kritériumoknak [41]. Korábban kidolgoztunk egy megbízható kísérleti modellt az END-MSC-k korai öregedésének különböző aspektusainak tanulmányozására [30]. Nevezetesen kimutattuk, hogy a szubletális oxidatív stressznek kitett END-MSC-k fokozatosan elsajátították az öregedő sejtek összes jellemző tulajdonságát, beleértve a perzisztens DNS-károsodási gócokat és az aktív DNS-károsodási választ, a klasszikus p53/p21/Rb által közvetített irreverzibilis sejtciklus-leállást. útvonal, proliferációs veszteség, sejthipertrófia, SA- -Gal festődés megjelenése és az öregedéssel összefüggő szekréciós fenotípus kialakulása [30, 32, 42]. Itt a megtervezett modellt az ouabain szenolitikus hatásának vizsgálatára, valamint az ionhomeosztázis mögött meghúzódó intracelluláris változások feltárására alkalmaztuk. Kezdetben a leggyakoribb paraméterek becslésével megerősítettük, hogy az egyszeri dózisú (1 órás, 200 μM) HO kezelés elegendő az END-MSC-k öregedésének indukálásához. Fontos, hogy a stresszes END-MSC-ket két héttel az oxidatív stressz után öregedőnek tekintették; ezért az összes öregedési markert legkorábban 14 nappal a H-Oz kezelés után értékeltük. Valójában az END-MSC-k H-Oz-kezelése proliferációs blokkhoz, sejthipertrófiához vezetett, amit a megnövekedett sejtméret jelez, a lipofuscin felhalmozódását, amelyet az autofluoreszcencia emelkedése mutat ki, az SA- -Gal megjelenését, a A p21/Rb útvonal és a HMGB1 elvesztése együttesen támogatja az öregedés kialakulását a választott kísérleti körülmények között (ac,e,f ábra).

Az öregedő sejtek legkárosabb hatásai szöveti és szervezeti szinten vélhetően meghosszabbodott életképességük következményei. Ezzel összhangban a HO2-val kezelt END-MSC-k még az öregedési fejlődés késői szakaszaiban is megőrizték magas életképességüket (az öregedő END-MSC-k életképességét a kezdeti oxidatív stressz után 17 nappal (14-3 nappal) értékelték (1d ábra) ). Összefoglalva, az END-MSC-k szubletális HO2-kezelése a korai öregedés megfelelő modellje, és releváns a szenolitikus vegyületek END-MSC-kre gyakorolt ​​hatásának vizsgálatához.

A szívglikozid ouabainnak nincs szenolitikus aktivitása az öregedő END-MSC-kkel szemben széles koncentráció-tartományban

A legújabb bizonyítékok arra utalnak, hogy a szívglikozidok, köztük az ouabain, a digoxin és a bufalin, hemolitikus hatású vegyületcsaládot képviselnek [25,26]. Annak ellenére, hogy ma a szívglikozidokat széles spektrumú szenolitikumoknak tekintik, hiányoznak az öregedő hMSC-kre gyakorolt ​​hatásukról szóló adatok. Ezért itt teszteltük, hogy az ouabain képes-e szelektíven halált indukálni öregedő END-MSC-kben. Ennek érdekében megvizsgáltuk a kontroll és az elöregedett END-MSC-k életképességét az ouabainnal végzett kezelést követően a széles koncentrációtartományban (10-'-től 10~ M-ig). Érdekes módon egyik alkalmazott koncentráció sem vezetett észrevehető csökkenéshez mind a kontroll, mind az öregedő sejtek életképességében az ouabain alkalmazását követő első napon (2. ábra és S1 kiegészítő ábra).

