Fenolsavak, flavonolok és flavan{1}olok ultrahanggal segített extrahálása muscadine szőlő héjából és magjából természetes mélyeutektikus oldószerek és mesterséges neurális hálózatok előrejelző modellezése segítségével

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

AbsztraktA tanulmány célja 9 természetes mélyeutektikus oldószer (NDES) extrakciós hatékonyságának vizsgálata volt ultrahang segítségével.fenolsavak, flavonolokés flavan{0}}olok a muscadine szőlő (Carlos) héjában és magjában, szemben a 75 százalékos etanollal. Mesterséges neurális hálózatot (ANN) alkalmaztak az NDES víztartalmának, az ultrahangos kezelési időnek, a szilárd-oldószer aránynak és az extrakciós hőmérsékletnek az optimalizálására, hogy a legmagasabb extrakciós hozamot érjék el az ellagsav, a katechin és az epikatekin esetében. Az újonnan kifejlesztett NDES (#1) kolin-kloridból áll:levulinsav: etilénglikol 1:1:2 és 20 százalékos víz vonja ki a bőrben a legtöbb ellagsavat, 22,1 mg/g. Ez a hozam 1,5-szerese a 75 százalékos etanolnak. A kolin-klorid: prolin: almasav 1:1:1 arányú és 30 százalékos vízből álló módosított NDES (#3) extrahálta a legtöbb katechint (0,61 mg/g) és epikatechint. (0,89 mg/g) a bőrben, illetve 2,77 mg/g és 0,37 mg/g a magban. Az ellagsav optimális hozama a bőrben az NDES #1 alkalmazásával 25,3 mg/g (megfigyelt) és 25,3 mg/g (jósolt) volt. Az optimális hozam (katekin plusz epikatekin) vetőmagban NDES #3 alkalmazásával 9,8 mg/g (megfigyelt) és 9,6 mg/g (jósolt) volt. Ez a tanulmány kimutatta a kiválasztott NDES-ek polifenolok magas extrakciós hatékonyságát optimalizált körülmények között.

További információért kattintson ide

Bevezetés

A természetes mélyeutektikus oldószereket (NDES) úgy állítják elő, hogy a hidrogénkötés-donorokat hidrogénkötés-akceptorokkal keverik össze megfelelő mólarányban [1]. Az egyik komponens olvadáspontja alacsonyabb legyen, mint a másiké [1]. Melegítés és keverés után ez a közeg szobahőmérsékleten folyékony lesz. A keverék stabilizálására és polarizálására vizet adunk hozzá. Az NDES-t alkalmazó fitokémiai extrakció területén a hatékony extrahálhatóság és oldhatóság miatt bővült a kutatás. Mindazonáltal több tényező is jelentős szerepet játszik az NDES és a szerves oldószerek összehasonlításakor, beleértve a hozamot, a költségeket, a visszanyerést és a toxicitást. A korábbi kutatások az NDES-t különböző polifenolok különböző élelmiszer-mátrixokból történő extrakciójával foglalkoztak. Például Bubalo et al. (2016) 5 NDES-t, vizet, 70% metanolt (v/v) és savanyított 70% metanolt (v/v) hasonlított össze az antocianinok, a katechin és a kvercetin-3-O-glükozid vörösszőlő héjából való kivonására. A kolin-klorid: oxálsav (1:1) és 25% víz (v/v) elegyéből álló NDES-t találták a leghatékonyabb extrakciós oldószernek [2]. Egy másik tanulmányban Panic et al. (2019) 8 NDES-t teszteltek, és az etanol 70 százalékát megsavanyították, és a kolin-klorid: citromsav (2:1) 30 százalékos vízzel (v/v) a legjobb NDES-t találták az antocianinok szőlőtörkölyből való kinyerésére [3]. A muscadine szőlő (Vitis rotundifolia) a délkeleti államokban őshonos, és az első termesztett vadon élő szőlő az Egyesült Államokban [4]. A Muscadine szőlőt 12 államban termesztik, összesen mintegy 5000 hektáron [5]. A muscadine szőlőnek 100 fajtája létezik, és mindegyik eltérő fizikai, érzékszervi vagy kémiai jellemzőkkel rendelkezik [4]. Közülük a Carlos egy széles körben ültetett muscadine szőlő magas terméshozama és növekedési konzisztenciája miatt [4]. A Carlos muscadine szőlő közepes méretű, bronz színű, vastagabb héjú, és átlagosan négy magot tartalmaz [6]. A Muscadine szőlő jelentős mennyiségben tartalmazpolifenolokamelyekről ismert, hogy csökkentik a gyulladást [7], gátolják a prosztata daganat növekedését [8] és javítják a cukorbetegek metabolikus válaszait [9]. A muscadine szőlőtörköly, a muscadine szőlőlé préselés vagy borkészítés mellékterméke, héjból és magvakból áll. Egy korábbi kutatásban aceton: víz: ecetsav keveréket (70: 29,7:0,3, v/v) használtak a fenolos vegyületek extrahálására nyolc floridai muscadine szőlőfajta magjából, héjából és pépéből, köztük Carlos [10]. A gyúlékony szerves oldószerek alkalmazása és alacsony extrakciós hatékonysága azonban akadályozta a gyakorlati alkalmazásokat. A muscadine szőlőtörköly nagy részét még mindig hulladékként dobják ki. A mesterséges neurális hálózat (ANN) egy nemlineáris leképezési rendszer, amely súlyozott asszociációkkal összekapcsolt különféle alapvető feldolgozóegységekből áll. Ezeket a feldolgozó egységeket "neuronoknak" nevezik [11]. A mesterséges neurális hálózat egy olyan gépi tanulási megközelítés, amely több bemeneten alapuló válasz előrejelzésére vagy előrejelzésére szolgál [11]. A korábbi kutatások válaszfelületi módszereket (RSM) alkalmaztak az extrakció optimalizálására és előrejelzésére. Azonban kevés tanulmány használta az ANN-t ugyanerre a célra. Például Sinha et al. (2013) azt javasolta, hogy az ANN jobb előrejelzési teljesítménnyel rendelkezik, mint az RSM a Bixa Orellana (Annatto) magvaiból származó természetes festék kivonásakor [12]. Egy hasonló tanulmányban Ciric et al. (2020) arról számoltak be, hogy az ANN-modell jobb volt, mint az RSM a fokhagymából történő fenolos vegyület extrakciójának előrejelzésében [13]. A kutatás célja az volt, hogy megvizsgálja a 9 NDES extrakciós hatékonyságát fenolsavak, flavonolok és flavan{17}olok esetében a 75 százalékos etanolhoz képest ultrahang segítségével. Az ANN-t alkalmaztuk a fenolos hozamra vonatkozó extrakciós körülmények előrejelzésére és optimalizálására. A hipotézis az volt, hogy a specifikus összetételű NDES 75 százalékos etanolnál nagyobb mennyiségű fenolosavat, flavonolokat és flavan{19}olokat von ki, és a legmagasabb extrakciós hatékonyság érhető el ANN-alapú prediktív modellezéssel.

