A húgyúti exoszómák azonosítják a gyulladásos útvonalakat vankomicinnel összefüggő akut vesekárosodásban

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Linda Awdishu 1,*, Amy Le 1, Jordan Amato 1, Vidhyut Jani 1, Soma Bal 2, Robert H. Mills 1, Marvic Carrillo-Terrazas 1, David J. Gonzalez 1, Ashita Tolwani 3, Anjali Acharya 4, Jorge Cerda 5, Melanie S. Joy 6,7, Paola Nicoletti 8, Etienne Macedo 2, Sucheta Vaingankar 2, Ravindra Mehta 2, Satish P. Ramachandra Rao 9 és a közvetlen nyomozók nevében †

1 Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California, San Diego, CA 92093, USA;a6le@ucsd.edu (AL); jegilmor@ucsd.edu (JA); vgjani@ucsd.edu (VJ); rhmills@health.ucsd.edu (RHM);mac215@health.ucsd.edu (MC-T.); djgonzalez@ucsd.edu (DJG)

2 School of Medicine, University of California, San Diego, CA 92093, USA; sobal@ucsd.edu (SB);emacedo@ucsd.edu (EM); svaingankar@health.ucsd.edu (SV); rmehta@ucsd.edu (RM)

3 School of Medicine, University of Alabama, Birmingham, AL 35233, USA; atolwani@uab.edu

4 Albert Einstein College of Medicine, The Bronx, NY 10461, USA; anjali2526@gmail.com

5 Albany Medical College, Albany, NY 12208, USA; jorge.cerda82@gmail.com

6 Vesebetegségek és magas vérnyomás osztálya, Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical, Aurora, CO 80045, USA; MELANIE.JOY@cuanschutz.edu

7 School of Medicine, University of Colorado, Aurora, CO 80045, USA

8 Mount Sinai School of Medicine, New York, NY 10029, USA; paola.nicoletti@mssm.edu

9 Sejt- és Molekuláris Medicina Tanszék, University of Michigan Medical System, Ann Arbor, MI 48109, USA; satishpr@med.umich.edu

* Levelezés: lawdishu@ucsd.edu; Tel.: plusz 858-534-3919

† A Közvetlen Nyomozók tagságát a Köszönetnyilvánítás tartalmazza.

Absztrakt:

Háttér:A vankomicint általában első vonalbeli terápiaként alkalmazzák a gram-pozitív mikroorganizmusok, például a meticillin-rezisztens Staphylococcus aureus kezelésére. Vankomicin által kiváltott akutvesesérülés(V-AKI) a betegek akár 43 százalékánál jelentették, különösen azoknál, akiknél magasabb a célzott minimális koncentráció. Az emberi sérülés pontos mechanizmusa továbbra is megfoghatatlan, a közelmúltban a proximális tubulussejtek apoptózisára irányultak bizonyítékok. Ebben a tanulmányban a vizelet exoszómák fehérjetartalmát vizsgáltuk V-AKI-ban szenvedő betegeknél, hogy tovább tisztázzuk a sérülési mechanizmusok és a lehetséges válaszok biomarkereit. Módszerek: A DIRECT vizsgálatba bevont V-AKI-s betegek vizeletmintáit, akik megfeleltek az UAB-UCSD O'Brien CenterBiorepository egészséges kontrolljainak, bevonták az elemzésbe. Az exoszómákat oldószerkizárás elve és polietilénglikollal kiváltott kicsapás alkalmazásával extraháltuk. A fehérjék azonosítását és mennyiségi meghatározását jelölésmentes folyadékkromatográfiás tömegspektrometriával (LC/MS) végeztük. A szérum kreatininszint átlagos csúcsértéke 3,7 ± 1,4 mg/dl volt, és avesesérülés4.0 ± 3.0 nap volt. Az elbocsátáskor a betegek 90 százaléka részlegesen felépült; 33 százalékuk tapasztalta a teljes gyógyulást a 28. napon. Öt V-AKI és 7 kontrollmintán végzett proteomikai elemzések 2009 fehérjét mutattak ki az összes mintában, és 251 fehérjét, amelyek szignifikánsan kapcsolódnak a V-AKI-hoz (Pi-score > 1). A legfontosabb megkülönböztető fehérjék a komplementC3, a komplement C4, a galektin-3-kötő fehérje, a fibrinogén, az alfa-2makroglobulin, az immunglobulin nehéz konstans mu és a szerotranszferrin voltak.

Következtetés:A vizelet exoszómái a gyulladásos fehérjék fokozott szabályozását mutatják nefrotoxikus sérülés után V-AKI-ban. További vizsgálatok szükségesek egy nagy betegminta számára, hogy megerősítsék ezeket az eredményeket a patofiziológiai mechanizmusok tisztázása és a lehetséges sérülési biomarkerek validálása érdekében.

Kulcsszavak:vankomicin; AKI; nefrotoxicitás; exoszómák; gyulladás; kiegészítés; immunpályák

Cistanche herbakezelheti a vesekárosodást

Chengdu Wecistanche rendelkezikcistanchevesekárosodás kezelésére szolgáló termékek

