Teljes átirat-elemzés a szepszisben szenvedő, súlyosan beteg idős betegek károsodott immunológiai jellemzőinek feltárására

Absztrakt

Háttér

A szepszis a kritikus állapotú betegek gyakori szövődménye, rendkívül heterogén, és magas morbiditási és mortalitási arányokkal jár, különösen az idősek körében. Az RNS-szekvenálás (RNA-Seq) felhasználását a biológiai útvonalak elemzésére széles körben alkalmazzák klinikai és molekuláris genetikai vizsgálatokban, de még mindig hiányoznak a szepszisben szenvedő idős betegeken végzett vizsgálatok. Ezért megvizsgáltuk a mortalitás szempontjából releváns biológiai és transzkriptomikus jellemzőket olyan idős betegeknél, akik szepszis miatt kerültek intenzív osztályra (ICU).

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Mód

37 szepszisben szenvedő idős beteget vettünk fel a Taichung Veterans General Hospital intenzív osztályáról. Az 1. és a 8. napon klinikai és laboratóriumi adatokat, valamint vérmintákat gyűjtöttünk az RNS-Seq analízishez. A 8. és 1. nap között DVID dúsítási analízissel és génkészlet-dúsítási elemzéssel azonosítottuk a differenciálisan expresszált gének dinamikus transzkriptumát és dúsított útvonalait. Ezután a T-sejt-repertoár sokféleségét elemeztük MiXCR-rel.

Eredmények

Összességében 37 betegnél volt szepszis, és a reagálókat és a nem reagálókat főkomponens-analízissel csoportosították. A 7. napon szignifikánsan magasabb SOFA-pontszámokat, hosszabb lélegeztetőgépes napokat, intenzív osztályos tartózkodási időt és kórházi mortalitást találtak a nem reagáló csoportban, mint a reagáló csoportban. A 8. napon szepszisben szenvedő idős intenzív osztályos betegeknél a veleszületett immunitással és gyulladással kapcsolatos gének, mint például a ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 és PCSK9, felszabályozásra kerültek. A differenciálisan expresszált gének (DEG-ek) gazdagodtak a transzkripció szabályozásában, az adaptív immunválasz, az immunglobulintermelés, a transzkripció negatív szabályozásában és az immunválasz szabályozásában. Ezenkívül a T-sejt-receptorok változatosabbak voltak a -8 napon a reagáló csoportban, mint a -1 napon, ami azt jelzi, hogy a szepszisből való felépülésük jobban szabályozott volt, mint a nem reagáló betegeknél. .

Következtetés

A szepszis mortalitása és előfordulási gyakorisága egyaránt magas volt az időseknél. RNS-Seq adatok alapján funkcionális útvonal- és MiXCR-analízisekkel azonosítottuk a mortalitás szempontjából releváns biológiai jellemzőket és transzkriptomikus jellemzőket; és azt találták, hogy a válaszadó csoportban megnőtt a veleszületett immunitás és megnőtt a T-sejtek diverzitása; a nem válaszoló csoporthoz képest. Az RNA-Seq további kiegészítő információkat nyújthat a kezelési eredmények pontos és korai előrejelzéséhez.

cistanche növény-növelő immunrendszer

Kulcsszavak

Szepszis, RNA-Seq, idős intenzív osztályos beteg, eltérően expresszálódó gének, T-sejt receptor

Bevezetés

A szepszis olyan klinikai szindróma, amely potenciálisan életveszélyes. A fertőzésre adott rendezetlen gazdaválasz termeli, és rendkívül heterogén és halálos globális egészségügyi fenyegetést jelent, különösen az idős lakosság körében [1, 2]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az idős betegeknél nagyobb a szepszis kockázata, és nagyobb a betegség súlyossága, mint az általános populációban [3]. Az elmúlt két évtizedben folyamatosan emelkedett a szepszis miatt intenzív osztályra (ICU) kerülő idős betegek száma az idősek számának folyamatos növekedése miatt [4]. Nevezetesen, a magas intenzitású ellátás ellenére az intenzív osztályra felvett idős betegek mortalitása továbbra is magas, de még mindig hiányoznak olyan tanulmányok, amelyek a szepszisben szenvedő idős betegek kezelési válaszával kapcsolatos biológiai útvonalakkal foglalkoznának [5]. Az idősek immunrendszere az életkor előrehaladtával számos biológiai változáson megy keresztül, amelyek befolyásolják az idősek immunválaszát, ami nagyobb valószínűséggel jár immunhiányos állapotokhoz [6]. A károsodott adaptív immunitás az idősek immunoeszcencia kulcsfontosságú jellemzője [7, 8], de az idősek szepszis alatti transzkriptomikus jellemzői továbbra is feltáratlanok. Ezek a változások nemcsak a bakteriális fertőzésekre való hajlamot határozzák meg, hanem a szepszis progresszióját és a klinikai kimeneteleket is [6]. Ezért kritikus fontosságú az intenzív osztályra felvett idős betegek változó immunológiai válaszainak és mortalitás szempontjából releváns biológiai jellemzőinek vizsgálata [9, 10].

