A BATF3 szerepe a Tu9 differenciálódásban és a T-sejt által vezérelt L-patológiákban MuCOsal (1. rész)

További információért kérem vegye fel a kapcsolatotdavid.wan@wecistanche.com

A T helper 9 (T,9) sejtek fontosak a gyulladásos és allergiás betegségek kialakulásában. A TH9 transzkripciós hálózat konvergálja a citokinekből és az antigénprezentációból származó jeleket, de nem teljesen ismert. Itt azonosítottuk a TL1A-t, a TNF szupercsalád tagját, mint az egér és a humán TH9 differenciálódás erős indukálóját.Mechanikusan, a TL1A indukálta a BATF és BATF3 transzkripciós faktorok expresszióját, és elősegítette a //9 promoterhez való kötődését, ami az I-9, BATF- és BATF3-hiányok fokozott szekréciójához vezet, károsította az IL{{6} } szekréció Tμ9 és Ty9-TL1A-polarizációs körülmények között. In vivo, T-sejt transzfer modell segítségével kimutattuk, hogy a TL1A elősegítette az IL-9-függő, T,9 sejt által kiváltott bél- és tüdőgyulladást. A semlegesítő IL-9 antitestek gyengítették a TL1A által vezérelt nyálkahártya-gyulladást. A Batf3-7T_9-TL1A sejtek csökkentett gyulladást éscitokin expresszióin vivo a WT sejtekhez képest. Eredményeink azt mutatják, hogy a TL1A elősegíti a T_9 sejtek differenciálódását és működését, és meghatározza a BATF3 szerepét a T-sejt-vezérelt nyálkahártya-gyulladásban.

Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni Cistanche-ról

BEVEZETÉS

A T helper (T-) sejtek speciális alcsoportjai szerves szerepet játszanak a szöveti homeosztázis fenntartásában és a gyulladásos betegségek kialakulásában a nyálkahártya felszínén. A TH9 sejteket a közelmúltban egy független T-sejt-alcsoportként azonosították, amely főként IL-9-t, de IL-10-ot és IL-21-t is termel. A 12 Tμ9 sejteket számos betegségben, köztük az allergiás tüdőben is szerepet játszanak. gyulladás, kísérleti autoimmunencephalomyelitis(EAE), vastagbélgyulladás, 3- A közelmúltban a TH9 sejtekben parazita féregfertőzések és rákos megbetegedések fordultak elő. a jelentések szerint szerepet játszik a gyulladásos bélbetegségekben (IBD).-9A colitis ulcerosa (UC) betegeknél emelkedett a nyálkahártya IL-9 plusz T-sejtje és az IL-9 receptor (IL) száma Az -9R) szabályozottabb a bélhámban. Az IL-9 hiánya gátolja az akut és krónikus betegségek kialakulásátoxazolon által kiváltott vastagbélgyulladás, az UC-t utánzó modell. A Crohn-betegségben (CD) szenvedő betegeknél a magas-8-10 szérum IL-9 szint a súlyos betegséggel korrelál.

1. ábra: A TL1A fokozza az egér és a humán TH9 sejtek differenciálódását. A naiv rágcsáló CD4 plusz T-sejteket Ty0-vagy T9-polarizációs körülmények között differenciáltuk TL1A-val vagy anélkül 3 napig, és ELJSA-analízissel ]L-9, IL{{9} } és IL{10}} szekréció. b Naiv humán CD4 T-sejteket (CD4'CD45RACD45ROCD25) izoláltunk egészséges donorok PBMC-jéből, és TH9-polarizációs körülmények között differenciáltunk TL1A-val vagy anélkül 3 napig. A humán IL{19}} szekréció ELISA-analízise 48 és 72 óra után. Box-whisker diagram, amely az IL-9-koncentrációt mutatja a tenyészet felülúszójában a TH9 és TH9-TL1A-val kezelt sejtek esetében. A négyzetek a mediánt, valamint a 25. és 75. percentilist, a whiskerek pedig az eloszlás minimális és maximális értékét jelölik. N=7-9. Az adatok a négyből egy független kísérlet átlagát ± SD-jét jelentik (független kísérletek. *p< 0.05,***p=""><0.005 determined="" by="" student's="">