Az ouabain-kezelést követő harmadik napon azonban jelentős dózisfüggő csökkenést mutattunk ki a kontroll END-MSC-k életképességében (2a. ábra és S1 kiegészítő ábra). Váratlanul az öregedő sejtek rezisztensebbnek bizonyultak az ouabainnal szemben minden egyes vizsgált koncentrációnál. Ezzel az eredménnyel összhangban az 10-M ouabain hajlamosabb apoptotikus halálhoz vezetett a kontrollsejtekben (20,75 százalék An plus /PI- és 36,47 százalék An plus /PI plusz), mint az öregedő sejtekben (15,01 százalék An＋/PI). -és 12,15 százalék An plusz /PI plusz )(2b. ábra). A kapott eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy az öregedő END-MSC-k összefüggésében az ouabainnak nincs szenolitikus aktivitása.

Az öregedést kiváltó ingerek variabilitásával összefüggő lehetséges hatások kizárása érdekében az ouabain szenolitikus hatására további kísérleteket végeztünk. Az END-MSC-ket ugyanis oxidatív stressz helyett etopoziddal kezeltük, hogy korai öregedést váltsunk ki.citrus bioflavonoidokAz etopoziddal kezelt END-MSC-k az öregedő sejtekre jellemző összes tulajdonságot mutatták (3a-e ábra).

Fontos, hogy az ouabainnak nem volt hemolitikus hatása az etopoziddal kezelt öregedő END-MSC-kre (3f. ábra és S2 kiegészítő ábra). Ezek az adatok további megerősítést nyújtanak a fenti eredményekhez, és bizonyítékot nyújtanak arra, hogy az ouabain által kiváltott elemzés hiánya nem az öregedés kiváltására használt konkrét öregedési trigger következménye.

1. ábra Az oxidatív stressz által kiváltott END-MSC-k korai öregedési modelljének validálása. Az öregedő END-MSC-k laza proliferációt mutatnak, b hipertrófián mennek keresztül, c fokozott autofluoreszcenciát érnek el, magas sejtéletképességet tartanak fenn d és e SA- -Gal aktivitást mutatnak a kontrollokhoz képest. f A p53 és Rb foszforilációs szintjei, valamint a p21 és HMGBI fehérjék expressziós szintjei kontroll és öregedő END-Ouabain nem fejt ki hemolitikus hatást a különböző eredetű humán mezenchimális őssejtekre. Megfigyeléseink kiterjesztése az ouabain által indukált analízis hiányára vonatkozóan az END-MSC-kben. , elemeztük az ouabain hatását más forrásokból, köztük a zsírszövetből, a fogpépből és a Wharton-zseléből izolált hMSC-kre. Adataink további megerősítése érdekében különböző öregedési modelleket alkalmaztunk: replikatív öregedés AD-MSC-k esetén, doxorubicin-indukált öregedés DP-MSC-k esetén, és oxidatív stressz által kiváltott öregedés WJ-MSC-k esetén (4a-f ábra).

A 4g. ábrán látható, hogy a különböző típusú hMSC-k életképességében különböztek az ouabain-kezelés során, például mind a kontroll, mind az öregedő DP-MSC-k sokkal ellenállóbbak voltak az ouabain hatásával szemben, mint a WJ-MSC-k (4g. ábra és S3b kiegészítő ábra, c). Mindazonáltal, az ouabain nem volt képes szenolízist indukálni az öregedő hMSC-k egyik típusában sem (4g. ábra és S3 kiegészítő ábra). A kapott adatok együttesen azt mutatják, hogy az ouabain által kiváltott elemzés hiánya a különböző típusú hMSC-k közös jellemzője. MSC-k. A bemutatott értékek átlag±SD. Az a és d pontokban végzett több csoportos összehasonlításhoz egyutas ANOVA-t alkalmaztunk, n=3, ns nem szignifikáns,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

A GAPDH-t használtuk betöltési kontrollként

A szívglikozid bufalin nem képes elpusztítani az öregedő END-MSCS-t

Annak igazolására, hogy a szívglikozidok nem fejtik ki szenolitikus hatásukat a hMSC-k felé, bufalint alkalmaztunk, amely egy másik, a szívglikozidok családjába tartozó, az említett szenolitikus hatással rendelkező vegyület [25]. A bufalin szinte semmilyen hatással nem volt a kontroll és a H2O{2}}kezelt öregedő END-MSC életképességére széles koncentrációtartományban (10-7-tól 10-5 M-ig) (5a. ábra és kiegészítő S4a ábra).

