Absztrakt:FelhasználásCistanche sivatagolaKét gazdanövényt (haloxilon ammodendron és atriplex canescens) parazitálva, mint tesztanyagokként, ez a tanulmány meghatározta a poliszacharid-tartalmat a C. deserticola-ban a különböző gazdaszervezetekből, fenol-szulfursav módszerrel. Transzkriptom szekvenálás és a haloxilon-cisztanche ésAtriplex-Cistanche-társulásokaz Illumina Novaseq 6000 szekvenálási platformon végezték. A kutatás a különböző gazdaszervezetekből származó C. deserticola transzkriptom-különbségeinek vizsgálatára összpontosított, a polysacharid metabolizmusában részt vevő kulcsfontosságú enzimatikus gének szűrésére és a kiválasztott gének qRT-PCR ellenőrzéssel történő validálására. Ennek a tanulmánynak az a célja, hogy elméleti alapot nyújtson az új gazdanövények feltárásához és a C. sivaterticola genetikai javulásához. Az eredmény azt mutatta, hogy az Atriplex quadriptera-C.deserticola-ban található poliszacharid-tartalom jobb volt, mint a Haloxylon ammodendron-C jelenléte. Deserticola. A transzkriptom összehasonlító elemzésével az 14089 differenciálisan expresszált géneket (DEG) szűrjük az Atriplex quadriptera-C húsos szárából. Deserticola és haloxilon-ammodendron-C. Deserticola. A KEGG dúsítás elemzésének eredményei azt mutatták, hogy ezek a DEG -k leginkább kiemelkedően gazdagodtak a szénhidrát -anyagcserével, a galaktóz -anyagcserével, az aminosav -anyagcserével és a zsírsav -anyagcserével kapcsolatos útvonalakban. Ezenkívül összesen 26 DEG -t nyertünk a poliszacharid -metabolizmushoz kapcsolódó négy útvonalból, amelyek közül a fruktozidáz gén és a -galaktozidáz gén expressziós szintje a haloxilon -ammodendron -C -ben. A divaticola szignifikánsan magasabb volt, mint az Atriplex quadriptera-C-ben. Deserticola. Az UDP-glükóz-dehidrogenáz gén és a mannóz -1- foszfát-guanilát-transzferáz gén expressziós szintje az Atriplex quadriptera-C-ben. A divaticola szignifikánsan magasabb volt, mint a haloxilon ammodendron-C-ben. Deserticola, amely lehet a legfontosabb enzimgének a poliszacharid -metabolizmus különbségének szabályozására a C. deserticola -ban.

Kulcsszavak Cistanche sivatagola; átírási szekvenálás; házigazdák; A poliszacharid metabolizmusának különbsége

Cistanche sivatagola

 

Cistanche sivaterticola yc ma, elsősorban elosztvaGansu, Xinjiang, Ningxia és Belső -Mongólia, egy hagyományos kínai gyógynövény, amely a közelmúltban szerepel a"Gyógyászati ​​és élelmiszer -homológ"katalógus. Különböző egészségügyi előnyei vannak, példáultonizáló vese yang, tápláló esszencia és vér, valamint a bélmozgások előmozdítása, hogy széles körben alkalmazzákOrvostudomány, egészségügyi ellátás és az élelmiszeripar[1]. Annak miattheterotróf jelleg, Cistanche sivatagolaparazitálja a különféle gazdanövényeketHaloxilon -ammodendronÉs az újonnan bemutatottfélig örökké zöld cserjeAtriplex canescens(Pursh) Nutt.az elsődleges házigazdák.

