Új stratégia a Cistanche Tubulosa aktív komponenseinek szűrésére spektrum-hatás kapcsolatelemzés és hálózati farmakológia alapján Ⅱ

3. Eredmények és megbeszélés

3.1. HPLC ujjlenyomatok

3.1.1. Módszer érvényesítése

A HPLC-módszer validálása azt mutatta, hogy a módszer pontosságára, reprodukálhatóságára és stabilitására vonatkozó relatív szórás (RSD) kisebb volt, mint 2,85 százalék a relatív csúcsterületre (n = 11) és 0,77 százalékra. a relatív retenciós időre (n = 11). Ugyanennek a mintaoldatnak a pontossága a 0.05–{{10}},77 százalék relatív időre és 0,28– 2,70 százalék a közös csúcsok relatív területére. A kísérlet reprodukálhatósága a 0.03–0,20 százalék a relatív időre, és 0,23–2,59 százalék a közös csúcsok relatív területére vonatkozóan. A minta stabilitása 0,09-0,24 százalék volt a relatív retenciós időre és 0,75-2,85 százalék a közös csúcsok relatív területére. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a megállapított ujjlenyomat teljesült. A genipozidsav lineáris összefüggései,echinakozid, akteozid, tubulozid A, ésizoakteozidaz S4 táblázatban láthatók. Az R négyzet értéke 1.0000 volt, ami jó linearitást jelez. A minta visszanyerésének eredményei azt mutatták, hogy a genipozidsav, echinakozid,akteozid, tubulozid A, ésizoakteozid100,37 százalék , 103,59 százalék , 98,46 százalék , 100,81 százalék és 101,19 százalék volt , és a minták visszanyerésére vonatkozó RSD kevesebb mint 2,68 százalék volt .

Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni a Cistanche aktív összetevőiről

3.1.2. Csúcsterület (PA) és relatív retenciós idő (RRT)

A 11 tétel C. tubulosa HM-ek, WE-k és HR-ek referencia-ujjlenyomatait és ujjlenyomatait a 2. ábra mutatja be. Tizenegy csúcsot, amelyek jó elválasztást és felbontást mutattak, közös csúcsként azonosítottak a HM-ek, WE-k és HR-ek között. Az öt standard vegyületet genipozidsavként (A2) azonosították,echinakozid(A8),akteozid (A9), tubulozidA (A10), ésizoakteozid(A11). A standard vegyület,echinakozid, amely minden kromatogramon jelen volt (átlagos retenciós idő 12.86 perc), megfelelő csúcsterülettel és jó stabilitással, referenciacsúcsként választottuk, és a másik tíz relatív retenciós idejének (RRT) kiszámításához használtuk. közös csúcsok. E különböző formák RRT-jei a 0.16–1.51 tartományba esnek. Ezen közös csúcsok PA-értékét és variancia-együtthatóját (CV százalék) az S5–S7 táblázat tartalmazza. Az adatokból a PA CV százalékértékei különböző formákban 25,78 százalék –142,02 százalék, 23,36 százalék –150,38 százalék, illetve 28,91 százalék –112,78 százalék a HM-ek, a WE-k és a HR-ek esetében. Ezek az eredmények jelentős különbségeket mutatnak mindegyikük koncentrációjábanCistanche tubulosaösszetett a különböző formák között. A HM-ek, WE-k és HR-ek ujjlenyomata a 3. ábrán látható.

