Mi a különbség a vadon termő Cisztanche és a mesterségesen termesztett Cistanche között az immunitást fokozó aktivitás tekintetében

Kapcsolat: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Zhao Bing; Yang Xiumei; Wu Daocheng; Ba Xueli; Li Quanxiao; Tan Yachao; Zhang Ailian

Absztrakt:

Célkitűzés:A vadon növekvő cisztanche és a mesterségesen termesztett cisztanche poliszacharidok (a továbbiakban: WCDPS és CCDPS) immunerősítő hatásának összehasonlítása.

Mód:Különböző dózisú (alacsony, közepes és magas) WCDPS-t és CCDPS-t és ovalbumint (OVA) szubkután immunizáltunk ICR egerekkel, OVA-specifikus IgG antitest, valamint IgGl és IgG2a antitest altípusokat ELISA-val és MTT módszerrel detektáltunk. OVA-specifikus limfocita proliferációs aktivitás, áramlási citometria a CD4 plusz T sejtek és CD8 plusz T sejtek expressziós szintjének kimutatására.

Eredmények:Mind a WCDPS, mind a CCDPS jelentősen növelheti az OVA-specifikus antitest IgG expressziós szintjét, valamint az IgG1 és IgG2a antitesttípusokat (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS and CCDPS can significantly promote OVA-specific lymphocyte proliferation, and the difference between the same dose is not statistically significant (P>0.05); A WCDPS és a CCDPS jelentősen növelheti a CD4 plusz T és CD8 plusz T sejtek résztartalmát (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), a WCDPS és a CCDPS nem volt hatással az immunizált egerek tömegére.

Következtetés:Mind a WCDSP, mind a CCDPS szignifikánsan fokozhatja az OVA-specifikus humorális és celluláris immunválaszokat, és a kettő között nincs statisztikailag szignifikáns különbség, és jó a biztonságuk.

Kulcsszavak: cistanche; cisztanchából származó poliszacharidok; ovalbumin; adjuváns

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),más néven Cunyun és Dayun, sok éve a Lydanaceae parazita lágyszárú növénye. Ritka és értékes kínai gyógyászati ​​anyag. Fő összetevői közé tartoznak a cisztanchából származó poliszacharidok, a Cistanche feniletanoid glikozid vegyületek, szerves savak, alkaloidok stb.⑷, amelyek számos funkciót töltenek be, például táplálják az esszenciát és a vért, segítik a jangot, tonizálják a vesét, valamint enyhítik az öregedést⑸. A cistancse rendkívül magas gyógyászati ​​értéke miatt a vadon élő fajok túlzott kitermelése a kihalás szélén áll, a mesterségesen termesztett cisztancse sikeres volt. A hazai és külföldi kutatók rengeteg kutatást végeztek a vadon növő cisztanch és a mesterségesen termesztett cisztanche kémiai összetevőivel és hatóanyagaival kapcsolatban, de kevés jelentés született a vadon termesztett és a termesztett cisztanche poliszacharidok cisztanche (WCDPS/CCDPS) adjuváns aktivitásának összehasonlításáról. . Számos tanulmány kimutatta, hogy a cisztanchából származó növényi poliszacharidok adjuvánsként szabályozhatják a szervezet immunválaszát. Sok kutató használt kínai gyógynövényeket vakcina adjuvánsként, és jó eredményeket ért el."

Ez a tanulmány a korábbi kutatáson (6) alapul, hogy összehasonlítsa aimmunerősítőa Xinjiang WCDPS és CCDPS tevékenységei. Főleg egérimmunizálási kísérletekkel különböző dózisú WCDPS-t és CCDPS-t szubkután immunizáltak OVA-val ICR egerekben, és ezek hatása a humorális szintre.immunitásés az immunizálás után az OVA által kiváltott celluláris immunitást teszteltük. Hasonlítsa összevadul nő a ciszternaésmesterségesen termesztett cisztanchepoliszacharidok A citrusfélékben található poliszacharidok immunerősítő aktivitása referenciaként szolgálhat a mesterségesen termesztett cisztanche jobb fejlesztéséhez és hasznosításához Hszincsiangban.

