A vizelet gyakori kilökődési modulja (uCRM) pontszáma a nem invazív vesetranszplantációs monitorozáshoz

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Absztrakt

Az allograft biopsziákban expresszált 11 génből álló Common Rejection Module (CRM) korábban arról számolt be, hogy biomarkerként szolgál az akut kilökődéshez (AR), korrelál a graft sérülésének mértékével, és előrejelzi a jövőbeli allograft károsodást. Ennek a génpanelnek a felhasználását vizsgáltuk vesetranszplantált betegek vizeletsejt-pelletén. A biopsziával megerősített akut kilökődésben, határvonali AR-ban (bAR), BK-vírus nephropathiában (BKVN) szenvedő betegek vizelet-sejtüledékeit gyűjtöttük, és normál protokoll biopsziával (STA) elemeztük a 11 gén expresszióját kvantitatív polimerázlánc segítségével. reakció (qPCR). Felmértük ennek a 11 CRM génnek a bőségét, az autokorrelációt és az egyéni expressziós szinteket. 10/11 gén expressziója magasabb volt AR-ban az STA-hoz képest. A Psmb9 és a Cxcl10 ugyanolyan pontosan osztályozhatja az AR-t a STA-val szemben, mint a 11-génmodell ( érzékenység=93,6 százalék ,specifitás=97,6 százalék ). Az expressziós szintek geometriai átlagán alapuló Au CRM pontszám nagy pontossággal (AUC= 0.9886) tudta megkülönböztetni az AR-t az STA-tól, és specifikusan korrelált a tubulitisz és az intersticiális gyulladás szövettani méréseivel, nem pedig a tubuláris atrófiával, glomerulosclerosissal, intimális proliferáció, tubuláris vakuolizáció vagy akut glomerulitis. Ez a vizelet génexpresszión alapuló pontszám lehetővé teheti az AR non-invazív és kvantitatív monitorozását.

A CSITANCHE HATÁSAI: GYULLADÁSGÁTLÓ

Bevezetés

A vesetranszplantáció (KTx) az előnyben részesített módszer a végstádiumú vesebetegség (ESRD) bármilyen okból történő kezelésére [1]. Míg ez a terápiás megközelítés világszerte rutin gyakorlattá vált, jelentősen javítva a betegek életminőségét és túlélését[2], a hosszú távú vese-allograft kimenetele nem javult a várt módon annak ellenére, hogy jobban megértették az allograft kilökődésének immunbiológiáját és az újdonságokat. és erősebb immunszuppresszív szerek [3]. A perzisztens és rossz graft túlélés fő oka az, hogy nem lehet nem invazív módon számszerűsíteni a graft immunkárosodásának terhét, és előre jelezni az akut kilökődést a jelentős funkcionális hanyatlás és a szövettani sérülés előtt. Valójában jól ismert, hogy a KTx-betegek folyamatosan ki vannak téve immun- és nem immunrendszeri eredetű sérüléseknek [4, 5], az időszakos KTx-monitorozás az allograft diszfunkció érzéketlen helyettesítő markereitől, például a szérum kreatininszinttől (6, Z) és a sporadikus KTx-monitoringtól függ. protokoll allograft biopsziákon alapul a szubklinikai szövettani graft sérülés kimutatására a szérum kreatininszint zavarása nélkül[8]. Bár a graft diszfunkciójának csak a szérum kreatinin alapján történő értékelése érzékeny a nem specifikus, megállapított allograft károsodásra, alacsony a specifitása az akut kilökődés (AR) diagnosztizálására, mivel a szérum kreatininszint emelkedése más, az allograft kilökődéssel nem közvetlenül összefüggő okok miatt következhet be, mint például az immunszuppresszív (IS) gyógyszerrel kapcsolatos nefrotoxicitás, akut tubuláris nekrózis, fertőzés valamint az intersticiális fibrózis és tubuláris atrófia (IFTA) Ezen túlmenően, bár a megfigyelő biopsziák használatát az arany standard eszköznek tekintik lograft elváltozások esetén ez a megközelítés költséges, invazív, az eljárás morbiditásával jár (vérzés veszélye; szedációt igénylő eljárás, különösen gyermekkori KTx-betegeknél)[9], tele van operátorok közötti leolvasási eltérésekkel, és gyakran rosszul reprezentálja a fokális szövettani sérülést, ezért olyan nem invazív biológiai markerek alkalmazása, amelyek pontosan előre jelezhetik és számszerűsíthetik a beteg terheit. az allograft immunsérülése jelentős előrelépést jelentene a precíziós KTx monitorozásban [10-12].

