A Cistanche Deserticola összes glikozidja elősegíti a neurológiai funkciók helyreállítását azáltal, hogy indukálja a neurovaszkuláris regenerációt
Mar 29, 2022
Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fujiang Wang1, Ruiyan Li 2, Pengfei Tu1, Jianping Chen3, Kewu Zeng1* és Yong Jiang1*
Háttér:A hagyományos kínai orvoslásról, a Cistanche deserticolaról beszámoltak arról, hogy a szív- és érrendszeri és az agyi érrendszeri betegségekre is alkalmazható. Az ischaemiás stroke elleni védelmet szolgáló aktív összetevői azonban nem tisztázottak. Célunk volt a C. deserticola ischaemiás stroke elleni aktív komponenseinek és lehetséges mechanizmusainak feltárása.
Mód:Vizsgáltuk a C. deserticola-kivonatok, az összglikozidok (TG-k), a poliszacharidok (PS-ek) és az oligoszacharidok (OS-ek) agyvédő hatását a középső agyi artéria elzáródás-reperfúzió (MCAO/R) patkánymodelljében. 2, 3, 5-Trifenil-tetrazólium-klorid (TTC) festést használtunk az agyi infarktus térfogatának meghatározására, az Evansblue assay-t pedig a vér-agy gát (BBB) permeabilitásának felmérésére. Ezután a CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin, Keap-1 és Nrf{13 kifejezéseket. }}-t Western-blot vagy immunfluoreszcenciával elemeztük, az MDA, SOD, CAT és GSH-Px aktivitásokat pedig kittel elemeztük.
Eredmények:A TG-kezelés jelentősen csökkentette a neurológiai hiánypontszámokat és az infarktusok mennyiségét, elősegítette az angiogenezist és a neurális remodellinget, és hatékonyan megőrizte a vér-agy gát integritását a modellcsoporthoz képest. Ezenkívül a TG jelentősen csökkentette az MDA szintet és növelte az antioxidáns aktivitást (SOD, CAT és GSH-Px) az agyban. Eközben a TG-k jelentősen leszabályozták a Keep-1 kifejezést, és megkönnyítették a Nrf-2 nukleáris transzlokációját. Éppen ellenkezőleg, a PS-ek és az OS-csoportok esetében nem figyeltek meg védőhatást.
Következtetés:A TG-k a C. deserticola fő aktív komponensei az MCAO/R által kiváltott agykárosodással szemben, és a védelem főként a Nrf{1}}/Keap-1 útvonalon keresztül történik.
Kulcsszavak:Cistanche deserticola,agykárosodás, teljes glikozidok, poliszacharidok, oligoszacharidok, Nrf{0}}/Keap-1 útvonal
cistanche amazon deserticola
BEVEZETÉS
A stroke-ot a halálozás és rokkantság egyik fő okának tekintik a világon (Donnan et al., 2008). A stroke esetek közel 87 százalékát ischaemiás stroke váltja ki (Ovbiagele és Nguyen-Huynh, 2011). Jelenleg a leghatékonyabb szer és az egyetlen FDA által jóváhagyott ischaemiás stroke kezelésére használt gyógyszer a rekombináns szöveti plazminogén aktivátor. A szélütéses betegek nagy része azonban nem reagál erre a gyógyszerre a szűk terápiás időintervallum és a vérzéses szövődmények súlyos kockázata miatt (Lee et al., 2012; Schellinger és Kohrmann, 2014). A trombolitikus kezelés egyik legnagyobb kihívása az ischaemia/reperfúziós (I/R) sérülés, amelyet az agysérülések és a funkcióromlás fő okának tekintenek. Az agyi ischaemia utáni reperfúzió növeli az agyvérzés kockázatát, miközben neurovaszkuláris sérüléshez vezet, és túlzottan reaktív oxigénfajtákat (ROS) termel, amelyek károsítják a vér-agy gátat (Alluri et al., 2015). Számos tanulmány megerősítette, hogy a BBB megzavarása az ischaemiás stroke patogenezisének fő oka (Cao et al., 2016b).
A BBB főként endoteliális sejtekből, pericitákból, asztrocitákból, neuronokból és bazális membránokból áll. A BBB magösszetevői az agyi mikrovaszkuláris endothelsejtek, amelyeket szoros csomópontok kötnek össze, így korlátozva az exogén molekulákat az agyba. A tightjunctionok kóros elváltozásai – különösen az occludin, a claudin-5 és a zonulaoccludens-1 (ZO-1) – jelentősen befolyásolják a BBB működését ischaemiás stroke során, különösen a barrier permeabilitását (Liuet al., 2014). Hu és mtsai, 2018; Liu és mtsai, 2019). Az I/R periódusokban a túlzott ROS az egyik fő tényező, amely az agyi neuronok közvetlen károsodásához vezet (Ding et al., 2014). A ROS-túltermelés bizonyos csomópontok lebomlásához és a BBB megzavarásához vezet, aminek következtében a BBB-n keresztül exogén molekulák jutnak az agyba, ami az agykárosodás súlyosbodásához vezet (Cheon és mtsai, 2016; Zhang QY et al., 2017). Ezért a BBB antioxidánsokkal történő védelmét a reperfúziós sérülések megelőzésének lehetséges módjaként tekintették.