Anyagok és módszer

Kísérleti anyagok:

Vadon termő ciszternák és termesztett ciszternák (kereskedelmi forgalomban kapható). Az RPMI 1640 táptalajt a GIBCO-tól vásároltuk; A magzati szarvasmarha szérumot az Israel Bioind cégtől vásároltuk; Áramlási citometriás antitestek: PE patkány-egér-ellenes CD3, APC patkány-egér-elleni CD4, FITC patkány-egér-ellenes CD8a-t az amerikai BD cégtől vásároltuk, tojásfehérje fehérje (Ovalbumin, OVA) Sigma termék, torma-peroxiddal jelölt kecske antiegér Az IgG-t, IgGl-t és IgG2a-t a Southbiotech-től (USA) vásároltuk. A többi kísérleti kémiai reagens mind hazai analitikai reagens.

Kísérleti állatok:

Tiszta minőségű nőstény ICR egereket (6-8 hét, 18-22 g) a Xinjiang Medical University Kísérleti Állatközpontjától vásároltunk. Az állatokat laboratóriumunk állatszobájában tartottuk, a kísérletet az állatok akklimatizálása után 7 nappal kezdtük meg.

WCDPS és CCDPS előkészítése:

A [17] hivatkozás a vízkivonás és az alkoholos kicsapás módszerét használja. A rövid lépések a következők: Vegyünk száraz Xinjiang termesztett és vadon élő cisztancseport, adjunk hozzá 10-szeres térfogatú vazelint és abszolút etanolt az ultrahanghoz 1 órára; szívószűrés után tartsa vissza a gyógyszermaradványt és szárítsa meg, adjon hozzá 10-szeres térfogatú desztillált vizet 37T Ultrahang kétszer, centrifugáljon 4 000 fordulat/perc 10 percig, egyesítse a felülúszókat, forgó bepároljuk és töményítse, majd egy éjszakán át alkohol; vákuumszűrés és szárítás után nyers extraktumport kapunk; A Savage módszer ⑻ eltávolítja a fehérjét a WCDPS-ből és a CCDPS-ből. A WCDPS-ben és a CCDPS-ben a cisztanchából származó poliszacharidok hagyma-kénsav módszerrel meghatározott mennyisége 76,82%, illetve 59,58% volt.

Egér immunizálás és szérumgyűjtés:

Kísérleti állatmodellként a {{0}} hetes ICR nőstény egereket használtuk. A kísérletet 9 csoportra osztottuk, mindegyik csoportban 5: 0,9 százalékos NaCl, OVA 10 jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA- WCDPS 100 nettó, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 net. Az immunizálás előtt oldjuk fel 0,9 százalékos NaCl-dal, és immunizáljuk az egereket szubkután kétszer 2 hetes időközönként. Az immunizálás előtt vért vesznek, majd az -80Y szérumot elkészítik és tárolják későbbi felhasználásra.

A WCDPS és a CCDPS hatása az egerek növekedésére:

A WCDPS és a CCDPS egerek növekedésére gyakorolt ​​hatásának megfigyelése érdekében az egyes csoportokban az egerek tömegét lemértük a kezdeti immunizálás előtt 0 nappal, az immunizálás után 14 nappal és 21 nappal.

Egér szérum antitest IgG kimutatása és tipizálása WCDPS és CCDPS immunizálás után:

A szérum antitestek meghatározására indirekt ELISA módszert alkalmaztunk. Bevontuk az ELISA lemezt 2,5 jig/ml OVA-val, 4Y egy éjszakán át; 3-szor mossuk PBST-vel, majd adjunk hozzá 5 százalék zsírmentes 37 literes tejport a blokkoláshoz 1 órán keresztül; 3-szor mossuk PBST-vel, és adjuk az elsődleges antitestet az egerekhez az immunizálás után minden csoportban A szérumban, az elsődleges antitest hígítási aránya 1:100, 100 pirula lyukanként, 37 Tl óra; háromszori PBST-vel történő mosás után adjunk hozzá másodlagos antitesteket: kecske anti-egér IgG, IgGl, IgG2a (l: 5 000) HRP 37-tel jelölt Inkubáljuk a sárkányt 1 órán át; 4-szeri PBST-vel végzett mosás után adjunk hozzá tetrametilbenzidin (TMB) szubsztrát oldatot, hogy elkerüljük a fényt 15 percig. Adjon 50 ul-t mindegyik lyukba, hogy leállítsa a reakciót 2 mol/l H2SO4-dal, és mérje meg az A45O/655 értéket. Hasonlítsa össze az antitestek szintjét az egyes csoportokban.