A poliszacharidok a legfontosabb aktív anyagok az értékelésbenCistanche sivatagolaminőség. Különböző gazdaszervezet körülmények között afelhalmozódás és metabolikus összetétel-y -azCistancheA poliszacharidok jelentősen eltérnek [2]. Az orvosi kutatás ezt kimutattaCistancheA poliszacharidok rendelkeznekAntioxidáns, neuroprotektív, immunszabályozó és memória-fokozóFarmakológiai hatások, hatékonyan enyhítveAlzheimer-kór, Parkinson-kór és májdepresszió által kiváltott léphiány[3]. A modern fejlődésselextrakciós technikák és multi-spektrum elemző technológiák, aTartalom, összetétel és szerkezeti jellemzők-y -azCistancheA poliszacharidokat fokozatosan megvilágítják, kibővítve alkalmazásaikat.

Szempontjábólmolekuláris biológiai kutatás-onCistancheA fajok, a transzkriptom szekvenálási vizsgálatok elsősorban a koncentráltakCistanche tubulosaésHaloxilon-CistancheKomplex rendszerek.Például,Hou et al.[4] előadtaTeljes hosszúságú transzkriptom szekvenálás és gén expressziós profilozás-y -azCistanche tubulosafelhasználásPacbio és bgiseq -500 RNA-seq technológiák, azonosítás237 772 egyedi átiratés a kulcsfontosságú enzim gének szűrésefeniletanoid -glikozid bioszintézis- Hasonlóképpen,Feng et al.[5] vezetetteliratok és metabolomikus elemzéseka haustoria és a szomszédos szövetekHaloxilon gyökerek ésCistanchehúsos szárak, feltárva a gazdaszervezet szerepét aCistancheMetabolitok. Tanulmányuk hangsúlyozta, hogy aA gazdagép növénye nemcsak a hozamot érintiCistanchede a minősége is- A kutatás azonbanCistancheA különféle gazdanövények parazitálása továbbra is korlátozott.

Atriplex canescens, a mélyen gyökerező és erősen stresszálló növény, különbözik a hagyománytólHaloxilon gazdaszervezetés aAz Egyesült Államok Közép-félszáraz fennsíkja- Az utóbbi években bevezették és előléptették aúj házigazdaCistanche sivatagolaművelés-benKína északnyugati részén. Egy Qing et al.[6] elemezte és összehasonlította apoliszacharid -felhalmozódásCistancheA haloxilon és az atriplex canescens parazitizálásaugyanabban a termelési területen, a FindingJelentős különbségek a poliszacharid -tartalombanA két gazdaszervezet között.

Így ez a tanulmány céljaszekvenálva a húsos szárokatCistanche sivatagolaA haloxilon és az atriplex canescens parazitizálása, aA poliszacharid bioszintézisében részt vevő kulcs enzim gének differenciális expressziója- Az eredmények biztosítják aElméleti alapok a további kutatásokhozCistanchepoliszacharid bioszintézis mechanizmusok, gazdagítják a transzkriptikus vizsgálatok atriplex-CistancheRendszerek, és elősegítik az innovációt a magas színvonalonCistanchecsíraplazma erőforrások.

 

Anyagok és módszerek

1.1 Kísérleti anyagok

Cistanche sivatagolaA minták parazitálnakHaloxilon -ammodendronésAtriplex canescensösszegyűjtötték aCistanchetenyésztési bázisXiquan Town, Jingtai megye, Gansu tartomány(szélesség36 5. fok 'n, hosszúság103 42 -es fok 'E). MindkétHaloxilonésAtriplex canescensugyanabban a környezetben termesztették. A mintákat kategorizáltukHaloxilon-Cistanche(A minta A)ésAtriplex-Cistanche(H minta),mindegyik kategóriára három ismétléssel (replikátumonként öt növény). A mintavételt beállítottuk2024. április, és a mintákat azonosítottákCistanche sivatagolahúsos izzókGuo Yehong professzoraMezőgazdasági Főiskola, Gansu Mezőgazdasági Egyetem.

Követve aA Shanghai OE Biotech Co., Ltd. mintavételi iránymutatásai, aCistancheA húsos szárokat ultrapure vízzel öblítettük, és a felesleges nedvességet szűrőpapírral eltávolítottuk. Vékony szeleteket vettünk aFelső, középső és alsóAz egyes szárok közül alaposan összekeverve és kriogén fiolákba helyezik. A minták voltakgyorsan fagyos folyékony nitrogénben-ra2 óraMielőtt áthelyezték volna a-80 Dome -fagyasztóTároláshoz [7].