2. ábra Standard minták HPLC ujjlenyomata

3.1.3. A HM-ek, a WE-k és a HR-ek tartalma

Öt szabványos összetevőjeC. tubulosamegmérték. A fő komponensek tartalmát az 1. táblázat mutatja. A HM-ek, WE-k és HR-ek összehasonlítását a 2. táblázat és a 4. ábra mutatja. A C. tubulosa-ban lévő PhG-k biológiailag aktívak, de hőérzékenyek. A vízben oldódó hőérzékeny komponensek ésszerű módszerrel hatékonyan kinyerhetők. Általában a Cistanche herbát vízzel extrahálják, majd koncentrált oldattá párolják be a következő kémiai elemzéshez [26, 27, 30]. Az extrakciót és besűrítést követően porlasztva szárítási technológiát alkalmaztunk, és az eljárást módosítottuk az előző cikkhez képest. A folyékony gőzből gyorsan eltávolították a vizet, majd növényi nyersanyagok száraz kivonatait kapták. Ebben a lépésben a maltodextrin hozzáadása általános hordozónak tekinthető a diszperzió fokozása és a tárolási idő meghosszabbítása érdekében. Egy sor gyártási folyamat során a gyógynövényeket adalékanyagokkal sajtolták granulátummá. A segédanyagok hozzáadásának ez a lépése nem szerepelt a kísérletben. Általánosságban elmondható, hogy a gyártási folyamatunk a 2.2. pontban leírtak szerint extrakciót, sűrítést és porlasztva szárítást foglal magában, párhuzamosan a granulátum előállítási eljárással. E félkész termékek előállításához a fenti három lépést kell követni. A WE-k képzési eljárása koncentrálást és porlasztva szárítást foglal magában, amelyek könnyen elveszítik a hőérzékeny komponenseket, de a HR-eket a HM-ek extrakciója és szárítása után kapják. Kíváncsiak vagyunk, hogy lehetséges-e, hogy aktív komponensek maradnak a HR-ekben. Eredményeink szerint a verbaszkozid tartalom jelentősen csökkent a HM-ről a WE-re és a HR-re (, illetve ). A verbaszkozid termikus stabilitását úgy vizsgáljuk, hogy a hevítési folyamat során HPLC-vel követjük a csúcsterület változásait. 4 órás melegítés után a verbaszkozid 41,6 százaléka marad vissza. Azt jelzi, hogy a verbaszkozid hőérzékeny [31]. Az izoakteozid, a tubulozid A és az echinakozid a WE-ben stabilak maradtak összetett feldolgozási eljárások után. A hosszú távú szárítási folyamat során a PhG-k felhalmozódása szignifikáns csökkenést mutatott, ami ezen hőérzékeny komponensek termikus lebomlásának tudható be [32]. A többi célkomponens tekintetében a HR-ek és a WE-k nem különböztek szignifikánsan a verbascoside kivételével. Ennek a különbségnek a megértése lehetővé teszi számunkra, hogy a jövőben jobb minőségi szabványokat dolgozzunk ki a növényi iszapokra, és termékké alakítsuk őket.

1. táblázat 11 tétel C. tubulosa tartalma

2. táblázat A fő összetevők tartalmának összehasonlítása (n = 11).

,

4. ábra Öt különböző formából származó komponens tartalommeghatározása (n = 11). , ns: nem jelentős.

3.1.4. Ujjlenyomat-hasonlósági elemzés

A három C. tubulosa csoport közötti hasonlóságokat értékeltük. A növényi anyag-víz kivonat, gyógynövény-anyag-gyógynövény-maradvány és vízkivonat-gyógynövény-maradék hasonlósági értékei a 0,943-0,994, 0,847-{ tartományban voltak. {9}}.995, illetve 0.938–1.000 (3. táblázat).

3. táblázat A HM-WE, HM-HR és WE-HR hasonlóságai 11 C. tubulosa tételnél.

3.2. Antioxidáns aktivitási tesztek eredményei

A C. tubulosa különböző formáinak antioxidáns aktivitását a DPPH, , és a befogóképesség-vizsgálatok segítségével határoztuk meg, a vonatkozó eredményeket pedig az 5. ábra mutatja be. Az S8. táblázatban a DPPH és a befogóképesség vizsgálati eredményeinek tartományai: { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 és 0,32–27,65 mg/ml a három különböző formánál a C. tubulosa 11 tétele között. Három antioxidáns aktivitási tesztben a HM-ek és a WE-k mutattak szoros gátló aktivitást, míg a HR-ek mutatták a leggyengébb gátlást.