Hasonlóan ahhoz, amit az ouabain-kezelésnél megfigyeltünk, a bufalinnal végzett elemzés hiánya független volt az öregedést kiváltó ingerektől, mivel az oxidatív stresszre vagy az etopozidra adott válaszként öregedő ESC-k életképessége nem változott (5a, b ábra, kiegészítő ábra). S4a, b). A fent leírt eredmények megerősítik, hogy a szívglikozidok hatástalannak bizonyultak a célzott halál indukciójában öregedő END-MSC-kben. MSC-k. A bemutatott értékek átlag±SD. Az a és d pontokban végzett több csoportos összehasonlításhoz egyutas ANOVA-t alkalmaztunk, n=3, ns nem szignifikáns,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

A szívglikozid bufalin nem képes elpusztítani az öregedő END-MSCS-t

Annak igazolására, hogy a szívglikozidok nem fejtik ki szenolitikus hatásukat a hMSC-k felé, bufalint alkalmaztunk, amely egy másik, a szívglikozidok családjába tartozó, az említett szenolitikus hatással rendelkező vegyület [25]. A bufalin szinte semmilyen hatással nem volt a kontroll és a H2O{2}}kezelt öregedő END-MSC életképességére széles koncentrációtartományban (10-7-tól 10-5 M-ig) (5a. ábra és kiegészítő S4a ábra).

Hasonlóan ahhoz, amit az ouabain-kezelésnél megfigyeltünk, a bufalinnal végzett elemzés hiánya független volt az öregedést kiváltó ingerektől, mivel az oxidatív stresszre vagy az etopozidra adott válaszként öregedő ESC-k életképessége nem változott (5a, b ábra, kiegészítő ábra). S4a, b). A fent leírt eredmények megerősítik, hogy a szívglikozidok hatástalannak bizonyultak a célzott halál indukciójában öregedő END-MSC-kben.

2. ábra Az Ouabainnek nincs hemolitikus aktivitása a HO2-kezelt öregedő END-MSC-kkel szemben széles koncentráció-tartományban. A kontroll és az öregedő END-MSC-k relatív sejtéletképessége (százalék) 3 nappal az 1077,10~6,10-5 M ouabainnel végzett kezelés után. b Apoptózis indukció END-MSC-ben 10-6 M ouabain hatására Annexin V/DAPI kettős festéssel értékelve. n=3 független kísérlet. Minden adat megfelel az átlag±SD-nek. A statisztikai szignifikanciát a Welch-féle t-próbával értékeltük: ns nem szignifikáns,***p<>

Mind az ouabain, mind a bufalin szívglikozidok szelektíven képesek sejthalált indukálni öregedő A549 és SK-Hep1 sejtekben

Figyelembe véve azt a tényt, hogy eredményeink nem egyeznek a szívglikozidok széles spektrumú szenolitikus hatásával kapcsolatban nemrégiben publikált bizonyítékokkal, úgy döntöttünk, hogy ezt a hatást a vonatkozó tanulmányokban leírt sejtmodell segítségével reprodukáljuk [25,26]. Így kísérletsorozatot végeztünk kontroll és öregedő A549 tüdőkarcinóma sejtek felhasználásával. Az A549 sejtekben az öregedést etopozid kezeléssel indukáltuk. Az A549 sejtek etopozid által kiváltott öregedése a terápia által kiváltott öregedés gyakran használt, így jól jellemzett modellje [4]. Kimutatták továbbá, hogy az ouabain szelektíven elpusztítja az etopoziddal kezelt öregedő A549 sejteket[25]. Az A549 öregedésének bizonyítására felmértük a proliferációs rátát, a sejtméretet, a lipo-finom felhalmozódását, az SA- -Gal festődést és az aktivációs állapotot. a p53/p21/Rb útvonal és a HMGB1 expressziós szintje (6a-e. ábra).