A BBB lebomlása mellett az I/R idegi érkárosodást és idegi halált is okozhat (Jung et al., 2010). Sztrók során fokozott idegsejthalál lehet az oxidatív stressz következménye (Chi et al., 2018), és számos tanulmány kimutatták, hogy a ROS súlyosbítja a stroke súlyosságát és a neurológiai károsodást (Kondo et al., 1997; Crack és mtsai, 2001; Crack és mtsai, 2006). Bár a klinikai vizsgálatok nem hoztak kielégítő eredményeket, a neuroprotekció továbbra is ígéretes stratégia az akut ischaemiás stroke kezelésében (Moretti és mtsai, 2015). Így a stroke kezelésére hatékony neuroprotektív gyógyszerek felkutatása előnyös az agyvérzéses betegek számára.
A hagyományos kínai orvoslás (TCM) intézkedéseket tesz a szervezet belső egyensúlyhiánya elleni beavatkozásra (Gaire, 2018). Az ischaemiás stroke összetett patogenezise miatt a TCM és aktív összetevőinek multifaktoriális hatása kritikus szerepet játszik a stroke kezelésében. A Cistanche deserticola YC Ma, amely Mongólia és Északnyugat-Kína száraz vagy félszáraz területein széles körben elterjedt, széles körben használt TCM-herb különféle betegségek, például feledékenység és depresszió kezelésére Kínában több mint 1,{3}} éve. A modern farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a C. A deserticola többféle farmakológiai aktivitást mutatott, például javította a tanulási és memóriafunkciókat, az idegrendszer védelmet, az immunitást, az antioxidánsokat, az öregedésgátló és a fáradtságot csökkentő hatásokat (Ko és Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li és mtsai, 2015). Kémiai elemzés A C. deserticola törzse kimutatta, hogy fő összetevői közé tartoznak a fenil-etanol-glikozidok, iridoidglikozidok, poliszacharidok és oligoszacharidok (Jiang és Tu, 2009). A C. deserticola agyvédő aktív összetevői azonban nem egészen világosak.
A C. deserticola neuroprotektív tulajdonsága magában foglalja a terápiás potenciált a kognitív eredetű betegségekben, mint például a stroke és a depresszió, valamint az Alzheimer-kór (Wang et al., 2017). A C. deserticola stroke-okra gyakorolt hatásával, beleértve az aktív komponenseit és a hatásmechanizmusait, azonban nagyon korlátozottak a kutatások. Jelen munkában három C. deserticolából származó kivonat, az összglikozidok (TG-k, fenil-etanol-glikozidok és más glikozidok), a poliszacharidok (PS-ek) és az oligoszacharidok (OS-ek) védőhatását vizsgáltuk az agyi I/R sérülésekre. Eredményeink hozzájárulhatnak a C. deserticola pontos klinikai alkalmazásához, és a forischaemiás stroke terápia jelöltjeként szolgálhatnak.
Cistanchénak tterápiás potenciálkognitív betegségekben, mint például a stroke és a depresszió,valamint az Alzheimer-kór.
ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
Vegyszerek és reagensek
A Cistanche deserticola szárait a belső-mongóliai Alashanból vásároltuk, és az egyik szerző (P.-F. Tu) azonosította. A TG-ket, PS-eket és OS-eket a korábban közölt módszerünk szerint állítottuk elő (Gao et al., 2015). . A TG-k kvantitatív analízisét nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) végeztük a korábban leírtak szerint (Li et al, 2019), kromatogramja pedig az 1. ábrán látható. A TG-k fő összetevői az echinakozid, a tubulozid A, az akteozid, az izoakteozid és a2'- acetil-lakteozid; tartalmuk 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g és 12,045 mg/g. A PS-ek és az OS-ek tartalma rendre 69,42%, illetve 65,24% HPLC-vel, illetve fenol-kénsav analízissel meghatározva (Zhang A. et al., 2018; Shi et al., 2019).
Az echinacoside (A0282), a tubulosideA (A0942), az akteozid (A0280), az izoakteozid (A0281) és a 2'-acetil-lakteozid (A0943) standard referenciáit a Chengdu MustBiotechnology-tól (Sichuan, Kína) vásároltuk. Az összes szabvány tisztasága meghaladja a 98 százalékot. A Nissl folt H&E készleteket a Bostertől (Wuhan, Kína) vásároltuk. Az Edaravone-t (T0407-1) a TargetMol-tól (Sanghaj, Kína) vásároltuk. A nyúl anti-patkány MAP-2 (ab32454), Nrf-2(ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) és egér-patkány elleni CD31 (ab24590) a következőtől vásárolt: Abcam Inc (Cambridge, MA, USA). A Rabbit anti-patkány Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) és Occludin (BS72035) a Bioworld Technology-tól (Nanjing, Kína) vásárolt. A Cell SignalingTechnology Inc. (Boston, MA, USA) volt a nyúl-patkány Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-SmoothMuscle Actin (a-SMA,19245T) forrása. A GAPDH-t (HRP-60004) a Proteintech Group, Inc.-től (Chicago, USA) vásárolták. A másodlagos antitesteket a Zhongshan GoldenBridge Biotechnology (Peking, Kína) szállította. A Hoechst 33258-at a Beyotime-tól (Jiangsu, Kína) szerezték be.