A TH9 sejtek TGF- 1 és IL-4 jelenlétében különböznek a naiv CD4 plusz T sejtektől. A T-sejt receptor (TCR), TGF- 1 és IL-4 receptorok mögött számos transzkripciós faktor szükséges a TH9 sejtek differenciálódásához, ideértve az IRF4, STAT6, GATA3, PU.1, NF- kB, és az alapvető leucin cipzáros transzkripciós faktor, ATF-szerű (BATF.11-15 A Tμ9 sejtek differenciálódását elősegítő transzkripciós program és gyulladásos kiváltó okok azonban még mindig nem ismertek, és az lL{{-hoz köthető leszármazási faktor. 17}} kifejezés nem azonosítható.

A BATF transzkripciós faktorok családja a következőkből állBATF, BATF2, ésBATF3és az AP-1 transzkripciós faktorok családjába tartozik, amely magában foglalja a JUN-t és a FOS-t. A BATF családban a transzkripciós faktorok DNS-kötő doménből és leucin cipzár motívumból állnak, de nem rendelkeznek transzaktivációs doménnel, és kezdetben az AP-1 aktivitás negatív szabályozóiként írták le őket." A közelmúltban végzett vizsgálatok azonban kimutatták, hogy a BATF család tagjai kölcsönhatásba lépnek az IRF transzkripciós faktorokkal, beleértve az IRF4-et és az IRF8-at, és kötődnek az AP-1-IRF összetett elemszekvenciákhoz, hogy szabályozzák célgénjeiket T-sejtekben és dendritikus sejtekben. A BATF-re a Ty9 sejtek fejlődéséhez is szükség van mint TH2, TA17 és Try sejtek. A 15,19BATF3-ról leírták, hogy szabályozza a CD8a plus és CD103 plus dendritikus sejtek fejlődését. „2' A BATF-fel ellentétben a BATF3 nem redundáns funkcióját a Tu sejtek fejlődésében nem vizsgálták igazolták. Ezen túlmenően, még tisztázandók azok az extracelluláris ingerek, amelyek aktiválhatják a BATF3 útvonalat CD4 plusz Tu sejtekben.

2. ábra A TL1A felszabályozza a BATF és a BATF3 expresszióját a T,9 differenciálódás során. TH9 és TH9-TL1A sejtek transzkripciós profilozása RNS-szekvenálás segítségével. Az RNS-szekvenálási adatokat megjelenítő hőtérkép a 100 legnagyobb IQR-rel (interkvartilis tartomány) rendelkező gén használatával. A hőtérképtől balra és felett lévő dendrogramok a gének (sorok) és a minták (oszlopok) klaszterezését jelzik. b A naiv CD4 plusz T sejteket különböző TH alcsoportokba és Treg-ekbe differenciálták 3 napig. A relatív BATF mRNS expressziót PCR-rel elemeztük. A naiv CD4 plusz T sejtek differenciálódtak TH0- vagy TH9- polarizációs körülmények között, TL1A-val vagy anélkül a jelzett ideig. A relatív BATF mRNS expressziójának PCR analízise, ​​d BATF és IRF4 együttes festése (fent). A BATFIRF4 sejtek százalékos arányának kvantitatív elemzése (alul).e BATF és IL együttes festése-9. fg

TL1A. f IL-9 és BATF reprezentatív intracelluláris festődése 48 óra.g-nál.BATFfIL-9 plusz T-sejtekmegkülönböztetve Ty9 és T9-TL1A feltételek mellett. Az eszközök láthatók. Minden szimbólum egy adományozót jelöl. N=4. h A relatív Batf3 mRNS expressziót különböző egér Th alcsoportokban és Tregekben qPCR-rel elemeztük. A relatív Batf3 mRNS expressziót a megadott időpontokban. j A BATF3 és az IL reprezentatív együttes festődése-9. k GyakoriságaBATF3IL-9 plusz T-sejteka Ty9 és a TH9-TL1A feltételek között különböztetik meg. Az eszközök láthatók. Minden szimbólum egy egyedi kísérletet jelöl. N=3. Im Naive humán CD4 plusz T-sejtek differenciálódtak T,{6}}polarizációs körülmények között TL1A-val vagy anélkül. I Az IL-9 és a BATF3 reprezentatív intracelluláris festődése 48 óránál. m A BATF3L-9 plusz T-sejtek gyakorisága differenciált TH9 és TH9-TL1A körülmények között. Az eszközök láthatók. Minden szimbólum egy adományozót jelöl. N=4. Az adatok két (a) vagy legalább három (bd. i. k) független kísérletből egy független kísérlet átlagát ± SD-jét jelentik.*n<0.05. n=""><0.01.***n <="" 0.005="" as="" determined="" by="" student's="">

