A kombinált terápia új hatásai a kaszpáz-1/Gasdermin D által kiváltott piroptózis gátlásán keresztül lupus nephritisben

További információ:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang és Jin Lin

ABSZTRAKT

Célkitűzések: A mikofenolát-mofetil, takrolimusz és szteroidok kombinációs terápiája hatékony a teljes remisszió elérésébenlupus nephritis(LN). A kombinált terápia egyedülállóan csökkentette a kaszpázt-1 a monoterápiákhoz képest, amelyek képesek hasítani a gasdermin D-t (GSDMD), és a közelmúltban apiroptózishóhér. Ezért megvizsgáltuk, hogy a kombinációs terápia lehetővé tette-e a kaszpáz-1/GSDMD által közvetített elnyomását.piroptózisLN-ben (lupus nephritis).

Kattintson a cistanche deserticola ma vesegyulladáshoz

Módszerek: A GSDMD expresszióját és aktiválódását LN-ben szenvedő ember és egér vesemintáiban mutatták ki (lupus nephritis) immunhisztokémiai festéssel és immunblottal. Az MRLlpr egerekből izolált primer podocitákat LPS plusz ATP-vel inkubáltuk, majd monoterápiával vagy kombinációs terápiával előkezeltük. A kaszpáz-1/GSDMD által kiváltott gátlásapiroptóziskombinációs terápiával MRLlpr egereken és humán mintákon értékelték. FAM kaszpáz-1 készlettel és áramlási citometriával vizsgáltak. közötti összefüggéspiroptózisperifériás vérben, és a szisztémás lupus erythematosus betegség aktivitási indexét (SLEDAl) elemezték.

Eredmények: Veseszövet minták az LN-ből (lupus nephritis) betegek és egerek nagymértékben megnövekedett expressziós szintet és a GSDMD hasadását mutatták. Tenyésztett podocitákban a kombinációs kezelés jelentősen elnyomta az NLRP3 és a kaszpáz-1 aktivációját, és csökkentette a GSDMD N-terminális szintjét. A kombinált terápia a kaszpáz-1/GSDMD által közvetített gátlásán keresztül elnyomta a betegség progressziójátpiroptózisemberben és MRL/LPR egerekben egyaránt. A kaszpáz-1/PI pozitív sejtszám a perifériás vérben pozitívan korrelált az SLE-DAl-vel. LN (lupus nephritis) a teljes és részleges remisszióban szenvedő betegek kaszpáz-1/PI pozitív sejtszáma jelentősen csökkent a kiindulási értékhez képest. Az Ac-FLTD-CMK, egy GSDMD-eredetű inhibitor, megakadályozta az LN kialakulását (lupus nephritis).

Következtetés: A kombinációs terápia elnyomja a kaszpáz-1/GSDMD által közvetítettpiroptózisin vitro és in vivo, és csökkenti a betegség progresszióját.

Kulcsszavak:lupus nephritis, piroptózis, kaszpáz-1, gasdermin D, terápia

Kezelési terápia apiroptózis

BEVEZETÉS

Lupus nephritis(LN) a vesegyulladás, amely az autoimmun betegség, a szisztémás lupus erythematosus (SLE) következménye.LN (lupus nephritis) az SLE-ben szenvedő betegek fő megnyilvánulása. A betegek körülbelül 60 százalékánál alakul ki ez az állapot, körülbelül 20 százalékuk pedig végstádiumú vesebetegséggé (ESRD) (1). A mikofenolát-mofetil (MMF), a kalcineurin inhibitorok (CNI) és a szteroidok kombinációja kiegészítő hatásokat fejt ki, és a toxicitást is minimalizálja (2). Ez a terápia javasolt a LN (lupus nephritis), és jobb hatékonyságot és teljesebb remissziót eredményez, mint az intravénás ciklofoszfamid (IVCY) és a szteroidok (3-5).

A kombinált terápia molekuláris és sejtes mechanizmusainak vizsgálatára átfogó transzkriptomikai analízist alkalmaztak az LN egérmodelljében. (lupus nephritis). Az MRL/LPR egerek önmagukban MMF-et, takrolimuszt vagy prednizont kaptak monoterápiaként vagy hármas gyógyszer kombinációkban. A gének expressziójának profiljai LN-ben szenvedő egerek veséjében (lupus nephritis)feltárt olyan lehetséges mechanizmusokat, amelyek a kombinált terápia additív és szinergikus hatásait magyarázhatják a monoterápiákkal összehasonlítva. A kombinációs terápia által egyedileg modulált 45 csökkentett gén egyike a kaszpáz-1 (6). Inflammaszómák aktiválják, amelyek multiprotein oligomerek, amelyek NLRP3-ból, pro-kaszpázból{5}} és apoptózissal összefüggő foltszerű fehérjéből (ASC) állnak, integrált kaszpáz affinitási doménnel. Az NLRP3/ASC/kaspáz-1 gyulladást az LN patogenezisében kulcsfontosságú tényezőként ismerték el. (lupus nephritis). Az NLRP3 inflammaszóma a kaszpáz-1 aktiválásával autoinflammatorikus rendellenességeket vált ki, elindítva a gyulladást elősegítő citokinek, pl. IL-1 termelését, amelyről ismert, hogy podocita diszfunkciót vált ki az LN-ben (7-9).

