Egy új homozigóta KLHL3 mutáció az autoszomális recesszív pszeudohipoaldoszteronizmus okozójaként, késői életkorban diagnosztizáltak Ⅱ
Nov 02, 2023
Eredmények
Esetleírás
Az alanyt, egy török származású nőt, 58 éves korában utalták be a Düsseldorfi Egyetemi Kórház Nephrológiai Osztályának ambulanciájára tartós hyperkalaemia miatt (először 47 évesen diagnosztizálták), IV-es típusú vese tubuláris acidózis gyanúja miatt. krónikus vesebetegség (CKD) jelenléte (G3a A2, KDIGO), a bal vese májzsugorodása, nephrolithiasis 17 éves korban műtéti kőeltávolítással, visszatérő húgyúti fertőzések és magas vérnyomás (először 41 évesen diagnosztizálták). évek). Korábbi kórtörténete szignifikáns volt a szívkoszorúér-betegség szempontjából: 47 éves korában nem ST szegmens elevációt követő myocardialis infarktus, többszörös stent beültetés és ST-elevációs szívinfarktus 5 hónappal a beutalás előtt. A második szívinfarktus után a szérum káliumszintje 7,3 mmol/l-re emelkedett, és súlyos izomfájdalmak jelentkeztek. A beteg paroxizmális pitvarfibrillációról, hiperkoleszterinémiáról és kontrasztanyag-allergiáról is beszámolt. A gyógyszerek a következők voltak: bisoprolol 2,5 mg bid, kalcium-polisztirol-szulfonát 15 g bid, nátrium-hidrogén-karbonát 3 g tid, fenprokumon, atorvasztatin 40 mg qd, aszpirin 100 mg qd, pantoprazol 40 mg qd, L-thyroxin 2, 5 mg clogpidqrel . A sztatinterápia ideiglenes abbahagyása nem csökkentette az izomfájdalmat. Az általa kezelt AT1-receptor antagonista kezelés abbahagyása, valamint az alacsony káliumtartalmú étrend nem vezetett a hyperkalaemia javulásához.
A családtörténet jelentős volt a szülői rokonság (I. fokú unokatestvérek), mindkét szülő magas vérnyomása, a hatvanas évei elején anyja halálos agyvérzése és apja koszorúér-betegsége szempontjából. Bátyja tisztázatlan eredetű vesebetegségben halt meg Törökországban az 50-es éveiben (az 1a. ábrán látható).
Az értékelés időpontjában a vérnyomás 148/87 Hgmm, a pulzusa pedig 60/perc volt. A klinikai vizsgálat nem volt figyelemreméltó, az alsó végtagok enyhe ödémája, többszörös hematóma és striae distensae kivételével.
KATTINTSON IDE A CISTANCHE VESE SZÁMÁRA TÖRTÉNŐ GYÓGYNÖVÉNYI KÉSZÍTMÉNYÉHEZ KAPCSOLATBAN
A laboratóriumi vizsgálat hyperkalaemiát (szérum kálium 5,3 mmol/L [normál 3,6-4,8]), normál szérum nátriumot (139 mmol/L, normál 135-145), hyperchloraemiát (107 mmol/L, normál 95) mutatott –105), hypomagnesemia 0,55 mmol/l-nél (normál 0,73-1.{17}}), emelkedett szérum kreatininszint 1,18 mg/dl-nél (normál)<0.90) with an estimated glomerular filtration rate of 51 mL/min (CKD-EPI [40], normal 90–140), elevated urea of 47 mg/dL (normal 21– 43), suppressed renin concentration (<1.0 pg/mL [normal 1.7–23.9]), and aldosterone of 157 pg/mL (normal 12–236). Serum calcium and phosphate were normal (2.31 mmol/L [normal 2.10–2.42] and 0.95 mmol/L [normal 0.84–1.45], respectively). Venous blood gas analysis revealed pH 7.33 (normal 7.35–7.43), standard bicarbonate 19.8 mmol/L (normal 24–30), and standard base excess −5.3 mmol/L (normal −2 to +3). Spot urinary potassium was low (6.5 mmol/L [normal 10–200]), whereas spot urinary calcium was normal (0.36 mmol/L); urinary creatinine was 24.2 mg/dL. There was no detectable albuminuria or proteinuria.