1.2 Kísérleti módszerek

1.2.1 A standard görbe létrehozása és a poliszacharid -tartalom meghatározása

A 10 mgmintaD-glükóz-szabványpontosan megmérték és feloldották a100 ml térfogat lombikdesztillált vízzel a100 ug · ml⁻¹ tőzsdei oldat- Kalibrációs megoldások{{0}}. 2, 0. 4, 0. 6, 0.a tőzsdei oldatot áthelyezték10 ml dugott kémcsövek, vízzel hígítva1. 0 ml, majd összekevered1. 0 ml 6% fenololdatés5 ml koncentrált kénsav- Az örvénylés után az oldatokat forrásban lévő vízfürdőben melegítettük20 perc, majd lehűtött egy jégvíz fürdőben10 perc. A üres vezérléskészítették el1. 0 ml desztillált vízA glükózoldat helyett. Az abszorbanciát a482 nmAUV-VIS spektrofotométer, és astandard görbeelőállítottákkoncentráció (x) mint vízszintes tengelyésabszorbancia (y) függőleges tengelyként.

A módosított megközelítést követveLi Jie et al. [8], 0. 2 g szárítottCistancheporpontosan megmérték és a20 ml dugott kémcső. 10 ml 80% etanolhozzáadtuk, és a keveréket kitettékultrahangos extrahálás 80 fokos (100 W, 40 kHz) 30 percig- A kivonatot forrón szűrtük, és az eljárást egyszer megismételjük. A maradék szárítása után,10 ml desztillált vízhozzáadtuk, és az ultrahangos extrakciót kétszer megismételtük. A szűrleteket kombináltuk és hígítottuk20 mldesztillált vízzel.1. 0 ml ennek a megoldásnaktovább hígították10 mldesztillált vízzel.

A 1. 0 ml aliquotaz előkészítettCistancheA mintaoldatot ugyanazzal az eljárás alkalmazásával elemeztük, mint a glükózstandardot. Az abszorbancia482 nmmértük, és a poliszacharid tartalmaCistancheKiszámítottuk a különféle gazdanövényeket.

1.2.2 RNS extrakció, cDNS könyvtári felépítés és szekvenálás

A teljes RNS -t extraháltukCistanche sivatagolaA minták parazitálnakHaloxilon -ammodendronésAtriplex canescensaTiangen DP441 RNA Kit (Kína), követve aTrizol reagens protokoll- Az RNS tisztaságát aNanodrop 2000 spektrofotométer (Thermo Scientific, USA), míg az RNS -koncentrációt és az integritást egyAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA).

A transzkriptom könyvtárakat aVahts univerzális V6 RNA-seq könyvtár előkészítő készlet- A minőség -ellenőrzés után aAgilent 2100 Bioanalyzer, a könyvtárakat szekvenáltuk aIllumina Novaseq 6000 platform, generáló150 bp páros végű olvasmány.

1.3 Adatelemzés

1.3.1 Transzkriptom összeszerelés és funkcionális megjegyzés

Nyers beolvassaFASTQ formátumfeldolgozták a feldolgozássalTrimomatikusEltávolításA PLOY-N olvasmányok és az alacsony minőségű olvasmányok, eredményezveTiszta olvasmányok- Az adapter szekvenciákat és az alacsony minőségű régiókat eltávolítottuk, és a tiszta leolvasásokat összeállítottukcontigs(kifejezett szekvencia címkék) használvaHáromsági szoftver- Az egyes klaszterek közül a leghosszabb átiratot választották aunigeneTovábbi elemzéshez.