Az ouabain öregedő rákos sejtekkel szembeni hemolitikus aktivitásának igazolására először megbecsültük a dózisfüggő sejtek életképességét. Összhangban a fent leírt eredményeinkkel, nem tudtuk kimutatni az életképes kontroll vagy öregedő A549 sejtek számának jelentős csökkenését 24 órán belül az ouabain alkalmazását követően (S5a kiegészítő ábra). A kezelést követő 3 napon belül azonban az ouabain dózisfüggő módon szignifikánsan csökkentette az öregedő A549 sejtek életképességét, míg a kontroll A549 sejtek száma sokkal kisebb mértékben (7a. ábra és S5a kiegészítő ábra). Nevezetesen, a kontrollsejtek körülbelül 90 százaléka megőrizte életképességét 10- M ouabain mellett, szemben az azonos dózissal kezelt öregedő A549 sejtek 50 százalékával (7a. ábra). Ezenkívül az öregedő A549 sejtek hajlamosabbak voltak a bufalin által kiváltott sejthalálra, mint kontroll társaik (7b. ábra) (5b. ábra és S5b kiegészítő ábra).

A publikált adatok szerint az ouabain kaszpáz-{0}}dependens apoptózist váltott ki öregedő A549 sejtekben [26]. Valójában szignifikáns növekedést mutattunk ki a kettős pozitív és/vagy PI-frakcióban az 10-6M ouabainnel kezelt rákos sejtekben (7c. ábra). Továbbá fluoreszcens assay segítségével a kaszpáz -3 aktiválódását figyeltük meg ouabainnel kezelt öregedő A549 sejtekben (7d. ábra). Összességében ezek az eredmények teljesen összhangban vannak más szerzők által leírt adatokkal, és megerősítik az ouabain hemolitikus aktivitását az A549-el szemben.

Emellett doxorubicint használtunk etopozid helyett az A549 öregedésének előidézésére (8a-e ábra). Ahogy az várható volt, a doxorubicinnel kezelt öregedő A549, valamint az etopoziddal kezelt nagyobb érzékenységet mutatott mind az ouabain, mind a bufalin iránt, mint a kontroll társaik (8g. ábra és S6 kiegészítő ábra). Ez utóbbi megerősíti, hogy a szívglikozidok szenolitikus hatása független az öregedést kiváltó ingerektől. Így a szívglikozidok valóban szenolitikus hatással rendelkeznek

3. ábra Az Ouabain nem képes szenolízist indukálni az etopoziddal kezelt öregedő END-MSC-kben. Az END-MSC-k epizód-indukált öregedési modelljének validálása: proliferációs képesség, b sejtméret, c autofluoreszcencia szint és d SA- -Gal aktivitás, e Rb foszforilációs szintje és p21 és HMGBI fehérjék expressziós szintje. f A kontroll és az öregedő sejtek relatív sejtéletképessége (százalék) 10-6 ouabainnel végzett kezelés után. Az értékek átlag±SD. Több csoport esetén egyirányú ANOVA-val végzett összehasonlítást alkalmaztunk,n=3, ns nem szignifikáns,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Végül úgy döntöttünk, hogy megismételjük az etopoziddal kezelt májráksejtek elemzési kísérleteit, az SK-Help-et, amely egy másik sejtmodell, amely a szívglikozidok bizonyítottan szenolitikus hatását mutatja Guerrero és munkatársai szerint. tanulmány [25] (9a-e ábra). Az etopoziddal kezelt öregedő SK-Help mindkét szerrel szemben nagyobb érzékenységet mutatott, mint a kontroll társai, ami bizonyítja a szívglikozidok hemolitikus hatását ezzel a sejttípussal szemben (9f. ábra és S7 kiegészítő ábra).

Ezek az adatok együttesen azt bizonyítják, hogy a szívglikozidok által kiváltott hemolízis szelektivitása inkább a sejttermészettől függ, mint a konkrét öregedési triggertől.

Ez a cikk a Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 cikkéből származik: https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x