1. Bemutatkozás

A vankomicin egy glikopeptid antibiotikum, amelyet kritikus állapotú betegek meticillinrezisztens Staphylococcus aureus fertőzéseinek kezelésére használnak. A nefrotoxicitás súlyos nemkívánatos esemény, amely a kezelt betegek 10–20 százalékát érinti, és a kórházi tartózkodás időtartamának megnövekedésével, a 30-nappali kórházi visszafogadási arányokkal és a minden okból kifolyólagos 30-napos halálozással [1] társul. Vankomicinnel összefüggő akutvesesérülés(V-AKI) dózisfüggő, és 4-17 napon belül kezdődik a terápia. Bár a V-AKI-t régóta a vankomicin egyik fő mellékhatásaként ismerték fel, a nefrotoxicitás mechanizmusai továbbra is kevéssé ismertek. A vankomicin által kiváltott sejtes és molekuláris válaszok megértése kulcsfontosságú a mechanizmusok megértéséhez és olyan stratégiák kidolgozásához, amelyek minimalizálják a V AKI kockázatát és a kapcsolódó költségeket, miközben maximalizálják hatékonyságát a fertőzések kezelésében. A toxikus veseválaszt úgy tűnik, hogy a vankomicin közvetlen hatása okozza a proximális tubulusok epitéliumára [2]. A mai napig standard toxikogenomikai megközelítéseket alkalmaztak a V-AKI egérmodelleken történő tanulmányozására, de humán vizsgálatok hiányoznak [3–5]. Állatmodellek bizonyítják, hogy a vankomicin adása oxidatív stresszt vált ki, ami hozzájárulhat a vesekárosodáshoz [6,7]. A sérülés egyik lehetséges mechanizmusa a gyógyszer beszorulása a proximális tubuláris sejtekben, mivel a szerves kation transzporterek (OCT) szállítják a bazolaterális membránon keresztül a tubulus proximális sejtjébe, de aktív efflux transzport mechanizmust nem azonosítottak [6] –8].

Az exoszómák membrán eredetű mikrocita vezikulák, amelyek kulcsszerepet játszanak az intercelluláris kommunikációban és a fehérje/nukleinsav szállításában, és lehetőséget adnak új biomarkerek felfedezésére, amelyek elősegítik a betegség klinikai diagnózisát.vesesérülés[9]. Feltételezték, hogy az exoszómák nagyobb specificitásúak és érzékenyebbek a biomarkerek felfedezésére, ami a minták stabilitásának tulajdonítható, mint a hagyományos szérum- és vizeletmintákat használó transzkriptomikai és proteomikai megközelítéseknél [9]. Ebben a tanulmányban azt a hipotézist teszteltük, hogy a vizelet exoszóma fehérjéiben a V-AKI hatására bekövetkező változás segít feltárni a sérülés mechanizmusait, és új biomarkereket azonosítani a igazoltan gyógyszer-indukált vesekárosodásban szenvedő betegek körében. Ehhez a Drug-Induced Renal Injury Consortium (DIRECT) vizsgálat alanyait alkalmaztuk, amely a gyógyszer okozta akut esetek klinikailag elbírált eseteinek nemzetközi, többközpontú csoportja.vesesérülésés populáció alapú kontrollok a farmakogenomikai előrejelzők vizsgálatára genomszintű asszociáció segítségével. A DIRECT vizsgálat részleteit a Módszerek részben és a laboratóriumunkban megjelent friss publikációban ismertetjük [10].

2. Eredmények

Az elemzésekbe 22 alany, 10 V-AKI eset és 12 kontroll vizeletmintája került be. A betegek demográfiai adatai hasonlóak voltak a V-AKI esetek és a kontrollok között, és az 1. táblázatban foglaltuk össze. Ahogy az várható volt, a magas vérnyomás, a cukorbetegség és a szívelégtelenség prevalenciája magasabb volt a V-AKI esetekben a kontrollokhoz képest (1. táblázat).

Minden V-AKI-esetben az AKI 2. vagy magasabb stádiuma alakult ki, a vesebetegségeket javító globális eredményeket (KDIGO) meghatározott kritériumok szerint (1. ábra) [11]. A V-AKI kialakulása 4.0 ± 3.0 nappal a vancomycin kezelés megkezdése után következett be. A szérum kreatinin (Scr) változásának időbeli lefutását a kórházi felvételt követően a kórházi elbocsátást követően és azt követően az 1. ábra mutatja.

1. ábra: A szérum kreatininszintjének változásai a V-AKI tanfolyam során. Ez az ábra a szérum kreatininszint változásait mutatja 10 esetben a vankomicinnel összefüggő akut betegség során.vesesérülésa kórházi felvételtől a sérülés utáni 90. napig. Az időpontok megfelelnek a Drug-Induced Renal InjuryConsortium (DIRECT) vizsgálati időpontoknak. Rövidítések: SCr=szérum kreatinin, Kórházi=Kórházi felvétel, Predrug=a gyógyszerexpozíció előtt, DIRI=gyógyszer okozta vesekárosodás meghatározása teljesült, DrugDC {{8} } gyógyszer abbahagyása vagy dóziscsökkentés, Nadir Scr=legalacsonyabb szérum V-AKI után, Hospital Disch{11}} kórházi elbocsátás

A V-AKI esetek kiindulási kockázati tényezői a szepszis (30 százalék), a szívbetegség (30 százalék), a diabetes mellitus (30 százalék), a vérszegénység (20 százalék), a radiokontraszt expozíció (10 százalék), a májbetegség (10 százalék) és a hipoalbuminémia (10 százalék) (2. ábra).

A V-AKI esetek legfeljebb három gyógyszeres vancomycin adagolási epizódot kaptak. A vankomicin napi adagja 1000 és 4000 mg között volt. Az egyes adagolási epizódokban eltöltött napok átlagos (interkvartilis tartomány (IQR)) számát a 3. ábra mutatja. Az 1–3. adagolási epizódokhoz kapcsolódó átlagos (standard deviáció (SD)) vankomicin minimális plazmakoncentrációja 20,6 ± 8,1-re emelkedett. 29,6 ± 16,3, 38,0 ± 13 mg/l. Az egyes epizódok közötti koncentrációkülönbség azonban nem volt statisztikailag szignifikáns (1. epizód vs. 2 p=0.5, 2. epizód vs. 3. p=0.41)

Az egyéb eredményekre vonatkozó adatokat a 2. táblázat foglalja össze. Tekintettel a sérülés súlyosságára, a betegek 20 százaléka szorult vesepótló kezelésre. A kórházi halálozás 10 százalék volt. Kórházi elbocsátáskor a betegek 90 százaléka nem gyógyult meg a V-AKI-ból. Hat betegnél a sérülés utáni 28. napon, négynél a 90. napon mértek Scr-t. A 28. napon hat beteg közül kettőnél (33 százalék) volt AKD, de a fennmaradó négy beteg közül egynél sem volt AKD a 90. napon.Vesebiopsziát a V-AKI esetek 20 százalékában végeztek (2. táblázat).