2. Anyagok és módszerek 2.1. Vegyszerek és reagensek A kolin-kloridot, levulinsavat, 1,2-propándiolt, DL-almasavat, oxálsavat, sósavat és hangyasavat az Acros Organics-tól (Morris Plains, NJ, USA) szereztük be. A tejsavat, etilénglikolt, glicint, HPLC-minőségű acetonitrilt, metanolt és etanolt a Fishers Scientific-től (Waltham, Massachusetts, USA) vásároltuk. Az L-prolint és a betain-hidrokloridot az Alfa Aesartól (Ward Hill, MA, USA) vásároltuk. Az ellagsav, galluszsav, ferulinsav, (plusz)-katekin, (-)-epikatechin, miricetin, kvercetin és kaempferol HPLC-minőségű standardjait a Sigma Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be.

2.2. Az NDES tervezéseAz 1. táblázatban szereplő 1–2. számú NDES-t korábbi tanulmányunkban terveztük [14]. Az 1–2. számú NDES-ben a kolin-kloridot választottuk hidrogénakceptornak, míg minden új NDES-hez két különböző hidrogéndonort választottak. A hidrogéndonorok és az akceptor közötti mólarányokat, valamint a víztartalmat előzetes kísérletekben határoztuk meg. Az 1. táblázatban szereplő 3–9. számú NDES-t az irodalomból választottuk ki, mivel a korábbi tanulmányok hatékony NDES-nek nevezték őket a polifenolok extrakciójában. Az NDES #3 víztartalmát az idézett irodalomból módosítottuk. Az NDES elkészítéséhez fűtési módszert alkalmaztak [15]. Röviden összefoglalva, a hidrogénkötés-akceptort összekevertük a hidrogénkötés donor komponenseivel Erlenmeyer-lombikban egy keverőrúddal. A lombikban lévő keveréket lezártuk, és 50 ◦C-ra melegítettük körülbelül 30 percig, vagy amíg tiszta folyadék nem keletkezik, és szobahőmérsékleten stabil maradt. Az 1. táblázatban szereplő víztartalmakat az NDES keverékek végső térfogata alapján számítottuk ki. Az 1. táblázatban felsorolt ​​NDES pH-értékét pH-mérővel (AB15, Accumet, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mértük. 2.3. Mintaelőkészítés / Ultrahanggal segített extrakció A fagyasztott muscadine szőlő (Vitis rotundifolia) héját és magját (Carlos fajta) a Paulk Vineyards (Wray, Georgia, USA) biztosította. A héjak, levelek vagy levélnyelek eltávolítása után a törkölyt magokra és bőrre választották. A mintákat ezután vákuumkemencében (Isotemp, Model 285A, Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) 60 ◦C-on és -30 in.Hg-nál alacsonyabb vákuumnyomáson szárítottuk. Ezután a mintákat finom porrá homogenizáltuk kiméra őrlővel (A1{{105}}00, RRH Inc., 2800 W, Zhejiang, Kína). 1:20 (g: ml) kezdeti szilárdanyag-oldószer arányt alkalmazva 0,50 g muscadin szőlőhéjat vagy magot 10 ml NDES-ben vagy 75 százalékos etanolban háromszor elegyítettünk. A mintákat ezután vízfürdőbe (60 ◦C) helyeztük, és ultrahanggal kezeltük (VCX 1500, Sonics & Materials Inc., 1500-Watt, 50/60 Hz, Newtown, CT, USA) 30 percig 100 százalékon. amplitúdó két körre (15 perc/kör). Ezután a mintákat azonnal centrifugáltuk (Sorvall ST 8, Fisher Scientific, Suzhou, Kína) 3260 g-vel, amíg tiszta felülúszót nem kaptunk. Végül a felülúszót összegyűjtöttük, és –20 ◦C-os fagyasztóban tároltuk a fenolsavak (ellagsav, galluszsav, ferulinsav), flavonolok (miricetin, kvercetin és kaempferol) és flavan{45}}olok HPLC-elemzéséhez. (katekin és epikatekin). 2.4. Fenolsavak, flavonolok és flavan{48}olok HPLC-elemzései A fenolsavakat, flavonolokat és flavan{49}olokat HPLC-rendszeren (Agilent Technologies 1200, Waldbronn, Németország) elemeztük az Sandhu és Gu (2013) [16]. A HPLC rendszer egy bináris szivattyúból, egy automatikus mintavevőből, egy termosztált oszloptérből, egy diódasoros detektorból és egy fluoreszcencia detektorból áll. A fenolos savak és flavonolok vizsgálata előtt a szőlőhéj- vagy magkivonatokat hidrolizáltuk. A hidrolízist úgy végeztük, hogy 1 ml kivonatot összekevertünk 4 ml hidrolízisoldattal (50% metanolt tartalmazó 1,2 M sósav), majd vízfürdőbe helyeztük (Precision, Model 2837, 400 W, 50/60 Hz, Thermo Scientific, Marietta , OH, USA) 90 °C-on 80 percig. Ezt követően a mintákat 25 ◦C-ra hűtöttük, majd 5 percig ultrahanggal kezeltük. A kivonat hidrolízisére nem volt szükség a katechin és az epikatekin elemzéséhez. A hidrolizált és nem hidrolizált kivonatokat 0,45 μm-es politetrafluoretilén (PTFE) membránon szűrtük a HPLC analízis előtt. Az ellagsav, galluszsav, ferulinsav, miricetin, kvercetin, kaempferol, katechin és epikatekin analíziséhez 10 µl-t injektáltunk egy SB-C18 oszlopba (4,6 × 250 mm, 5 µm, Zorbax, Agilent, Santa Clara USA). A mozgó fázisok (A) 0,5% hangyasav és (B) 100% acetonitril voltak. Az áramlási sebesség 1 ml/perc volt, 25 perces módosított