1. ÁBRA|A TG-k HPLC-kromatogramja (A) és standard referencia (B).
Állatok
A Sprague-Dawley patkányokat (hím, 250-300 g tömegű) a Vital River Laboratory Animal Technology-tól (Peking, Kína) szereztük be, és egy légkondicionált szobában tartották őket 12 órás fény/sötét ciklusban. Minden állatkísérletet az ARRIVE állatkutatási irányelveinek (Kilkenny et al., 2010; McGrath és mtsai, 2010) megfelelően végeztek, és a Pekingi Egyetem Egészségtudományi Központjának Institutional Animal Care and Use Committee (LA2019123) jóváhagyta.
Állatkísérleti protokollok
A patkányokat MCAO/R-nek vetettük alá, amint azt korábban leírtuk (Wang et al., 2018). Röviden, a bal közös nyaki artériát (CCA), a külső nyaki artériát (ECA) és a belső nyaki artériát (ICA) feltártuk, és egy 3-0 nylon monofil varratot helyeztünk be az ECA-ból az ICA-ba, amíg el nem érte a középső agyi artériát ( MCA). 1,5 órás MCA-elzáródás után a reperfúziót a filament eltávolításával szimuláltuk. A sebészeti beavatkozás során minden patkány testhőmérsékletét 37,0 fokon tartottuk.
Gyógyszer Adminisztráció
A patkányokat véletlenszerűen hat csoportra osztották az SPSSszoftver 22-es verziójával.0 a leírás szerint (Jiang et al., 2014): normál csoport (NOR); modellcsoport (MOD); edaeavone csoport (pozitív gyógyszer, 6 ml/kg, EDI); TGs csoport (280 mg/kg, TGs); PS-csoport (280 mg/kg, PS-ek) és OS-csoport (280 mg/kg, OS-ek). A TG-ket, PS-eket és OS-eket naponta egyszer adtuk be az MCAO/R után 14 napig. A NOR és MOD csoportokat normál sóoldattal kezeltük. Az állatok száma az 1. táblázatban látható.
1. TÁBLÁZAT|Az állatok száma különböző kísérleti csoportokban és különböző paraméterek a beadást követő 14. napon.
A súly és a módosított neurológiai hiánypontszám (mNSS) mérése
A testsúlyt a 14. napon egy ADVENTURE™ digitális mérleggel (OHAUS, New Jersey, USA) követték nyomon. Az NSS-t FJ Wang (Wang és mtsai, 2018) által leírt módszer szerint értékelték, kisebb módosításokkal.
2, 3, 5-Trifenil-tetrazólium-klorid (TTC) festés
Az infarktus térfogatát a korábban leírtak szerint mértük (Wanget al., 2015). Röviden, az agyat hét egyenlő távolságra lévő koronális blokkra (2 mm) osztották fel. Ezeket a metszeteket 2%-os TTC-vel (Coolaber, Peking, Kína) festettük 37 fokon 15 percig. Infarctvolume ( százalék )=(ipsilateralis ischaemiás félteke térfogata–kontralaterális ischaemiás félteke térfogata)/kontralateralis ischaemiás félteke térfogata × 100.
Nissl és H&E festés
A patkányokat mélyen elaltattuk, majd az egész agyat gyorsan eltávolítottuk a koponyáról, és 4%-os paraformaldehiddel rögzítettük, majd paraffinviaszba ágyaztuk, majd 7 µm vastagságú szeletekre vágtuk. A metszeteket Nissl-lel és H&E-vel festették meg. Ebben a vizsgálatban hat véletlenszerű 200 × 200 µm-es mezőt rögzítettek minden szövetmintában fénymikroszkóppal. A Nissl testeinek számát az IPPsoftware 6.0-s verziójával számolták meg (Media Cybernetics, Bethesda, USA).
Evans Blue Assay
A patkányok 2 százalékos EB-t (Coolaber Science & TechnologyCo., LTD) kaptak az MCAO/R után. Két órával később a patkányokat elaltattuk, majd az egész agyat gyorsan eltávolítottuk, és acetonban homogenizáltuk. A felülúszókat 620 nm-en elemeztük egy 800 TS abszorbancia olvasóval (BioTek, USA).
A kataláz (CAT), a szuperoxid-diszmutáz (SOD), a malondialdehid (MDA) és a glutation-peroxidáz (GSH-Px) aktivitásának mérése
Minden szérummintát 4, 000 × fordulat/perc sebességgel centrifugáltunk 15 percig 4 fokon, majd elemeztük az MDA, CAT, SOD és GSH-Px aktivitását a gyártó utasításait követve (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd.). , Kína).