Nemrég kimutattuk, hogy a TL1A, a TNF szupercsalád tagja, amely fontos szerepet játszik az immunmediált betegségekben, beleértve az IBD-t, 25 indukálja az IL-9 szekrécióját a Tu17 sejtekben. "Továbbá egy nemrégiben megjelent publikáció kimutatta, hogy a TL1A a DR3 receptorán keresztül elősegíti a TA9 differenciálódásátIL-2-ésSTATISZT5-de PU.{0}} és STAT6-független mechanizmusok allergiás tüdőgyulladásban.2' A TL1A által indukált transzkripciós programok és a TL1A által indukált TH9 sejtek patogenitása bélgyulladásban és IBD-ben azonban továbbra is tisztázandó. tisztázott.

Itt bemutatjuk, hogy a TL1A egy új jelátviteli útvonalon keresztül elősegíti a humán és egér TH9 sejtek differenciálódását. A BATF3-at a Tp9 sejtek differenciálódásának új transzkripciós szabályozójaként határozzuk meg. A TL1A kromatin átalakuláshoz vezet az lI9 lókuszban, és az IRF4 és a BATF úttörő transzkripciós faktorok toborzásához vezet, amelyek fontos összetevői az IL-9 transzkripciós aktiválásának, valamint a BATF3-nak a 9 promóteren belüli konzervált régiókba. Ezenkívül a TL1A STAT6-függő módon fokozza a BATF és BATF3 expresszióját. BATF- és Batf3-hiányos T-9 és TL1A-indukált TH9(T-9-TL1A ) sejtek IL-9 termelése károsodott.TH9-TL1AA sejtek erősen gyulladást előidézőek in vivo, ha örökbe fogadják őket Ragi-7-egerekbe, ami nyilvánvaló a belek és a tüdő súlyos nyálkahártya-gyulladásából, amelyet a semlegesítő IL-9 antitestekkel végzett kezelés gyengített. A Batf3-/TH9-TL1A sejtek Rag1-7egerekbe való átadása jelentősen csökkenti a nyálkahártya gyulladását és a citokintermelést a WT TH9-TL1A sejtekhez képest. Adataink azt mutatják, hogy a TL1A és BATF3 új szerepet tölt be a patogén effektor T,9 sejtek fejlesztésében, és azonosítja ezt a jelátviteli útvonalat, mint potenciális terápiás célpontot a T_9- által vezérelt patológiákban, beleértve az IBD-t és az allergiás tüdőbetegséget.