gradienssel: 0-5 perc, 10-30% B; 5–10 perc, 30–40 százalék B; 10–20 perc, 40–50 százalék B; 20–25 perc, 50–10 százalék B; ezt követi 5 perc egyensúlyozás. Az oszlop hőmérsékletét 30 ◦C-ra állítottuk be. A detektálási hullámhossz ellagsav, galluszsav és ferulinsav esetében 260 nm, miricetin, kvercetin és kaempferol esetében 360 nm volt fotodiódasoros detektoron. A katechin és az epikatekin gerjesztése és emissziója 230 nm, illetve 321 nm volt, fluoreszcencia detektorral. A polifenolvegyületeket az ellagsav, galluszsav, ferulinsav, miricetin, kvercetin, kempferol, katechin és epikatekin standard görbéivel határoztuk meg. Minden standard görbe 7 pontos és R2 > 0,99 volt. 2.5. Személyre szabott tervezés mesterséges neurális hálózatokhoz Négy független extrakciós változó négy szinttel: víztartalom (15–60 százalék), ultrahangos kezelési idő (5–35 perc), szilárdanyag/oldószer arány (1:5–1:20) és extrakció hőmérsékletet (30–60 ◦C) (S1 táblázat) alkalmaztunk a fenolsavak, flavonolok és flavanolok extrakciós hozamának optimalizálására. Ellentétben a klasszikus kialakításokkal, mint például a válaszfelület-kialakítás, az ANN-alapú tervezés nem igényel ismétlődő futtatásokat, és más adatstruktúrát részesít előnyben. Korábbi tanulmányunkban [14] az ANN megbízhatóbb módszer volt az extrakciós hozam előrejelzésére, mint az RSM. Ezért ebben a vizsgálatban az ANN-t választották az ellagsav, katechin és epikatekin extrakciós hozamának előrejelzésére. A JMP Pro (14.2-es verzió, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) egy 40 futtatást tartalmazó testreszabott tervet (S2 táblázat) hoztak létre, hogy kifejezetten az ANN prediktív modellezéshez szolgáltasson adatokat. A 40 futtatás véletlenszerűsítését alkalmaztuk az esetleges torzítások kiküszöbölésére. Az ANN fő egyenlete a következő: a=∑jj=1 wh jpg plusz bhk, k=1toK (1), ahol h a rejtett rétegben lévő neuronok száma, j és k a bemeneti változók és a rejtett neuronok száma, p a bemeneti változó, bh a rejtett réteg torzítása, wh pedig a rejtett réteg súlya. Az ellagsav, a katechin és az epikatekin extrakciós hozamát a négy független változóhoz viszonyítva ANN segítségével elemeztük, először az adatok betanításával, majd kiválasztva a legjobb aktivációs típust és számos neuront, amely az adatok megfelelő illeszkedését eredményezi. Az előrejelzési modellek sikerességének értékeléséhez három értéket értékeltek: R-négyzet, az átlagos négyzetes előrejelzési hiba (RASE) négyzetgyöke (2. egyenlet) és az átlagos abszolút hiba (AAE). A RASE jelentése RASE=̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ SSE/n √ (2) Ahol az SSE adakozik az előrejelzési hibák (a tényleges válaszok és az előrejelzett válaszok közötti különbségek) négyzetére és összegezésére, valamint n-re számos megfigyelés esetén. Az 1-hez közeli R-négyzet a RASE-val és a nullához közeli AAE-vel azt jelenti, hogy az adatok jobban illeszkednek a modellbe. 2.6. Statisztikák A fenolsavak, flavonolok és flavan{142}olok extrakciós hozamát egyutas ANOVA-val, majd Student-féle t-teszttel hasonlítottuk össze 0,05-nél kisebb vagy azzal egyenlő értéknél a JMP Pro segítségével (14.2-es verzió, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Mindegyik nde-t és 75 százalékos etanolt Dunnett-teszttel hasonlítottuk össze p 0,05-nél kisebb vagy azzal egyenlő értéknél. A főkomponens-analízist (PCA) a JMP Pro-n (14.2-es verzió, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) végeztük a muscadine szőlő héjából és magjából extrahált fenolos vegyületekre. 3. Eredmények és megbeszélés 3.1. A muscadine szőlő héjából NDES által kivont polifenolok Kilenc NDES-t és 75 százalékos etanolt használtak a muscadine szőlő héjából származó polifenolok extrakciójához. A 2. táblázat az ellagsav, galluszsav, ferulinsav, miricetin, kvercetin, kaempferol, katechin és epikatekin extrakciós hozamát mutatja. Az ellagsav volt a leggyakrabban kivonható polifenol a szőlőhéjban, ezt követi a galluszsav és a ferulinsav. Ez a megállapítás összhangban van a korábbi tanulmányokkal [17,18]. Az NDES #1, #8, #7, #3, #2 és #9 szignifikánsan nagyobb mennyiségű ellagsavat vont ki a szőlőhéjból, mint a 75 százalékos etanol. Az ellagsav legmagasabb extrakciós hozamát az NDES #1 érte el, ezt követte az NDES #8 22,1 ± 2,2 mg/g és 21,3 ± 2,5 mg/g értékkel (2. táblázat). A Student-féle t-teszt szerint azonban nem volt szignifikáns különbség az NDES #1 és az NDES #8 között. Érdekes módon az NDES #1 a legkevésbé hatékony NDES az antocianinok kinyerésére