Azt találták, hogy a porlasztva szárított WE-k alacsony koncentrációban is jelentős aktivitást mutatnak. Egy korábbi jelentés szerint a porlasztva szárított Vernonia amygdalina WE 0,17 mg/ml-nél 50 százalékos szaggatás-gátlást ért el [33]. A hosszú extrakciós idők és a magas hőmérséklet alkalmazása kétélű fegyver. Egyrészt az extrakciós idő és a porlasztva szárítás bemeneti hőmérsékletének növelése javítja a hozamot és a hatékonyságot. Ezenkívül a kivonatok erős antioxidáns aktivitást és magasabb koncentrációjú biológiai komponenseket érnek el, mint ezek a növények [34]. Másrészt a túlzottan meleg beáramló levegő lebontja a bioaktív vegyületeket. Az ilyen megnövekedett levegő bemeneti hőmérséklet az antioxidáns Bidens pilosa kivonat aktivitásának elvesztéséhez vezetett, és a fenolos vegyületek csökkenésének tulajdonítható [35]. A jelenlegi eredmények összhangban vannak a fent említett jelentéssel. Például az S6-ban a WE gyengébb gyökgátló képességet mutatott, mint mind a HM, mind a HR. Ezenkívül az S5-ben a HR erősebb DPPH- és szuperoxid-anion-megkötő képességet mutatott, mint a HM és a WE. A PhG-k szerkezete glikozidos kötésekből és acetilcsoportokból áll, amelyek enzimatikus hatás hatására könnyen hidrolizálódnak, vagy magas hőmérsékleten lebomlanak. Ezek a reakciók a nagyüzemi gyártás során egyes főkomponensek csökkenését okozhatják. Egyes komponensek hidrolízise vagy izomerizációja azonban felgyorsíthatja más komponensek szintézisét. Az ilyen átalakulások gyakoriak a Cistanches gyógynövények feldolgozásakor [36–38]. A PhG-k vízoldhatósága azt jelenti, hogy a legtöbb biológiai komponens vízkivonás útján hasznosítható. Évtizedek óta fennáll az az állítás, hogy az aktív komponensek többsége a WE-ben marad, így ésszerűnek tűnik feltételezni, hogy a nedves maradék anyagokat az extrakció után el lehet dobni. Helytelen azonban a C. tubulosa HR-eit hulladéknak tekinteni. A kutatók rámutatnak, hogy a PhG-k instabilak, és érzékenyek az enzimatikus vagy hidrolitikus lebomlásra [39]. Azok a hidrolízis vagy izomerizációs reakciók, amelyek hozzájárulnak a biológiai összetevők csökkenéséhez a fitogyógyászatban a feldolgozás során, egyúttal új lehetőségeket is kínálhatnak a HR-ek kiaknázására. A hagyományos extrakciós módszerek átalakításával a gyógyszermaradványok hatékonyabban fejleszthetők és hasznosíthatók. Enzimatikus hidrolízist végeztek, hogy a Panax ginseng maradékát monocukrokká alakítsák. A poliszacharidok és ginzenozidok, például a cukor, a borostyánkősav, a ginzeng poliszacharidok és a ginzenozidok hozama nőtt [40]. A Sophora flavescens maradványokat ultrahangos hullámokkal etil-acetáttal extraháljuk [41]. A gyógynövénymaradványok hasznosításának frissített technológiáit Huang et al. [42].

A PLSR és a BCA eredmények alapján a különböző formák felső öt csúcsát DPPH, szuperoxid anion és hidroxil gyökfogó assay segítségével szűrtük, hogy azonosítsuk a legfontosabb csúcsokat. Az eredményeket a Venn-diagram szemlélteti (7. ábra). Az A2, A6, A8 és A10 azok a közös csúcsok, amelyeken HM, WE és HR osztozik (7(a) és 7(c) ábra) a szuperoxid-anion- és hidroxilgyökfogó vizsgálatokban, míg a HM, WE és HR. A HR-ben nincsenek DPPH vizsgálati csúcsok. Eközben a BCA modellek azt mutatják, hogy az A1, A2, A3 és A6 a HM, a WE és a HR közös csúcsai (7(d)–7(f) ábra). Nevezetesen, a Venn-diagram átfedései azt jelzik, hogy a BCA modell alkalmasabbnak tűnik, mint a PLSR modell, az előbbi több ismétlést mutat. A BCA modell együtthatóit és az antioxidáns képesség IC50 értékeit RDA segítségével elemeztük. Ahogy a 8. ábrán látható RDA, a HM-ből és HR-ből származó A1, A3 és A6 pozitív kapcsolatban van az antioxidáns indexekkel, kivéve, hogy az A3 negatívan kapcsolódik a hidroxilgyökfogó képességhez. A WE-től származó A1 és A6 erős korrelációt mutat a DPPH-val és a szuperoxid-anionnal. A különböző formákból észlelt A6 csúcsok a DPPH-hoz, szuperoxid anionhoz és hidroxil gyökökhöz mutatják a legerősebb kapcsolatot. Az A1 és az A3 is hasonló kapcsolatot mutat.