A vese ultrahangja kis jobb vesét mutatott ki (8,5 cm hosszú), vékony, inhomogén parenchymával, hegesedés gyanújával és 12- mm-es jól körülhatárolható kerek cisztával. A bal vese normál méretű (10 cm hosszú), normál parenchyma vastagságú, 22- mm-es jól definiált kerek ciszta és bonyolult 12- mm-es, jól körülhatárolható kerek ciszta, feltételezett septummal. . Nem volt bizonyíték a hidronephrosisra.
A nem megfelelően alacsony vizelet káliumkiválasztással járó hyperkalaemiás metabolikus acidózis jelenléte, amely nem magyarázható önmagában CKD-vel, alacsony reninszintű hypertonia aldoszteronnal, amely nem volt megfelelően alacsony a hyperkalaemiához, és a szülői rokonság arra késztetett bennünket, hogy fontolóra vegyük a PHA II-t. A napi 25 mg hidroklorotiaziddal történő kezelés megkezdése a szérum káliumszintjének 4,2 mmol/l-re történő csökkenéséhez vezetett 1 héten belül, és a vérnyomás normalizálódott. A kalcium-polisztirol-szulfonátot és a nátrium-hidrogén-karbonátot gyorsan leállították. A hidroklorotiazid napi 12,5 mg-ra történő ideiglenes csökkentése a hyperkalaemiás acidózis újbóli megjelenéséhez vezetett. Hiponatrémia hidroklorotiazid-terápia után fordult elő, és sóban gazdag étrend hatására megszűnt. Két hónappal a klinikánkon tett első látogatás után az eredetileg bejelentett izomfájdalmak megszűntek. Az enyhe fájdalom, amelyet eltérő jellegűnek írtak le, a sztatinkezelésnek tulajdonították enyhe CK jelenlétében (153 U/L, normál<145) and LDH (250 U/L, normal <147) elevation. A review of prior therapy for hypertension revealed a regimen of valsartan plus hydrochlorothiazide (12.5 mg) prior to myocardial infarction, after which hydrochlorothiazide had been discontinued, apparently unmasking electrolyte abnormalities and causing muscle pain.
Genetikai elemzés
A PHA II klinikai gyanúja miatt a KLHL3, CUL3, WNK1 és WNK4 gének PCR és Sanger szekvenálását végeztük el (lásd Módszerek). A WNK1, WNK4 és CUL3 gének változatait nem azonosították. Azonban egy homozigóta chr5:g.136973013 G > A (GRCh37) variánst azonosítottak a KLHL3 génben, ami egy p.Arg431Trp missense mutációt (NP_059111.2) eredményezett, amelyet a PolyPhen valószínűleg károsítónak jósolt [41]. , a SIFT [42] által káros, a MutationTaster [43] által pedig betegséget okoz (az 1b. ábrán látható). Ez a változat egyszer heterozigóta állapotban van jelen a gnomAD 251 436 allélja között (allélgyakoriság 4 × 10-6) [44], és egyszer heterozigóta állapotban 21 366 allél között az ALFA Projectben (www.ncbi.nlm. nih.gov/ snp/docs/gsr/alfa/; allélgyakoriság 5 × 10-5). A dbSNP-ben rs769995865 néven szerepel, és a ClinVarban nem jelentették. Az emberi 431-es pozícióban lévő arginin teljesen megőrződött 100 gerinces között (http://genome.ucsc. edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=hg19&g=multiz100way, a ló kivételével szekvencia nem áll rendelkezésre), a C. intestinalis (vázas zsákállat), a D. melanogaster (gyümölcslégy) és a C. elegans (féregféreg) (az 1c. ábrán látható). A 41 paralóg fehérje közül 17-ben az arginin konzervált, és egyik paralóg sem mutat triptofánt ebben a pozícióban (online ellátás. 1. ábra). A homozigóta variáns megtalálása a rokonság hátterében, az általános populációban előforduló ritkaság és az érintett maradék evolúciós konzerválása arra késztetett bennünket, hogy a KLHL3 p.Arg431Trp mutációt a betegség okozóinak jelölteként tekintsük. A változat a 3. Kelch-szerű ismétlésben található (az 1d. ábrán látható). Korábban egyetlen egyedben leírtak egy homozigóta p.Arg431Gln variánst az azonos csoportnál [12] (1. táblázat).
