A kínai gyógynövénygyógyászat Cistanche hatása a korai embrió-magzati fejlődésre
Mar 08, 2022
Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Li Yufang 1, Xu Qinwei 2, Zhang Li 2, Zhang Wenchang 2, Feng Shutang 3*
[Absztrakt]Használj disznótembriókin vitro megtermékenyítésből kutatás és összehasonlítás céljából. Hozzáadás hatásakínaigyógyszerösszetevőketCistancheés Astragalus fejlődéséhezkorai embriókközegben NCSU{{0}} bebizonyosodott. A kísérlet bebizonyította, hogy: (1) A térfogatarány 0,10 százalékCistancheés 0.10 százalék Astragalust adtunk a tenyészléhez, és aCistancheaddíciós csoport A blasztociszták aránya (15,76 százalék) szignifikánsan magasabb volt, mint az üres csoporté (9,26 százalék) (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0.05), jelezve, hogyCistanchedeserticolajelentősen elősegíthetikorai embrionálisfejlődés. (2) Ha a koncentráció (V/V) aCistanche{0}}.05 százalék és 0,10 százalék, a blasztociszták aránya (17,02 százalék és 16,75 százalék) szignifikánsan magasabb, mint az üres csoportban (0) (P<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">kínaigyógyszerCistanchea táptalajban a 2-sejtstádiumban a blasztociszta fejlődési aránya (13,81 százalék) szignifikánsan magasabb volt, mint a 4-sejtstádiumban (7,53 százalék) (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Cistanchebefore cleavage (13.67%) ) Is slightly higher, but the difference is not obvious (P>0.05).
A fejlődési környezet in vivo és in vitro eltérései miatt aembriókszabad gyökök károsítják a korai sertés in vitro tenyésztése soránembrióksejtanyagcsere zavarokat, vagy a DNS, RNS és fehérjék károsodását okozza [1]. A fagyasztott spermával történő in vitro megtermékenyítés fejlődési ütemének további javítása érdekében ez a kísérlet bizonyos koncentrációjúCistancheés Astragalus javítani aembriófejlesztési környezet in vitro.
1. Anyag és módszer
1. 1 Kultúra feltételei:
A sertés petesejtek in vitro érlelését, az in vitro megtermékenyítést és a korai embriók in vitro tenyésztését 5 százalékos CO2-tartalmú inkubátorban, 39 fokos maximális telített páratartalom mellett végeztük.
1.2 Reagensek és táptalaj:
A petesejtek érési alapfolyadéka NCSU{{0}}, a petesejtek mosófolyadéka PVA-TL-HEPES folyadék, a megtermékenyítő folyadék 0,1 százalék BSA-t tartalmazó Tris puffer (mTBM), ill. a sperma mosófolyadéka Dubecco-féle, 0,1 százalék BSA-val. A foszfáttal pufferelt sóoldat (DPBS), a spermiumolvasztó folyadék BTS, a kumuluszfolyadék 1 mg/mL hialuronidáz PBS, a petesejtek műtéti folyadéka HEPES pufferelt NCSU-23, a korai embriók alaptenyésztő folyadéka pedig 0 0,4% BSA NCSU-23, add (V/V) 0,05% ~0,15% Cistanche szükség szerint, használja a BTS-t a sperma felolvasztásához. Használat előtt melegítse elő és egyensúlyozza ki több mint 4 órán keresztül egy inkubátorban, amely 5% CO2 levegőt és legfeljebb 39 fokos telített páratartalmat tartalmaz [2].