7. ábra

A PLSR és a BCA modell Venn diagramja: (a) DPPH vizsgálat. (b) scavenging assay. (c) a scavenging assay-t a PLSR modellel elemeztük. (d) DPPH vizsgálat. (e) öblítési vizsgálat. (f) a scavenging assay-t a BCA modellel elemeztük. Az átfedő szakasz a HM, WE és HR közös csúcsszilánkja volt.

3.4. Hálózati farmakológiai alapú elemzés

3.4.1. CT hálózat kiépítése

A GeneCards adatbázisból és az OMIM adatbázisból összesen 4359, az antioxidáns aktivitással kapcsolatos célpontot nyertünk ki. Ezzel egy időben az aktív komponenseket a TCMSP adatbázisból és a SwissTargetPrediction adatbázisból szűrtük. Ezután 198 célpontot gyűjtöttek össze és szabványosítottak az UniPort adatbázison keresztül. Az aktív komponensek és az antioxidánsokkal kapcsolatos betegségek 159 célgént tartalmaztak (lásd az S1 ábrát). A CT-hálózatot a vegyületek és a kulcsfontosságú géncélpontok közötti összefüggés illusztrálására hoztuk létre (9. ábra).

9. ábra CT hálózat. A hálózat kimutatta az összefüggést az aktív komponensek és a kulcsfontosságú géncélpontok között.

3.4.2. A PPI hálózat kiépítése és a kulcsfontosságú célok átvilágítása

A PPI-t a STRING adatbázis segítségével vizualizáltuk (10. ábra). A hálózat 159 csomópontot és 2528 élt tartalmazott. A teljes interakciós hálózatban az összekötő komponensek vagy a több célponttal rendelkező csomópontok lehetnek a kulcsfontosságú komponensek vagy célgének, amelyek antioxidáns szerepet játszanak a C. tubulosa-ban. Az eredményeket letöltöttük és megjelenítettük a Cytoscape-ben. Minél magasabb a DC érték, annál sötétebb a szín, és minél nagyobb a kombinált pontszám, annál vastagabb az él. Azt találtuk, hogy a RAC-alfa szerin/treonin-protein kináz (AKT1), az interlukin-6 (IL6), a tumor nekrózis faktor (TNF) és a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor A (VEGFA) központi helyen helyezkednek el (11. ábra), jelezve, hogy kulcsfontosságú célpontok voltak, amikor az aktív összetevők antioxidáns hatást fejtettek ki. Beszámoltak arról, hogy az echinakozid csökkenti a mitokondriális diszfunkciót a mitogén által aktivált protein kinázok (MAPK) és az AKT, valamint ezek foszforilált formáinak szabályozása révén [43]. A kutatók azt feltételezték, hogy a C. tubulosa glikozidjainak antidiabetikus hatása a PhG-k antioxidáns aktivitásának köszönhető, mivel csökkenti a proinflammatorikus citokineket, mint például az IL{11}} és a TNF- [44]. Ezenkívül az echinakozid károsíthatja a petefészekrák sejtek növekedését azáltal, hogy csökkenti a VEGFA expresszióját, hogy gátolja az angiogenezist [45], ami szorosan összefügg a ROS rendszerrel, mivel a ROS indukálja a VEGF jelátvitel expresszióját [46].

10. ábra PPI hálózat.