EREDMÉNYEK

A TL1A fokozza a rágcsáló és humán Tμ9 sejtek differenciálódását in vitro A TL1A TH9 differenciálódásra gyakorolt ​​hatásának meghatározásához naiv CD4 T sejteket stimuláltunk TH9 körülmények között TL1A-val vagy anélkül. A TL1A jelentősen fokozta az IL-9 szekréciót és az I/9 mRNS expresszióját (1a. ábra, 1a. kiegészítő ábra). A TL1A önmagában nem indukált IL-9 szekréciót, ami arra utal, hogy a TL1A a TGF- 1 és IL-4 szinergikusan hat az IL-9 termelés elősegítésére. A T-9--asszociált citokinek L-10 és IL-13 szekrécióját és mRNS-expresszióját szintén fokozta a TL1A (1a. ábra, 1a, b kiegészítő ábra). A korábbi jelentésekkel összhangban az intracelluláris IL-9 festéssel végzett időbeli kísérletek tranziens IL-9 expressziót mutattak ki, amely maximális indukciót mutatott T-9 körülmények között a 3. napon, és a napon visszaesett az alapvonalra. 5 (kiegészítő 1b ábra). egy korai időpontban meghaladta a TH9 körülmények között kiváltott IL-9 termelés maximumát (1b. kiegészítő ábra). Megfigyeltük az IL-9 plusz IL-10 plusz sejtek növekedését is TL1A jelenlétében (1b. kiegészítő ábra). Nem figyeltünk meg elmozdulást más Tu-alcsoportok felé (1c. kiegészítő ábra). A TH9 differenciálódás fokozása a TL1A által teljes mértékben a DR3 receptorától függött (1d. kiegészítő ábra). Összességében ezek az adatok azt sugallják, hogy a TL1A szinergizál a TGF- 1-dal és az IL-4-vel a TA9 differenciálódásában és az IL-9 termelésben.

A TL1A emellett szignifikánsan fokozta a TH9 differenciálódását antigén-specifikus környezetben, OVA-specifikus OT-ll sejteket használva (kiegészítő 1e, f ábra). A TL1A nem befolyásolta a sejtproliferációt a TH9 differenciálódás során (1g. kiegészítő ábra), amint azt a memória CD4 plusz T sejtek esetében kimutatták. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a TL1A fokozta a TH9 differenciálódását anélkül, hogy befolyásolta volna a proliferációt. Ezenkívül megvizsgáltuk az IL-9 termelést azokban a sejtekben, amelyeket Ty9 és TH9-TL1A körülmények között 3 napig differenciáltunk, majd anti-CD3-mal/ újrastimulálunk. CD28. Megnövekedett IL-9 termelést figyeltünk meg a TH9-TL1A sejtekben a TH9 sejtekhez képest a másodlagos stimuláció után, amely tovább fokozódott TL1A jelenlétében (1h, i. kiegészítő ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a TL1A a differenciált TH9 sejtek IL-9 termelését is fokozta. Ezt követően meghatároztuk a TL1A hatását a humán Tu9 sejtek differenciálódására. A naiv CD4 plusz T sejteket egészséges donorok PBMC-jéből izoláltuk, és Tu9 körülmények között, jelenlétében stimuláltuk. Az egér TH9 sejtekből származó adatainkkal összhangban a TL1A hozzáadása jelentősen megnövelte az IL-9 szekréciót humán TH9 sejttenyészetekből (1b. ábra).

A TL1A indukálja a BATF és a BATF3 transzkripciós faktorok expresszióját A TL1A által indukált jelátviteli utak tisztázása érdekében RNS szekvenálást alkalmaztunk a TH9 és TH9-TL1A sejtek transzkriptomikus profiljának felmérésére. A TL1A nem változtatta meg lényegesen a TH9 transzkripciós profilját, ami azt jelzi, hogy a TL1A globálisan nem torzította el a TH9 differenciálódását (az adatokat nem mutatjuk be). Azonban 219 gén eltérően expresszálódott a TH9-TL1A sejtekben (2a. ábra, 1. és 2. kiegészítő táblázat). Az útvonal-dúsítási elemzés jelentős változásokat azonosított a citokin-citokin receptorban és a JAK-STAT jelátviteli útvonalakban részt vevő génekben T,9-TL1A körülmények között (1. és 2. kiegészítő táblázat, az adatok nem láthatók). A BATF3 és számos BATF által szabályozott gén szignifikánsan felszabályozott T,9-TL1A körülmények között (3. kiegészítő táblázat), ami arra utal, hogy a BATF3 és BATF transzkripciós faktorok részt vehetnek a TH9-TL1A sejtek differenciálódásában. A leírás szerint a BATF szükséges A Tp17 és TA9 sejtek fejlődésének meghatározásához.15, 31-34 -hogy a TL1A aktiválja-e a BATF család tagjait, először felmértük a BATF expressziós szintjét a különböző Tu alcsoportokban, és erős BATF mRNS expressziót észleltünk TH9 és TH2 sejtek (2b. ábra). A TL1A tovább fokozta a BATF expresszióját Tu9 körülmények között, különösen az 1. napon, amikor a TH9 körülmények önmagukban nem elegendőek a BATF mRNS indukálásához (2c. ábra). A TL1A önmagában hasonló mértékben indukálta a BATF mRNS-t, mint a Tp9 körülmények (2c. ábra). A BATF intracelluláris festése megerősítette, hogy a Ty9-TL1A stimuláció jelentősen növelte a BATF plusz sejtek százalékos arányát (2d. ábra). Ezenkívül a TL1A önmagában növelte a BATF plusz sejtek százalékos arányát, és ami még fontosabb, a BATF*IRF4 plusz sejtek százalékos arányát a TH9 állapotokhoz képest, ami arra utal, hogy a TL1A fokozhatja az IRF{53}}BATF kooperatív komplexek képződését (2d. ábra). A TH9-TL1A stimuláció növelte a BATF plusz IL-9 plusz sejtek százalékos arányát is (2e. ábra).