Western-blot-elemzés
Az egyes patkányokból összegyűjtött agyszöveteket (100 mg) homogenizáltuk és RIPA lízispufferben lizáltuk, majd BCA kit (Beijing TransGenBiotech Co., Ltd.) segítségével elemeztük a fehérjekoncentráció kimutatására. A szöveti összfehérjéket 10%-os SDS-PAGE gélekre vittük fel, és nitrocellulóz membránra vittük át. A membránt 5%-os sovány tejjel blokkoltuk, majd egy éjszakán át inkubáltuk elsődleges antitestekkel 4°C-on. A membránt ezután egy másodlagos antitesttel inkubáltuk. A Western blot analízist Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, Kína) alkalmazásával elemeztük.
Immunfluoreszcens elemzés
Immunfluoreszcens festést végeztünk CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf{6}} és Keap{7}} esetén. A Nrf{8}}, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 és Keap{15}} elleni elsődleges antitesteket a következőre hígítottuk: 1:200 és 1:100. Az Alexa Flur 488 egér anti-nyúl IgG és a rodamin (TRITC) kecske anti-nyúl IgG másodlagos antitesteit egyaránt 1:200 arányban hígították. A sejtmagokat Hoechst 33258-cal festettük meg. A képeket Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA) segítségével készítettük. A fehérje expressziót az IPP szoftver 6.0 verziójával elemeztük.
Statisztikai analízis
Minden adatot átlag ± SD-ként írtunk le. Az SPSS szoftver 22-es verzióját.{1}}statisztikai elemzés céljából végezték el. A különböző csoportok összehasonlításakor egyutas ANOVA-t használtunk. P < 0,05="" volt="" a="" statisztikai="">
cistanche testépítő neuroprotection
EREDMÉNYEK
A TG-k növelik a testsúlyt és csökkentik az agykárosodást MCAO/R patkányokban
14 napos TG-vel, PS-sel, Oss-val és EDI-vel végzett kúra után értékeltük az I/R patkányok testtömegét, neurológiai hiányosságait és infarktusos térfogatát. Az eredmények azt mutatták, hogy a MOD-csoportban a testsúlyok nagymértékben csökkentek, míg a csökkent súlyok a TG-k, PS-ek és EDI-csoportokban nyilvánvalóan növekedtek (2A. ábra). A neurológiai hiánypontszámokat jelentősen csökkentették az EDI és a TG-k (2B. ábra). A NOR csoport patkányainak agyszeletei mélyvörösek voltak, és nem fordult elő infarktus, míg a MOD csoport patkányai nagy, azonos oldali agyi infarktust mutattak. A TG-kezelés után az infarktus térfogata jelentősen csökkent (2C, D ábra). A PS és OS kezelés nem mutatott nyilvánvaló hatást a fenti indexekre. A fenti adatok azt mutatták, hogy a TG jelentősen enyhítheti az I/R által kiváltott agyi sérülést, de a PSs és az OS-ek nem.
2. ÁBRA|A TG-k csökkentik az átmeneti fokális agyi ischaemia által kiváltott agykárosodást.
A TG-k javítják az MCAO/R patkányok hisztopatológiai károsodását
A TG-k, PS-ek és az OS-kezelés kórszövettani károsodásokra gyakorolt egyes hatásainak meghatározása érdekében H&E festést végeztek a kóros károsodás feltárására. A NOR csoport agyának hisztomorfológiai szerkezetét rendszeresen rendeztük. A TG csoportokban a morfológiai változások kisebbek voltak, mint a MOD csoportban. A PS-ek és OS-kezelési csoportok azonban nem mutattak szignifikáns javulást a morfológiai változásokban (3. ábra).
A TG-k enyhítik az I/R-indukált patkányok utáni idegi sérüléseket
A Nissl festés az ischaemiás terület penumbrájában található neuronok hisztopatológiai elváltozásait mutatta ki. A 4. ábrán látható, hogy a normálneuronok tiszta sejtmaggal és ép szerkezettel rendelkeztek. A MOD-csoportban az idegsejtek megnagyobbodott intercelluláris terekkel rendelkeztek. A niszltestek eltűntek, összezsugorodtak és mélyen foltosak voltak. Ezeket a változásokat azonban ritkán figyelték meg az EDI, TG és PSs csoportokban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a TG-k és PS-ek jelentősen gyengíthetik az ischaemia/reperfúzió által kiváltott idegi károsodást.
A TG-k csillapítják a BBB-megszakítást I/R-kezelt patkányok után
Az Evans blue assay egy klasszikus módszer a BBB permeabilitás változásának kutatására. A kísérleti eredmények azt mutatták, hogy megnövekedett Evans kék volt a MOD csoportban, míg szignifikánsan csökkent az Evans kék a TG-kkel és EDI-vel kezelt patkányokban. Ezenkívül nem volt szignifikáns különbség a PS- és az OS-terápiás csoportok között (5. ábra). Ezek az eredmények azt sugallták, hogy a TG-k jelentősen csökkenthetik a BBB-zavart.
3. ÁBRA|A TG-k javítják a hisztopatológiai károsodást MCAO/R patkányokban.