3.4.3. Dúsítási elemzés és CTP hálózat létrehozása

A potenciális antioxidáns vegyületek számos biológiai funkcióra hatnak, köztük a BP-re, a CC-re és az MF-re. A 12(a) ábrán a legjobb 10 útvonal látható. A PPI hálózatból előre jelzett célpontok elsősorban számos biológiai folyamatra reagáltak, mint például szerves ciklikus vegyületekre, xenobiotikus ingerekre, szervetlen anyagokra, oxigénszintekre és a sejtkomponensek mozgásának pozitív szabályozására. A sejtkomponens analízis kimutatta, hogy a gének főként a membrán rafthoz, az extracelluláris mátrixhoz, a szekréciós szemcse lumenéhez, a transzkripciós szabályozó komplexhez és a sejt apikális részéhez kapcsolódnak. Ezek a célpontok számos molekuláris funkcióban is részt vesznek, beleértve a DNS-kötő transzkripciós faktor kötődést, a fehérje homodimerizációs aktivitást, a fehérje domén-specifikus kötődést és a citokin receptor kötődést.

12. ábra Dúsítási elemzés: (a) GO dúsítási elemzés. b) KEGG dúsítási elemzés.

E főbb csomópontok biológiai funkcióinak vizsgálatára útvonaldúsítási elemzést végeztek. A KEGG dúsítási eredményekből buborékdiagram készült, amely bemutatja a 20 legjobb útvonalat. Minél nagyobb volt a folt, annál több gén szerepelt az útvonalon. Amint a 12(b) ábrán látható, a C. tubulosa kulcsfontosságú útvonalai a rák, a lipid és az érelmeszesedés, az AGE-RAGE jelátviteli útvonalak a diabéteszes szövődmények, a kémiai karcinogenezis – a receptor aktiváció és a MAPK jelátviteli útvonalaihoz kapcsolódnak. Vizsgálták a C. tubulosa hatását az apoptózisra és a celluláris redox homeosztázisra. Az adatok arra utalnak, hogy a C. tubulosa ígéretes jelölt lehet a vastagbélrák elleni terápia számára [47]. A C. deserticola kivonat idős emberekben található [48].

A 13. ábra szemlélteti a korrelációt az útvonalak és a hozzájuk kapcsolódó célpontok között, valamint az átfedő célgének és a C. tubulosa biológiailag aktív komponensei közötti kapcsolatot. Elkészült a CTP hálózat globális képe, amely 12 összetevőből, 159 célpontból és 20 útvonalból állt. A legtöbb célpont azonos volt a hatóanyagjelöltekkel. Ezek a magas kapcsolódási fokú hatóanyagjelöltek voltak felelősek a CTP-hálózat magas összekapcsoltságáért, különösen a kvercetin (= 131 fok). A célpontok többségét, mint például az AKT1, IL6, TNF és VEGFA, a rákos megbetegedési útvonalakkal kapcsolatos KEGG útvonalakhoz társították.

13. ábra CTP hálózat.

4. Konklúziók

Ebben a tanulmányban elsősorban összetett helyzeteket vizsgáltunk, amikor figyelembe vesszük a HM, WE és HR spektrum-hatás összefüggéseit.C. tubulosa. A HPLC ujjlenyomatok ésantioxidáns vizsgálatokA H-k, WE-k és a HR-ek közötti különbségek azonosítására használtákC. tubulosa. A HPLC ujjlenyomatok szerint 11 csúcs volt gyakori a Hs, WE és HR 11 tételében. genipozidsav,echinakozid, verbascoside, tubulozid A, ésizoakteozide csúcsok között azonosították. Ennek az öt komponensnek a tartalmát meghatároztuk. Emellett az antioxidáns hatása aC. tubulosaA H-k, WE-k és HR-ek a kémiai összetételben a bonyolult gyártási körülmények miatt bekövetkezett változások miatt változtak. A változatos statisztikai modelleken alapuló spektrum-hatás összefüggés vizsgálat azt mutatta, hogy az A6 csúcs lehet a legmeghatározóbb komponens a három formája között.C. tubulosa. A tanulmány hálózati farmakológián alapult, hogy feltárja a lehetséges mechanizmusokatC. tubulosatovábbantioxidánsvegyületek szűrésével, a kulcsfontosságú célpontok előrejelzésével, hálózatok kiépítésével és dúsítási elemzések elvégzésével. Eredményeink elméleti alapot adnak a gyógynövénymaradványok újrahasznosításához és annak lehetőségéhezC. tubulosakezelésébenantioxidánsokkal összefüggő betegségek.