Összesen 2009 fehérjét tartalmazott az a 12 minta, amely a peptidek rokon spektrummal való párosítására szolgáló szűrő felhelyezése után került elemzésre. Ezeket a fehérjéket tovább elemeztük. Először egy fő koordináta-analízist (PCoA) végeztünk az egyes minták teljes proteomjának összehasonlítására. Ez az elemzés szignifikáns elkülönülést (PERMANOVA p-érték=0,037) tárt fel az AKI és a kontrollminták között (4. ábra), ami összefoglalja a szisztémás szintű fenotípust exoszóma fehérje szintjén is, így növelve bizalmunkat ezekben az adatsorokban. . Az egyes fehérjék és a V-AKI státusz közötti kapcsolat erősségét a pi-érték metrika segítségével rangsoroltuk, amely a p-érték szignifikancia és a fold-változás kombinációját [12].

4. ábra: A proteóma összetétele megkülönbözteti a V-AKI betegek és kontrollok vizeletexoszómáit. (A) A mintaproteomok fő koordinátáinak elemzése. A Bray-Curtis távolság metrikáját használtuk a minta proteomja közötti különbségek kiszámításához, és egy fő koordináta diagramot mutatunk be. Az 1. és 3. tengely mentén elkülönülés figyelhető meg az AKI-minták (piros) és a kontrollminták (kék) között. (B) Boxplot, amely összefoglalja a Bray-Curtis távolságot a kontroll és az AKI minták között. Az (A)-ban bemutatott AKI és a kontrollminták közötti statisztikai elválasztást permutációs variancia-teszttel (PERMANOVA) teszteltük. Boxplotok láthatók, amelyek összefoglalják az eredményeket a kontroll- vagy AKI-minták és a kontrollminták távolságának összehasonlításakor.

Ezután a V-AKI és a kontrollminták közötti bináris összehasonlítás 42 fehérjét eredményezett, amelyek szignifikánsan kapcsolódnak az AKI fenotípushoz, és 26 fehérjét, amelyek a kontroll fenotípushoz kapcsolódnak (Pi pontszám > 1) (S1 kiegészítő táblázat). Az 5A. ábrán látható egy vulkán diagram, amely szemlélteti az egyes fehérjékhez kapcsolódó szignifikanciát és hajtásváltozást. A V-AKI esetek legfőbb megkülönböztető fehérjéi a fibrinogén, a C3 komplement, a C4 komplement, a galektin{10}}kötő fehérje, az alfa{11}} makroglobulin, az immunglobulin nehéz konstans mu és a szerotranszferrin voltak (5B. ábra). Génkészlet-dúsítási elemzést végeztek a jelentős fehérjék között, hogy azonosítsák a V-AKI betegekben megváltozott fehérjék kategóriáit, és az eredményeket az S1 kiegészítő táblázat foglalja össze. Számos, az AKI-fenotípushoz kapcsolódó fehérjéről kimutatták, hogy a gyulladáshoz kötődő és/vagy gyulladásos fenotípus közvetítő funkciói vannak. Annak tesztelésére, hogy ezek a fehérjeváltozások összefüggésben lehetnek-e a mögöttes citokin jelátvitelben bekövetkezett változásokkal, citokin következtetést végeztünk, amely erős kapcsolatot mutatott az AKI-asszociált fehérjék és az IL10, IL6 és TNF citokinek között. Ezek a citokinek 2,8, 2,3 és 2{24}}szer több kapcsolatot tartalmaztak AKI-asszociált fehérjékkel, mint a kontrollhoz kapcsolódó fehérjékkel, amint azt az 5C. ábra foglalja össze. Az AKI-asszociált fehérjék és a kikövetkeztetett citokinek fehérje-fehérje kölcsönhatási hálózatai túlnyomórészt proinflammatorikus kapcsolatokat mutattak az AKI-asszociált fehérjék között, amint azt az 5D. ábra foglalja össze.

5. ábra: Fehérjeszintű asszociációk a V-AKI-hoz. (A) Vulkán diagram, amely bemutatja az egyes fehérjék fold-változását és t-teszt jelentőségét a V-AKI állapot szempontjából. Az AKI-hoz és a kontrollállapothoz kapcsolódó 10 legfontosabb fehérje kék, illetve piros színnel jelenik meg. Az 1-nél nagyobb Pi-pontszámon alapuló egyéb kapcsolódó fehérjék sárga színnel jelennek meg. (B) Minden egyes fehérjére kiszámítottunk egy Pi-pontszámot, amely mind a fold-változást, mind a t-teszt szignifikanciáját tükrözi, és a legerősebb asszociációjú fehérjéket ábrázoltuk. (C) AKI-vel vagy kontrollfehérjékkel kapcsolatos topcitokinek. Hálózati alapú citokinkövetkeztetési megközelítést alkalmaztunk, és bemutatjuk azokat a citokineket, amelyek a legerősebb dúsítási pontszámot mutatják akár az AKI, akár a kontrollhoz kapcsolódó fehérjék tekintetében. A piros oszlopok az AKI-asszociált fehérjékhez kapcsolódó citokineket, a kék sávok a kontrollhoz kapcsolódó fehérjékhez kapcsolódó citokineket jelölik. (D) AKI-asszociált fehérjék és AKI-val gazdagított kikövetkeztetett citokinek fehérje-fehérje interakciós hálózata. A fehérjecsomók külső széle a gyulladást elősegítő vagy gyulladásgátló citokinekkel való asszociációtól függően színeződik. Az egyes csomópontok mérete az egyes fehérjék és az AKI állapot közötti statisztikai asszociáció erősségét jelenti.