Az aktív kaszpáz-1 hasítja a gasdermin D-t (GSDMD) az N- és C-terminális doménjeihez kapcsolódóan. Ezután az N-terminális domén elősegíti a pórusképződést a sejtmembránban, stimulálja a sejtetpiroptózisvalamint citokin IL-1 és IL-18 termelése(10). Feltörekvő tanulmányok kimutatták, hogy a GSDMD által közvetítettpiroptózisrészt vesz olyan betegségek progressziójában, mint az autoimmun encephalomyelitis (11), a sclerosis multiplex (12), az alkoholos hepatitis (13) és a gyulladásos bélbetegség (14). Ezenkívül a kaszpáz-1/GSDMD genetikai vagy farmakológiai gátlása kimutatták, hogy megvédi a vesét a sérülésektől a diabéteszes vesebetegség egérmodelljeiben (15, 16), valamint az akut vesekárosodás után is (17-19). Azonban,piroptózisLN-ben (lupus nephritis)még mindig rosszul definiált(20). Feltételeztük, hogy a kombinációs terápia jótékony hatásokat fejtett ki LN-ben (lupus nephritis)) gátlásávalpiroptózisa kaszpáz-1/GSDMD indukálta.

Ebben a tanulmányban a kaszpáz-1 és a GSDMD aktiválódását a veseszövetekben, valamint a kombinációs terápia kaszpáz-1/GSDMD-függő hatásait vizsgáltuk.piroptózisgátlás MRL/LPR egerekben és LN-ben szenvedő betegekben (lupus nephritis). Lehetséges összefüggéseipiroptózisaz SLE betegség aktivitási indexével (SLEDAI) és a kezelésre adott válaszokat is értékelték.

Kezelés apiroptózis

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Tanulmányi populáció

A vizsgálati csoport olyan betegekből állt, akiknél biopsziával diagnosztizáltak LN-t (lupusvesegyulladás) Legkevesebb, mint 6 hónappal a beiratkozás előtt. A beteg életkora 18-65 év volt, és mindegyik megfelelt az American College of Rheumatology for SLE (2l, 22) és az International Society of Nephrology/Renal Pathology Society (2003) osztályozási kritériumainak. A Zhejiang Egyetem Orvostudományi Karából és a Nanjingi Egyetem Orvostudományi Karából vettek fel olyan betegeket, akiknek proteinuriája (1,5 g/nap vagy annál nagyobb) és szérum kreatininkoncentrációja 265,2 umol/l vagy annál kisebb volt. A kizárási kritériumok a következők voltak: egy beteget korábban nagy dózisú metilprednizolonnal kezeltek; biológiai (specifikus patogén molekulákat célzó) vagy kombinált terápia; aktuális plazmaferézis vagy intravénás globulinnal végzett kezelés a szűrést követő 12 héten belül; kóros májfunkciók; aktuális aktív fertőzések; és rosszindulatú daganat a vizsgálat megkezdését követő 4 héten belül. LN (lupusvesegyulladás) betegek pulzusterápiában részesültek metilprednizolonnal 3 napon keresztül 0,5 g/nap dózisban. A metilprednizolon pulzusterápia befejezése után a kombinációs csoport prednizonnal (0.6 mg/kg/nap), MMF-fel (0.5 g, két adag/nap) és takrolimuszszal (2 mg, két adag/nap) összesen 4 hétig. Ezután a prednizon dózisait, amelyeket továbbra is MMF-fel (0,5 g, két adag/nap) és takrolimuszszal (2 mg, két adag/nap) kombináltak, kéthetente 5 mg/nap-kal csökkentették, amíg 10 mg/nap fenntartó dózist értek el(4). A teljes remissziót (CR) a vizelet fehérjekoncentrációjának 24-órájában 0,4 g-nál kisebb vagy azzal egyenlő, aktív vizeletüledékek hiányában, 35 g/l vagy annál nagyobb szérumalbuminkoncentrációban és normál kreatininben vettük. (23). A részleges remissziót (PR) a vizelet fehérjekoncentrációjának legalább 50 százalékos csökkenéseként tekintettük, ha a vizelet fehérjekoncentrációja legfeljebb 3,5 g-ra csökkent, a szérum albuminkoncentráció pedig legalább 30 g/ L, és a szérum kreatininkoncentráció normál vagy legfeljebb 25 százalékos növekedése a kiindulási értékhez képest. Intézményi felülvizsgálati bizottságunk jóváhagyta a vizsgálatot (IIT20200410A), és minden beteg írásos beleegyezését adta a felvétel előtt.