Szerkezeti elemzés
A Kelch-domén (a 2a. ábrán látható) hat "propellerlapátból" áll, amelyeket lapátok közötti hidrogénkötések stabilizálnak [45]. A Kelch-domén felszíni mutációival végzett korábbi szimulációs vizsgálatok a WNK4 peptiddel való kölcsönhatás csökkenését mutatták ki, de a Kelch-WNK4 kötődést a fehérje magjában lévő mutációk csekély mértékben zavarták [46]. Itt egyensúlyi molekuladinamikai szimulációkat használtunk az R431W magmutáció szerkezeti és dinamikus következményeinek meghatározására. Az R431W a harmadik (K3) és a negyedik (K4) légcsavarlapátok közötti interfészen helyezkedik el, közvetlenül a WNK{12}}kötőhely alatt (a 2a. ábrán látható). Az R431W és WT szimulációk közötti átlagos négyzetes fluktuációk különbségének kiszámítása (a fehérjeszerkezet variancia mértéke) reprodukálhatóan igazolta, hogy a mutáció által okozott fehérjedinamikai zavar az egész fehérjében továbbterjed, a K3-nál erősen megnövekedett szerkezeti dinamikával. K4 interfész és a környező K3–K5 régió, de csökkent a dinamika a távolabbi helyeken is (lásd a 2b. ábrát). A globális RMSD számítások a mutáns szerkezeti instabilitásának enyhe növekedését mutatták az 1.1-µs szimulációk során – a K3–K4 interfész (425–465. maradékok) és a WNK4-kötőhely fókuszált RMSD számításai (339., 355., 360., 386., 402., 407., 432., 449., 451., 481., 498., 528. és 577. aminosavak), ami az R431W mutáns harmadlagos szerkezetének megsértésére utal (lásd: 2c, F. lent).
A K3 (425–441. maradékok) és K4 (442–465. maradékok) pengék közötti kölcsönhatás további számszerűsítéséhez kiszámítottuk a hidrogénkötések (h-kötések) számát és a két csoport közötti COM távolságot. A WT interfész átlagosan héttel több hbondot tart fenn, mint az R431W mutánsban. Maga az R431 csak 4–5 h-kötésben vesz részt – ami a K3–K4 h-kötések ~27%-át teszi ki –, ami azt jelzi, hogy az R431W mutáció a teljes interfészt megzavarja (2d., e. ábra). Ezenkívül az R431W mutáns megnövekedett COM-távolságot mutat a két aldomain között (lásd a 2d. ábrát), ami megerősíti a h-kötés elemzést.
A mutáció WNK4 kötődésre gyakorolt hatásának felmérésére kiszámítottuk a kötőzseb elektrosztatikáját az 1.1-µs szimuláció során. Az R431W mutáció mérsékelt változást indukál a kötőzseb elektrosztatikájában a negatív feszültségek felé (lásd a 2d. ábrát). Bár szerény, a csökkent pozitív potenciál a kötési zsebben hátrányosan befolyásolná a negatív töltésű WNK4 savas motívum társítását.