Ezenkívül a humán TH9 sejtekben szignifikánsan magasabb százalékban voltak IL-9-termelő sejtek, amikor TL1A-val stimulálták (2f. ábra, g). Nevezetesen, az IL-9-termelő sejtek többsége együtt expresszálta a BATF-et. A BATF és az IRF4 együttes festése azt mutatta, hogy a TL1A hozzáadása növelte a BATF*IRF4 plusz sejtek százalékos arányát a humán T{10}} differenciálódása során (az adatokat nem mutatjuk be), ami arra utal, hogy az IL-9 termelés fokozódik. a BATF jelátviteli útvonalon keresztül a TL1A konzervált egér és humán TH9 sejtek között. A BATF-fel szemben a BATF3 szerepe a TH-sejtek differenciálódásában kevésbé meghatározott. RNS-seq adataink megerősítése érdekében meghatároztuk a Batf3 expressziós szintjét T-9 sejtekben és más TH alcsoportokban, és azt találtuk, hogy a Batf3 mRNS expressziója a legmagasabb a T-9, T,1 és TH2 sejtekben. sejteket (2h. ábra). A TL1A javította a Batf3 kifejeződését T-9 körülmények között (2i. ábra). A BATF3 intracelluláris festése megerősítette, hogy a T,9-TL1A stimuláció szignifikánsan növelte a BATF3 plusz IL-9 plusz sejtek százalékos arányát (2j. ábra, k). Humán T9 sejtekben a TL1A szignifikánsan fokozta a BATF3 expresszióját plusz IL-9 plusz cellák (2l. ábra, m). A BATF-hez hasonlóan az IL-9-termelő sejtek többsége együtt expresszálta a BATF3-at.

3. ábra: A TL1A fokozza a BATE IRF4 és BATF3 kötődését a //9 promoterhez a Ty9 differenciálódás során, a, b A naiv egér CD4 plusz T sejtek differenciálódtak TH0- vagy Tμ9-polarizációs körülmények között. vagy TL1A nélkül 2 (BATF, IRF4 és AcH3), vagy 3 (BATF3) napig. ChP vizsgálatokat végeztünk a BATF, IRF4, BATF3 vagy AcH3 konzervált nem kódoló szekvenciákhoz (CNS) 1 (a) és CNS0 (b) //9. Az adatok egy független kísérlet átlagát ±SD jelentik két független kísérletből.*p<><>< 0.005="" as="" determined="" by="" student's="">

A BATF és a BATF3 kritikus transzkripciós faktorok a TL1A által kiváltott T_9 differenciálódásban