Állatmodellek

A nőstény MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) egereket a SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (Sanghaj, Kína) szállította, az egereket véletlenszerűen osztották fel véletlenszám-generátor segítségével, csoportonként 5 egeret és ketreceket. . 8 hetes korukban orálisan kezelték őket 0,5 mg/kg takrolimusz (MCE HY-13756), 50 mg/kg MMF (MCE HY-B0199) és 1 mg/kg kombinációjával. kg prednizont (MCE HY-B0214) vagy vivőanyagot naponta összesen 8 héten keresztül, a korábban leírtak szerint (6). Az Ac-FLTD-CMK-t MCE szintetizálta, és naponta 10 mg/kg-ot injektáltunk ip. Valamennyi kezelést megvakítottuk a következő kimutatásért felelős résztvevők számára. A vizelet albumin-kreatinin arányát (UACR) az Albuwell M és a Creatinine Companion (Excell, Phil, USA) segítségével határoztuk meg. A vesemintákat 4%-os paraformaldehidben fixáltuk szövettani és immunhisztokémiai festés előtt, és a vesekéregeket immunoblot analízishez extraháltuk. Az egerek használatát az intézményi állatgondozói és -használati bizottságunk ({20}} szám) jóváhagyta.

Egerek Glomeruli izolálása és podocita tenyésztés

A glomerulusokat 12-hetes nőstény C57 és MRL/LPR egerek veséiből tisztítottuk a korábban leírtak szerint (24). Az érzéstelenített egereket 37 °C-ra előmelegített mágnesgyöngyökkel perfundáltuk. A veséket eltávolítottuk és jégen 1 mm³-re aprítottuk. Ezután a veseszöveteket 37 fokon emésztettük 1 mg/ml kollagenázzal és 100 U/ml DNáz I-gyel 30 percig, majd kétszer szűrtük 100-μm Falcon sejtszűrővel (431752, BD). Többszöri 4 fokos HBSS oldattal (H1025, Solarbio) végzett mosás és 200g-vel 5 percig tartó enyhe centrifugálás után a mágneses állvány (HY-K0200, MCE) segítségével összegyűjtöttük a glomerulusokat tartalmazó gyöngyöket és háromszor mostuk HBSS oldattal. Az izolált glomerulusokat I-es típusú kollagénnel (C3867, Sigma-Aldrich) bevont tenyésztett edényeken tenyésztettük 5 százalékos CO-ban, 37 fokon Jeffrey által leírt módszer szerint (25). Az in vitro kísérletben 2. passzázs podocitákat használtunk.PyroptosisIndukció, citotoxicitás és IL-1 szekréció kimutatása

Az MRL/LPR egerekből származó podocitákat 1 mg/ml LPS-sel (tell-pb5lps, In InvivoGen) alapoztuk meg Opti-MEM-ben 4 órán át, majd 5 mM ATP-vel (tlrlatpl, In Vivo gén) stimuláltuk. A C57 egerekből származó podocitákat normál kontrollként levágtuk. Monoterápiák takrolimusz (10 μM), MMF (luM) és prednizon (10 μM) vagy kombinált terápia 1 órán át előinkubáltuk a sejtekkel az LPS beindítás előtt. A stimuláció utáni citotoxicitást citotoxicitás-detektáló készlettel (11644793001, Roche) határoztuk meg a gyártó utasításai szerint. A stimuláció után a felülúszót összegyűjtöttük és az IL-1 egér ELISA Kit (BMS6002, Invitrogen) segítségével a gyártó utasításai szerint mértük.

Antitestek és reagensek

A kaszpáz-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) szintjét a gyártó utasításai szerint értékelték.PyroptosisA perifériás vérben FAM FLICAMCaspase-1 Kit (Bio-Rad, USA) segítségével mértük áramlási citometriával.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzéseket GraphPad Prism (ver. 8.0) segítségével végeztük, és az adatokat átlag ± SD formában adtuk meg. Két csoport-összehasonlítást Student-féle t-próbával, korrelációs elemzéseket pedig Pearson-féle korrelációval végeztünk. Kétfarkú p<0.05 was="" considered="" statistically="">

Kezelés apiroptózis belupus nephritis (LN)

EREDMÉNYEK

GSDMD-közvetítettPyroptosisAktiválódik az LN által érintett vesékben (lupusvesegyulladás)