Az egér lép limfocita proliferációjának kimutatása WCDPS és CCDPS immunizálás után:

MTT módszert alkalmaztunk a limfociták proliferációjának kimutatására CCDPS-sel és WCDPS-sel immunizált egerek lépében. Az egerek lépét aszeptikus körülmények között izoláltuk 21 nappal az első immunizálás után, és a lépsejteket 1 0% FBS-t tartalmazó RPMI 1640 tápközeggel hígítottuk, hogy egyedi sejteket állítsunk elő. Szuszpenzió, számlálás és a sejtek beállítása sejtek/ml-t szétterítjük egy 96-lyukú sejttenyésztő lemezre, adjunk hozzá 20 OVA-t (végső koncentráció 10 |xg/ml) és ConA-t (végső koncentráció 5 pig/ml) Stimuláljunk, állítsunk be egy üres sejtkontrollt és egy üres szérumot. kontrollt egyidejűleg, tedd egy 37Y sejtes inkubátorba 48 órára, adj 20 MTT-t minden mérőhelyhez, 37^ és folytasd az inkubálást 4 órán keresztül, adj hozzá 100|±1 DMSO-t minden egyes mérőhelyhez a feloldódáshoz és teszteld a szívet 0 /63. Érték, számítsa ki az egyes egércsoportok stimulációs indexét (SI).

A CD4 és CD8 expressziója CD3 plusz T-sejteken WCDPS és CCDPS immunizálás után:

Áramlási citometriát alkalmaztunk a CD4 plusz T és CD8*T sejtek expressziójának kimutatására CD3 plusz T sejtek felszínén. Az egérlépet aszeptikus körülmények között izoláltuk 21 nappal az elsődleges immunizálás után, és a lépet 10% FBS-t tartalmazó RPMI 164{14}} tápközeggel kezeltük. Készítsen egysejtes szuszpenziót, számolja meg és állítsa be a sejtek számát 1x106 sejtre/mintára, végezzen CD4 és CD8 festést a CD3 plusz T sejtek felületén, védje meg a fénytől szobahőmérsékleten 25 percig, és használjon 10 ml foszfáttal pufferolt oldat, amely 0,5% FBS-t (foszfáttal pufferolt oldat) tartalmaz. sóoldat, PBS) 1 200 r/perc 7 perc egyszeri mosás, 250 |jil PBS hozzáadása, 200 mesh rézhálós áteresztés, áramlási citometria a CD4 és CD8 expressziójának kimutatására a CD3*T sejtek felszínén.

Statisztikai módszerek:

A Flowjo 7.6 szoftver feldolgozza az áramlási citometriás teszteredményeket; A GraphPad Prism 5.0 az adatok elemzésére szolgál, és az adatok mindegyike az átlag ± standard eltérésen alapul. A Student és a teszt segítségével hasonlítsa össze a kísérleti csoportok adatait. P<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Eredmény

1. The effect of WCDPS and CCDPS on the growth of mice: After co-immunization with WCDPS and CCDPS and OVA, weigh the weight of the mice (Table 1). There was no statistically significant difference in the bodyweight of mice in each group during the same growth period ( P>0.05).

2. A WCDPS és a CCDPS hatása az OVA-specifikus antitest IgG-re: WCDPS-t és CCDPS-t szubkután immunizáltunk OVA-val, hogy kimutathassuk az OVA-specifikus IgG antitest expresszióját a szérumban 14 és 21 napos immunizálás után. Az eredményeket az 1. ábra mutatja, a WCDPS és a CCDPS dózisfüggő módon elősegítette az antitest IgG expresszióját a szérumban; Az OVA plusz WCDPS 50 p,g az OVA plusz CCDPS 50 |xg-hez képest jelentősen elősegítheti az OVA-specifikus antitestek kialakulását az OVA plusz CCDPS 50 |xg-hez képest. Az IgG expressziója (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); the difference between WCDPS and CCDPS at the same dose was not statistically significant (P>0.05).