A TG-k elősegítik az angiogenezist az I/R sérült patkányokban
Újabb tanulmányok azt mutatják, hogy az angiogenezis kritikus szerepet játszik az akut ischaemiás stroke utáni idegrendszeri funkcionális helyreállításban és a prognosztikai kimenetelben (Yuen et al., 2015). A TG-k, PS-ek és OS-ek angiogenezisre gyakorolt hatásának értékelésére a CD31-et és az a-SMA-t használtuk a kapillárisszámok számszerűsítésére. Az immunfluoreszcens festés azt mutatta, hogy a MOD csoport jelentős csökkenést okozott a CD31 (6A., B. ábra) és a-SMA (6C., D. ábra) expressziójában az I/Rrats ischaemiás területeinek penubrájában, a normál patkányokhoz képest. Ez az eredmény azt szemlélteti, hogy az I/R érkárosodást okozhat az ischaemiás féltekék cortex penumbrájában. A TG-k és az EDI-kezelés azonban jelentősen növelte a kapilláris sűrűséget, az angiogenezist és az arteriogenezist, amint azt a CD31 és a-SMA fokozott expressziója jelezte. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a TG-k elősegíthetik az angiogenezist az I/R patkányok ischaemiás penumbrájában, de a PSs és OS-ek nem.
A TG-k növelik a Tight Junction Protein expresszióját az I/R sérült patkányokban
A BBB megzavarása növelheti az agy víztartalmát és a szövetek duzzadását, ami agysérüléshez vezethet. A szoros kapcsolódású fehérjék a BBB fontos szerkezeti összetevői (Tenreiro et al., 2016; Jiang és mtsai, 2018). Annak tesztelésére, hogy a stroke utáni TG-k, PS-ek és OS-kezelés befolyásolhatja-e a BBB integritását, a ZO-1, a claudin-5 és az okkludin expresszióját immunfluoreszcencia analízissel végeztük. Az eredmények azt mutatták, hogy a claudin-5, az occludin és a ZO-1 expressziója láthatóan csökkent a MOD csoportban. Ezek azonban jelentősen megnövekedtek 14 napos TG-kezelés után. A PS-ek és OSs-csoportok nem mutattak szignifikáns változást ezekben a fehérjeexpressziókban (7. ábra). Ezek az adatok azt mutatták, hogy a TG-k szabályozhatják a szoros junction fehérje expressziót, és valószínűleg megőrzik a BBB integritását az I/R sérülés után.
A TG-k növelik a pericita lefedettséget a kapillárisokon I/R sérült patkányokban
A kapillárisokon lévő periciták lefedettsége kritikus szerepet játszik a BBB integritásának megőrzésében (Armulik et al., 2010; Daneman és mtsai, 2010). Így megvizsgáltuk, hogy a pericita lefedettség növelhető-e a TG-k, PS-ek és OS-ek kezelésével. Az immunfluoreszcencia intenzitás analízis eredményei azt mutatták, hogy mind a PDGFRb, mind a CD31 expressziója drámaian csökkent a MOD csoportban. A TGsto beadása az I/R patkányokban szignifikánsan helyreállította, sőt megnövelte a PDGFRb és CD31 expressziós intenzitását, de eltérést figyeltek meg a PS-ek és OS-ek kezelési csoportjaiban (8. ábra). Így a TG-k kezelése jelentősen növelheti a pericita lefedettséget. Ezek az eredmények azt is megerősítették, hogy a TG-k képesek megőrizni a BBB integritását az I/R után.
A TG-k elősegítik az idegi remodellinget I/RIsérült patkányokban
Számos tanulmány szerint a stroke utáni neurogenezis jelentősen javíthatja a funkcionális helyreállítást (Grefkes és Ward, 2014; Zhang et al., 2019). A szinaptofizint (SYN), a posztszinaptikus denzitású 95-ös (PSD-95) fehérjéket és a mikrotubulus-asszociált protein 2-t (MAP-2) használtuk markerként a kéreg ischaemiás penumbrájában a neuronok plaszticitásának vizsgálatára. A TG-k, PS-ek és OS-kezelésnek az I/R sérült patkányok neurogenezisére gyakorolt hatásának felmérésére immunfluoreszcenciát és Western blot-ot végeztünk a SYN, PSD95 és MAP{8}} expressziójára. Ahogy a 9. és 10. ábrán látható, a SYN, PSD95 és MAP{12}} expressziós szintek I/Rpatkányokban 14 napos reperfúzió után csökkentek a NOR patkányokhoz képest, míg a TG-k és PS-ek gyógyulása jelentősen megnövelte expressziós szintjüket. . Az OSs csoport nem mutatott szignifikáns változást a MOD csoporthoz képest. Az adatok azt mutatták, hogy a TG-k és PS-k gyógyítása drámai módon elősegítette az idegi remodellinget az I/R sérülés után.