1.3 A kínai orvoslás Cistanche főzési módja:
Cistanche-oldat: Vegyünk 5 g-ot és tegyük egy 100 ml-es főzőpohárba, adjunk hozzá ultratiszta vizet, merítsük ultratiszta vízbe, forraljuk fel nagy lángon, forraljuk 20 percig, majd gyűjtsük össze. a leves; ismételje meg a fenti eljárást, gyűjtse 3-szor egymás után, állandó térfogat 100 ml-re, 0,22 μm szűrő tartalék. Astragalus oldat: Vegyünk 5 g-ot és tegyük egy 100 ml-es főzőpohárba, adjunk hozzá ultratiszta vizet és merítsük bele, forraljuk fel erős tűzön, és hagyjuk forralni 20 percig, majd gyűjtsük össze a gyógylevest; ismételje meg a fenti eljárást, gyűjtse össze 3-szor egymás után, állítsa a térfogatot 100 ml-re, szűrje le 0,22 μm tartalékot.
Kínai gyógymódGyógynövény:Cistanche
1.4 Sertés petesejtek in vitro érése:
A kocák petefészkeit a pekingi Pengcheng Élelmiszer Vágóhídról gyűjtöttük össze, 38 fok körüli hőmérsékletű, 0,9 százalékos, antibiotikumot tartalmazó normál sóoldatba helyeztük, 4 órán belül visszaszállították a laboratóriumba, és háromszor mostuk normál sóoldattal. Használjon 10 ml-es fecskendőt egy 12-mérőtűvel a petefészek eltávolításához, amelyekben 2-6 mm átmérőjű tüsző található a petefészek felszínén. Mossa 3-4-szer TL-HEPES oldatban és 3-4-szer NCSU-ban-23, amelyet több mint 4 órán keresztül szén-dioxid inkubátorban egyensúlyoztak. Tegyen át 20–30 petesejteket csoportosan 100 μl-re, adjon hozzá 10% PFF-et, 10 NE/mL HCG-t, 10 NE/ml PMSG-t, 10 ng/ml EGF NCSU-23 cseppecskéket, és tenyésztse körülbelül 22 órán keresztül. 10 százalék PFF-fel, 10 ng/ml EGF-fel NCSU-23-cseppekre a tápközegbe, és folytassa a tenyésztést 44-46 órán keresztül[3].
1.5 Sperma kapacitációja és in vitro megtermékenyítés:
Készítse elő az mTBM-oldatot koffein és BSA nélkül, és 48 órán keresztül egyensúlyozza ki inkubátorban 5% CO2-t és 39 fokos maximális telített páratartalmat, a pH-értéket 7,2-7,8 tartományba állítva; adjon hozzá koffeint és BSA-t 44 órával a felhasználás előtt, és folytassa az egyensúlyozást. A sperma minőségét megvizsgáltuk, és 10 ml-t centrifugáltunk 900 fordulat/perc sebességgel 3 percig, szuszpenzióhoz 10 ml 0,1% BSA-t tartalmazó DPBS-oldatot adtunk hozzá, és 900 °C-on centrifugáltuk. fordulatszám/perc 3 percig [3]; 1 ml TBM-oldat szuszpendálása után 60 fokkal megdöntött. Az energiagyűjtő kezelést 5 százalék CO2 levegővel és 39 fokos maximális telített páratartalmú inkubátorban végezzük 1 órán keresztül[3~5]. A 0,1% hialuronidázt tartalmazó petesejtek mosóoldatába helyezzük a 44-46-osra érett petesejtek-kumulusz sejt komplexet, majd pipettával eltávolítjuk a kumulusz sejteket, majd a petesejteket feltárjuk. Mossa meg háromszor a kiegyensúlyozott TBM-ben, végül helyezze az egyes 10-15 darabokat egy 50 μL-es TBM-es csoportba, és várja meg a spermát [6, 7]. Fecskendezzen be 50 μL kapacitációból származó spermát egy csepp TBM-et tartalmazó petesejtekbe, és végezzen megtermékenyítést 6 órán át 5 százalékos CO2-tartalmú inkubátorban, 39 fokos maximális telített páratartalom mellett.