Annak vizsgálata, hogy a GSDMD hozzájárult-e az LN patogeneziséhez (lupusvesegyulladás), először teszteltük a GSDMD fehérje expressziós szintjét LN-ből vett vesemintákban (lupusvesegyulladás) betegek. Az immunhisztokémiai elemzés a GSDMD feltűnően megnövekedett expressziós szintjét tárta fel LN-ből vett vesebiopsziás mintákban.lupusvesegyulladás) IV., V., I. és Vand IV. és V. típusú betegeknél, és összehasonlítva az egészséges alanyokkal. A GSDMD univerzálisan expresszálódott glomeruláris podocitákban, tubuláris sejtekben és infiltrált intersticiális sejtekben LN-ben (lupusvesegyulladás) betegek. A pozitív (piros nyilak) és negatív festődésű (fekete nyilak) területet megnöveltük (1A ábra). Ezután megbecsültük a GSDMD-pozitív terület százalékos arányát a vesében (1B. ábra). Hasonló eredményeket találtak MRL/LPR egerek és vad típusú kontrollok veséjében. Az immunblot analízis megerősítette a GSDMD nagymértékben megnövekedett expresszióját és hasadását MRL/LPR egerek vesemintáiban (1C. ábra). A GSDMD a glomeruláris podocitákban, tubuláris sejtekben és az infiltrált intersticiális sejtekben megemelkedett MRL/LPR egerekben a kontroll egerekhez képest (1D. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a GSDMD által közvetített aktiválódott az LN által érintett veseszövetben (lupusvesegyulladás).

1. ÁBRA|A GSDMD erősen megemelkedett és hasad az LN-ben (lupus nephritis) szenvedő betegek és egerek veséjében.

(A) A GSDMD immunkémiai festése egészséges alanyokból és LN-ből vett vesemintákban (lupusvesegyulladás) betegeknél a pozitív (piros nyilak) és a negatív festődés (fekete nyilak) megnagyobbodott.

(B) A GSDMD pozitív területek számszerűsítése a III plusz V, IV, IV plus V, V LN típusban látható (lupusvesegyulladás) betegek és egészséges alanyok.

(C) A teljes hosszúságú, hasított N-terminális domén és C-terminális domén GSDMD immunoblot elemzése vesekéregben három pár kontroll és MRL/LPR egérből.

(D) A GSDMD immunkémiai festése kontrollokból és MRL/LPR egerekből vett vesemintákban.

*p < {{0}},05,="" **p="">< 0,01.="" ln="">lupusvesegyulladás), lupusvesegyulladás; FL, teljes hosszúságú; NT, N-terminális domén; CT, C-terminális domén.

A kombinált kezelés elnyomja a GSDMD által közvetítettPyroptosisAktiválás primer podocitákban in vitro

A kombinált terápia gátló hatásainak vizsgálata apiroptózis, az LPS plusz ATP stimulációs módszert alkalmaztuk az indukálásrapiroptózisMRL/LPR egerek podocitáiban, normál kontrollként vad típusú C57 egerekből származó podocitákat véve. Az MRLlpr egerekből származó podocitákat 4 órán át LPS-sel kezeltük, majd 4 órán át ATP-vel kezeltük, amely egy általánosan használt stimulus a GSDMD-közvetített ingerekben.piroptózisaktiválás(26). A normál kontrollhoz képest a podociták ezt követően piroptotikus morfológiai jellemzőket mutattak, például sejtduzzadást és buborékolást. A kombinált terápiával végzett előkezelés jelentősen javította a piroptotikus morfológiai jellemzőket és a citotoxicitást (2A. ábra). LPS plusz ATP indukálta podociták citotoxicitása. Ehhez képest a kombinált terápia szignifikánsan csökkentette a citotoxicitást és az IL-1 szekréciót a felülúszóban, amelyet LPS plusz ATP stimuláció indukált (2B. és C. ábra). A GSDMD által közvetített aktiválás további ellenőrzésérepiroptózis, elemeztük a kanonikus gyulladásokat és a GSDMD aktivációt immunoblot segítségével. A piroptotikus morfológiai változásokkal és citotoxicitással összhangban az LPS plusz ATP szignifikánsan aktiválta az NLRP3-at, a kaszpázt-1 és hasította a GSDMD-t a podocitákban (2D. ábra). A kombinált kezelés jelentősen elnyomta az NLRP3 és a kaszpáz-1 aktivációját, és csökkentette a GSDMD N-terminális szintjét. Nevezetesen, a takrolimusz, MMF vagy prednizon monoterápiák elnyomták az LPS-t és az ATP-t, serkentik a sejt citotoxicitását és L-1 szekrécióját, de a kombinációs terápia jelentősebb gátló hatást mutatott a kaszpáz-1 és a GSDMD esetében. Ezek az eredmények olyan bizonyítékot szolgáltattak, amely alátámasztotta azt a nézetet, hogy a kombinációs kezelés javította a GSDMD által közvetített hatástpiroptózisaz NLRP3 és a kaszpáz aktiválásának elnyomásával-1.