TGs Alter Nrf{0}} és Keap-1 kifejezések I/R sérült patkányokban
Az oxidatív stressz az I/R sérülések fő patogén mechanizmusa (Ya et al., 2018; Yu és mtsai, 2018). A vizsgálatok igazolták, hogy a Nrf{2}} az antioxidatív válaszok fő szabályozója (Thompson et al., 2015). Az I/R sérülés utáni Nrf-2 és Keap-1 által közvetített oxidatív válaszok vizsgálata érdekében értékeltük a Keap-1 citoplazmatikus expresszióját és nukleáris transzlokációját. Eközben az Nrf{{7} expresszióját. }} az I/R sérült patkány agyszöveteiben is megvizsgáltuk (10. és 11. ábra). Az immunfluoreszcens elemzés szerint az Nrf{10}} főként a citoplazmában található a NOR csoportban. A TGs csoportban a Nrf-2 expressziója a citoplazmatikus lokalizációban csökkent, de a sejtmagban felfelé szabályozott, és a Keap{12}} expressziójának csökkenése is megfigyelhető volt. Az adatok azt mutatták, hogy a TG-k agyvédelme a Nrf{13}} és a Keap-1 modulációjával hozható összefüggésbe.
4. ÁBRA|A TG-k gyengítik a neuronális sérüléseket I/R-kezelt patkányok után.
A TG-k mérséklik az agyszövet oxidatív stresszét I/R sérült patkányokban
A TG-k antioxidáns hatásának igazolására a SOD, CAT, GSH-Px és MDA aktivitását értékeltük I/R sérült patkányokon. A 12. ábrán az MDA-tartalom jelentősen megnőtt a MOD-csoportban, ugyanakkor a SOD,CAT és GSH-Px aktivitása csökkent a normál patkányokhoz képest. Ezzel szemben a TG-kezelés jelentős csökkenést eredményezett. az MDA tartalmában és a SOD, CAT és GSH-Px aktivitásának növekedésében. Ezek az eredmények tovább erősítették a TG-k antioxidációs aktivitását.
VITA
Számos tanulmány arra utal, hogy a TCM C. deserticola kiterjedt biológiai aktivitással rendelkezik, például fokozza a tanulási képességet, a memóriát és az immunitást (Dong és mtsai, 2007; Jiang és Tu, 2009; Wanget al., 2017; Xia és mtsai, 2018). ). Azonban a C aktív komponensei. A neuroprotekciós deserticola esetében továbbra sem világos. A jelenlegi munka célja a C. deserticola aktív komponenseinek szűrése az ischaemiás stroke ellen MCAO/R modellen. Három C. deserticola kivonatot (TG-k, PS-ek és OS-ek) használtunk az MCAO/R patkányokra gyakorolt hatásuk, valamint a lehetséges mechanizmusok értékelésére.
A stroke gyakori akut cerebrovaszkuláris betegség. Epidemiológiai vizsgálatok szerint a stroke gyakoribb a férfiaknál, mint a nőknél (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik és Bushnell, 2017). Így kísérletünkben hím patkányokat alkalmaztunk a tesztekhez. Eredményeink bebizonyították, hogy az I/R indukció felgyorsította az oxidatív stresszt és az infarktus volumenét, megtörve a BBB-t, és ideg- és agyi érkárosodáshoz vezetett. A szűrést követően a TG-kről azt találták, hogy csökkentik az infarktus mennyiségét, és elősegítik a neurális remodellinget és az angiogenezist. Ezenkívül megfigyelték, hogy a TG-k megtartják a BBB integritását az I/R sérülés után. Éppen ellenkezőleg, a PS-ek és az OS-k nem hoznak jelentős enyhülést az I/R-sérülésekre. Így a TG-ket a C. deserticola fő aktív frakciójának tekintik a neuroprotekció szempontjából, potenciálisan az idegi remodelling, az angiogenezis és a BBB integritásának elősegítése révén az Nrf-2/Keap-1 útvonal aktiválása révén.
5. ÁBRA|A TG-k enyhítik a BBB megszakítását az I/R sérülés után.
Egyre több bizonyíték utal arra, hogy a hatékony kollaterális keringés kialakítása lényegesen fontos az infarktus és az ischaemiás penumbra kialakulásának elkerülésében, és kritikus kezelés az ischaemiás stroke korai szakaszában (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). A vaszkuláris endothel sejtek és a simaizomsejtek ischaemiás infarktus utáni proliferációja meghatározza a kollaterális keringés létrejöttét. Az ischaemia modellek azonban gyakori jelenségekkel rendelkeznek, vagyis az oxidatív stressz széles körben előfordul az agy mikroérrendszerében. A vizsgálati adatok kimutatták, hogy számos antioxidáns megzavarhatja a BBB működését és az angiogenezis tulajdonságait (Mentor és Fisher, 2017). A CD31 és az a-SMA a vaszkuláris endoteliális sejtek, valamint a simaizomsejtek markerei (Saboor et al., 2016). A C. deserticola-ból származó kivonatok fent említett sejtproliferációjára gyakorolt hatásának vizsgálatára megvizsgáltuk a CD31 és az a-SMA expresszióját az agyi ischaemiás penumbra homogenizátumban. Adataink azt mutatták, hogy a TG-k feltűnően javították a CD31 és az a-SMA expresszióját. Azonban nem volt szignifikáns különbség a PS-ek és az OS-csoportok között. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a TG-k csökkenthetik az agykárosodást azáltal, hogy elősegítik az angiogenezist a CD31 és az a-SMA expressziójának fokozásával, míg a PS-ek és az OS-ek nem nyújtottak ilyen védelmet az agykárosodással szemben. Ezek az eredmények megerősítették, hogy csak a TG képes megakadályozni az agyi I/R sérülést.