Cistanche tubulosakezelheti a vesekárosodást

3. Megbeszélés

Beszámolunk egy új megközelítésről a vizelet exoszómák felhasználására a kábítószer-indukált patofiziológiai mechanizmusok tájékoztatására.vesesérülésprototipikus vesetoxikusként vankomicint használnak. Ennek a tanulmánynak az egyik erőssége a DIRECT tanulmány [10] jól jellemzett, betegszintű adatainak beépítése, amelyeket a mechanizmusok, köztük a gyógyszerek által kiváltott genomika felderítésére fejlesztettek ki.vesesérülés. A 2. vagy magasabb stádiumú AKI-vel rendelkező alanyok a kiinduláskor a hagyományos kockázati tényezőknek voltak kitéve. Minden vizsgálati alany szignifikánsan megemelkedett a vankomicin plazma legalacsonyabb koncentrációja annak ellenére, hogy az általánosan elfogadott, napi 4 g-os nefrotoxicitási küszöbértéknél kisebb napi adagot kaptak [13]. Sok alany nem gyógyult fel teljesen a V-AKI-ból a kórházi elbocsátáskor, és a sérülést követő hónapban akut vesebetegségben szenvedett. A várakozásoknak megfelelően kevés beteg kapott vesebiopsziát.

A húgyúti exoszóma/extracelluláris vezikula (EV) proteomika kimutatta, hogy a V-AKI esetek megcélzott megkülönböztető fehérjéi közé tartozik a C3 komplement, C4 komplement, galektin-3-kötő fehérje, fibrinogén, alfa-2 makroglobulin, immunglobulin nehéz konstans mu és szerotranszferrin. Ezek az exoszóma leletek a V-AKI szubcelluláris/szupramolekuláris szintű sérülési mechanizmusairól tájékoztatnak, és potenciálisan biomarkerekként szolgálhatnak a gyógyszer által kiváltott betegségfolyamat kontinuuma mentén.

A vérben és a vizeletben jelenlévő exoszómák fontos szerepet játszanak a sejtközi kommunikációban, a koagulációban és a hulladékkezelésben [14]. Méreggel kapcsolatos akut utánvesesérülés, a tubuláris epiteliális sejtekből felszabaduló exoszómák sérülési jeleket közvetíthetnek a makrofágok beszűrődése érdekében, és elősegíthetik a tubulointersticiális gyulladást [15]. Indoklásunk szerint az exoszómák fehérjetartalma különbözik a V-AKI esetek és az egészséges kontrollok között. Kétszázötvenegy fehérje diszregulált a V-AKI-ban, és úgy tűnt, hogy ezek túlnyomórészt részt vesznek a gyulladásos és véralvadási útvonalakban. E 251 fehérje közül elemzésünk kimutatta, hogy a C3 komplement, a C4 komplement, a galektin-3- kötő fehérje, a fibrinogén, az alfa-2 makroglobulin, az immunglobulin nehéz konstans mu és a szerotranszferrin szignifikánsan összefügg a V-AKI esetekkel.

Eredményeink alapján, amelyek szerint a C3 és a C4 a legjobban megkülönböztető V-AKI exoszómafehérjék közé tartozott, azt javasoljuk, hogy a komplementrendszer aktiválódása szerepet játszik a vankomicin által kiváltott vese tubuláris sérülésében. Ez jó összhangban van azzal a publikált irodalommal is, hogy a komplementrendszer aktivációja szerepet játszik az immunkomplex glomerulonephritisben és számos vesebetegségben [16]. Az ischaemia vagy nephrotoxin expozíció következtében kialakuló AKI-ben a komplementaktiváció által közvetített vesekárosodás összefüggésbe hozható olyan szisztémás gyulladásos eseményekkel, amelyek távoli szervsérülést és betegek halálozását váltják ki, és hozzájárulnak ahhoz [17]. Az ischaemia-reperfúziós (IR) sérülések modelljeiben a hipoxia, az ATP kimerülése és a mitokondriális károsodás szabad oxigéngyökök képződését eredményezi a reperfúzió során [18]. A citokinek, kemokinek és a komplement aktiváció felerősítik a gyulladást, ami akut tubuláris sérüléshez vezet. Ezenkívül a C3a és C5a receptor hiányos egerek védettek az infravörös károsodástól [19,20]. Kimutatták, hogy az IR-sérülés felszabályozza a komplement komponensek helyi termelésétveseendoteliális és tubuláris sejtek [16,21]. Számos állatmodelleken és humán alanyokon végzett tanulmány kimutatta a komplement fehérjetermékek, például a C3 és C4 fokozott lerakódását a tubuláris alapmembrán mentén trauma vagy sérülés után.vese. A megnövekedett lerakódási szintek nem mutatkoztak szignifikánsan a peritubularis vagy glomerulus régióban, hanem erősen koncentrálódnak a tubuláris membránban, amint az emberi és állati modellvesék biopsziáiban is látható [17]. Az exoszómák és az EV-k szállíthatják a keringési komplement komponenseket, ha a komplement aktiválása nem szabályozott [22,23]. Számos sejtkísérlet és klinikai megfigyelés igazolta, hogy a felszabaduló EV-k hordozzák és modulálják a komplement fehérjéket, és ezzel egyidejűleg gyulladásos állapotban történő termelésük is képes befolyásolni a keringési vezikulák számát [23]. A két folyamat kölcsönös függősége arra a következtetésre vezet, hogy az EV-k biomarker források, célpontok és terápiás hatóanyag-leadási ágensek lehetnek olyan komplement és immunmoduláló vegyületek felé, amelyek nagyon fontosak az AKI gyulladásos mechanizmusai szempontjából. Megállapításunk, miszerint a V-AKI minták az egészséges kontrollokhoz képest, azt mutatják, hogy a vankomicin közvetlen toxicitására adott immunválaszok szerepet játszanak a vesetubuláris sejtekben. A fenti fehérjetartalom mellett a vizeletből származó exoszómák/EV-k potenciális non-invazív biomarkerek is a vesebiopszia alternatívái, amelyek kimutatják és tájékoztatják a komplementrendszer szerepét a kábítószer-indukált folyamatokban.vesesérülés.