Az unigenes funkcionális kommentárját úgy végeztük, hogy összehasonlítottuk őket aNCBI nem redundáns (NR) fehérje adatbázis, svájci-prot és a gének evolúciós genealógiája: nem felügyelt ortológ csoportok (EGGNOG) adatbázisfelhasználásGyémánt szoftver (e-érték <1e -5). Eukarióta ortológ csoportok (KOG) annotációa homológ gének azonosítására végeztük. Ezenkívül az unigenes -t feltérképeztékGének és genomok (KEGG) útvonalak kiotói enciklopédiaA metabolikus út kommentárához.Gén ontológia (GO) osztályozás és funkcionális kommentára svájci-prot adatbázis leképezésével végezték.

1.3.2 A differenciálisan expresszált unigének (DEG) génexpressziós elemzése és azonosítása

A génexpressziós szinteket számszerűsítettükBowtie2A tiszta leolvasások összehangolása az unigenes -hez. Az expressziós értékeket úgy számítottuk, hogyFragmensek kilobáz / átirat egy millió leképezett leolvasás (FPKM)felhasználásexpressz szoftver- A differenciális expressziós elemzést elvégeztükDeseq2 szoftver,negatív binomiális eloszlás (NB) tesztekA szignifikancia teszteléshez használják. A differenciálisan expresszált géneket (DEG -k) úgy definiáltuk, mint aQ-érték <0. 05éshajtásváltás (fc)> 2.

1.3.3 QRT-PCR A differenciálisan expresszált gének validálása

Kulcsfontosságú enzimgénekpoliszacharid bioszintézis-veljelentős differenciális kifejezéskiválasztottákmennyiségi valós idejű PCR (QRT-PCR) validálás- Az RNS-mintákat minőség-ellenőrzéssel végeztük, és az OD értékeket a fordított transzkripció előtt megmértük. cDNS szintézist végeztünk aAll-in-one első szálú cDNS szintézis Supermix a QPCR-készlethez- A szintetizált cDNS -t hígítottuk10- hajtás, és a QRT-PCR-t afluoreszkáló QPCR rendszerkülönböző kerékpáros körülmények között.Actb-t (béta-aktin) használtunk belső referencia génként, és a relatív gén expressziós szinteket kiszámítottuk a2⁻AδCT módszer.

 

1. táblázat Primer szekvenciák

Génazonosító	Génnév	Forward Primer (5 '-3')	Fordított primer (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ i 1_2}	GMPP	GATAGTGGCTACAACATCCACTT	CCTCCTCTCGTCGTAGTTC
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ i 17_2}	PFP	TatATGGGACCATGGAACCAA	GacCataggCCgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ i 4_1}	Ugdh	Aaagatctccagttcgtaagc	AccaattcgttgatgctAcc
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ i 6_1}	lacz	Gtctccttgttattcgtgaggat	Gtcgatggtgtgaagcagat
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ i 1_1}	SACA	Ttacgaggatagtgaggtgcta	Aatggagatgagggttga
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ i 4_2}	lacz	GGCACAGTCAAGGTACGATG	Kaktgcatcgaggagaaag
-	ACTB	CaatggatgataTatcgcgcgt	Kaktgcatcgaggagaaag

 

 

1.4 Adatelemzés

Hierarchikus klaszterezési elemzésdifferenciálisan expresszált gének (DEG)felhasználva végeztékR (v3.2.0)A gén expressziós mintázatok ábrázolása csoportok és minták között. GO (gén ontológia) dúsítási elemzés ésKEGG (gének és genom kiotói enciklopédia) útdúsítási elemzésfelhasználva végeztékR, ahipergeometrikus eloszlás- A jelentősen dúsított funkcionális kifejezéseket felhasználva mutatták bebárdiagramok, buborékgondok és dúsító kör parcellák.

2 Eredmények és elemzés

2.1 Polyiszacharid tartalom meghatározási eredményei

Az abszorbancia mérésekből kapott lineáris regressziós egyenlet:

y {{0}}. (R^2=0. 9963) y =0. 0154x - 0.1636 (r 2=0. 9963)

lineáris tartományával20–90 ug · ml⁻¹- A pontosság, az ismételhetőség, a stabilitás és a minta visszanyerési aránya{{0}}. 38%, 0. 86%, 0,53%és 99,67%, illetve.