Az ischaemiás stroke a neuronális plaszticitás károsodása vagy az agyterületek átalakulása által okozott cerebralischaemia következménye. A stroke betegek többsége neurológiai rendellenességekben szenved. A neurogenezis aktiválása ígéretes stratégia a stroke-os betegek neurológiai funkcióinak javítására (Cramer és Chopp, 2000). A neurogenezis közvetlenül részt vesz a neurológiai funkció helyreállításában az agy I/Rinérülése után (Zhang et al., 2019). Korábbi kutatások azt mutatják, hogy a TG-k javíthatják a hippocampális piramissejtek túlélési arányát és neurogenezist indukálhatnak (Lian és mtsai, 2017). Az oxidatív stressz a neuronok elvesztését okozza számos betegség során, mint például a Parkinson-kór, a stroke és így tovább (Duan és Si, 2019; Singh és mtsai, 2019). A Nrf-2 sok, a neuro-védelemmel kapcsolatos gént átírja a promóter régiójukban, főként a SOD-t, MDA-t, CAT-t és g-glutamil-cisztein ligázokat stb. (Satoh et al., 2006). A szinaptikus formációhoz és a neurotranszmisszióhoz szorosan kapcsolódó SYN, PSD-95 és MAP-2 fehérjék az ischaemiás penumbra régióban a kutatási neuronális plaszticitás markereinek tekinthetők. A vizsgálat után azt találtuk, hogy a gyógyítás A TG-k szignifikánsan növelhetik a PSD95, SYN és MAP kifejeződését{11}}, ami azt jelzi, hogy a TG-k agyi védelme összefüggésben volt az I/R során megnövekedett neuronális plaszticitással. Kár azonban, hogy a PSs-ok esetében nincs nyilvánvaló különbség mint operációs rendszer csoportok. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a TG-k fokozhatják a neuroplaszticitást agyi I/R sérülés után.
A stroke-betegeken végzett képalkotó kutatások kimutatták, hogy a BBB-diszfunkció a periischaemiás agy szembetűnő tulajdonságának tekinthető (Bang et al., 2007). A TJ-k, amelyek citoplazmatikus fehérjékből, transzmembrán fehérjékből és a kapilláris endoteliális sejtek közötti kapcsolódási adhéziós molekulákból állnak, nagyon fontosak a BBB integritásának megőrzésében (Ye et al., 2019). Közülük a ZO-1, a claudin-5 és az occludin a TJ-k legfontosabb fehérjéi. Egyre több bizonyíték utal arra, hogy az ischaemia által kiváltott BBB megnövekedett permeabilitása általában korrelál a ZO-1, a claudin-5 és az occludin változásaival (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al. ., 2017; Liu et al., 2018). Ebben a munkában az eredmények azt mutatták, hogy bár a TG-k szignifikánsan növelhetik a ZO-1, a claudin-5 és az andoccludin fehérjék expresszióját az MCAO-indukált agyszövetekben, sem a PSs, sem az OS-ek nem. A BBB agyi endotélsejtekből áll, és szorosan kapcsolódik a pericitákhoz (Nyul-Toth et al., 2016). A periciták létfontosságúak a BBB integritásához (Bell és mtsai, 2010). Az ischaemiás stroke a periciták elhalását és az agyendoteliális sejtekről való leválását váltja ki az akut fázisban, így destabilizálja a mikroérrendszert és megváltoztatja a BBB tulajdonságait (Zechariahet al., 2013). Adataink azt mutatták, hogy a TG-k növelhetik a periciták lefedettségét a kapillárisokon, és növelhetik a ZO-1, a claudin-5 és az okkludin expressziós szintjét. Ezek a jelenségek bebizonyították, hogy a TG-k hatékonyan védik a BBB integritását az agy I/R sérülése után. Összefoglalva, a TG-k többféle módon is gyengíthetik az agykárosodást, például elősegítik az angiogenezist, javítják a neuronális plaszticitást és fenntartják a BBB integritását.