Funkcionális elemzés
A KLHL3 p.Arg431Trp patofiziológiájának további tanulmányozása érdekében a pTRE2hyg vektorban 3x FLAG-címkézett humán WNK4-et, a pFN21A vektorban pedig Halo-címkézett humán KLHL3-at kódoló plazmidokat kaptunk [47]. Helyirányított mutagenezissel bevittük a p.Arg431Trp mutációt a WT KLHL3 plazmidba, és heterológ módon expresszáltuk a megfelelő plazmidokat COS7 sejtekben. Amikor WT-t és mutáns KLHL3-at WT WNK4-gyel együtt expresszáltak, az anti-Halotag primer antitestekkel végzett Western-blotok WT KLHL3 sávokat mutattak ki. Két független KLHL3 p.Arg431Trp klón ismételt transzfekciója azonban kezdetben nem eredményezett kimutatható sávokat (a relatív intenzitás -aktin expresszióval normalizálva, 0,761 ± 0,144 a WT-ben vs. {{25) }}.0{{3{{40}}}9 ± 0.002 in p.Arg431Trp, p < { {60}}.0001, t=12.81). A WNK4 anti-FLAG Western blottal meghatározott expressziós szintjei szignifikánsan magasabbak voltak a KLHL3 p.Arg431Trp-t együtt expresszáló sejtekben, mint a WT KLHL3-at együtt expresszáló sejtekben (a relatív intenzitás -aktin expresszióval normalizálva, 0,721 ± 0,137 WT-vel vs. 0,967 ± 0,315 Trp és 0,967 Trp , p=0.005, t=3.546). Minden értéket átlag ± SEM-ként adtunk meg, és az összehasonlítást egy kétoldali aránypáros t-próbával végeztük el, df=11 (a 3a., b. ábrán látható). Annak megállapítására, hogy a KLHL3 p.Arg431Trp kisebb mennyiségben expresszálódott-e, növekvő mennyiségű (0, 0,5, 1, 2, 4 és 8 µg) WT és mutáns plazmidokat transzfektáltunk. 8 µg-mal megnövekedett letalitást figyeltünk meg (az adatokat nem mutatjuk be), de 4 µg-os mutáns plazmid expressziójával gyenge sávot tudtunk kimutatni a várt méret mellett (figyeljük meg a hosszabb expozíciós időt a WT-hez képest, a 3c. ábrán látható). Annak felmérésére, hogy a csökkent fehérjestabilitás okozhat-e csökkentett expressziós szintet a mutáns fehérjében, cikloheximid-chase vizsgálatokat végeztünk. A KLHL3 p.Arg431Trp gyorsabban lebomlott, mint a WT (3d. ábra).
3. ábra: WNK4-gyel és üres vektorral, WT-vel vagy p.Arg431Trp (R431W) KLHL3-mal transzfektált sejtlizátumok reprezentatív Western-blotja. b Box és whisker diagramok (Tukey) 12 kísérlet eredményeinek mennyiségi meghatározásával, mindegyik plazmid két független klónjának felhasználásával. **, p=0.0046; ****, p < 0,0001 (kétfarkú aránypáros t tesztek). c Növekvő mennyiségű WT-vel vagy R431W KLHL3-mal transzfektált sejtlizátumok reprezentatív Western-blotja. Vegye figyelembe a WT és az R431W eltérő expozíciós idejét. Az alsó és felső HaloTag-pozitív sáv a KLHL3 monomert és dimert tükrözheti. d Reprezentatív Western blot sejtek 2 µg WT-vel vagy 4 µg R431W KLHL3 plazmiddal transzfektált, cikloheximiddel kezelt és a jelzett időpontokban lizált sejtekről. Vegye figyelembe a különböző expozíciós időket. 2 biológiai ismétlés analízise 2 technikai ismétléssel a mutáns fehérje csökkent stabilitását mutatja, béta-aktinra normalizálva és 0 óra időpontban (átlag ± SD). 12 óra elteltével lényegesen kevesebb R431W van jelen, mint a WT fehérje (Mann-Whitney teszt, *, p=0.029).