áfonya törköly [14]. Ez arra utalt, hogy az NDES #1 szelektíven extrahálhatja az ellagsavat vagy az ellagitanninokat az antocianidineket is tartalmazó élelmiszer-mátrixból. Az ilyen szelektivitás az NDES és a specifikus fenolosztályok közötti molekuláris kölcsönhatások különbségeinek tulajdonítható. Az S1 ábra (A panel) a szőlőhéjból NDES #1-gyel extrahált, 260 nm-en detektált galluszsav, ellagsav és ferulinsav HPLC-kromatogramját mutatja. A 75 százalékos etanol grammonként 12,7 ± 1,2 mg ellagsavat vont ki a szőlőhéjból. A legalacsonyabb ellagsav extrakciós hozama az NDES #4-ben volt megfigyelhető, 7,44 ± 0,6 mg/g. A galluszsav extrakciós hozama az NDES #9, #8, #1, #4, #7 és #3 által összehasonlítható volt, és jelentősen meghaladta a 75 százalékos etanolt. A legnagyobb mennyiségű gallusavat az NDES #9 extrahálta 10,4 ± 0,5 mg/g, míg a legalacsonyabb mennyiséget 5,55 ± {{40}} 0,1 mg/g-ot NDES #5 extraháltunk. A legnagyobb mennyiségű ferulsavat az NDES #1 extrahálta 6,32 ± 0,7 mg/g értékkel, a legalacsonyabb mennyiséget pedig az NDES #5, 3,11 ± 0.{{5{{52 }}}} mg/g. Ezenkívül nem volt szignifikáns különbség az NDES #1 és a 75 százalékos etanol között a ferulasav extrakciójában (2. táblázat). A legnagyobb mennyiségű katechint és epikatechint az NDES #3 extrahálta 0,61 ± 0,1 mg/g és 0,89 ± 0,1 mg/ g, illetve (2. táblázat). Eközben az NDES #3 és #6 szignifikánsan nagyobb mennyiségű epikatekint vont ki, mint 75 százalékos etanol. Az S2 ábra (A panel) a szőlőhéjból NDES #3-mal extrahált katechin és epikatekin HPLC-kromatogramját mutatja. A katechint azonban nem mutatták ki a 75 százalékos etanolos kivonatban. A legalacsonyabb mennyiségű katechint (0.02 mg/g) és epikatechint ({{90}},14 mg/g) az NDES #2 és NDES # extrahálta. 5, ill. A miricetin volt a legnagyobb mennyiségben előforduló flavonol, a kaempferol pedig a legkevesebb. Dunnett tesztje kimutatta, hogy az NDE-k és a 75 százalékos etanol összehasonlítható volt a miricetin, kvercetin és kaempferol extrakciójában (2. táblázat). A legnagyobb mennyiségű miricetint az NDES #1 (1,84 mg/g), majd a 75 százalékos etanol (1,73 mg/g), majd az NDES #8 (1,67 mg/g) extrahálta. A legmagasabb kvercetin mennyiséget 75 százalékos etanol (0,41 mg/g), NDES #1 (0},40 mg/g) és NDES #8 ({135}} mg/g) extrahálta. {143}},38 mg/g). Ezzel szemben a legkisebb mennyiségű miricetint és kvercetint az NDES #5 extrahálta 0,87 mg/g, illetve 0,27 mg/g értékkel. Ez a megállapítás tovább hangsúlyozza az NDES #5 általános gyenge képességét, hogy kivonja a polifenolokat a szőlő héjából. A legmagasabb kaempferol mennyiséget 75 százalékos etanol (0{05 mg/g), a legalacsonyabb NDES #5 és NDES#6 (0,03 mg/g) extrahálta. Az S1 ábra (B panel) a miricetin, kvercetin és kaempferol HPLC-kromatogramját mutatja a szőlőhéjból NDES #1 segítségével, 360 nm-en detektálva. A fenolsavak, flavonolok és flavanolok legmagasabb összege 40,7 mg/g volt NDES #1-el extrahálva, majd 39,8 mg/g NDES #8-mal extrahálva, míg a legalacsonyabb összeg 18,4 mg/g volt. NDES #5 (2. táblázat). Az NDES pH-ja 0,3 és 3,3 között volt (1. táblázat). Az NDE-k pH-értéke és a fenolsavak, flavonolok és flavan{119}olok hozama közötti Rnégyzetes korrelációt a 2. táblázat sorolja fel. A pH és az extrakciós hozamok közötti összefüggés hiánya arra utal, hogy a pH nem befolyásolta az extrakció hatékonyságát. 3.2. Az NDES-szel kivont polifenolok muscadin szőlőmagból A fenolsavak, flavonolok és flavanolok szőlőmagból történő extrakciójának összesített hozama észrevehetően alacsonyabb volt, mint a héjból (3. táblázat). A magvakban a legnagyobb mennyiségben extrahálható polifenol a katechin és az epikatekin volt, míg a kaempferol nem volt kimutatható. Az olajat tartalmazó komplex magmátrix (13 tömegszázalék, száraz bázis) egy lehetséges magyarázata a fenolos vegyületek szőlőmagból való alacsony kivonhatóságának [19]. A legnagyobb mennyiségű katechint az NDES #3 extrahálta 2,77 mg/g-mal (3. táblázat). Ez a hozam lényegesen magasabb volt, mint az összes többi NDES és 75 százalékos etanol esetében. Az S2 ábra (B panel) a szőlőmagból NDES #3-mal extrahált katechin és epikatekin HPLC-kromatogramját mutatja. A legalacsonyabb mennyiségű katechint az NDES #5 extrahálta 0,30 mg/g mennyiségben. Az NDES #1, #2 és #9 kivételével minden NDES szignifikánsan nagyobb mennyiségű epikatechint extrahált, mint 75 százalékos etanol (3. táblázat). A legmagasabb epikatekin koncentrációt az NDES #4 (0,71 mg/g) és az NDES #5 (0,68 mg/g), míg a legalacsonyabbat 75 százalékos etanol (0,11 mg/g) extrahálta. A szőlőmagban a galluszsav volt a legnagyobb mennyiségben extrahálható fenolsav, ezt követi a ferulinsav és az ellagsav. A legnagyobb mennyiségű gallusavat az NDES #4 extrahálta 0,45 mg/g-mal, majd az NDES #9 és az NDES #8. Ezek az NDE-k lényegesen nagyobb mennyiségű gallusavat vontak ki, mint a 75 százalékos etanol. A legalacsonyabb mennyiségű gallusavat (0,2 mg/g) az NDES #3 extrahálta. A legmagasabb kitermelés