A BATF és a BATF3 szerepének további meghatározásához kromatin immunprecipitációs (ChIP) vizsgálatokat végeztünk, hogy meghatározzuk a kötődést két Il9 konzervált nem kódoló szekvenciánál (Il9 CNS1, CNSO).5 A TL1A önmagában szignifikánsan nagyobb BATF-kötődést indukált a II9 CNS1-hez, mint a TH9 körülmények között. és a TH9-TL1A tovább javította a BATF-kötést (3a. ábra). Az upstream I/9 központi idegrendszerben0 a TL1A szintén fokozta a BATF-kötést T,9 körülmények között, míg a TL1A önmagában nem volt hatással (3b. ábra). A TL1A megnövelte az IRF4 kötődést Ty9 körülmények között a CNS1-nél és a CNS-nél{22}}(3a, b ábra). Érdekes módon az acetilált hiszton 3(AcH3) kötődése a CNS1-hez és a CNSO-hoz, amelyről korábban leírták, hogy elősegíti a kromatin átépülését az Il9 lókuszban a TH9 differenciálódás során, szintén megnövekedett Ty9-TL1A körülmények között (3a, b ábra). A BATF3 kötődése a CNS1-hez a TH9 sejtekben felerősödött, és a kötődés tovább fokozódott TH9-TL1A körülmények között, míg a BATF3 nem kötődött a CNS0-hoz (3a. ábra, adatok nem láthatók). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a TL1A fokozza a BATF, BATF3 és IFR4 kötődését a //9 promoterhez TH9 körülmények között, hogy indukálja az 119 expressziót. A BATF és BATF3 szerepének megerősítése a TL1A-függő és Batf3-7-T-sejtekben. IL-9, IL-Ty9 differenciáció, Batf7- a 10-et használtunk, és az IL-13 termelés súlyosan károsodott a BATF-/-sejtekben Tμ9 körülmények között (4. ábra). 4a-d). A TL1A stimuláció azonban legalább részben felülmúlta a BATF-re vonatkozó követelményt az IL-9 és IL-13 termeléséhez a Ty9 differenciálódás során (4a, b, d ábra). BATF3 hiányában az IL-9 indukciója jelentősen csökkent, különösen Tμ9-TL1A körülmények között (4e, f ábra, 2a kiegészítő ábra). A BATF-fel ellentétben a BATF3-ra nem volt szükség a -10 vagy IL-13 kifejezéshez (4g, h ábra, 2b, c kiegészítő ábra). A TL1A jelenlétében a BATF és BATF3 felszabályozásához vezető jelátviteli útvonalak meghatározásához a Stat{ {79}}és p50-/cellák. A p50-/TH9 sejtekben csökkent a BATF plusz IRF4t sejtek százalékos aránya, és a BATF plusz IRF4 plusz sejtek százalékos arányának növekedése a TL1A stimuláció alatt szinte teljesen megszűnt (3a, b kiegészítő ábra). A BATF és Batf3 mRNS felszabályozása T.9 körülmények között p50-független volt, míg a BATF és Batf3 expresszió fokozódása TH9-TL1A körülmények között teljesen p50-függő volt (3c. kiegészítő ábra). , d). A Stat6-/T9 sejtekben csökkent a BATFIRF4 plusz sejtek százalékos aránya, és ezek növekedése a Tμ9-TL1A stimuláció hatására teljesen megszűnt (4a, b kiegészítő ábra). Hasonlóképpen, a BATF és a Batf3 mRNS felszabályozása teljes mértékben a STAT6-tól függött TH9 és TH{104}}TL1A körülmények között (4c, d kiegészítő ábra). Nem észleltük a BATF vagy a BATF3 hiányának szignifikáns hatását a Batf3 és BATF expressziójára, ami arra utal, hogy a két transzkripciós faktor között nincs kompenzáció (5. kiegészítő ábra). Ezek az adatok együttesen azt sugallják, hogy a BATF és a BATF3 fontos és különálló szerepet játszik a T_9 differenciálódás során a TL1A jelenlétében, és hogy a TL1A stimuláció hatására megnövekedett BATF és BATF3 expresszió a STAT6-tól és a kanonikus NF-KB útvonaltól függ. Ezután RNS-szekvenálást végeztünk WT- és Batf{117}}/-Tμ9-TL1A-sejteken. Összesen 139 gén expresszálódott eltérően a WT-ben a Batf3-7Ty{9-TL1A-sejtekkel szemben (4i. ábra, 4. kiegészítő táblázat). A génontológiai útvonal dúsítási elemzése jelentős változásokat azonosított a transzkripció, a sejtproliferáció és az intracelluláris jelátvitel szabályozásában részt vevő génekben (5. és 6. kiegészítő táblázat). Ezek az eredmények rávilágítanak a BATF3 szerepére a Ty9-TL1A sejtek differenciálódásában. A T-9-TL1A sejtek erősen patogén in vivo A TH9-TL1A sejtek patogén potenciáljának in vivo meghatározásához örökbefogadóan transzferáltunk ex vivo differenciált CD45.1 plusz Tμ9 vagy TA9-TL1A sejteket Rag1-'-egerekbe. Azoknál az egereknél, amelyek Ty9 sejteket kaptak, nem alakult ki jelentős súlycsökkenés (5a. ábra). Az egerek azonban, amelyek TH9-TL1A sejteket kaptak, lefogytak, és súlyosabb bélgyulladás alakult ki, különösen a vékonybélben (5a-c ábra). Súlyos tüdőgyulladást is megfigyeltünk, amelyet a gyulladásos sejtek peribronchiális és perivaszkuláris sejtinfiltrációja jellemez a TA9-TL1A recipienseknél. Az Alcian Blue periodic acid-Schiff-fel (AB-PAS) végzett festés a mucintermelő sejtek hiperproliferációját mutatta a Ty9-TL1A-recipiensek légúti epitéliumában (kiegészítő 6a, b ábra). Magasabb sejtszámot figyeltünk meg a lépben és a lamina propria mononukleáris sejtekben (LPMC), valamint a lép-, MLN- és LPMC CD4 plusz sejtek százalékos arányát és abszolút számát a TH9-TL1A-recipiensekben (5d. ábra, e), ami arra utal, hogy Ty 9-A TL1A sejtek nagyobb proliferációs potenciállal rendelkeznek in vivo. A Ki67-festés megerősítette, hogy a TH9-TL1A recipiensekből származó MLN-ből, lépből és LPMC-ből származó sejtek még 6 héttel a T-sejt-transzfer után is proliferatívabbak (5f. ábra). A TH9-TL1A recipiensekből származó anti-CD3/anti-CD28-restimulált MLN-sejtekben szignifikánsan magasabb IL-13 és IL-17 szekréciót figyeltek meg (5g. ábra), és szignifikánsan magasabb IL-9 és IL-13 szekréció a Ty9-TL1A-recipiensekből származó anti-CD3/anti-CD28-restimulált LPMC-ben (5h. ábra). Megfigyeltük a lép és MLN IL-9 plusz, IL{-13 plusz és IL-17 plusz sejtek abszolút számát, valamint magasabb MLN, lép és LPMC CCR6 plusz és CD103 plusz T-sejtek TH9-TL1A recipiensekben, ami összhangban van e sejtek szerepével a nyálkahártya felszínén (5i, j ábra). IL-9 szükséges a T#9-TL1A sejtek által kiváltott in vivo gyulladáshoz Annak vizsgálatához, hogy a TH9-TL1A sejtek fokozott IL-9 termelése hozzájárult-e a bél- és tüdőgyulladáshoz, a TH9-TL1A sejteket kapó egereket neutralizáló IL-9 vagy kontroll antitestekkel kezeltük a T-sejt transzfer kísérlet időtartama alatt. A kórszövettani analízis szignifikánsan csökkentette a bélgyulladást az anti-lL{207}}kezelt egerekben az izotípus kontrollokhoz képest (6a, b ábra). Az anti-lL{211}}kezelt egerekben mérséklődött tüdőgyulladást is megfigyeltünk, csökkent peribronchiális beszűrődéssel és csökkent nyálkát termelő sejtek számával (6c. kiegészítő ábra). Az összes sejtszám és az összes CD4tCD45.1 plusz T-sejt MLN-ben csökkent az anti-IL{217}}kezelt egerekben az izotípus kontrollokhoz képest (6c. ábra). Az anti-IL-9 kezelés szintén csökkentette az IL-13 és IL-17 termelődését az MLN-ben és a lépben, míg az IFN-y termelés nem változott (6d. ábra, adatok nem láthatók). Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a T-9-TL1A sejtek erős effektorsejtek voltak, és in vivo bél- és tüdőgyulladást okoztak, és hogy a patogén hatás IL-9-függő volt.