Megbeszélés/Következtetés
58 éves korában az itt jelentett pácienst később diagnosztizálták, mint bármelyik korábban bejelentett recesszív KLHL3 mutációt. A szakirodalomban közölt legidősebb beteget 56 évesen diagnosztizálták [15]. Retrospektív módon azonban a hypertonia és a hyperkalaemia már több éve jelen volt betegünknél. A PHA II-vel kapcsolatos jellegzetes hyperkalaemiás metabolikus acidózist valószínűleg egy tiazid diuretikum beadása takarta el. A hidroklorotiazid szívizominfarktus utáni abbahagyása volt az izomfájdalommal és magas vérnyomással összefüggő masszív hyperkalaemiás acidózis valószínű oka, amely végül a PHA II diagnózisához vezetett. Ezért azt javasoljuk, hogy a vesefunkcióhoz nem megfelelő hyperkalaemiás metabolikus acidózis jelenléte szuppresszált reninnel kombinálva még 5 0 évesnél idősebb betegeknél is felveti a PHA II gyanúját. A PHA II diagnózisát bonyolíthatják a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszert befolyásoló, már meglévő vérnyomáscsökkentő gyógyszerekkel végzett kezelés hatásai, és tévesen emelkedett vagy alacsony renin- és/vagy aldoszteron-értékekhez vezethetnek [48, 49]. A normál glomeruláris filtrációs ráta ellenére kialakult hyperkalaemiát gyakran a PHA II jellegzetességeként írják le [6]. Bár ez jellemző lehet gyermekekre, felnőtteknél, mint például az itt közölt betegnél, a régóta fennálló magas vérnyomás, nephrolithiasis és visszatérő húgyúti fertőzések károsodott veseműködéshez vezethetnek, amint arról korábban egy heterozigóta mutációval rendelkező betegnél beszámoltunk [14]. PHA II-ben [50] leírták a betegünkhöz hasonlóan a nephrolithiasist, de ez nem gyakori lelet. Érdekes módon a vizelet kalcium: kreatinin aránya nem emelkedett betegünkben (0,17 ill.<0.06 mmol/mmol creatinine, respectively), contrary to observations in large kindred with the WNK4 mutation and average urinary calcium of 0.85 ± 0.27 mmol/mmol creatinine [51]. Severe target-organ damage in our patient, including myocardial infarctions and CKD, emphasizes the need for early diagnosis and adequate therapy of PHA II, although hypertension and target-organ damage in our patient's parents may also point to a genetic risk independent of the homozygous PHA II mutation. To prevent delayed diagnosis, after more common causes, such as primary aldosteronism, have been excluded, genetic testing for Mendelian forms of hypertension should be considered by practitioners when patients present with low-renin hypertension in the presence of hormonal and/or electrolyte abnormalities.
A beteg családjából származó minták nem álltak rendelkezésre elemzéshez; a rokonság hátterében azonban nagy valószínűséggel mindkét szülő heterozigóta hordozója volt a p.Arg431Trp mutációnak. A beteg elhunyt testvéréről nem álltak rendelkezésre részletes információk. Elképzelhető, hogy ő is PHA II-ben szenvedett, ami CKD-t eredményezett, amely végül végzetes lett.
Lehetséges, hogy a páciensünkben megfigyelt p.Arg431Trp mutáció megakadályozza a Kelch domén feltekeredését, összhangban a mutált domén csökkent szerkezeti stabilitásával, amelyet szimulációink során figyeltünk meg, ahol az oldallánc szubsztitúció beépült a már feltekeredő fehérjébe. Ennek megfelelően a Western blot analízis a p.Arg431Trp KLHL3 szignifikánsan csökkent expressziós szintjét mutatta (a 3a-c ábrákon látható). A cikloheximid (a fehérje bioszintézis gátlója) chase vizsgálata a p.Arg431Trp KLHL3 csökkent fehérjestabilitását mutatta ki (lásd a 3d. ábrát), hasonlóan a p.Ser410Leu variáns korábbi megfigyeléseihez [52]. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a p.Arg431Trp mutáció elsődleges következménye a fehérje feltekeredett állapotának destabilizálása, míg a hajtogatott KLHL3 és a WNK4 közötti kölcsönhatások csökkenése legfeljebb másodlagos hatás. Mindenesetre a KLHL3 alacsonyabb szintje csökkenti a WNK ubiquitinilációját, ami nagyobb WNK4 abundanciát eredményez (a 3. ábrán látható), és arra következtetnek, hogy magasabb NCCT foszforilációt, valamint alacsonyabb káliumszekréciót okoz a ROMK-n keresztül, megmagyarázva a mögöttes patofiziológiát.
Köszönetnyilvánítás
Köszönjük Dr. Shinichi Uchida-nak (Tokiói Orvosi és Fogorvosi Egyetem), hogy kedvesen biztosította a pTRE2hyg WNK4 és pFN21A KLHL3 plazmidokat, Iana Lukianovának a Western blot kísérletekhez nyújtott támogatást, és Gabriel Stöltingnek a hasznos megbeszélésekért.
Etikai nyilatkozat
A kutatási protokollt a Heinrich Heine Egyetem Düsseldorfi Orvostudományi Karának Etikai Bizottsága hagyta jóvá (4330-as vizsgálati szám), és a kutatás résztvevőjétől a Helsinki Nyilatkozattal összhangban írásos beleegyezést kaptak a kutatási tanulmány elkészítéséhez és az esetjelentés közzétételéhez. .