Ezután megvizsgáltuk a jelátviteli útvonalat, hogy feltárjuk a TG-k agyvédelmének hátterében álló mechanizmust. Az I/R sérülés folyamata többtényezős, így számos mechanizmus vesz részt a patogenezisben. Az oxidatív stressz alapvető kockázati tényező, amely hozzájárul az I/R által kiváltott agysérüléshez (Suda et al., 2013), mint például a BBB szerkezet károsodásához, a vaszkuláris endoteliális diszfunkcióhoz és az ischaemiás neuronális sérülés súlyosbodásához (Xiong és mtsai, 2015; Caglayan et al., 2015). al., 2019; Priestley et al., 2019). Így az oxidatív stressz vonzó terápiás célponttá vált az I/R által kiváltott agysérülések esetén. A 2. fázisú enzimek, amelyeket az E-2-kapcsolódó faktor-2 (Nrf{9}}) közvetítenek. fontos eszköznek tekintették, amellyel a neuronok megvédik magukat az oxidatív stresszel szemben (Suzukiand Yamamoto, 2015; Ya és mtsai, 2018). Egyre több bizonyíték utal arra, hogy a Nrf{12}} aktiválása az I/R során a neuroprotekció lehetséges terápiás célpontja (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). A Nrf-2, mint az endogén antioxidáns védekezés fontos szabályozója, közvetíti a hem oxigenáz 1 (HO-1) és más antioxidáns enzimek szintjét, mint például a NAD(P)H kinon-oxidoreduktáz1 (NQO1), SOD, CAT, GSH és MDA (Siow et al., 2007; Dinget al., 2014). Ezenkívül az Nrf{22}} fontos szabályozó szerepet játszik az inangiogenezisben. A jelen tanulmány azt mutatja, hogy az Nrf{23}} szignifikánsan fokozható és aktiválható az érrendszeri fejlődés folyamatában (Wei et al., 2013).
Amint azt korábban leírtuk (Jiang és Tu, 2009), a TG-k sok bioaktív vegyületet tartalmaznak, például echinakozidot, tubulozid A-t, akteozidot, izoakteozidot és 2'-acetil-lakteozidot, és némelyikük neuroprotektív funkciót mutatott agyi I/R sérülés után (Penget al. ., 2016). Az echinakozidnak számos farmakológiai hatása van, például antioxidáns, öregedésgátló, neuroprotekció, gyulladáscsökkentő, gyulladáscsökkentő, májvédő, csontképződést elősegítő és daganatellenes hatás (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. és munkatársai, 2018; Ji és munkatársai, 2019; Xu és mtsai, 2019). A közelmúltban az echinakozidot erős antioxidánsként azonosították a központi idegrendszerben (Lu et al., 2016). Az echinakozid csökkentheti az MDA-tartalmat, és javíthatja a SOD és a GSH Px aktivitását ischaemiás agysérülésben, és a molekuláris dokkolási elemzés kimutatta, hogy az echinakozid kötődhet a Keap-hez{13}}, ami az Nrf-2 nukleáris transzlokációjához vezethet (Li et al. , 2018). A Xia vizsgálata kimutatta, hogy az akteozid csökkentheti az infarktus térfogatát és az agy víztartalmát, hogy javítsa a neurológiai hiányosságokat MCAO/R patkányokban az oxidatív stressz mérséklésével (Xia et al., 2018). Más tanulmányok kimutatták, hogy az izoakteozid növelheti a celluláris antioxidáns enzimek, a SOD és a CAT aktivitását a H2O2-kezelt V79-4 sejtekben (Chae et al., 2005). A TG-kben található aktív vegyületekről szóló fenti jelentések alapján arra következtethetünk, hogy a TG-k az antioxidációs útvonalakon keresztül védelmet nyújthatnak az ischaemiás stroke ellen.
Li beszámolt a fenil-etanol-glikozidok (PhG-k) neuroprotektív hatásairól a H2O2-indukált apoptózisra PC12 sejteken az Nrf2/ARE útvonalon keresztül (Li et al., 2018). Ezeket a PhG-ket szignifikánsan elnyomta a Nrf2 nukleáris transzlokáció kiváltása és a HO-1, az NQO1, a glutamát-cisztein ligáz katalitikus alegység (GCLC) és a glutamát-cisztein ligáz módosító alegység (GCLM) expressziójának fokozása (Li et al., Gong et al., 2018; al., 2019). Ezért ezek az eredmények arra utalnak, hogy az Nrf{12}}/ARE útvonal döntő szerepet játszik a PhG-k által közvetített védőhatásokban az idegsejtekben. Hasonlóképpen, ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a TG-k csökkenthetik az MDA szintjét és növelhetik a SOD, CAT és GSH-Px szintjét az I/R patkányokban. Mindeközben a TG-k növelhetik az Nrf2 expresszióját a sejtmagban, és csökkenthetik a megfelelő expressziót a sejtmagban. A citoplazmát, és jelentősen csökkenti a Keap-1 expressziót. Ezért a Nrf-2/Keap-1 útvonal szerepet játszhat a TG-k által közvetített neuroprotektív hatásokban. Ennek az útvonalnak a további validálását a jövőben in vitro sejttenyésztéssel végeznék oxigén-glükóz-megvonás/reoxigenációs sérülésmodellekkel. Ráadásul C. Dezerticola kivonatokat adtunk be vizsgálatunkban 14 napig folyamatosan. Mivel a felnőttkori neurogenezis befolyásolná a neuroprotektív hatások értelmezését a 14 napos reperfúzió során, a neurogenezis nem zárható ki jelenlegi kísérletünkben a CT-k neuroprotektív hatásának feltárására. Ez a kutatásunk korlátja.
Összefoglalva, a C. deserticolából származó TG-k azok, amelyek fokozhatják az angiogenezist és a neurogenezist, valamint fenntarthatják a BBB integritását I/R sérült patkányokban, de nem a PS-ek és az OS-ek. A hatásokat a Nrf{0}}/Keap-1 útvonal aktiválása közvetítheti.