4. ábra BATF és BATF3 hiányosságok hatása a TH9 differenciálódásra. ad Batf7 vagy WT egerekből származó naiv CD4 T-sejteket TH0- vagy TH9-polarizációs körülmények között differenciáltunk TL1A-val vagy anélkül 3 napig. Az IL-9 és IL-10.b intracelluláris festése.b Az IL-9 termelés ELISA-analízise.c Az IL-10termelés ELISA-analízise.d Az IL{{14} ELISA-analízise } Termelés. eh Batf{17}}vagy WT egerekből származó naiv CD4 plus T-sejteket T,9-polarizációs körülmények között TL1A-val vagy anélkül 3 napig differenciáltunk. e Az IL-9 intracelluláris festése és az IL-10.f Az IL-9 termelés ELISA-analízise. g Az IL-10 termelésének ELSA-elemzése. h Az IL-13 termelés ELISA elemzése. I WT és Batf3′TH9-TL1A sejtek transzkripciós profilja RNS-szekvenálás segítségével. A p-vel eltérően expresszált gének RNS-szekvenálási adatait megjelenítő hőtérkép<0.01. the="" dendrograms="" to="" the="" left="" and="" above="" the="" heat="" map="" represent="" the="" clustering="" of="" genes="" (rows)="" and="" samples="" (columns).="" data="" represent="" means±="" sd="" of="" one="" independent="" experiment="" out="" of="" two="" (i)="" or="" three="" (a-h)="" independent=""><0.05,**p <="" 0.01,="" ***p=""><0.005 determined="" by="" student's="">