A szepszis rendkívül heterogén, és összetett és dinamikus immunológiai reakciók jellemzik, amelyek kezdetben túlzott gyulladásos válaszreakciót, majd szabályozatlan/kimerült adaptív immunitást foglalnak magukban [11]. Számos tanulmány kimutatta a szepszis után megváltozott adaptív immunitást; Úgy tűnik, hogy az úgynevezett immunparalízis az egyik kulcsfontosságú immunológiai jellemző, amely a szepszisben szenvedő betegek immunitásának tartós romlásához vezet [12]. Az RNA-Seq-et korábbi vizsgálatokban használták a transzkriptomikus aláírás vagy "szubendotípus" megtalálására szepszisben szenvedő betegeknél. A szepszishez kapcsolódó algenotípusok a szepszis utáni szervi diszfunkció korai javulása, az immunhiányos betegek adaptív immunitásának gyengülése, valamint a szeptikus sokkban szenvedő betegek szteroidokra való reagálása [13, 14]. Az RNA-Seq adatok felhasználásával a közelmúltban olyan analitikai eszközöket fejlesztettek ki, mint a MiXCR a T-sejt receptorok (TCR-ek) diverzitásának számszerűsítésére [15, 16]. Ebben a tanulmányban szeptikus betegek dinamikus transzkriptumát vizsgáltuk az 1. és 8. nap páros mintáinak vizsgálatával, és azt találtuk, hogy az immunhiányos szeptikus betegek csökkent T-sejt-diverzitást és veszélyeztetett T-sejt-funkciót mutattak. Ez a tanulmány a mortalitás szempontjából releváns biológiai jellemzők és transzkriptomikus jellemzők feltárását tűzte ki célul, hogy jobban megértse az adaptív immunitással összefüggő jelátvitelt olyan idős betegeknél, akik szepszis miatt kerültek az intenzív osztályra.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Anyagok és módszerek Tanulmánytervezés és adatgyűjtés

A tanulmányt a TCVGH Institutional Review Board (IRB-szám: CE20069B) hagyta jóvá, és minden résztvevő beleegyezését kérte. 2018 decembere és 2022 januárja között harminchét idős intenzív osztályos beteget vettek fel a Taichung Veterans General Hospital-ból (TCVGH). A beiratkozáskor demográfiai adatokat gyűjtöttek, és az első és a 8. napon vérmintákat vettek. Két 4 ml-es vér alikvot részét steril EDTA vakutainerekben gyűjtöttük, és azonnal átvittük 10,5 ml RNAlater®-t (TermoFisher, Waltham, MA, USA) tartalmazó RNS-mentes fiolákba.

RNS extrakció és szekvenálás

Ebben a vizsgálatban RNS-t extraháltunk a PAXgene Blood RNA Kit segítségével, és az átlagos RNS integritásszám (RIN) 8,31±0,58 volt. A könyvtár felépítése során a gyártó utasításait követték, és a következő kísérletekben 1,000 ng fragmentált RNS-t használtak fel. 150-bp páros végű olvasást használtak az RNA-Seq-hez a NovaSeq platformon (Illumina, Inc., San Diego, CA, Egyesült Államok), és minden mintán legalább 50-60 millió leolvasás volt. Az RNA-seq adatkészletet a National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) GSE216902 nyilvántartási szám alatt helyezték el. Az adatkészletet a sejtarányok és az útvonal elemzésére használták.

Szekvenciális szervi elégtelenség értékelés (SOFA) pontszám

A szekvenciális szervi elégtelenség értékelése (SOFA) a szepszissel összefüggő szervelégtelenség számszerű értéke, azaz számszerűsíti a szervelégtelenség számát és súlyosságát. Mindegyik pontszám 0 és 4 között mozog, a magasabb pontszám pedig a szervi diszfunkció romlását jelzi [17]. A SOFA-pontszámok dinamikus változását használtuk a reagálók (R) és nem válaszolók (NR) meghatározására, és egy résztvevőt NR-nek minősítettek, ha a SOFA-pontszám csökkenése az 1. napról a 7. napra kisebb volt, mint 2 [13, 18, 19] .

Az RNA-Seq adatok bioinformatikai elemzése 

A szekvenálás jó minőségű volt, 30 Phred pontszámot használtunk, és a HISAT2 a szekvencia leolvasásait a referenciagenomhoz (GRCh38/hg38) térképezte [20]. A DEseq2 R csomagot [21] használták a differenciálisan expresszált gének (DEG) azonosítására, és az olvasási számokat a featureCounts [22] segítségével számítottuk ki. Az átlagos leképezési arány 87,6±4,8%, illetve 65,5±17,6 millió leolvasás volt. A profiler [23] R csomagot a genomokon (KEGG, https://www.genome.jp/kegg/) és a génontológián (GO, http://geneontology.org) alapuló funkcionális dúsítás és útvonal-elemzés elvégzésére használták. /) adatbázisok. A 0,05-nél kisebb korrigált p-értéket szignifikánsan dúsítottnak tekintettük. Minden differenciálisan kifejeződő gént funkcionálisan annotáltunk Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [24] segítségével, és egy Cytoscape 3.9.0 [25] vizualizált dúsítási térképet készítettek. A GSEA eredményeket egy dúsítási térkép alkalmazásával vizualizáltuk, amely a génkészleteket hasonlósági hálózatba rendezi. A csomópont, a kapcsolat és a csomópont színe a génkészletet, a taggének átfedését és a dúsítási pontszámot jelenti [24].