Bár számos korábbi tanulmány (a konkrét hivatkozásokat lásd a következő néhány mondatban) a galektin-3 (Gal-3) szerepére összpontosítottvesesérülés, kevés adat áll rendelkezésre a galektin-3-kötő fehérjéről (Gal-3-bp). A Gal-3 a vese gyűjtőtubulusaiban expresszálódik, és elősegíti a nefrogenezist, modulálja a sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatásokat, és szabályozza a gyulladást [24–26]. Henderson és mtsai. áttekintette a Gal-3 szerepét a gyulladásban, és megállapította, hogy a Gal-3 kulcsfontosságú összetevője a krónikus gyulladásnak, és ha a szövetsérülés visszatérővé válik. Megkönnyíti a szövetsérülés „elfalazását”, késlelteti a sérülés terjedését [27]. Ezenkívül Nishiyama et al. ischaemiás AKI-ban szenvedő patkányokon kimutatták, hogy a Gal{10}} mRNS felszabályozott, és a következő reperfúziót követően az immunhisztokémia a Gal-3 növekedését mutatta ki a nefronszegmensekben [25]. Tsuchiyama et al. azt találták, hogy a Gal-3 beadása nephrotoxikus szérum nephritisben szenvedő patkányoknak csökkentette a vizelet fehérjekiválasztását, a félhold képződését és a makrofágok glomerulusokba való beszivárgását [28]. Ez arra utal, hogy ischaemiás vagy immunmediált sérülés után a Gal{16}} szerepet játszik a regenerációban. A Gal-3 rokon partnereként a Gal-3-bp alapvető szerepe, valamint a vankomicin és más szerek okozta nefrotoxikus károsodásban fellépő felszabályozás oka a jövőbeni vizsgálatok során elengedhetetlen.

Vizsgálatunk azt is megállapította, hogy a fibrinogén mindhárom alegysége szabályozatlan, jó összhangban a korábban publikált adatokkal. A fibrinogén egy oldható dimer plazmamolekula, és minden dimer három polipeptidből áll: alfa, béta és gamma [29]. Kulcsszerepet játszik a vérzéscsillapításban és a véralvadásban, de fontosnak bizonyult a gyulladásos állapotok szabályozásában is [30–32]. Ajay et al. kimutatták, hogy a fibrinogén elérhetősége fontos a veseműködés, a gyulladás és a túlélés szempontjából [33]. Ezenkívül a fibrinogén adhezív hatást fejthet ki a vese hámsejtjein, ami előnyös lehet a tubuláris elzáródás megelőzésében [34]. A fibrinogén szignifikánsan megnövekedett és szabályozottabb az AKI-ban, és korábban potenciális biomarkerként értékelték az AKI korai kimutatására [29]. Hoffman és munkatársai tanulmányozták a fibrinogén változását ischaemia/reperfúzió és ciszplatin beadása után patkányokban, és az mRNS 30 perccel a bilaterális IR-sérülés után emelkedett, és 48-72 óra elteltével érte el a csúcsot, míg a ciszplatin adása során a fibrinogén mRNS expressziója csökkent. 24 órán belül észlelték [29]. A vizelet fibrinogénjét már 3 órával az ischaemiás reperfúziós sérülés után és 24 órával a ciszplatin beadása után kimutatták, ami avesesérülésmolekula 1 (KIM-1) [29].

A Cistanche előnyei: kezelhetivese sérülés

Történelmileg a V-AKI két különböző patofiziológiai mechanizmusát általánosan elfogadták, a közvetlen toxikus hatásokból eredő akut tubuláris nekrózist és az akut intersticiális nephritist. A vese proximális tubuláris epitéliumában a citoszkeletális integritás elvesztése, nekrózis és apoptózis következik be akut tubuláris nekrózis esetén [35]. A nekrotikus sejtek olyan molekulákat szabadítanak fel, amelyek felerősítik a veleszületett immunrendszert, gyulladást indukálva és felgyorsítva a tubuláris sérülést [35]. A jelenlegi vizsgálatban gyulladásos markereket mutattunk ki V-AKI-ban szenvedő betegek vizeletében. Ezenkívül proinflammatorikus kapcsolatot találtunk az IL10, IL6 és TNF citokinek és a legfontosabb AKI-t megkülönböztető fehérjék között. Összességében ezek az adatok azt sugallják, hogy a V-AKI patofiziológiája a tubuláris toxicitás egyike, és a gyulladás fokozódik a sérülés utáni 24-72 órában.

Tanulmányunknak számos korlátja van. A 22, túlnyomórészt kaukázusi származású betegből álló kis minta korlátozza megállapításaink általánosíthatóságát más nemekre, rasszokra és etnikumokra. Vizsgálatunk másik korlátja az volt, hogy minden egyes páciens vizelet-exoszóma mintája eltérő mennyiségű összfehérjét tartalmazott, ami megnehezítette a specifikus fehérjék mérését, különösen a kisebb abszolút mennyiségűek esetében. Jóllehet ez önmagában nem feltétlenül korlátozza ezt a vizsgálatot, mivel minden egyén azon képessége, hogy fehérjéket pakoljon a vizelet exoszómáira, természetesen változó, a fehérjék alacsonyabb mennyisége egyes egyénekben korlátozza további elemzések és általánosítható következtetések levonásának lehetőségét. nagyobb populációk. A harmadik korlátozás az egyetlen időpontban alkalmazott minta, amely korlátozza az AKI kontinuum különböző fázisaiban fellépő sejtváltozások megértését, pl. azonnali sérülési fázis, javítási fázis stb. A szekvenciális mintavétel segít jobban megérteni az exoszómatartalom időbeli lefolyását. változások, a gyógyszerek felhalmozódása által kiváltott oxidatív stressz és az immunpályák felszabályozása a helyreállítás során. A jelenlegi vizsgálatban az Scr-küszöbök által meghatározott betegek vettek részt. A szérum kreatinin tökéletlen vesefunkciós biomarker, mivel az Scr emelkedése gyakran elmarad a sérülés mögött [36]. Ez korlátozza az Scr érzékenységét és specifitását a korai felismerés érdekébenvesesérülés[36], és olyan tanulmányok jelentek meg, amelyek azonosítjákvesesérülésbiomarkerek, mint plvese sérülésmolekula 1 (KIM1) és neutrofil zselatinázzal asszociált lipocalin (NGAL) a nephrotoxicitás korai kimutatására [37,38]. Amint arról korábban beszámoltunk, a biomarkerek képesek kimutatni mind a nyilvánvaló, mind a szubklinikai szintű gyógyszer-indukáltakatvesesérülés[39,40].