2. ÁBRA|A kombinált kezelés in vitro javítja a podociták piroptózisát.

(A) Piroptotikus jellemzőket mutattunk ki a tenyésztett primer podocitákban, miután LPS-sel és ATP-vel inkubáltuk, és kombinált kezeléssel előkezeltük. A nyilak piroptotikus tulajdonságokat mutató sejteket jeleztek.

(B) A fertőzött sejtek felülúszóit sejthalálra elemeztük, az LDH szekrécióval mérve.

(C) A fertőzött sejtek felülúszóit IL-1b felszabadulásra elemeztük.

(D) Az NLRP3, a kaszpáz-1, a GSDMD-NT és az ASC expresszió immunblot elemzése takrolimusz, MMF, prednizon vagy kombinációs kezelés után NLRP3 gyulladásos aktiválást követően.

*p < {{0}}.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0,001;="" ****p="">< 0,0001.="" ldh,="">

DSMO, dimetil-szulfoxid, FK506, takrolimusz; MMF, mikofenolát-mofetil; PNS, prednizon; COM, kombinált terápia; ASC, apoptózissal összefüggő foltszerű fehérje.

Kombinált kezelés elnyomott kaszpáz-1/GSDMD által kiváltottPyroptosisMRL/LPR egerekben

A nyolchetes MRL/LPR egerek MMF, takrolimusz és prednizon vagy vivőanyag-kontroll kombinációját kapták. Egy korábbi vizsgálattal (6) összhangban 8 hetes kezelés után nem találtak különbséget a mortalitásban vagy a testtömegben a vivőanyaggal és a kombinációs kezeléssel kezelt csoportok között. A hordozó csoporttal ellentétben a kombinált terápia nagyon hatékony volt a proteinuria, a glomerulosclerosis és a vese intersticiális immunsejtek infiltrációjának megelőzésében (1. kiegészítő ábra).

Ezt követően megvizsgáltuk a kaszpáz-1 és a GSDMD expressziós szintjét kombinált terápiás és vivőanyag-kontroll csoportokban. Az immunhisztokémiai elemzés kimutatta, hogy a glomeruláris és vese intersticiális kaszpáz-1 és a GSDMD expressziója jelentősen csökkent a kombinációs terápiás csoportban (3A. ábra). Az immunblot analízis a kaszpáz-1 és a GSDMD csökkent expresszióját és hasadását is megállapította a kombinált kezelési csoport vesekéregében (3B. ábra). Ezenkívül a kaszpáz-1/propidium-jodid (PI) kettős pozitív sejteket áramlási citometriával éspiroptózisFAM Caspase{0}}készlet. Az eredmények a kaszpáz-1*/PI' perifériás vérsejtek számának jelentős csökkenését mutatták ki a kombinált kezelést kapott MRL/LPR egerekben, összehasonlítva a vivőanyaggal kezelt MRL/LPR egerekkel (3C. és D. ábra). Ezenkívül a kombinációs kezelés jelentősen csökkentette a szérum Ii koncentrációját is (3E. ábra). Így arra a következtetésre jutottunk, hogy a kombinációs kezelés elnyomta a kaszpáz-1/GSDMD-indukált hatástpiroptózisa vesékben és az LN vérsejtjeiben (lupusvesegyulladás) egerek.

3. ÁBRA|Kombinált kezelés legyengített kaszpáz-1/GSDMD által közvetített piroptózis MRL/LPR egerekben.

(A) A GSDMD és a kaszpáz -1 immunkémiai festése MRL/LPR egerek vesemintájában. A vivőanyag-kontrollhoz képest a kaszpáz-1 és a GSDMD expressziója jelentősen gátolt volt a kombinált kezelési csoportban.

(B) A teljes hosszúságú és hasított GSDMD és a kaszpáz -1 immunblot elemzése MRL/LPR egerek vesekéreg-mintáiban; a vivőanyaggal és kombinációs kezeléssel kezelt csoportok eredményeinek összehasonlítása.

(C) Kaszpáz-1/PI kettős pozitív sejtek FACS-értéke olyan MRL/LPR egerek perifériás vérében, amelyek kombinált kezelésben részesültek vagy nem.

(D) A kaszpáz-1/PI kettős pozitív sejtek mennyiségi meghatározása kombinációs kezelésben részesült vagy nem kapott MRL/LPR egerek perifériás vérében.