A TCR elemzések sokfélesége

Az RNA-Seq adatokat a MiXCR v3-ban használtuk.0.13 [15, 16] a szepszises betegek klonotípusainak számszerűsítésére egy korábban közölt protokoll alapján [14]. A VDJTools v 1.2.1 [26] szoftvert használták a komplementaritást meghatározó régió -3 (CDR3) számának és a minta sokféleségének kiszámítására a kvantitatív klonotípusok megszerzése után.

statisztikai elemzések

A normalitás ellenőrzésére Kolmogorov–Smirnov tesztet használtunk, és azt találtuk, hogy több változó eloszlása, beleértve a lélegeztetőgép napját, az intenzív osztályon való tartózkodás időtartamát és a kórházi tartózkodás időtartamát, balra ferde volt. Az adatok egységes formátumban való bemutatása érdekében a kategorikus változók gyakoriságát (százalékát) a kategorikus változókra és a folytonos változókra mediánként (interkvartilis tartomány, IQR) mutattuk be. A két csoport közötti különbségeket a Mann–Whitney U teszttel elemeztük a folytonos változókra és a Fisher-féle egzakt tesztet a kategorikus változókra. A szignifikancia szintje 0.05 volt, és a statisztikai elemzések kétoldalúak voltak. Az összes adatelemzés elvégzéséhez az R 4.1.0-s verzióját használtuk.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Eredmények A betegek jellemzői és a SOFA pontszámok

Ebbe a vizsgálatba 37 szepszisben szenvedő idős beteget vontunk be [átlagéletkor 83 év (IQR: 79–87 év)] (1. táblázat). A főkomponens-analízis során megfigyeltük, hogy a -1 nap és a -8 nap közötti eltérés jobb volt a reagáló betegeknél (válaszadó csoport, R), mint a nem reagáló betegeknél (nem reagáló csoport, NR). jelzi a szepszisből való szabályozott felépülést az immunkompetens csoportban (1. további fájl: S1. ábra). Összességében a 37 beteg között 23 reagáló beteg (válaszadó csoport, R) volt, átlagos életkoruk 82 év (IQR: 79,5–86,5 év), és 14 nem reagáló beteg (nem reagáló csoport, NR). medián életkor 84 év (IQR: 79-88 év). Az 1. táblázat a vizsgált csoport alapvető jellemzőit mutatja be. Magasabb albumint (medián 3,3 mg/dl, IQR: 3-3,7 mg/dl) és alacsonyabb C-reaktív proteint (medián 9,16 mg/dl, IQR: 3,9-17,5 mg/dl) figyeltek meg a kezelés során, mint társaiknál. A reagáló csoporthoz képest a nem reagáló csoportban szignifikánsan magasabb volt a SOFA pontszám a 7. napon, hosszabb volt a lélegeztetőgépes nap, hosszabb volt az intenzív osztályon való tartózkodás, és magasabb volt a kórházi mortalitás.

Különleges dinamikus transzkriptom szepszisben szenvedő idős intenzív osztályos betegeknél

Amint az 1A. ábrán látható, az összes mintából származó 500 legfontosabb variábilis gén főkomponens-analízisével felfedeztük, hogy az intenzív osztályon lévő idős szepszises betegek transzkriptumjai jelentősen eltértek az 1. és a 8. napon. A differenciális expressziós gének ( DEG-eket) azonosították a génexpressziós profilok 8. és 1. nap közötti összehasonlításával idős intenzív osztályos betegeknél a p kritériumok alapján.<0.01 and log fold change>0.25 vagy<− 0.25. Tree DEGs (two upregulated and one downregulated gene) were found in the R group, while the NR group only had 11 DEGs (five upregulated and six downregulated genes). We found that in elderly sepsis patients in the ICU, the top upregulated genes were innate immunity- and inflammation-relevant genes, namely, ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33, and PCSK9, which bind to low-density lipoprotein receptors (LDLRs), leading to LDLR degradation and increasing LDL cholesterol levels (Fig. 1B). 