4. Anyagok és módszerek

4.1. Beteg kiválasztása

Az elemzésbe 10 V-AKI-s beteg vizeletmintáját vonták be, akiket a DIRECT vizsgálatba vontak be [10], és 12 egészséges kontroll vizeletmintát az UAB-UCSD O'Brien Center Biorepository-ból. A kontroll alanyokat nemük, rasszuk és életkoruk egy évtizede alapján a vizsgálati alanyokhoz illesztettük, és nem kaptak vankomicint vagy ismertek.vesesérülés. A DIRECT tanulmány egy nemzetközi tanulmány, amely a gyógyszer-indukáltak farmakogenetikai előrejelzőit vizsgáljavesesérülésesetek és populáció alapú kontrollok genomszintű asszociációs vizsgálatával [10]. A DIRECT vizsgálatot az intézményi kutatóbizottság hagyta jóvá (IRB #121651), és a beiratkozás előtt minden résztvevőtől írásos beleegyezést kaptak, amely magában foglalta a tárolt minták felhasználását a jövőbeni elemzésekhez. Az AKI-t a DIRECT-ben a vesefunkció hirtelen csökkenéseként határozták meg, amelyet a következő kritériumok bármelyike ​​igazolt: (1) a szérum kreatininszint (Scr) abszolút emelkedése (0,3 mg/dL vagy egyenlő vagy nagyobb, mint 26,4 µmol/ L) (48- órás időablakon belül) a referencia Scr-értéktől, (2) az Scr százalékos növekedése legalább 50 százalékkal (a referenciaérték 1,5-szerese) hét napon belül, (3) a vizelet mennyiségének csökkenése kimenet (dokumentált oliguriája<0.5 ml/kg/h="" for="">6 óra) a megfelelő folyadék újraélesztés ellenére (4) az Scr abszolút csökkenése legalább 0,3 mg/dL vagy nagyobb vagy egyenlő, mint 26,4 µmol/L (48- belül). h időablak) a referencia Scr-től, és (5) az Scr relatív csökkenése 50 százalék vagy annál nagyobb (a referencia 1,5-szerese) hét napon belül. A vankomicin-expozíciót követően 2. stádiumú AKI-ban szenvedő betegeket vontak be a vizsgálatba. A klinikai adatokat, beleértve a demográfiai adatokat, a kórelőzményt, a fizikális vizsgálati eredményeket, az életjeleket, a vér- és vizeletkémiai adatokat, a biopsziás eredményeket és a gyógyszeradagolási adatokat, a következő időpontokban gyűjtöttük: (1) kórházi felvétel, (2) vancomycin-kezelés megkezdése, ( 3) a sérülés csúcspontja, (4) a gyógyszer abbahagyása vagy a dózis csökkentése, (5) a sérülés megszüntetése, (6) a kórházi elbocsátás, (7) 28 nap és (8) 90 nap a sérülés után. A vankomicin adagolási epizódot a dózis vagy a gyakoriság változásaként határozták meg. Az akut vesebetegség (AKD) definíciója szerint az 1. stádiumú vagy annál nagyobb AKI perzisztenciája az expozíciót követő 7 napig vagy annál nagyobb [41]. Az AKD-ben szenvedő betegeket a kórházi elbocsátáskor kategorizálták, ha az AKI 1. vagy annál magasabb stádiuma továbbra is fennállt, és a kórházi elbocsátásig eltelt idő hét napnál hosszabb volt. Minden résztvevőtől vizelet- és teljes vérmintát vettek. Minden V-AKI esetet két független nefrológus (EM, JC, RL) ítélt meg az ok-okozati összefüggés megállapítása érdekében. A módszerek teljes leírását korábban publikálták [10].

4.2. Exoszóma-előkészítés és proteomikai adatgyűjtés

Vizelet- és vérmintákat vettünk a DIRECT vizsgálatban résztvevőktől, és a mintákat –80 ◦C-on lefagyasztottuk az exoszóma előkészítése előtt. Az ebben az analízisben használt vizeletmintákat a vesekárosodáshoz legközelebb eső időszakból választottuk ki, amely 24 és 72 óra között van.vesesérülés. Az exoszómákat fagyasztott AKI vizeletmintákból extraháltuk egy, az oldószerkizárás elvén alapuló házon belüli protokoll segítségével, polietilénglikol (PEG) által kiváltott kicsapással, amint azt Rao et al. a közelmúltban megjelent publikáció [42] oldala az exoszomális fehérjékről a gél tripszinezése előtt készült NuPAGE bisTris10% akrilamid 12 lyukú gélekkel, hogy 40 µL fehérjét rezolváljanak a kontroll és az AKI vizeletminták exoszómáiból.