A mértpoliszacharid tartalom-benCistanche sivatagolaA különböző gazdanövényekből származó minták a következők voltak:

Haloxilon-Cistanche: 6.51%

Atriplex-Cistanche: 11.83%

2.2 Transzkriptom szekvenálás és adatgyűjtés

Transzkriptom szekvenálásHat mintaösszesen generált41,77 g tiszta adatok- A mintánkénti érvényes adatok6,89 g - 7,04 g,Q30 Bázis százaléka 95,38% és 95,91% között, és egyAz átlagos GC tartalom 45,13%.

Összesen61 423 Unigenesösszeszerelték, teljes hosszával65,962 858 bpés egyÁtlagos hossza 1 073,91 bp.

2.3 Gén funkcionális kommentár

Összesen61 423 Unigenesa szekvenálásból nyertékCistanche sivatagolaA minták két különböző gazdanövényt parazitálnak. A kommentár eredményei a következők:

30,689 Unigenes (49,96%)megjegyzésbe kerültek aNR (nem redundáns) fehérje adatbázis.

18 698 Unigenes (30,44%)megjegyzésbe kerültek aSvájci-prot adatbázis.

3 998 Unigenes (6,51%)megjegyzésbe kerültek aKEGG adatbázis.

17 188 unigenes (27,98%)megjegyzésbe kerültek aKOG (eukarióta ortológ csoportok) adatbázis.

25 280 Unigenes (41,16%)megjegyzésbe kerültek aeggnog (a gének evolúciós genealógiája: nem felügyelt ortológ csoportok) adatbázis.

16 210 unigenes (26,39%)megjegyzésbe kerültek aGO (Gene Ontology) adatbázis.

16 153 unigenes (26,30%)megjegyzésbe kerültek aPFAM (fehérjecsaládok) adatbázis.

Ezek között,21 650 unigeneshosszabb volt, mint1 kb.

Homológia elemzés aNR adatbáziskiderült, hogy az első három legszorosabban rokon faj a következők voltak:

Paulownia Fortunei (30,23%)

Phtheirospermum japonicum (14,15%)

Chenopodium quinoa (7,1%)

 

 

2. táblázat ACistanche sivatagolaGénfunkció

Adatbázis	Anotációs génszám	Arány (%)
NR	30,689	49.96
Svájciréf	18,698	30.44
Lakó	3,998	6.51
Kóg	17,188	27.98
eggnog	25,280	41.16
MEGY	16,210	26.39

 

 

2.4 GO és KEGG funkcionális kommentár és osztályozás

AGO (Gene Ontology) adatbázishasználták aNR adatbázis, összesen16 210 Unigenes- Ezeket az unigeneket kategorizáltákHárom fő funkcionális csoport:

Biológiai folyamat (BP)

Molekuláris funkció (MF)

Celluláris komponens (CC)

Abiológiai folyamat (BP) kategória, a legelterjedtebb unigene -klaszterek a következők voltak:

"Celluláris folyamat" (11 023 Unigenes)

"Metabolikus folyamat" (9,117 unigenes)

Acelluláris komponens (CC) kategória, 17 Alkategóriaazonosították, minden egyes alkategóriával legalább tartalmaznak30 Unigenes- A legnagyobb klaszterek a következők voltak:

"Sejt" (13,947 Unigenes)

"Cell Rész" (13 918 Unigenes)

Amolekuláris függvény (MF) kategória, a leggazdagabb funkcionális csoportok a következők voltak:

"Kötelező" (10 039 Unigenes)

"Katalitikus tevékenység" (8 490 Unigenes)

2. ábra Go Funkcionális kommentár és osztályozás az unigének

 