A dinamikus transzkriptom DAVID-dúsítási elemzése

Annak bemutatására, hogy idős intenzív osztályos betegek biológiai útvonalai megváltoztak a 8. és az 1. nap között, bemutattuk a dúsított útvonalat az online DAVID v6.8 szerver segítségével. Amint a 2. ábrán látható, a génontológiai (GO) buborékdiagramokat az adatkészlet legjobb 20 DEG-jének biológiai folyamataira állítottuk össze. Azt találtuk, hogy a szepszisben szenvedő idős intenzív osztályos betegek DEG-jei gazdagodtak a transzkripció, az adaptív immunválasz, az immunglobulintermelés, a transzkripció negatív szabályozása és az immunválasz szabályozásában. A DAVID funkcionális GO analízisét a 3. ábra mutatja be. A kontrollokkal összehasonlítva a DEG-ekben lévő gének által kódolt fehérjék funkcionális annotációi szignifikánsan (P<0.05) increased or decreased enrichment. These annotations were categorized according to biological processes, cellular components, and molecular functions. There were significant differences between DEG-encoded proteins involved in the regulation of transcription, the immune response, protein phosphorylation, and Ras protein signal transduction at the level of biological processes (Fig. 3), whereas cellular component analysis revealed significant differences between the T-cell receptor complex, cytosol nucleoplasm, and nucleus (Fig. 3). Significant differences were found in the enrichment of encoded proteins associated with protein binding, metal ion binding, translation factor activity, or transcriptional activator activity according to molecular function analysis (Fig. 3). Ten, we used the Cytoscape ClueGO plugin to investigate the functional enrichment of the DEGs in the dataset to further refine the biological process from the analysis of DAVID-GO terms [27]. Additionally, the REACTOME pathway analysis from ClueGO revealed that cytokine signaling in the immune system, adaptive immune system, sensory perception, innate immune system, and immunoregulatory interactions between lymphoid and non-lymphoid cells were significantly enriched in many DEGs.

1. táblázat Szepszisben szenvedő idős intenzív osztályos betegek jellemzői

1. ábra A főkomponens-elemzés A és a B vulkándiagram a transzkriptom -1 és -8 nap között

2. ábra Differenciálisan expresszált gének funkcionális és útvonaldúsítási analízise DAVID-dal buborékdiagram segítségével

3. ábra A biológiai folyamat (BP), sejtkomponens (CC) és molekuláris funkció (MF) DAVID funkcionális génontológiai (GO) elemzése

TCR elemzések MiXCR-rel szepszisben szenvedő idős intenzív osztályos betegeknél

Tekintettel arra, hogy az R és NR csoportok egy specifikus T-sejt receptor jelátviteli útvonalon, az egyedi CDR3, D50 és az inverz Simpson-index felhasználásával gyógyultak fel a szepszisből, MiXCR-t használtunk a T-sejt receptor (TCR) diverzitásának meghatározására. ) (5A–C. ábra). A 8. napon az R csoport CDR3-, D50- és inverz Simpson-indexe szignifikánsan magasabb volt, mint az 1. napon. Ezenkívül a D50-index szignifikánsan magasabb volt az R-csoportban, mint az NR-csoportban a 8. napon (5B. ábra). Végül felmértük az egyedi CDR3 sokféleségét az inverz Simpson-index segítségével, amely bőséges klonotípusokat tükröz. Hasonló mintázatot figyeltünk meg, a TCR szignifikánsan megnövekedett diverzitásával az R csoportban, különösen a 8. napon (5C. ábra).

Vita

Ez a tanulmány bemutatja, hogy a mortalitás szempontjából releváns biológiai jellemzők és az adaptív immunitáshoz kapcsolódó jelátvitel transzkriptomika segítségével, összehasonlítva az 1. és a 8. nap közötti különbségeket (1. további fájl: S1 ábra), megbízhatóan azonosíthatják a szepszisben szenvedő idős intenzív osztályos betegeket, és megkülönböztethetik a nem reagáló betegeket a reagálótól. . A szepszis biomarkereit vizsgáló korábbi tanulmányok az ismert biológiai funkciók és útvonalak tudásalapú módszerekkel történő kiválasztásától függtek [28], és csak néhány tanulmány célzott közvetlenül olyan géneket, amelyek funkcióját nem írták le teljesen [29]. Ebben a tanulmányban az RNA-Seq-et alkalmaztuk a biológiai és immunológiai jellemzők azonosítására szepszisben szenvedő idős intenzív osztályos betegeknél főkomponens-analízis, differenciális génexpresszió-elemzés és MiXCR segítségével. A veleszületett immunitás és gyulladások, mint például a ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 és PCSK9, fokozottan szabályozottak szepszisben szenvedő idős intenzív osztályos betegeknél. A ZDHHC19 egy palmitoil-transzferáz, és az RRAS palmitoilezését közvetíti, ami a sejtek életképességének növekedéséhez vezet [30]. Az egész genomra kiterjedő génexpressziós analízist összefüggésbe hozták a székletperitonitis által okozott szepszisben szenvedő intenzív osztályos betegek fokozott expressziójával [31]. A HDC (hisztidin-dekarboxiláz, HDC) a II. csoportba tartozó dekarboxiláz család tagja, és homodimert képez, amely piridoxál-foszfátot használ az L-hisztidint hisztaminná alakítására. Egy állatkísérlet, amelyet Hattori és munkatársai végeztek. [32] HDC-gén-knockout (HDC−/−) egereket használt. A szepszis vakbélkötéssel és punkcióval (CLP) történő előidézése után a HDC-knockout egerek csökkent plazma hisztaminszintet mutattak, és a TNF-, IL-1b-, IL-6- és MCP1-szintek szepszisben való növekedése mérséklődött, ha plazmahiány volt. hisztamin [32]. A szepszis által kiváltott abnormális citokintermelés és a több szerv (tüdő, máj és vese) sérülése szignifikánsan csökkent a HDC-knockout egerekben a WT C57BL/6 J egerekhez képest. A HDC expresszió gátlása megakadályozta a gyulladásos szövetsérülést és javította a túlélést a CLP által kiváltott szepszisben szenvedő egerekben [32]. Ezenkívül a hisztamin elősegítheti a proinflammatorikus citokinek termelését, amelyeket az NF‐κB transzkripciós faktor szabályoz. CLP-indukált szepszis alatt a HDC-knockout egerek szignifikánsan csökkentette az NF‐κB aktivitását a sejtmagban a WT egerekhez képest [32]. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a hisztamin az NF-kB aktivitás növelésével indukálja a proinflammatorikus citokinek és kemokinek szintézisét.