A proteomikus, RNS és mikroRNS biomarkerek lekérdezése KTx-betegek vizeletében csoportjaink és mások [13-17] bebizonyították, hogy optimális biológiai folyadék a vese allograft sorozatos monitorozására, mivel ez a vese allograft ultrafiltrátuma. vese, és tükrözi a vesegraftban található biológiai folyamatokat és gyulladásos terhelést [18]. Számos tanulmány ellenére, amelyek korábban a vizelet biomarkereit nem invazív diagnosztikai megközelítésként értékelték a vesetranszplantáció során előforduló AR elemzésére, kizárólag az egyedi biomarkerekre, például bizonyos kemokinekre és receptorokra, mint például a CXCR3, CXCL9 vagy CXCL10 [{{ 6}}] megnehezítik az AR molekuláris komplexitásának és heterogenitásának rögzítését a különböző KTx betegekben. Ennek a heterogenitásnak a megragadása elengedhetetlen a sérülések terhének számszerűsítéséhez olyan módon, amely felhasználható az AR prospektív monitorozására és a graftsérülés terápiás beavatkozás utáni felépülésére [25, 26].

Ebben a tanulmányban a 11 génből álló Common Rejection Mod-ule (CRM) [27] felhasználásából nyert ismereteket alkalmazzuk, amelyet eredetileg négy különböző típusú szilárd anyagból származó biopsziás minták nyilvánosan elérhető transzplantációs szöveti microarray adatkészleteinek kimerítő metaanalízisével fejlesztettek ki. szervek. A szövetben lévő CRM gének (tCRM) mindegyike túlzottan kifejeződött az AR-betegek körében, függetlenül a szerv típusától, az immunszuppressziós protokollok különbségeitől vagy a génexpressziót lekérdező platformok különbségeitől. Egy kombinált génpontszám számítási analízisével meghatározott kvantitatív küszöb (a tCRM pontszám) pontosan megjósolta az AR jelenlétét a szöveti génexpressziós aláírások keresztellenőrzésével 8 független humán vese allograft kohorszában (n{8}} minta). biopsziák[27]. A tCRM pontszámot qPCR-rel tovább validálták egy különálló, KTx biopsziás mintákon végzett vizsgálatban, mind az AR, mind a krónikus allograft sérülés (CAl) diagnosztikájában, eltérő génkészletű küszöbértékekkel [28]. Ezenkívül ezt a CRM-génkészletet a krónikus tüdő allograft diszfunkcióban (CLAD) szenvedő tüdőtranszplantált betegek biopsziás szöveteinek független készletében validálták [29].

Ebben a tanulmányban felmérjük a CRM génkészletet, amelyet KTx-betegek vizeletmintáira használnak, és ismert szövettanú allograft biopsziákkal párosítják az AR és más immunmediált sérülések non-invazív diagnosztizálására. Továbbá kifejlesztünk egy vizelet CRM (uCRM) pontszámot, amely pontosan megkülönbözteti az STA és az AR betegeket. Ennek a pontszámnak a klinikai potenciálját a bAR kimutatásában úgy értékeljük, hogy ezt a pontszámot korreláljuk a tubulitis és az intersticiális gyulladás szövettani pontszámaival.

A CSITANCHE HATÁSAI: AZ IMUNITÁS JAVÍTÁSA

Anyagok és metódusok

Vizeletminták és a vizsgálati kohorsz

A vizsgálatban részt vettek a Stanford Egyetemen 2000 és 2011 között, valamint az UCSF Medical Centerben 2014 és 2016 között beiratkozott KTx-ben részesülőktől származó biobank vizeletminták (n=1760). A tanulmányt a Kaliforniai Egyetem San Francisco Intézményi Ellenőrző Testülete és Etikai Bizottsága hagyta jóvá. Minden beteg írásos beleegyezését adta a kutatásban való részvételhez, teljes mértékben betartva a Helsinki Nyilatkozatot. A jelentett klinikai és kutatási tevékenységek összhangban vannak az Isztambuli Nyilatkozat alapelveivel, amint azt a Szervkereskedelemről és a transzplantációs turizmusról szóló Isztambuli Nyilatkozat vázolja. Az AR uCRM küszöbének megállapításához használt vizeletmintákból 178 vizeletmintát azonosítottak páros vese allograft biopsziával, amelyek egyértelműen meghatározott patológiájú Banff-osztályú AR[30,31] vagy sérülés nélküli/stabil (STA) graftok (1. példa). Ezenkívül értékeltük az uCRM-teszt aláírását is BK vírusos nephropathiában, amely fontos zavaró tényező az AR diagnózisában, és gyakran jelentős gyulladással jár az allograft biopszián. Összességében 28 mintát dobtak ki az alacsony tartalommal és rossz minőségű RNS-sel kapcsolatos minőségellenőrzési problémák miatt, így 150 egyéntől származó 150 vizeletminta végső megszámlálását eredményezték az immunmediált KTx-sérülés keresztmetszeti elemzéséhez. Minden vizeletmintát a vizeletgyűjtéskor biopsziával párosítottak, amelyet a Stanford Egyetem (Richard Sibley) vagy az UCSF (Zol-tan Laszik) központi patológusa értékelt.