Az ellagsav hozamát az NDES #9 (0.26 mg/g), majd az NDES #6 (0.17 mg/g) módszerrel kaptuk, amelyek jelentősen meghaladták a 75 százalékos etanolt. Hasonlóképpen a 3. számú NDE-k extrahálták a legalacsonyabb ellagsavat, 0.05 mg/g-nál. Ezenkívül az NDES #6, #7 és #3 lényegesen nagyobb mennyiségű ferulsavat vont ki, mint a 75 százalékos etanol. A legalacsonyabb ferulasav-extrakcióhozam 0,5 mg/g volt az NDES #5-nél. Továbbá ferulasav nem volt kimutatható az NDES #9 kivonatban. Ez valószínűleg azért volt, mert a ferulinsav oldhatósága alacsonyabb volt az NDES #9-ben, mint a többi NDE-ben. A legmagasabb miricetin-kivonatot a 75 százalékos etanol és az NDES #7 kapta 0,18 mg/g-nál, ami magasabb volt, mint az összes NDE. A legmagasabb kvercetin extrakciós hozam az NDES #6 (0.14 mg/g) és az NDES #3 (0,13 mg/g) volt, és mindkét NDES jobb volt, mint 75 százalékos etanol. Hasonlóképpen, az NDES pH-ja nem befolyásolta az extrakciós hozamot, amint azt az NDE-k pH-értéke és a 3. táblázatban felsorolt ​​fenolos savak, flavonolok és flavan{31}olok hozama közötti alacsony korreláció (R-négyzet) mutatja. 3.3 . Főkomponens-analízist (PCA) végeztünk, hogy a szőlőhéjban és a magvakban lévő különböző fenolos vegyületek extrakciós hozamát NDE-kkel és 75 százalékos etanollal társítsák (1. ábra). A PCA-t korrelációs mátrixon végezték el, hogy kimutathassák egyes NDE-k lehetséges szelektivitását specifikus fenolos vegyületek vagy csoportok extrakciójával szemben. A bőradatok szórásának körülbelül 85 százalékát az 1. és 2. főkomponens magyarázza. A terhelési diagram (1B. ábra) magas korrelációt mutat a fenolsavak (ellaginsav, galluszsav, ferulinsav) és a flavonolok (miricetin, kvercetin, és kaempferol). Ezeknek a csoportoknak a kivonásához a legjobb oldószerek az NDES #1, #8, #7 és a 75 százalékos etanol, amint az a pontdiagramon látható (1A. ábra). Eközben a katechin és az epikatekin elkülönülve jelent meg a többi fenolos csoporttól. Amint az 1A. ábrán látható, az NDES #3 szelektív volt a katechin és az epikatekin szőlőhéjból történő kivonására. Ez érdekes megfigyelés volt, mivel az NDES#3 az egyik legkevésbé hatékony NDES volt a proantocianidinek kivonására, amelyek a katechin és az epikatekin oligomerei és polimerei [14]. Ez arra utalt, hogy az NDES #3 szelektív lehet a kisebb molekulaméretű proantocianidinekre. A fenolos vegyületek klasztereződése a héj terhelési parcelláján (1B. ábra) különbözött a magvaktól (1D. ábra), függetlenül attól, hogy ezek a vegyületek a szőlőmagban alacsonyak. Az első és a második főkomponens a vetőmagadatok szórásának mintegy 73 százalékát magyarázta. A kvercetin, a miricetin és a ferulasav hatékonyabban extrahált NDES #6, #7 és 75 százalékos etanollal, amint az a pontdiagramon látható (1C. ábra). Az ellagsavat és a gallussavat az NDES #9 hatékonyabban extrahálta. A katechint ismét az NDES #3 extrahálta a legnagyobb hatékonysággal, ami hasonló volt a szőlőhéjnál megfigyelthez. Az epikatechint nagyobb hatékonysággal vonták ki az NDES #5, #4 és NDES #8 segítségével.