KEGG funkcionális kommentár és osztályozás

Alattátírási szekvenálás, összesen3,998 Unigenesmegjegyzésbe kerültek aKEGG (gének és genom kiotói enciklopédia) adatbázis- Ezeket az unigeneket besoroltákHat elsődleges kategória, a megfelelő unigene -számukkal és arányukkal a következők:

Sejt folyamatok: 326 Unigenes (8.15%)

Környezeti információfeldolgozás: 299 Unigenes (7.47%)

Genetikai információfeldolgozás: 1,771 Unigenes (44.30%)

Emberi betegségek: 14 Unigenes (0.35%)

Anyagcsere: 1 465 unigenes (36.64%)

Szervezeti rendszerek: 123 Unigenes (3.07%)

Ezt a hat elsődleges kategóriát tovább osztottuk20 másodlagos osztályozási szint- Köztük,Genetikai információfeldolgozásvolt a legmagasabb arány, majd követteAnyagcsere- AAnyagcsereKategória, a legelterjedtebb utak a következők voltak:

Szénhidrát anyagcseréje

Zsírsav -anyagcsere

Flavonoid metabolizmus

3. ábra KEGG metabolikus útja Az unigének kommentálása

 

2.5 ACistanche sivatagolakülönböző házigazdáktól

AAlapértelmezett differenciál kifejezés kiválasztási kritériumai, az azonosítás eredményeként14 089 differenciálisan expresszált gén (DEG):

6576 gént szabályoztak

7513 gént alulszabályoztak

A vulkán telekgenerálták a DEGS általános eloszlásának megjelenítésére.

AA 30 legjobb Go dúsítás funkcionális osztályozásDEG -kből megfigyelték, hogy:

ÖsszehasonlítvaBiológiai folyamat (BP)ésCelluláris komponens (CC)kategóriák,Molekuláris funkció (MF)szignifikánsabb DEG -dúsítást mutatott.

A leginkább a dúsított DEG -ket társítottáknukleinsav anyagcseréje, protein anyagcseréje és kulcs enzimek a galaktóz anyagcserében.

Ezenkívül a DEG -k jelentősen dúsultakA poliszacharid -metabolizmushoz kapcsolódó GO kifejezések, beleértve:

Keményítő anyagcsere -folyamat

Glikogén bioszintézis folyamat

Szacharóz katabolikus folyamat

Glükozidáz aktivitás

UDP-L-Rhamnose szintáz aktivitás

Poliszacharid -hidroláz aktivitás

4. ábra: A differenciálisan expresszált gének vulkáni térképe

 

KEGG Pathway dúsítási elemzése a DEG -kbenCistanche sivatagolakülönböző házigazdáktól

Hogy tovább vizsgálja adifferenciálisan expresszált gének (DEG)-benCistanche sivatagolakülönböző gazdanövényekből,KEGG útvonal -dúsítási elemzésvégezték. Az elemzés kimutatta, hogy:

A DEG -ket 117 metabolikus útvonalra térképezték fel.

AA 20 legjobb útvonalmegmutatottJelentős DEG -dúsítás, a leginkább dúsított útvonalakkal, beleértve:

Zsírsav -anyagcsere

-Linolénsav -anyagcseréje

Galaktóz anyagcseréje

Lizin lebomlás

AA 20 legkisebb metabolikus kategória a legkisebb Q-értékekkeljelezte, hogy a DEG -k szignifikánsan gazdagodnak:

Szervezeti rendszerek

Anyagcsere

Genetikai információfeldolgozás

E kategóriák között,"Anyagcsere"a legtöbb dúsított DEG volt, és a legjelentősebb dúsítást mutatta. Ezenkívül a dúsított metabolikus útvonalakon aA szabályozott és alulszabályozott unigenes aránya majdnem egyenlő volt.

Ezek az eredmények azt sugalljákA metabolikus útvonalak döntő szerepet játszanaka differenciális gén expressziójábanCistanche sivatagolaa különféle gazdanövényekből, különösen a BElipid, szénhidrát és aminosav -anyagcsere.