A legújabb kutatások kimutatták, hogy az ALOX15 és az FCER1A kulcsfontosságúak a bakteriális szepszis patogenezisében [33, 34]. Az ALOX15, egy lipidperoxidáló enzim, egy funkcionális lipoxigenáz (LOX) gén [35], amely többszörösen telítetlen zsírsavakat oxidál, és számos fiziológiai folyamathoz, valamint neurodegeneratív, gyulladásos és hiperproliferatív betegségek patogeneziséhez kapcsolódik [35, 36]. Az ALOX15 és metabolitjai több gyulladásos betegség, például szepszis, ízületi gyulladás, asztma, cisztás fibrózis és atherosclerosis patofiziológiájában is szerepet játszanak [36]. Az FCER1A (az IgE receptor Ia Fc fragmentuma, FCER1A), egy immunrendszerrel rokon fehérje, az allergiás reakciók kiváltó faktora, és szerepet játszik az allergiás gyulladásban [37, 38]. Az FCER1A korábbi vizsgálatokban szerepet játszott az anyagcsere-folyamatok szabályozásában és az immunszabályozásban. [38, 39]. Ezenkívül az asztma nagyobb valószínűséggel fordul elő, ha az FCER1B és más immunglobulinokkal kapcsolatos gyulladásos gének kölcsönhatásba lépnek [39]. Ezenkívül a PCSK9-et (protein konvertáz szubtilizin/kexin típusú- 9, PCSK9) a plazma LDL-C-szintjének központi szabályozójaként azonosították, mivel képes kötődni az LDL-receptorhoz (LDLR), és kiváltja azt a sejtekben a lizoszómális lebomláshoz. , ami az LDLR lebomlásához és az LDL koleszterinszint emelkedéséhez vezet [40].

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Jelen tanulmányban KEGG-dúsítást és GO-t használtunk e gének funkcionális annotációjának meghatározására annak érdekében, hogy megvizsgáljuk a szepszisben szenvedő idős intenzív osztályos betegek kifejezett DEG-jeit BP-ben, MF-ben és az FH molekuláris útvonalaiban. Ezek a DEG-ek elsősorban a transzkripció szabályozásában, az adaptív immunválaszban, az immunglobulintermelésben, a transzkripció negatív szabályozásában és az immunválasz szabályozásában gazdagodtak (2. ábra). A GO/pathway kifejezések funkcionálisan elrendezett hálózatát építettük fel a ClueGO/CluePedia Cytoscape beépülő modul segítségével, amely a biológiai kifejezések továbbfejlesztett értelmezése. Ez a bővítmény segített abban is, hogy megjelenítsük azokat a hálózatokat, amelyek funkcionálisan nagyobb génklaszterekből vannak csoportosítva [41]. A ClueGO beépülő modul segítségével azonosítottuk a differenciálisan szabályozott molekuláris útvonalakat és azok jelentős génkölcsönhatásait p-értékek és kappastatisztikák alapján, hogy átfogó képet kapjunk a szepszisben szerepet játszó DEG-ekről. Ezenkívül a DEG-ek transzkripciós aktivitásában és fehérjekötésében jelentősen feldúsultak, amikor a GO-ból származó MF-et elemezték (3. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a funkcionális dúsítási elemzések különösen a patogén motívumokra vagy citokinekre adott sejtválaszhoz kapcsolódó immunitási sejt jelátviteli útvonalakra vonatkoznak. Ezek valószínűleg várt eredmények szeptikus betegeknél, és további vizsgálatokra van szükség a szepszis útjainak tisztázásához. A kappastatisztikák és p-értékek alapján megállapítottuk, hogy a feldúsult biológiai folyamatok és molekuláris útvonalak közül az immunrendszerben a citokin jelátvitel, az adaptív immunrendszer, a szenzoros észlelés, a veleszületett immunrendszer, valamint a limfoid és nem limfoid sejtek közötti immunregulációs kölcsönhatások. sejtek szabályozatlanok voltak, és szignifikánsan összefüggtek a szepszis progressziójával szepszisben szenvedő idős intenzív osztályos betegeknél (4. ábra).