3.4. Fenolsavak és flavonolok extrakciós optimalizálása muskadinszőlő héjból és ANN előrejelzési modellezés A kolin-klorid: levulinsav: etilénglikol 1:1:2 (NDES #1) mutatta a legmagasabb extrakciós hozamot ellagsav esetében, ezért választották a további optimalizáláshoz és jóslat. A fenolos savak és flavonolok extrakciójára négy tényező hatását értékelték, beleértve a víztartalmat, az ultrahangos kezelési időt, a szilárdanyag/oldószer arányt és az extrakciós hőmérsékletet. Ezenkívül minden extrakciós tényezőhöz négy szintet alkalmaztak összesen 4{121}} randomizált futtatás során. Az ellagsav, galluszsav, ferulinsav, miricetin és kvercetin kísérleti extrakciós hozamát ezen öt érték összegével együtt a 4. táblázat mutatja. Összességében a legalacsonyabb és a legmagasabb extrakciós hozamkülönbség tartománya viszonylag nagy volt. fenolsavakhoz. Például az ellagsav esetében a legalacsonyabb hozam 9.{123}}3 mg/g (17. futtatás), a legmagasabb pedig 25,3 mg/g (15. futtatás), ami 16,2 mg/g különbséget eredményezett. (futás #17). Ezenkívül a legalacsonyabb hozam összege 20,7 mg/g, a legmagasabb pedig 71,5 mg/g volt. Ez szemlélteti, hogy az egyes extrakciós tényezők különböző szintjei milyen jelentős hatást gyakorolnak az extrakciós hozamra. A 15. futtatás a legnagyobb mennyiségű ellagsavat vonja ki. A 15. futtatás extrakciós körülménye 45 ml /10{{130}} ml víztartalom, 25 perc ultrahangos kezelés, 1:10 (g: ml) szilárd-oldószer arány volt. és az extrakciós hőmérséklet 60 ◦C. Az S3. ábra a szőlőhéjból NDES #1 segítségével extrahált optimalizált fenolos savak HPLC kromatogramját mutatja (4. táblázatban a 15. futtatás). A legmagasabb gallussavat (18,7 mg/g) a 24. futtatás során érték el az extrakció körülményei között, a legalacsonyabb értéket pedig 6,63 mg/g a 40. futtatás során. A ferulasav esetében a 22-es futtatás extrahálta a legnagyobb mennyiséget 19,2 mg/g-mal, míg a 14-es, 17-es, 29-es és 34-es futtatásban ferulinsav nem volt kimutatható. A 22. futtatást 60 ml/100 ml víztartalommal, 5 perces ultrahangos kezeléssel, 1:5 szilárd-oldószer-aránnyal és 60 °C-os extrakciós hőmérséklettel extraháltuk. A 2. futtatás a legmagasabb miricetint (10,1 mg/g) és kvercetint (1,87 mg/g) extrahált. A 2. futtatás extrakciós körülményei a következők voltak: 60 ml/100 ml víztartalom, 35 perces ultrahangos kezelés, 1:20 szilárd-oldószer arány és 60 ◦C extrakciós hőmérséklet. A legalacsonyabb bizonyos hozamot (3,79 mg/g) a 40-es futtatással nyertük ki. A 2. ábrán látható kontúrgrafikonok az extrakciós paraméterek (X1, X2, X3 és X4) hatását mutatják be az NDES #1 által a szőlőhéjból kivont ellagsav várható hozamára. Az ellagsav előrejelzett hozamait a 4. táblázatban használjuk fel ezeknek a számlálási paragrafusoknak az elkészítéséhez. Mindegyik panel 2 extrakciós paraméter hatását mutatja be. A kontúrvonalakat az ellagsav hozamával (mg/g) jelöljük. Az optimális becsült víztartalom körülbelül 35–45 ml/100 ml NDES volt, amint