A BATF3 hozzájárul a TH9-TL1A sejtek által vezérelt in vivo gyulladáshoz Annak megállapítására, hogy a BATF3 szerepet játszik-e a Tu9- in vivo okozta patológiákban, örökbefogadóan átvittük az ex vivo differenciált WT-t vagy Batf-ot3- /-TA9-TL1A Rag1-/-egerekbe. Azok az egerek, amelyek Batf3-'-TA9-TL1A sejteket kaptak, szignifikánsan kevésbé fejlődnek ki a tüdőben (7a., b. ábra, 6e. kiegészítő ábra), és csökken a bélgyulladás iránya (Histoscore: 3,6 vs. 1,2) ( 7a. ábra). Csökkentett sejtszámot figyeltünk meg a tüdőben és az LPMC-ben, valamint alacsonyabb MLN és tüdő CD4 plusz T-sejtek százalékos arányát a Batf37′-TL1A recipienseknél a WT TH9-TL1A recipienseknél (7c. ábra, 6d. kiegészítő ábra). Szignifikáns módon alacsonyabb százalékos IL-13 plusz és IL-17 plusz sejteket figyeltek meg a Batf3'-Ty9-TL1A-recipiensek lépében, MLN-jében és tüdejében (2. ábra). 7d). Adataink összességében azt mutatják, hogy a BATF3 szerepet játszik az IL-9 termelésben és a T#9 kialakulásában in vitro, valamint a Tp9-TL1A által vezérelt nyálkahártya-gyulladásban in vivo.

6. ábra: IL-9 szükséges a Ty9-TL1A sejtek által kiváltott in vivo nyálkahártya-gyulladáshoz. T,9 vagy Ty9-TL1A sejteket injektáltunk Rgg1-7 egerekbe, és az egereket hetente háromszor kezeltük anti-IL-9 antitesttel vagy izotípus kontrollal. a duodenum, Scale bar;200 μm. b Szövettani pontszámok a bélben.c Teljes MLN-sejtszám (bal oldalon), CD45.1 plusz sejtek gyakorisága (középen) és CD45.1 plusz sejtek összsejtszáma (jobbra).d IL ELISA-elemzése{15} }, IL-17 és IL-13 termelése MLN-ből anti-CD3-mal és anti-CD28-cal végzett ex vivo újrastimuláció után. Az adatok két független kísérletből egy független kísérlet átlagát ± SD értékét jelentik. n=4-5/csoport.*o<><0.01, as="" determined="" by="" student's="" t-test="" (b)="" or="" mann-whitney="" u="" test="" (c,="">