A gélkivonatokat a proteolízis megakadályozására pufferrel kombináltuk, amely 75 mM NaCl-t (Sigma, St. Louis, MO, USA), 3% nátrium-dodecil-szulfátot (SDS, Fischer, Arnold AFB, Tullahoma, TN, USA), 1 mM NaF-ot tartalmazott. (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM béta-glicerofoszfát (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM béta-glicerofoszfát (Sigma, Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM nátrium ortovanadát (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mM nátrium-pirofoszfát (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF, Sigma) és 1× Complete Mini EDTA szabad proteáz inhibitor tabletta 50 mM HEPES-ben (Sigma, St. Louis, MO, USA), pH 8,5. A fehérjék denaturálásához azonos térfogatú 8 M ureát 50 mM HEPES-ben (pH 8,5) adtunk hozzá, és két 10- másodperces szonikát hajtottunk végre 25 százalékos amplitúdóval. A fehérjéket redukáltuk, alkileztük és leállítottuk ditiotreitollal és jódacetamiddal a korábban leírtak szerint [43]. A fehérjéket triklór-ecetsav (Sigma, St. Louis, MO, USA) hozzáadásával a mintákhoz jégen, majd a fehérjéket 4 ◦C-on centrifugálással pelletáltuk. A fehérjepelleteket kétszer mostuk jéghideg acetonnal. A fehérjepelleteket 56 ◦C-on 30 percig szárítottuk, majd 1 M karbamidban 50 mM HEPES-ben újraszuszpendáltuk, majd egy éjszakán át szobahőmérsékleten emésztettük 6 µg LysC-vel (Wako, Richmond, Commonwealth of Virginia, USA), majd {{27} }h emésztés szekvenáló minőségű tripszinnel (Promega, Fitchburg, WI, USA) 37 ◦C-on. A mintákat C18 Sep-Paks segítségével sómentesítettük, és a fehérjék mennyiségét meghatároztuk [44]. Mintánként összesen 1,0 ug fehérjét elemeztünk folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriával (LC-MS [2]), 85 perces folyadékkromatográfiás gradienssel Easy-nLC 1000-en (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA). egy Orbitrap Fusion tömegspektrométerhez (Thermo Fischer Scientific) csatlakozik.

A kromatográfiát egy otthon húzott és megtöltött 30 cm-es oszlopon végeztük, amelyet háromszor megtöltöttünk 0,5 cm, 0,5 cm és 30 cm 5 µm C4, 3 µm C18, illetve 1,8 µm C18, és 60 ◦C-ra melegítjük. A peptideket először 500 bar nyomáson töltöttük be, majd egy 6-25% acetonitrilt tartalmazó kromatográfiás gradiens követte 70 perc alatt, majd egy 5-perc gradiens 100% acetonitrilig, amelyet 10 percig tartottunk. Az elektropermetes ionizációt 2000 V feszültség alkalmazásával végeztük egy rozsdamentes acél T-csomóponton keresztül, amely összeköti az analitikai oszlopot és az Easy-nLC rendszert. Minden mintát két mosás követett, kezdve 3-100%-os acetonitril gradienssel 15 percen keresztül, majd további 10 percig 100%-os acetonitrilben. A 375–1500 közötti töltési tömeg (m/z) tartományt 2–6 közötti töltési állapotú peptidek után vizsgáltuk. A csúcsok mennyiségi meghatározásához központosított adatokat használtunk. Az adatgyűjtés adatfüggő pozitív ion módban történt. A nyers spektrumokat a Proteome Discoverer 2.1-es verziójában keresték a Homo sapiens UniProt (www.uniprot.org (letöltve 2017. november 5-én)) referenciaadatbázisával a Sequest algoritmus [18], valamint a peptidek és a téves felfedezések ellenőrzésére használt fordított adatbázis-megközelítés mellett. ráta (FDR) 1 százalékra [17]. In silico tripszin emésztés a keresési paraméterekben meghatározottak szerint, a hat aminosavból álló minimális peptidhossz mellett. A keresési beállítások között szerepelt a metioninok oxidációjának dinamikus módosítása és a ciszteinek karbamidometilációjának statikus módosítása is. A prekurzor tömegtoleranciát 50 ppm-re, a fragmens tömegtoleranciát 0,6 Da-ra állítottuk be.

Amellett, hogy a spektrális egyezéseket és a fehérjéket korlátozzák<1% fdr,="" peptide="" matches="" were="" further="" screened="" to="" only="" include="" peptide="" spectral="" matches="" (psms)="" identified="" with="" high="" confidence.="" the="" summed="" abundance="" of="" the="" area="" under="" the="" curve="" of="" ms1="" peaks="" associated="" with="" psms="" was="" used="" to="" represent="" protein="" abundances.="" to="" help="" account="" for="" run-to-run="" variation="" in="" lc-ms2="" experiments,="" the="" raw="" protein="" abundances="" were="" next="" normalized="" by="" a="" two-step="" process.="" in="" the="" first="" step,="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" average="" abundance="" of="" a="" given="" protein="" throughout="" the="" experiment="" divided="" by="" the="" median="" of="" the="" protein="" averages="" observed="" throughout="" the="" experiment.="" in="" the="" second="" step,="" the="" adjusted="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundances="" observed="" within="" their="" respective="" samples="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundance="" observed="" in="" the="" entire="" experiment.="" records="" of="" the="" normalization="" and="" analysis="" of="" proteomics="" data="" are="" available="" in="" a="" jupyter="" notebook="" form="" at="">

4.3. Proteomikai adatok elemzése

A proteomikai adatelemzés rekordjait Jupyter notebook formátumban töltötték fel egy Github adattárba (2021. március 3-án érhető el). Az elvi koordináta-analízist (PCoA) Qiime2-vel (2019-7 verzió) végeztük [45]. Az idődiverzitás core-metrics parancsot használták a minták közötti távolság kiszámítására a Bray-Curtis metrika és a PCoA segítségével történő megjelenítésre. A kontroll és a V-AKI minták közötti távolság statisztikai elemzését egy páronkénti PERMANOVA teszttel végeztük a "qiime diversity beta-group szignifikancia" paranccsal. Ezekről az eredményekről boxplot-vizualizációt hoztunk létre a seaborn csomagon keresztül (2021. március 3-án). A V-AKI esetek és a kontroll alanyok bináris összehasonlítását a scipy csomag (2021. március 3-án) segítségével, független t-teszttel, egyenlőtlen varianciával végeztük. Az egyes fehérjék és a V-AKI státusz közötti kapcsolat erősségét a pi-érték metrika segítségével rangsoroltuk, amely a p-érték szignifikanciáját a szoros változással kombinálja [12]. Amint azt korábban leírtuk [46], a szignifikáns asszociációkat úgy határoztuk meg, hogy azok pi-értéke > |1|. Minden egyes fehérje asszociációt a V-AKI státuszhoz egy vulkán diagramon ábrázoltunk, hogy még jobban kiemeljük a legmagasabb rangú{27}} fehérjék elhelyezkedését. A génkészlet-dúsítási elemzést a DAVID szerverrel [47] végeztük, összehasonlítva a szignifikáns fehérjéket (pi-érték > |1|) az adatkészletben azonosított összes fehérje hátterével. A kapcsolódó funkcionális dúsítások klasztereit az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza.