Ezenkívül kimutattuk a T-sejtek diverzitását idős szepszisben szenvedő betegeknél, és MiXCR-t használtunk az RNS-Seq nyers szekvenciájának elemzésére, hogy meghatározzuk a TCR-ek klonotípusait, ami lehetővé tette a TCR-ek és a teljes transzkriptom diverzitásának egyidejű vizsgálatát. 15]. Ebben a vizsgálatban az RNA-Seq-et és a MiXCR-t használtuk a T-sejt-jelátvitel azonosítására, és az eredmények azt mutatták, hogy az R csoport TCR-diverzitása a -8 napon nagyobb volt, mint a -1 napon (5. ábra). . Az NR csoporthoz képest az R csoport szignifikánsan magasabb CDR3, D50 és inverz Simpson-index értékeket mutatott a -8 napon, mint a -1 napon. A TCR-ek indukált diverzitásának jelentőségét a szepszisben szenvedő idős, intenzív osztályon szenvedő betegeknél ez a bizonyíték is rávilágít, amely igazolja az RNA-Seq és MiXCR adatok felhasználásának életképességét a TCR-ek sokféleségének kezelésére szepszisben szenvedő betegeknél. Tanulmányunknak van néhány korlátja, amelyeket figyelembe kell venni. Először is, a vizsgálatban vizsgált betegek csoportja kicsi volt. Ennélfogva a különböző populációk nagyobb mintaméretű vizsgálata segítene adataink megerősítésében. Másodszor, ebben a tanulmányban az ömlesztett RNS-Seq-et használtuk, és a jövőbeni sc-RNS-Seq és funkcionális kísérletek indokoltak a sejtszintű validáláshoz. Ezenkívül a cDNS-végek 5' gyors amplifikációja (5'-RACE) megközelítés használható a T-sejt repertoár vizsgálatára, ami tovább erősítheti megállapításainkat. Harmadszor, RNA-Seq adatok felhasználásával értékeltük a gyulladásos válaszok biológiai és molekuláris funkcióit szepszisben szenvedő betegeknél. További funkcionális vizsgálatok szükségesek a szepszisben betöltött szerepek tisztázásához.

4. ábra A génontológia (GO) kifejezések gazdagítása a Cytoscape ClueGO/CluePedia bővítményével lett megjelenítve

5. ábra A T-sejt receptor diverzitása a(z) -1 napon és a napon-8. Az inverz Simpson-index értékei (A), egyedi CDR3 (B), D50 és (C). *<0.05, **<0.005

Következtetések

A szepszis incidenciája és mortalitása egyaránt magas az idősek körében. Vizsgálatunkba szepszisben szenvedő, kritikus állapotú idős egyéneket vontunk be, és az RNS-Seq adatok alapján funkcionális útvonal- és MiXCR-elemzésekkel azonosították a mortalitás szempontjából releváns biológiai jellemzőket és transzkriptomikus jellemzőket. Az 1. nappal összehasonlítva a 8. napon fokozottan szabályozott veleszületett immunitást és megnövekedett T-sejt-diverzitást tapasztaltunk a reagáló betegek között, ami azt jelzi, hogy a reagáló betegek jobban szabályozták a szepszisből való felépülést, mint a nem reagáló betegek. A pontos és korai előrejelzés megvalósítása érdekében az RNA-Seq teszt alkalmazása további kiegészítő információkat kínálhat a kezelési eredmények korai előrejelzéséhez.

Hivatkozások

1. Seymour CW, Kennedy JN, Wang S, Chang CH, Elliott CF, Xu Z és társai. A szepszis új klinikai fenotípusainak vakációja, validálása és lehetséges kezelési hatásai. JAMA. 2019;321(20):2003–17.

2. Sweeney TE, Azad TD, Donato M, Haynes WA, Perumal TM, Henao R és munkatársai. A bakteriális szepszis transzkriptomikájának felügyelet nélküli elemzése több adathalmazban három robusztus klasztert tár fel. Crit Care Med. 2018;46(6):915–25.

3. de Lange DW, Brinkman S, Flaatten H, Boumendil A, Morandi A, Andersen FH és mások. Az intenzív osztályra felvett 80 évnél idősebb betegek mortalitását előrejelző kumulatív prognosztikai pontszám. J Am Geriatr Soc. 2019;67(6):1263–7.

4. Flaatten H, de Lange DW, Artigas A, Bin D, Moreno R, Christensen S és mások. Az intenzív terápiás gyógyszerkutatás státusza és az intenzív osztályon lévő nagyon idős betegek jövőbeli napirendje. Intenzív Terápia Med. 2017;43(9):1319–28.