(E) A szérum IL{{0}}b koncentrációjának mennyiségi meghatározása MRL/LPR egerekben, amelyek kombinációs kezelést kaptak vagy nem kaptak. ####P < 0,0001.="" facs,="" fluoreszcenciával="" aktivált="" sejtválogatás;="" ct,="" kombinált="">

Kombinációs terápia elnyomott kaszpáz-1/GSDMD által kiváltottPyroptosisLN-ben (lupusvesegyulladás) Betegek

2020 januárja és 2020 júniusa között 47 LN-ben szenvedő beteg (lupusvesegyulladás). A bevont kohorsz kiindulási betegségét és demográfiai adatait az 1. kiegészítő táblázat sorolja fel. A kaszpáz-1/propidium-jodid mennyiségi meghatározása (a PI kettős pozitív sejteket LN-ben szenvedő betegeken végezték el.lupusvesegyulladás) III., IV., V., III. és V., IV. és V. típusú, egészséges kontrollokban pedig apiroptózisFAM Caspase{0}} készlet és áramlási citometria. Az egészséges kontrollokhoz képest a kaszpáz-1/PI kettős pozitív sejtek száma megnőtt a perifériás vérben (4A, B ábra). A kaszpáz-1/PI kettős pozitív sejteket is megvizsgáltuk 24-hetes kezelés után és a kiinduláskor. 24-hetes indukciós terápia után a CR és PR incidenciája 39,5 százalék (17/43), illetve 32,6 százalék (14/43) volt. A kaszpáz-1/PI kettős pozitív sejtszám a CR- és PR-betegek perifériás vérében jelentősen csökkent a kiindulási értékhez képest (4C. ábra). Korrelációt is azonosítottunk a kaszpáz-1 indukálása közöttpiroptózisés a SLEDA; az adatok egyértelműen azt mutatták, hogy a kaszpáz-1/PI pozitív arány a perifériás vérben pozitívan korrelált a SLEDAI-val (4D. ábra). Az Ac-FLTD-CMK, egy GSDMD-eredetű gátló, megakadályozta az LN kialakulását (lupusvesegyulladás).

4. ÁBRA|A kombinált terápia legyengített kaszpáz-1-közvetítette piroptózis LN (lupus nephritis) betegeknél.

(A) Kaszpáz-1/PI kettős pozitív sejtek FACS-ja a LN perifériás vérében (lupusvesegyulladás) kombinált terápiával vagy anélkül kezelt betegek.

(B) A kaszpáz-1/PI kettős pozitív sejtek mennyiségi meghatározása a III., IV., V., III. és V. típusú perifériás vérben, valamint IV plusz V LN.lupusvesegyulladás) betegek és egészséges alanyok.

(C) A kaszpáz-1/PI kettős pozitív sejtek mennyiségi meghatározása a LN perifériás vérében (lupusvesegyulladás).

(D) A kaszpáz-1/PI kettős pozitív sejtek arányának korrelációs elemzése az SLE-DAI-val.

**p < 0.01.="" facs,="" fluoreszcenciával="" aktivált="" sejtválogatás;="" ln="">lupusvesegyulladás), lupusvesegyulladás; CR, teljes remisszió; PR, részleges remisszió; SLE-DAI, szisztémás lupus erythematosus betegség aktivitási indexe.

Egy közelmúltban végzett tanulmány megállapította, hogy a GSDMDh egereknél fokozott vese C3 és IgG lerakódás, súlyosabb vesekárosodás és fokozott mortalitás alakult ki az SLE imikimod által kiváltott modelljében.17 A GSDMD LN-ben betöltött szerepének további tisztázása érdekében.lupusvesegyulladás), az MRL/LPR egereket Ac-FLTD-CMK21-gyel kezeltük 8- hetes koruktól kezdve, a vivőanyaggal a kontrollhoz hasonlóan. 8-hetes kezelés után nem találtak különbséget a mortalitásban vagy a testtömegben a hordozóanyaggal és az Ac-FLTD-CMK-val kezelt csoport között. A vivőanyag-kontroll egerekhez képest az Ac-FLTD-CMK-val kezelt MRL/LPR egerekben alacsonyabb volt a vizelet albumin-kreatinin aránya (5A. ábra), alacsonyabb volt a szérum kreatininkoncentrációja (5B. ábra), csökkent a glomerulosclerosis (5C. ábra) és a CD3. , CD4 és CD68 pozitív sejtinfiltráció (5D. ábra). Az immunhisztokémiai eredmények a GSDMD csökkent expresszióját (5D. ábra) és a szérum IL-1 szekréciójának ELISA-val meghatározott csökkenését mutatták (5E. ábra). Az adatok együttesen arra utaltak, hogy az Ac-FLTD-CMK gátoljapiroptózisLN által érintett vesékben (lupusvesegyulladás).

5. ÁBRA|Az Ac-FLTD-CMK, egy GSDMD-eredetű inhibitor, megakadályozta a LN (lupus nephritis) kialakulását.

(A) A vizelet albumin-kreatinin arányát az MRL/LPR egerekben számítottuk ki, amelyekben GSDMD-gátlót kaptak vagy nem.

(B) Szérum kreatinin MRL/LPR egerekben, amelyek GSDMD-gátlót kaptak vagy nem kaptak.