Összeférhetetlenségi nyilatkozat
Az AE, az NH, a BGH, a JPM és a TM nem jelentenek összeférhetetlenséget. Az LCR személyi díjakat kapott tanácsadásokért és felszólalási megbízásokért az Astellastól, a Baxtertől, a Bayer-Vitaltól, a Boehringertől, a Freseniustól, a Medtronictól, a Novartistól és a Recortól, amelyek nem vonatkoztak a lapra. Az UIS feltalálóként szerepel az US 10,696,739 és a 16/614,401 számú szabadalmakban, és nincs jelentősége a papírnak.
Finanszírozók
Ezt a tanulmányt a Ministerium für Kultur und Wissenschaft der Landes Nordrhein-Westfalen (Rückkehrprogramm), a Stiftung Charité (BIH_PRO_406) és a Német Kutatási Alapítvány (DFG, SCHO 1386/{) finanszírozta. {4}}; projekt-azonosító 431984000, CRC 1453), mind az UIS-nek. A Deutsche Forschungsge meinschaft (Német Kutatási Alapítvány) finanszírozta a JPM-nek (MA 7525/2- 1), a FOR 5046 kutatási egység részeként , P2 projekt), valamint az RWTH Aacheni Egyetem Orvostudományi Karán belüli Klinikai Kutatások Interdiszciplináris Központja (IZKF TN1- 3/IA532003) támogatásával. A szerzők hálásan köszönik a JARA-n keresztül biztosított számítási időt a Forschungszentrum Jülichben található JURECA szuperszámítógépen. A kézirat elkészítésében a finanszírozó szervezeteknek nem volt szerepük.
Hivatkozások
1 Együttműködés NCDRF. A vérnyomás világszerte tapasztalható trendjei 1975 és 2015 között: 1479 populációalapú mérési tanulmány összevont elemzése 19,1 millió résztvevővel. Gerely. 2017. január 7.;389(10064):37–55.
2 Oparil S, Acelajado MC, Bakris GL, Berlowitz DR, Cifkova R, Dominiczak AF, et al. Magas vérnyomás. Nat Rev Dis alapozók. 2018. március 22.;4: 18014.
3 Rimoldi SF, Scherrer U, Messerli FH. Másodlagos artériás hipertónia: mikor, kinek és hogyan kell szűrni? Eur Heart J. 2014 május;35(19): 1245–54.
4 Athimulam S, Lazik N, Bancos I. Low-renin hypertonia. Endocrinol Metab Clin North Am. 2019. december;48(4):701–15.
5 Bao M, Li P, Li Q, Chen H, Zhong Y, Li S et al. A monogén hipertónia genetikai szűrése hipertóniás egyénekben klinikai környezetben. J Med Genet. 2020. augusztus;57(8):571–80.
6 Healy JK. típusú pszeudohipoaldoszteronizmus: történelem, érvek, válaszok és még néhány kérdés. Magas vérnyomás. 2014. ápr.;63(4): 648–54.
7 Paver WK, Pauline GJ. Hipertónia és hyperpotassaemia vesebetegség nélkül fiatal férfiaknál. Med J Aust. 1964. augusztus 22.; 2:305–6.
8 Stokes GS, Gentle JL, Edwards KD, Stewart JH. Az idiopátiás hiperkalémia és a magas vérnyomás szindróma csökkent plazma renin aktivitással: a szérum káliumszint csökkentésének hatása a plazma reninre és az aldoszteronra. Med J Aust. 1968. december 7.;2(23):1050–4.
9 Arnold JE, Healy JK. A veseelégtelenség nélküli hiperkalémia, magas vérnyomás és szisztémás acidózis a káliumkiválasztás tubuláris hibájával jár. Am J Med. 1969. szept.;47(3): 461–72.
10 Gordon RD, Geddes RA, Pawsey CG, O'Halloran MW. A hipertónia és a súlyos hyperkalaemia a renin és az aldoszteron szuppressziójával jár együtt, és az étrendi nátrium korlátozással teljesen megfordul. Australas Ann Med. 1970. nov., 19(4):287–94.
A Wecistanche támogató szolgáltatása – Kína legnagyobb ciszterna exportőre:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel.:+86 15292862950
Vásároljon további specifikációkért:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