azt a 2B. és 2C. ábra mutatja. A hosszabb ultrahangos kezelési idő megnövelte az ellagsav hozamát (2D és 2E ábra), jelezve a szonikáció kritikus szerepét az NDES extrakcióban. Az extrakció során a szőlőhéjak vagy magvak NDES-szel való keverése részecskéket és gázokat eredményezett, amelyek akusztikus kavitációs helyeket adtak az ultrahangokhoz, és számos kis buborékot generáltak az NDES-ben. Ezeknek a buborékoknak a felrobbanása szélsőséges hőmérséklethez, nyomáskülönbséghez, nagy nyíróerőhöz, makroturbulenciákhoz és mikrokeveréshez vezetett, ami hatékonyan felkavarta az NDES-t, hogy felgyorsítsa a tömeg diffúzióját és átvitelét. Amikor a kavitációs buborékok felrobbantak a szőlőmag vagy a héjrészecskék felületén, a keletkező mikrosugarak és a részecskék közötti ütközések felület hámlásához, erózióhoz, részecskelebomáshoz, szonoporációhoz és sejtek széteséséhez vezettek [20]. Az ultrahang által kiváltott kavitáció ezen mechanikai hatásai fokozták az NDE-k behatolását a sejt belsejébe, így az élelmiszer-mátrixból az intercelluláris fenolok oldószerekbe kerültek. Az optimális szilárdanyag/oldószer arány 1:10 volt, amint azt a 2B., 2D. és 2F. ábra mutatja. Végül, a 60 ◦C-ig terjedő magasabb extrakciós hőmérséklet pozitív hatással van az ellagsav extrahálhatóságára, amint azt a 2C, 2E és 2F ábra mutatja. Ez közvetlen összefüggésre utal az extrakciós hőmérséklet és a szőlőhéjból kivont ellagsav hozama között. Az ellagsav extrakciós hozamokat (4. táblázat) elemeztük a predikciós modellezéshez mesterséges neurális hálózat segítségével. A kísérleti adatokat véletlenszerűen osztották fel egy képzési halmazra és egy validációs halmazra. A statisztikai szoftver által beállított érvényesítés beépítésének oka a túlillesztés elnyomása. Az ellagsavhozam (Y) előrejelzéséhez ugyanazt a négy független extrakciós faktort (X1, X2, X3 és X4), 1-2 rejtett réteget, különböző számú neuronnal és három aktiválási funkciót értékeltünk. Az alkalmazott aktiválási függvények hiperbolikus tangens, lineáris és Gauss-függvények voltak. Ezután az adatkészleteket addig képezték, amíg el nem értek egy magas R-négyzet értéket mind a betanítás, mind a validálás esetében. Az előrejelzési adatokat és a modellt létrehoztuk. A legjobb ANN struktúrát úgy választottuk ki, hogy a négy bemenetet (X1, X2, X3 és X4) egy rejtett réteggel elemeztük a Gauss-függvény segítségével tíz neuronnal (S5 ábra). A képzési és validációs halmazok R-négyzete 0,99, míg a modell RASE és AAE értéke 0,062 és 0,044 volt. Az ellagsav ANN-validációjának R-négyzete ebben a vizsgálatban (0,99) magasabb volt, mint a procianidinek (0,95) és az antocianinok (0,91) ANN-validációja egy korábbi tanulmányban [14]. Az R2 növekedése azonban a tanulmányban szereplő adatok jobban generált modellillesztésének tudható be, ami a kisebb kísérleti hibáknak köszönhető. A prediktív ANN-modelleket az ellagsav extrakciójához NDES #1 segítségével a 3–13. egyenletként mutattuk be:

Cistanche az immunitás javítására

Következtetés

A jelenlegi eredmények további bizonyítékokat szolgáltattak az NDES-képességek hatékonyságára vonatkozóan az élelmiszeripari melléktermékekből polifenolok kinyerésére. Az eredmények alátámasztották azt a hipotézist, hogy az NDES ultrahanggal segített extrakciója jobb, mint 75 százalékos etanolban. Az NDES hatékonyan extrahált három fenolosavat, két flavonolt és három flavan{3}olt a szőlő héjából és magjából. Az NDES #1 volt a leghatékonyabb NDES az ellagsav extrahálására, míg az NDES #3 különösen szelektív volt a katechin és az epikatekin extrakciójában. Az NDES észrevehető hátránya a magas viszkozitásuk, ami kihívásokat jelent a kezelés és a helyreállítás során. Jelen tanulmányban a mesterséges neurális hálózatok, függetlenül az eredmény korlátaitól, a prediktív modellezés gyakorlati megközelítését mutatták be. Az NDE-k robusztus közegek a fitokemikáliák élelmiszerrendszerekből való kinyerésére. Egyes NDE-k kevésbé toxikus oldószert is tartalmaznak ezen fitokemikáliák élő sejtekben történő tanulmányozására [21,22]. Végre a természetes mélyeutektikus oldószerek hatékony alternatív extrakciós közegek a szerves oldószerekkel szemben.

Hivatkozások

[1] W. Bi, M. Tian, ​​KH Row, Az alkohol alapú mélyeutektikus oldószer értékelése az extrakcióban és aflavonoidokválaszfelületi módszertani optimalizálással, J. Chromatogr. A 1285 (2013) 22–30, https://doi.org/10.1016/j. chroma.2013.02.041.
[2] M. Cvjetko Bubalo, N. ´ Curko, M. Tomaˇsevi´c, K. Kovaˇcevi´c Ghani's, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, Green extraction of grape skin fenols by using deep eutektic solvents, Food Chem. 200 (2016) 159–166, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2016.01.040.
[3] M. Panic, V. Gunjevi´c, G. Cravotto, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, A szőlőtörkölyből származó antocianinok extrakciójának lehetővé tétele természetes mélyeutektikus oldószerek felhasználásával, legfeljebb fél literes tételekben szőlőtörköly antocianinok extrakciója NADES alkalmazásával, Food Chem. 300 (2019) 125185, https://doi.org/ 10.1016/j.foodchem.2019.125185.
[4] M. Hoffmann és munkatársai, Muscadine Grape Production Guide for the Southeast, North Carolina State University, NC State Extension Publications, 2020 https://content. ces.ncsu.edu/muscadine-grape-production-guide (Hozzáférés: 2021. január 18.). [5] Cline, B. and C. Fisk, Overview of muscadine grape acreage, cultivars and production areas in the Southkelet US. Muscadine Szőlőműhely szövetkezeti kiterjesztő ügynökök számára, a Délvidéki Kisgyümölcs Konzorciumban. 2006: Délvidéki Kisgyümölcs Konzorcium.
[6] PC Andersen A. Sarkhosh D. Huff J. Breman 2020 6 10.32473/edis-hs100-2020.
[7] P. Greenspan és munkatársai, A muscadine szőlő (Vitis rotundifolia) gyulladásgátló tulajdonságai, J. Agric. Étel. Chem. 53 (22) (2005) 8481–8484, https://doi.org/ 10.1021/jf058015.
[8] DN Ignacio, KD Mason, EC Hackett-Morton, C. Albanese, L. Ringer, WD Wagner, PC Wang, MA Carducci, SK Kachhap, CJ Paller, J. Mendonca, L. Li Ying Chan, Bo Lin, DK Hartle, JE Green, CA Brown, TS Hudson, Muscadine szőlőhéj kivonat gátolja a prosztatarák sejtjeit azáltal, hogy a sejtciklus leállítását és a 40-es hősokk-fehérje révén csökkenti a migrációt, Heliyon 5 (1) (2019) e01128, https://doi .org/10.1016/j.heliyon.2019.e01128.