5. Guidet B, de Lange DW, Boumendil A, Leaver S, Watson X, Boulanger C és mások. A törékenység, a megismerés, a mindennapi élet aktivitása és a társbetegségek hozzájárulása a 80 év feletti akut betegek kimeneteléhez az európai intenzív osztályokon: a VIP2 tanulmány. Intenzív Terápia Med. 2020;46(1):57–69.

6. Stahl EC, Barna BN. Sejtterápiás stratégiák az immunogén-tudomány leküzdésére. Organogenezis. 2015;11(4):159–72.

7. Martin S, Perez A, Aldecoa C. Szepszis és immunszenszcencia idős betegeknél: áttekintés. Front Med (Lausanne). 2017. https://doi.org/10. 3389/fmed.2017.00020.

8. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D és mások. Antigén-specifikus adaptív immunitás a SARS-CoV-2 ellen akut COVID-19 esetén, valamint összefüggések az életkorral és a betegség súlyosságával. Sejt. 2020;183(4):996-1012 e1019.

9. Leblanc G, Boumendil A, Guidet B. Tíz dolog, amit tudni kell a kritikus állapotú idős betegekről. Intenzív Terápia Med. 2017;43(2):217–9.

10. Guidet B, Vallet H, Boddaert J, de Lange DW, Morandi A, Leblanc G és munkatársai. A 80 év feletti, kritikus állapotú betegek gondozása: narratív áttekintés. Ann Intenzív terápia. 2018;8(1):114.

11. Brady J, Horie S, Lafey JG. Az adaptív immunválasz szerepe szepszisben. Intenzív Terápia Med Exp. 2020;8(1):20.

12. Martin MD, Badovinac alelnök, Grifth TS. CD4 T-sejtes válaszok és a szepszis által kiváltott immunparalízis állapota. Front Immunol. 2020. https://doi.org/10. 3389/fmmu.2020.01364.

13. Barcella M, Bollen Pinto B, Braga D, D'Avila F, Tagliaferri F, Cazalis MA és társai. A szeptikus sokkos betegek szervi működésének javulásához kapcsolódó transzkriptomprofil azonosítása korai szupportív terápia után. Crit Care. 2018;22(1):312.

14. Cheng PL, Chen HH, Jiang YH, Hsiao TH, Wang CY, Wu CL és mások. Az RNA-Seq használata szepszisben szenvedő, immunhiányos betegek immunanyagcsere jellemzőinek vizsgálatára. Front Med (Lausanne). 2021. https://doi. org/10.3389/fmed.2021.747263.

15. Bolotin DA, Poslavsky S, Mitrophanov I, Shugay M, Mamedov IZ, Putintseva EV, et al. MiXCR: szoftver átfogó adaptív immunitásprofilkészítéshez. Nat Methods. 2015;12(5):380–1.

16. Bolotin DA, Poslavsky S, Davydov AN, Frenkel FE, Fanchi L, Zolotareva OI és munkatársai. Antigénreceptor repertoár-profilozás RNS-seq adatokból. Nat Biotechnol. 2017;35(10):908–11.

17. Vincent JL, de Mendonca A, Cantraine F, Moreno R, Takala J, Suter PM és mások. A SOFA pontszám használata a szervi diszfunkció/elégtelenség incidenciájának felmérésére az intenzív osztályokon: egy többközpontú, prospektív tanulmány eredményei. Az Európai Intenzív Terápiás Orvostudományi Társaság "szepszissel kapcsolatos problémákkal" foglalkozó munkacsoportja. Crit Care Med. 1998;26(11):1793–800.

18. Garcia-Gigorro R, Saez-de la Fuente I, Marin Mateos H, Andres-Esteban EM, Sanchez-Izquierdo JA, Montejo-Gonzalez JC. A SOFA és a Delta-SOFA pontszámok hasznossága a kritikus állapotú betegek kimenetelének előrejelzésére a sürgősségi osztályon. Eur J Emerg Med. 2018;25(6):387–93.

19. Jones AE, Trzeciak S, Kline JA. A szekvenciális szervi elégtelenség értékelési pontszáma a súlyos szepszisben szenvedő betegek kimenetelének előrejelzéséhez és a hypoperfúzió bizonyítékaihoz a sürgősségi osztály bemutatásakor. Crit Care Med. 2009;37(5):1649–54.

20. Kim D, Langmead B, Salzberg SL. HISAT: gyors illesztésű igazító alacsony memóriaigénnyel. Nat Methods. 2015;12(4):357–60.

21. Anders S, Huber W. Differenciális expressziós elemzés szekvenciaszámlálási adatokhoz. Genome Biol. 2010;11(10):R106.

22. Liao Y, Smyth GK, Shi W. FeatureCounts: hatékony általános célú program szekvenciaolvasás genomi jellemzőihez rendelésére. Bioinformat ics. 2014;30(7):923–30.

23. Raudvere U, Kolberg L, Kuzmin I, Arak T, Adler P, Peterson H, et al. g: Profiler: webszerver funkcionális dúsítási elemzéshez és génlisták konvertálásához (2019-es frissítés). Nucleic Acids Res. 2019; 47 (W1): W191–8.