(C) Reprezentatív képek a Periodic sav-Schiff-fel (PAS) festett vesemintákról és a glomerulosclerosis százalékos meghatározásáról.

(D) CD3, CD4, F4/80 és GSDMD immunkémiai festése. (E) A szérum IL-1b-koncentrációjának mennyiségi meghatározása GSDMD-gátlóval kezelt vagy nem kapott MRL/LPR egerekben.

Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. #p < {{0}},05,="" ##p=""><>

VITA

A kombinált terápia ígéretes stratégia a magasabb CR és az általános válaszarányok, a rövidebb idő a remisszióig és a kevesebb mellékhatás miatt. Ez idáig a kombinációs terápia mögöttes molekuláris mechanizmusai nem voltak ismertek. Fu és munkatársai (6) nemrégiben MRL/LPR egereket kezeltek monoterápiával vagy kombinációs terápiával, és átfogó transzkriptomikai elemzést végeztek a teljes veséken. Érdekes módon azt találták, hogy a kombinált terápia, de nem a monoterápia, kifejezetten és egyedi módon elnyomja a kaszpáz{1}} expresszióját.

Az NLRP3/ASC/kaszpáz-1 gyulladás ma már az LN patogenezisében kulcsfontosságú tényezőként ismert (lupusvesegyulladás). A podociták NLRP3 gyulladásai aktiválódnak lupuszra hajlamos egerekben és LN-ben szenvedő betegekben is.lupusvesegyulladás). Amikor az NLRP3 gyulladásokat kaszpáz-1 gátlóval elnyomták, a proteinuria, a veseszövettani elváltozások és a podocita lábfolyamat kiürülése javult a lupuszra hajlamos egerekben (8). Huang et al. (27) arról számolt be, hogy az NLRP3 expresszálódik az LN tubuláris sejtjeiben (lupusvesegyulladás) IV. osztályú, és hogy az NLRP3 aktiváció pozitívan korrelált az LN-ben szenvedő betegek aktivitási index pontszámával. Bebizonyosodott, hogy a kaszpáz-1 létfontosságú szerepet játszik a lupusz és az érrendszeri diszfunkcióban, így új terápiás beavatkozások lehetséges célpontja (28). A feltörekvő kísérleti gyógyszerek, mint például a RIP3(29), a P2X7 receptor antagonisták(30), a GSK-3 inhibitorok (31) és egy Nrf2 agonista (32) gátolták az LN kialakulását.lupusvesegyulladás). Az IL-18 megnövekedett szérumkoncentrációja korrelál a betegség súlyosságával és a vesekárosodás/veseérintettség mértékével az SLE-s betegekben (33). Legjobb tudomásunk szerint úgy tűnik, hogy a gasdermin család elengedhetetlen lehet a fejlődéséhezpiroptózis, de kevés bizonyíték áll rendelkezésre a GSDMD/GSDME jelenlétére SLE-betegekben.

Összességében megvizsgáltuk a GSDMD aktiválódását és expresszióját LN-ből vett vesebiopsziás mintákban (lupusvesegyulladás) betegek és MRL/LPR egerek. A GSDMD erősen indukált és hasított glomeruláris podocitákban és tubuláris sejtekben, valamint infiltrált intersticiális sejtekben. Ezt követően az MRL/LPR egerek MMF, takrolimusz és prednizon vagy vivőanyag kombinációját kapták. A vivőanyag-kontrollcsoporthoz képest a kaszpáz-1 és a GSDMD aktiválása csökkent a kombinált kezelési csoportban. A mértékepiroptózisa perifériás vérben is sokkal alacsonyabb volt a LN-ben (lupusvesegyulladás) betegek kombinációs terápia alkalmazása után. Ráadásul,piroptózisa perifériás vérben pozitív korrelációt mutatott a SLEDAI-val, ami arra utaltpiroptózisa perifériás vérben az SLE aktivitás jelentős markereként működhet. Feltételeztük tehát, hogy a kombinációs terápia jótékony hatásokat fejthet ki az LN-ben (lupusvesegyulladás) gátlásávalpiroptózisa kaszpáz-1/GSDMD indukálta. A kaszpáz-1 korábbi kristályszerkezeti vizsgálatai egy Ac-FLTD-CMK-komplexben számos enzim-inhibitor kölcsönhatást tártak fel, amelyek megakadályozták a GSDMD kaszpáz általi felismerését-1. Azonban azt találtuk, hogy az Ac-FLTD-CMK, amely GSDMD-eredetű inhibitorként működik, gátoltapiroptózisLN-ben (lupusvesegyulladás), amelyet más mechanizmus válthat ki.