To test for a relationship between V-AKI-associated proteins and inflflammatory cytokines, a recently developed network-based cytokine inference approach was utilized [48]. Briefly, a list of cytokines (TGFb, TNF, IFN, IL1-40, CXCL1-16, CCL1-27) was submitted alongside signifificantly altered proteins (pi-value > |1|) to the STRING-db tool [49]. Connections between proteins were determined using all interaction sources and a minimum interaction score >0.4. A citokineket először szűrtük, hogy legalább öt kapcsolódjanak a jelentősen megváltozott fehérjékhez. Ezután az egyes citokinek és a V-AKI-asszociált vagy kontroll-asszociált fehérjék közötti kapcsolatok arányát összehasonlítottuk a V-AKI vagy a kontroll-asszociált fehérjék közötti kapcsolatok teljes számával. Az egyes citokinek és más fehérjék közötti kapcsolatok számában mutatkozó különbségek figyelembevétele érdekében ezt az értéket a következőképpen hasonlítottuk össze az egyes citokinek és az összes jelentősen megváltozott fehérje közötti kapcsolatok számával. A kiválasztott citokinek dúsítási pontszámait a V-AKI-val vagy a kontrollhoz kapcsolódó fehérjékkel való asszociációjuk alapján ábrázoltuk. Végül a V-AKI-asszociált fehérjék és a V-AKI-asszociált fehérjékhez dúsított kapcsolatokkal rendelkező citokinek finomított keresését a Cytoscape 3.5.1-es verziójával vizualizáltuk kölcsönhatásaik szempontjából [50]. A fehérje-fehérje interakciós hálózatokat úgy díszítettük, hogy a V-AKI-val asszociált fehérjéket a pi-score asszociációjuk alapján mérettük meg a V-AKI-státuszhoz, és úgy színeztük, hogy kikövetkeztethető kapcsolatuk volt a gyulladást elősegítő vagy gyulladásgátló hatással rendelkező, dúsított citokinekkel.

sárkány gyógynövények cistanchekezelni tudjavese sérülés

5. Következtetések

Arra törekedtünk, hogy jobban megértsük a V-AKI sérülésének mechanizmusát klinikailag megítélt esetekből, és érdekes módon azt találtuk, hogy a komplement, a galectin-3 kötő fehérje és a fibrinogén szignifikánsan összefügg a V-AKI-val. Korábbi és saját tanulmányaink eredményei a komplementrendszer és a gyulladásos útvonalak szerepére utalnak a V-AKI-ban. Míg nagyobb vizsgálatok szükségesek a vankomicin által kiváltott károsodás molekuláris folyamatainak és az azt követő helyreállítási utak validálásához, az eredmények azt mutatják, hogy a vizelet exoszómái fontos információkkal járulhatnak hozzá a patofiziológiai mechanizmusokhoz, és biomarkerként szolgálhatnak a gyógyszerek által kiváltott károsodásokhoz.vesesérülés.

A szerző hozzájárulásai:

Koncepció, LA és SPR, módszertan, SV, SPR, DJG, RM; szoftver, DJG, RHM, formális elemzés, LA, AL, RHM; nyomozás, AL, JA, VJ, SB, MC-T., PN; írás – eredeti tervezet előkészítése, AL, JA, VJ, LA; írás – áttekintés és szerkesztés, RHM, DJG, MC-T., AT, AA, JC, MSJ, EM, RM, PN; felügyelet, SV, SPR; projekt adminisztráció, LA; finanszírozás megszerzése, LA Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát.

Finanszírozás:

Ezt a kutatást az International Serious Adverse Events Consortium finanszírozta. Az MCT-t a T32 DK007202 számú képzési támogatás támogatta.

Az Intézményi Ellenőrző Testület nyilatkozata: A vizsgálatot a helsinki nyilatkozat irányelvei szerint végezték, és a kaliforniai Egyetem Intézményi Felülvizsgáló Testülete (vagy Etikai Bizottsága) hagyta jóvá, San Diego Human Subjects Research Protections Program (IRB#121651).

Tájékozott beleegyező nyilatkozat: A vizsgálatban részt vevő összes alanytól tájékozott beleegyezést kaptunk

Köszönetnyilvánítás:

Szeretnénk megköszönni a DIRECT nyomozók közreműködését: Dinna Cruz, Stuart Goldstein, Patrick Murray, Andrew Davenport, Andrew Lewington, DavidSelewski, Michael Zappitelli, Marlies Ostermann, Li Yang, Bhavna Pandya, Patrick Brophy, DanielaPonce, Julia Steinke, Josee Bouchard, Carlos Irarrazabal, David Askenazi, Nitin Kolhe, RolandoClaure-Del Granado, Nadine Benador, Clare Castledine, Jonathan Barratt, Sunil Bhandari, AlyssaRiley, Ayse Akcan-Arikan, TK Davis, Christopher Farmer, Mark Kari Thomas, Fred Pang , Hansjoerg Rothe.

Összeférhetetlenség:

A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Feladó: Linda Awdishu: "A húgyúti exoszómák azonosítják a gyulladásos útvonalakat vankomicinnel összefüggő akut vesekárosodásban"

---Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2784