1.6 A megtermékenyített peték korai fejlődése és kimutatása:
6 órás megtermékenyítés után a petesejteket NCSU-23-val kezeltük, amelyet HEPES-sel vagy NCSU- 23-vel puffereltek, és 0,4% BSA-t tartalmazott az embriótenyésztő folyadékban. 23 Öblítse le háromszor, cserélje ki a táptalajt egy kiegyensúlyozott 0,4 százalékos BSA NCSU-23 cseppre, és inkubálja több mint 8 napig. Ellenőrizze a hipotetikus megtermékenyített peték felosztási arányát a 2. napon, ellenőrizze a morula arányát (plusz a blasztociszta arányát) a 6. napon, és ellenőrizze a blasztociszták arányát a 8. napon [8]. Mindegyiket megvizsgálták és rögzítették a testtükör alatt.
1.7 Kísérleti tervezés:
1.7.1 A hagyományos kínai orvoslás összetevőinek, a Cistanche-nak a hatása a korai embriófejlődésre.
Wuzhishan sertés[8] A kapacitáció, az in vitro megtermékenyítés után a megtermékenyítés befejeződik, majd a hasítás megtörténte után az embriókat addig cserélik, amíg 0,1 százalékra (V/V) hozzáadódnak. A megtermékenyített peték és a korai embriók fejlődésének megfigyelésére Cistanche-t, 0,1 százalékos astragalust és NCSU-t-23 (0,4 százalék BSA) (0,4 százalék BSA) tenyésztettek fontos összetevők nélkül (üres csoport). , és megítélni a két hagyományos kínai orvoslás komponensének hatását a korai in vitro embriófejlődésre Befolyás.
1.7.2 A Cistanche koncentrációjának hatása az embriók korai fejlődésére.
A wuzhishani sertés ondóját kapacitáljuk, és in vitro megtermékenyítésen esik át. A megtermékenyítés befejezése után a folyadékot {{0}} százalékra (üres csoport), 0.05 százalékra, 0,1 százalékra cseréljük, és 0,1 százalék, ill. A 15 százalékos Cistanche NCSU-23-ban (0,4 százalék BSA) figyelje meg a megtermékenyített peték fejlődését, és ítélje meg a kínai orvoslásban található Cistanche komponens különböző koncentrációinak hatását a korai in vitro embriófejlődésre.
1.7.3 A Cistanche addíciós periódus hatása a korai embriófejlődésre.
A wuzhishani sertés spermája kapacitáció, és in vitro megtermékenyítésen esik át. A megtermékenyítés befejezése után a megtermékenyített petesejt {{0}}sejtes állapotra, a megtermékenyített petesejt pedig 4-sejtstádiumra hasad, a folyadékot kicserélik és külön adagolják. 0,1% Cistanche NCSU-23 (0,4% BSA), figyelje meg a megtermékenyített peték fejlődését, és ítélje meg a citanche hozzáadásának hatását a korai in vitro embriófejlődésre a különböző szakaszokban.
1.8 Statisztikai elemzés:
Használja az SPSS13.{1}} khi-négyzet (χ2) tesztet és egyirányú varianciaanalízist.