3. WCDPS és CCDPS hatása az OVA-specifikus antitest tipizálásra: 21 nappal az immunizálás után kimutattuk az IgG1 és IgG2a tipizáló OVA-specifikus antitestek expresszióját a szérumban. Az eredményeket a 2. ábra mutatja. Az OVA-WCDPS 50 jig és az OVA-WCDPS 100 |xg Mumu szignifikánsan elősegítette az IgG2a antitest expresszióját a szérumban, mint az OVA-csoport önmagában (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. A WCDPS és a CCDPS hatása az egér OVA-specifikus limfociták proliferációjára: A WCDPS és CCDPS lép limfocitákra kifejtett hatásának kimutatása érdekében a cisztanchából származó poliszacharidokat szubkután immunizáltuk OVA-val, majd 21 nappal az immunizálás után a lépsejteket elválasztottuk. , kimutatásukra pedig az MTT módszert alkalmaztuk Elősegíti az OVA-specifikus limfocita proliferációt. Az eredményeket a 3. ábra mutatja. A WCDPS és a CCDPS dózisfüggő módon fokozta az OVA-specifikus limfocita proliferációt. A WCDPS és CCDPS kombinációja az OVA csoporttal jelentősen elősegítheti az OVA-specifikus limfocita proliferációt, összehasonlítva az OVA csoporttal önmagában. Limfocita proliferáció (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. WCDPS és CCDPS hatása CD3 plusz CD4 plus T és CD3 plus CD8 plus T sejtekre: 21 nappal a WCDPS és CCDPS szubkután OVA-val történő immunizálása után a CD4 és CD8 expresszióját CD3 plusz T sejtekben áramlási citometriával detektáltuk. ábrán látható, hogy az OVA-WCDPS 50, az OVA-CCDPS 50 jig és az OVA-WCDPS 100 jelentősen elősegítheti a CD3 plusz CD4 plusz T sejtek proliferációját (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); there was no significant difference between WCDPS and CCDPS and OVA compared with an aluminum adjuvant group (P>0.05).

Vita

Számos tanulmány kimutatta, hogy a kínai gyógynövénygyógyászat immunmoduláló „Da] funkcióval rendelkezik, és számos jelentés bizonyítja, hogy a kínai gyógynövény-poliszacharidok a cisztanchából felhasználhatók adjuvánsként a vakcinák immunhatásának fokozására”3], és a tanulmányban kiválasztott Congrong Xinjiang sivatagi húsa egyedülálló gyógyászati ​​anyag Xinjiangban, és a vadon élő fajok a kihalás szélén állnak, magasabb gyógyászati ​​értékükkel együtt, a termesztett fajok termesztése különösen fontos a gyógynövény-források fejlesztése és hasznosítása szempontjából. . A jelenlegi piacon lévő új vakcinák antigénspecifitása jó, de immunogenitása gyenge. A cistanche növényi poliszacharidjai pótolhatják ezt a hiányt. hazám nagy előnnyel rendelkezik a kínai gyógynövénygyógyászat kutatásában. Természetes kínai gyógynövényekből származó vakcina-adjuvánsokat szűrünk. Magas megvalósíthatóság. Tanulmányok kimutatták, hogy a kínai gyógynövény-poliszacharidok Cisztanche-ból különböző mértékben szabályozzák a specifikus immunitást és a nem specifikus immunitást, mint például a Ganoderma poliszacharidok a cistanche-ból, a Radixisatidis-poliszacharidok a cistanche-ból, a Poria cocos poliszacharidok a cistanche kojiból, az inulin poliszacharidok a cistanche-ból27 stb. Fokozza a vakcina immunrendszeri hatását.

A ciszterna iránti kereslet gyors növekedése miatt vadon élő fajait kihaltak, és mára a veszélyeztetett és védett növények közé sorolják hazámban. A sivatagi Caulis Carlsbad mesterséges telepítésének sikere alapján a termesztett fajok várhatóan felváltják a vadon élő fajokat. Ebben a kísérletben vadon termesztett cistanche-t és tenyésztett mesterségesen tenyésztett cisztanche-poliszacharidokat használtunk OVA-adjuvánsként az in vivo egérimmunizálási kísérletekhez. Különböző indikátorok tesztelésével kezdetben a vadon élő és termesztett cisztanche immunhatását értékelték, ami referenciaként szolgált a termesztett cistancse hatékony felhasználásához Hszincsiangban.

Annak érdekében, hogy megértsük a biztonságát a vadon termő cistancse és a termesztett mesterségesen termesztettcistanche szacharidokA cistanche-ból in vivo állatokkal végzett immunizálási kísérletek megfigyelték az egerek megjelenési jellemzőit, és azt találták, hogy az egereknek nincs hasmenése, felálló szőrzete vagy szakadása az immunizálás után, tevékenységük és légzésük normális, izomrángásuk nincs. Nem volt szignifikáns különbség az egerek testtömegében az egyes csoportokban a rendellenesség jelensége miatt, ami azt jelzi, hogy a WCDPS és CCDPS immunizálás nem befolyásolta az egerek növekedését, és bizonyos fokú biztonsággal rendelkezik. Az antitest IgG és a tipizálási tesztek eredményei azt mutatják: a WCDPS és a CCDPS szignifikánsan növelheti az OVA-specifikus antitest IgG expresszióját OVA-val történő együttes immunizálás után, és a hatás egyenértékű az alumínium adjuvánssal; szignifikánsan fokozhatja az OVA-specifikus IgG2a és IgGl típusú antitestek expresszióját. Megmutatja, hogy a cistanche poliszacharidjai egyszerre fokozzák a Th1 és Th2 immunválaszt, és nincs szignifikáns különbség a WCDPS és a CCDPS között. Az IgG2a antitest-tipizálás eredményei azt találták, hogy a WCDPS és CCDPS és az OVA koimmunizációs csoport jelentősen fokozhatja az IgG2a expresszióját az alumínium adjuváns csoporthoz képest, az alumínium adjuváns gyengébb a T-sejt expresszió elősegítésében, ami azt bizonyítja, hogy WCDPS és CCDPS használatos. adjuvánsként A celluláris immunitást elősegítő képesség lényegesen magasabb, mint az alumínium adjuvánsoké.