A közelmúltban egy TLR{0}}indukált SLE (34) egérmodellben a GSDMD-/- egerek nagyobb mértékű vesekárosodást és megnövekedett mortalitást fejlesztettek ki, ami kezdetben azt sugallta, hogy a GSDMD deléciónak védő hatása lesz, és összefüggésbe hozható a szisztémás gyulladás és autoantitestek termelése, amihez a mortalitás növekedése társul. A GSDMD-hiányos egerekben a vesemintákban a glomeruláris immunkomplex markánsabb lerakódása és magasabb proteinuria alakul ki, mint a vad típusú egereknél. Az extracelluláris HMGB1 fokozott szekrécióját a GSDMD-/limfocitákban is találták, ami arra utal, hogy nekrózis/piroptózisakkor történt, amikor a GSDMD nem volt jelen.

Caspase{0}} triggerekpiroptózisGSDMD hasítással. Ezzel szemben a GSDMD-hiányos vagy GSDMD-szegény sejtekben a kaszpáz-1 apoptózist, majd GSDME-függő másodlagos nekrózist éspiroptózis. Ha a terápia után hiányzik a GSDMD aktivitás, a GSDME esetleg a kaszpáz{0}}közvetített apoptózist is átválthatjapiroptózis(35,36). Ezenkívül a kaszpáz-8 aktiválása jelentősen fokozódott azokban a makrofágokban, amelyek GSDMD-hiányosak voltak. Szignifikáns kaszpáz-8 aktivációt találtak a TLR7-indukált GSDMD-hiányos LN-ben is (lupusvesegyulladás) egerek (34). Így GSDMD hiányában valószínű, hogy a kaszpáz-1 együttműködik a kaszpázzal-8, és a kaszpáz-3-GSDME által közvetített apoptózist váltja kipiroptózisLN-ben (lupusvesegyulladás), ez a hipotézis további kísérleti vizsgálatot igényel.

A jelenlegi tanulmánynak számos korlátozása van. Először is, a jelenlegi adatok alapján igazoltuk, hogy a kombinációs terápia képes elnyomnipiroptózis, de más kezelések, mint például a szteroidok és az MMF kettős terápiája, a szteroidok és a takrolimusz, vagy az anti-CD20 antitest szintén hasonló hatásokkal járhatnak. Másodszor, a kombinációs terápia kaszpázra -1 gyakorolt ​​gátló hatásának pontos molekuláris mechanizmusa még nem teljesen feltárt. Végül, de nem utolsósorban megfigyeljük a kaszpáz-1/PI kettős pozitív sejtek kapcsolatát a perifériás vérben az SLE-DAI-val, valamint a kombinációs terápia előtti és utáni változást egy retrospektív LN-ben (lupusvesegyulladás) betegcsoport. A kaszpáz-1/PI kettős pozitív sejtek klinikai prediktív értékét a betegségek aktivitására és a kezelésre adott válaszreakcióra vonatkozóan tovább kell vizsgálni egy nagyobb leendő kohorszban.

Összességében megállapítottuk, hogy a kombinációs terápia a kaszpáz-1/GSDMD által kiváltott szuppresszálásával fejtette ki jótékony hatásait.piroptózisLN-ben (lupusvesegyulladás), amely újszerű betekintést nyújtott az érintett sejtmechanizmusokba. Valójában a kombinációs terápia kifejezetten és egyedi módon elnyomta a kaszpáz{0}} expresszióját. Az NLRP3 és a kaszpáz-1 farmakológiai vagy genetikai gátlása javította a veseműködést és elnyomta az autoimmunitást LN-ben (lupusvesegyulladás). A kaszpáz-1 patofiziológiai szerepe az LN-ben (lupusvesegyulladás) érdemes további tanulmányozásra, és a GSDMD-t célzó terápiák LN-ben szenvedő betegeknél (lupusvesegyulladás) nagyon alaposan ki kell értékelni.

Kezelési módszer apiroptózis

IRODALOM

1. Saxena R, Mahajan T, Mohan C.LupusVesegyulladás: Aktuális frissítés.Arthritis Res Ther (2011)13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. Individualizing Therapy inLupusVesegyulladás. Kidney Int Rep (2019) 4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H, Liu ZH, Xie HL, Hu WX, Zhang HT, LiLS. Az V. és IV. osztály sikeres kezeléseLupusVesegyulladásMultitarget terápiával. J Am Soc Nephrol (2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z et al. Multitarget Therapy for Induction Treatment ofLupusVesegyulladás: Randomized Trial, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10,7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C, et al. Multitarget Therapy for Maintenance Treatment ofLupusVesegyulladás. J Am Soc Nephrol(2017)28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M és munkatársai. A transzkriptomikus elemzés új szinergikus mechanizmusokat tár fel a kombinációs terápiábanLupusVesegyulladás. Kidney Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. Ummarino D.LupusVesegyulladás: NLRP3 Inflammasome Ignites Podocyte Disfunction. Nat Rev Rheumatol(2017)13:451.doi: 10.1038/Orpheum. 2017.9