2. Az elemzés eredménye
2. 1 A hagyományos kínai orvoslás összetevőinek hatása a korai embrionális fejlődésre
As shown in Table 1, in the Cistanche and Astragalus group, the morula rate was not significantly different from that of the blank group (P>0.05). A két csoport blasztociszta aránya magasabb volt, mint a vak csoporté, és a Cistanche csoport blasztociszta aránya különbözött a vak csoportétól. Jelentős (P<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">
2.2 A kínai orvoslásban található Cistanche összetevő koncentrációjának hatása a korai embrionális fejlődésre
Amint a 2. táblázat mutatja, a Cistanche hozzáadása 0.05% és 0,10% közötti térfogatkoncentrációban az embriótenyésztő folyadékban jobban elősegíti a WZSP fagyasztott spermiumfolyadékot, az in vitro megtermékenyítési embriókat. , és a blasztociszták fejlődési üteme jelentősen eltér a vak csoportétól (P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">
2.3 A kínai orvoslás összetevője, a Cistanche egy időszak hozzáadásának hatása a korai embrionális fejlődésre
As shown in Table 3, after testing and analysis, the addition of Cistanche at a volume concentration of 0.10% at the 2-cell stage has a better-promoting effect on the WZSP frozen sperm liquid in vitro fertilization-embryo, and there is no significant difference from the addition before the cleavage (P>0.05). Szignifikáns különbség volt azonban 4 sejt hozzáadásával összehasonlítva (P<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">
3. Megbeszélés
A normál fejlődéshez képestembriókin vivo, az IVF fejlődési környezete megtermékenyítettembriókjelentősen eltér. A folyamat soránembriónövekedés és osztódás, nagy mennyiségű No., szabad gyökök, és néhány mérgező anyag termelődik, ami kedvezőtlen az embrió növekedésére. A szervezetben normálisan fejlődő embriók ezeket a kedvezőtlen tényezőket a belső környezeti anyagcsere révén kiküszöbölhetik; ezek a kedvezőtlen tényezők mindig felhalmozódnak az in vitro megtermékenyítés embriónövekedési környezetében. A hagyományoskínaigyógyszerhozzávalóCistancheFeladata lehet a koncentráció hiányának csökkentése és bizonyos szabad gyökök eltávolítása annak érdekében, hogy tovább javítsák a fagyasztott spermával történő in vitro megtermékenyítés fejlődési ütemét. A kísérlet során bizonyos koncentrációban hozzáadtakCistancheés Astragalus. Az eredmények megerősítették, hogy az Astragalusnak nincs hatékony hatása az in vitro tenyésztési környezet javítására. A megfelelő koncentrációCistanchebizonyos előmozdító hatással bírkorai embriófejlődését, de amikor a koncentrációjaCistanchemeghalad egy bizonyos koncentrációt, gátló hatása is vanembriófejlődés.
Tovább vizsgáltuk a különböző hatásokatCistanche, egy hagyományoskínaigyógyszerkomponenst, különböző szakaszokban, és a kísérlet megállapította, hogy akorai embriókmagasabb a fejlődési ráta a későbbi szakaszban, amikorcistanchehozzáadásra kerül a 2-cellaszakaszhoz. Ennek lehetséges oka a receptor külső környezete. A nitrogén-monoxid (NO) egy szignálmolekula és citotoxikus faktor, számos biológiai aktivitással. A NO hatása akorai embriófejlődését arra kell visszavezetnikorai embrionálisfejlődési szakaszban, amelyet a 2-sejtblokk (2-sejtblokk) egyik oka okozhat emlős embriókultúrában, és a sertések in vitro blokkolása a 4-sejtszakaszban [ 9]. A hagyományos kiegészítésekínaigyógyszerösszetevői bizonyos mértékig eltávolíthatják az NO szabad gyökjét és enyhíthetik a kedvezőtlen tényezőketembriónövekedés [10].
Cistanche
Hivatkozások
[1] Comport M. A szabad gyökök által kiváltott sejtláz három modellje [J]. Chem Biol Interact, 1989, 72(1/2):1- 56.
[2] Pan Dengke. A klónozott sertés szomatikus sejt fejlődését befolyásoló tényezők tanulmányozásaembriók[D]. Peking: Kínai Mezőgazdasági Egyetem, 2005.
[3] Zhang Yunhai. Kutatás a klónozott sertés előállításárólembriókszomatikus sejt magtranszfer technológia alkalmazásával [D]. Peking: Kínai Mezőgazdasági Egyetem, 2005.
[4] Lu Shengsheng, Zhang Yanling, Shi Deshun és mások. Szarvasmarha-szérum és sertéstüszőfolyadék érés során történő hozzáadásának hatása a sertés petesejtek nukleáris érésére éskorai embrionálisfejlődés in vitro megtermékenyítés után [J]. Heilongjiang Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2002, (8):1- 3.