A limfocita proliferáció MTT módszerrel történő kimutatásának eredményei azt mutatták, hogy az egyes csoportokban az egerek lépsejtjeit OVA stimulálta. A limfocita proliferáció stimulációs indexe (SI) az OVA-val kombinált WCDPS-ben és CCDPS-ben szignifikánsan magasabb volt, mint az egyedül OVA-val immunizált csoportban. OVA- A WCDPS 50 Ah és OVA-CCDPS 50 jig csoport stimulációs indexe szignifikánsan magasabb volt, mint az alumínium adjuváns csoporté; azt jelzi, hogy a WCDPS és CCDPS az OVA csoporttal kombinálva jelentősen növelheti az OVA-specifikus limfociták proliferációját az OVA csoporthoz és az alumínium adjuváns csoporthoz képest.

A T-limfocitáknak különböző alcsoportjai vannak. A CD3 az összes T-limfocita felszíni molekulája. Különböző fenotípusok szerint CD8 plusz T-sejtekre és CD4 T-sejtekre oszthatók. A CD4 plus molekulák MHC fl molekulák hatására képződhetnek, melyek aktiválás után főleg helper (Th) sejtekként használatosak. A CD8 plusz molekulákat MHC I molekulák hatására kell kialakítani. Az aktiválás után ölősejtekké (TC vagy CTL) válnak, amelyek fontos szerepet játszanak a vírusfertőzések elleni immunitásban és a tumorimmunitásban. 3". Az áramlási citometria CD3PD4 plusz T és CD3 plusz CD8 plus T sejt expressziót detektál, az eredmények azt mutatják, hogy a WCDPS és a CCDPS jelentősen elősegítheti a CD4 plusz T és CD8 plusz T sejtek proliferációját egy bizonyos dózistartományon belül, és nincs jelentős A CCDPS és az OVA kombinációja serkentheti a CD3 plusz CD4 plusz T és CD3 plusz CD8 plusz T sejtek expresszióját, és a két hatás egyenértékű.

Összefoglalva, a WCDPS és a CCDPS biztonságos adjuvánsként. Az OVA-val történő immunizálás után egyidejűleg fokozhatják a specifikus humorális immunitást és a celluláris immunitást. Az alumínium adjuvánsokhoz képest a WCDPS és a CCDPS jobb hatást fejt ki a celluláris immunitás fokozására, és nincs különbség a cisztanchából származó két poliszacharid fokozó hatása között. Ezek a kutatási eredmények anyagi referenciákat adnak a hszincsiangi mesterségesen termesztett cisztanche poliszacharidokhoz, amelyek adjuvánsként szolgálnak a cisztanchából, valamint anyagi alapot adnak a Hszincsiang-sivatagból származó biztonságos és hatékony immunadjuvánsok szűréséhez.cistanche.

Hivatkozások

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S et al. Az Atractylodis macrocephalus Koidzból származó poliszacharidok immunadjuváns válasza Newcastle-betegség (ND) ellen vakcinázott csirkékben [J]. Carbohydr Polym, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. szénhidrát pop. 2016. 01.033.

[2]Li J, Wang X, Wang W és mások. A Pleurotus ferulate vízkivonat fokozza az egér csontvelőből származó dendritikus sejtek érését és működését a TLR4 jelátviteli útvonalon keresztül [J]. Vaccine, 2015, 33(16): 1923-1933. DOI: 10.1016/j. vakcina.2015.02. 063.

[3] Zhao H, Luo Y, Lu C és mások. Az enterális nyálkahártya immunválasz kiválthatja a Ganoderma poliszacharid immunmoduláló aktivitását egerekben [J]. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.