A páciens jellemzői

150 unique urine samples were assessed for the uCRM assay in 150 unique kidney transplant patients. Baseline clinical and demographic variables by AR, bAR, BKVN, or STA phenotype are shown in Table1, There were no significant differences between the groups in the demographic variables, except in recipient age (p= 0.025) and in donor-source (p=0.0008). These samples were used in cross-sectional analyses for modeling of gene expression data and subsequent development and validation of the uCRM threshold for biopsy-proven AR. Samples were collected from both pediatric (n=94) and adult (n=56)patients to enable a model-independent of recipient age or baseline immunosuppression. Based on the matched biopsy diagnosis, urine samples were categorized in the following categories: AR(n=64;45 biopsies met criteria for Banff confirmed AR with >i2,t2, and infiltration by >4 mononukleáris sejt / tubuláris keresztmetszet, míg 19 felelt meg a határvonal AR kritériumainak il/ i2 és t0/t1 és 1-4 mononukleáris sejt/cső keresztmetszet általi infiltráció esetén, STA (n { {8}}), BK vírus nephritis (n =43), A betegek kalcineurin-inhibitor ILS-sémát kaptak takrolimuszon és mikofenolát-mofetilen, szteroidokkal vagy anélkül, valamint indukciós terápiát kaptak timoglobulinnal vagy anti-IL-vel{{ 12}} receptor monoklonális antitest (daclizumab vagy bazi. infliximab)[32]. A vizeletmintákat átlagosan 731 nappal a transzplantáció után vettük (tartomány: 169-1335 nap).

Sérülésfenotípusok meghatározása

All kidney biopsies were blindly and centrally analyzed at each institution by staff pathologists (RS and ZL)and were graded by the Banff dassification[31,33] for acute rejection.Intragraft C4d stains were performed [34] to assess for acute humoral rejection(AHR)[35]. Transplant injury was defined as>A szérum kreatininszintjének 20%-os növekedése a korábbi egyensúlyi állapothoz képest, és a kapcsolódó biopszia, amely AR-nek vagy BKVN-nek volt besorolva. A Banff-séma szerint legalább 1-nél nagyobb vagy azzal egyenlő tubulitis pontszámot határoztak meg intersticiális gyulladás pontszáma 1-nél nagyobb vagy egyenlő, mind a Cd, mind a DSA negatív. Mind a Tsejtek által közvetített AR (TCMR), mind az antitest által közvetített kilökődés (ABMR) esetek indukáltak, bár minden megfigyelt ABMR-eset vegyes fenotípusú TCMR és ABMR volt, mivel a tiszta ABMR betartása ritkán figyelhető meg alacsony kockázatú, nem érzékeny kohorszokban. Borderline változásokat (bAR) figyeltek meg néhány TCMR-es esetben, amelyet mononukleáris sejtek infiltrációja jellemez.<25% of="" the="" parenchyma)or="" foci="" of="" mild="" tubulitis(1-4="" mononuclear="" cells/tubular="" cross-section),="" and="" for="" purposes="" of="" molecular="" correlation="" analysis,="" these="" have="" been="" shown="" as="" bar,="" as="" the="" burden="" of="" histological="" inflammation="" was="" overall="" lower="" for="" these="" biopsy="" samples.="" bkvn="" was="" defined="" as="" the="" positivity="" of="" polyomavirus="" pcr="" in="" peripheral=""><1000-28,800,000), together="" with="" a="" positive="" sv40="" stain="" in="" the="" concomitant="" renal="" allograft="" biopsy.="" normal="" (sta)="" allografts="" were="" defined="" by="" an="" absence="" of="" significant="" injury="" pathology="" on="" the="" 6-month="" protocol="" biopsy,="" as="" defined="" by="" banff="" schema,="" stable="" graft="" function,="" no="" proteinuria,="" and="" no="">

1. ábra: A vizsgálat mintaválasztása és vizsgálati vázlata. 2000 és 2016 között 1760 vizeletmintát gyűjtöttek,

ebből 643-nak voltak megfelelő biopsziás adatok. Ebből a 643-ból 178-nak volt jól meghatározott AR, bar, BKVN vagy STA fenotípusa.