24. Merico D, Isserlin R, Stueker O, Emili A, Bader GD. Dúsítási térkép: hálózatalapú módszer a génkészlet-dúsítás vizualizálására és interpredációjára. PLoS ONE. 2010;5(11):e13984.

25. Shannon P, Markiel A, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D és mások. Cytoscape: szoftverkörnyezet biomolekuláris interakciós hálózatok integrált modelljéhez. Genome Res. 2003;13(11):2498–504.

26. Andersen ES. DNS és RNS struktúrák előrejelzése és tervezése. N Biotechnol. 2010;27(3):184–93.

27. Le Gall JR, Lemeshow S, Saulnier F. Egy új egyszerűsített akut fiziológiai pontszám (SAPS II) egy európai/észak-amerikai multicentrikus vizsgálat alapján. JAMA. 1993;270(24):2957–63.

28. Sutherland A, Thomas M, Brandon RA, Brandon RB, Lipman J, Tang B és mások. Új molekuláris biomarker diagnosztikai teszt kidolgozása és validálása a szepszis korai kimutatására. Crit Care. 2011;15(3):R149.

29. Lukaszewski RA, Jones HE, Gersuk VH, Russell P, Simpson A, Brealey D és mások. A posztoperatív fertőzés és szepszis tünetmentes diagnózisa génexpressziós aláírások segítségével. Intenzív Terápia Med. 2022. https://doi. org/10.1007/s00134-022-06769-z.

30. Niu J, Sun Y, Chen B, Zheng B, Jarugumili GK, Walker SR és mások. A zsírsavak és a rákkal amplifikált ZDHHC19 elősegítik a STAT3 aktiválását az S-palmitoiláción keresztül. Természet. 2019;573(7772):139–43.

31. Burnham KL, Davenport EE, Radhakrishnan J, Humburg P, Gordon AC, Hutton P és munkatársai. A széklet hashártyagyulladásra és tüdőgyulladásra adott szepszis transzkriptomikus válasz közös és különálló aspektusai. Am J Respir Crit Care Med. 2017;196(3):328–39.

32. Hattori M, Yamazaki M, Ohashi W, Tanaka S, Hattori K, Todoroki K és társai. Az endogén hisztamin kritikus szerepe a végszervi szövetkárosodás elősegítésében szepszisben. Intenzív Terápia Med Exp. 2016;4(1):36.

33. Reyes M, Filbin MR, Bhattacharyya RP, Billman K, Eisenhaure T, Hung DT és társai. A bakteriális szepszis immunsejtek jele. Nat Med. 2020;26(3):333–40.

34. Tang-Huau TL, Gueguen P, Goudot C, Durand M, Bohec M, Baulande S és mások. Humán in vivo generált monocita eredetű dendritikus sejtek és makrofágok keresztezi az antigéneket vakuoláris úton. Nat Commun. 2018;9(1):2570.

35. Ivanov I, Kuhn H, Heydeck D. Az arachidonsav 15-lipoxigenáz-1 (ALOX15) szerkezeti és funkcionális biológiája. Gén. 2015;573(1):1–32.

36. Singh NK, Rao GN. A 12/15-lipoxigenáz (ALOX15) növekvő szerepe az emberi patológiákban. Prog Lipid Res. 2019;73:28–45.

37. Baioumy SA, Esawy MM, Shabana MA. A keringő FCepsilonRIa felmérése krónikus spontán csalánkiütéses betegekben és összefüggése a klinikai és immunológiai változókkal. Immunbiológia. 2018;223(12):807–11.

38. Liao EC, Chang CY, Hsieh CW, Yu SJ, Yin SC, Tsai JJ. Az IgE által közvetített allergiás betegségek genetikai markereinek feltáró kísérleti vizsgálata FcepsilonR1alpha és Cepsilon expressziójával. Int J Mol Sci. 2015;16(5):9504–19.

39. Hua L, Zuo XB, Bao YX, Liu QH, Li JY, Lv J és mások. Négy lókuszos génkölcsönhatás az IL13, IL4, FCER1B és ADRB2 között kínai Han gyermekek asztmájában. Pediatr Pulmonol. 2016;51(4):364–71.

40. Kosenko T, Golder M, Leblond G, Weng W, Lagace TA. Az alacsony sűrűségű lipoprotein a humán plazmában a proprotein konvertáz szubtilizin/kexin típusú-9 (PCSK9)-hez kötődik, és gátolja a PCSK9- által közvetített kis sűrűségű lipoprotein receptor lebomlását. J Biol Chem. 2013;288(12):8279–88.

41. Bindea G, Mlecnik B, Hackl H, Charoentong P, Tosolini M, Kirilovsky A és mások. ClueGO: Cytoscape beépülő modul a funkcionálisan csoportosított génontológia és útvonal-annotációs hálózatok megfejtésére. Bioinformatika. 2009;25(8):1091–3.