Az RNS-kivonás, a cDNS-szintézis és a qPCR mennyiségi meghatározása után 28 minta nem felelt meg a QA/QC-nek, így 150 maradt

minták statisztikai elemzéshez és modellezéshez.

Vizeletgyűjtés, feldolgozás, teljes RNS extrakció, cDNS szintézis és qPCR

A vizeletet (50 ml; steril tartály) vesetranszplantált betegektől gyűjtöttük a biopsziás eljárás előtt, és az AR kezelésének intenzitását megelőzően. Az RNS-t a vizeletsejtek üledékéből vontuk ki a korábban közölt protokollunk szerint [36]. Röviden, a vizeletsejteket a 50- ml vizeletminta 2000xg-vel 20 percig centrifugálásával nyertük ki. RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA). Az RNS minőségét NanoDrop ND-2000 spektrofotométerrel (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) 260/280 arányban értékeltük. A cDNS szintézist 50 ng extrahált RNS felhasználásával végeztük SuperScript VILO"Master Mix (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával. A qPCR-t 50 ng össz-RNS-ből szintetizált cDNS-en végeztük, majd 1,56 ng cDNS-t dolgoztunk fel specifikus célamplifikációval és mintavétellel. hígítás az összevont Taqman-tesztekkel az 1 l uCRM génekre multiplexben, Taqman PreAmp Master Mix-szel (ABI) 5 ul végtérfogatig, 18 cikluson keresztül termikus ciklusban, majd hígítva DNS szuszpenziós pufferrel (TEKnova, CA). Mikrofluidikus qPCR-t a 96,96-os dinamikus tömbökön (Fluidigm, South San Francisco, CA) 2,25 ul specifikus célamplifikációból származó hígított mintát használva, valamint Taqman Assays-t (ABI) minden géntranszkriptumhoz (S1 táblázat), Taqman Universal master mixet (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia) és Loading Reagent (Fluidigm), a chip HX IFC Controlleren keresztüli feltöltésével és qPCR végrehajtásával a BioMark (Fluidgm) rendszerben. Az RNS expresszió relatív mennyiségét összehasonlító cy segítségével számítottuk ki cle threshold (CT) módszer. Az expressziós értékeket 18-ra normalizáltuk riboszomális RNS endogén referencia és univerzális RNS (Agilent Inc., Santa Clara, CA) felhasználásával.

Statisztikai

Az összes qPCR vizsgálatot két párhuzamosban futtattuk. Az összes adatot átlag± SEM formában adjuk meg. A CRM gének fenotípusonkénti összehasonlításához vegyes hatású modellt használtunk Geisser-Greenhouse korrekcióval, többszörös összehasonlító korrekciókkal Beniamin, Krieger és Yekutieli kétlépcsős lineáris lépéses eljárásával. A Pearson korrelációt és a hierarchikus porozást a Morpheusban (Broad Institute) végezték. A gépi tanulási előrejelzési modelleknél az adatokat egy képzési halmazra (80 százalék) és egy tesztelési halmazra (20 százalék) osztották fel. A tesztelési halmazon validált döntési fa osztályozási modellt használtuk a legpontosabb uCRM-pontszám meghatározására. Változó szelekció véletlen erdők használatával (VSURF) az AR ys STA osztályozására, valamint az egyéni gének fontosságának értékelésére és rangsorolására szolgált. A Random Forest változó fontosságú kimenetét úgy definiáljuk, hogy a modellből kizárt (véletlenszerűen permutált) változó (gén) modelljének átlagos százalékos csökkenési pontatlansága. A fenotípus-szétválasztás vizualizálására szolgáló felügyelet nélküli porozást a Mathematica 11.3 (Wolfram Research, Champaign. IL) elosztott sztochasztikus szomszéd beágyazási algoritmusával (t-SNE) végeztük. A CRM gének hálózati elemzését GeneMANIA segítségével végeztük [37]. A demográfiai változókra vonatkozó statisztikát az IMP 14.2 (SASInstitute, Cary, NC) esetében a diszkrét Khi-négyzet analízissel, a folyamatos változókra Kruskal-Wallis teszttel végeztük. Hacsak másként nem jelezzük. az összes többi elemzést Prism 8.0.1-gyel (GraphPad, Carlsbad, CA) végeztük és vizualizáltuk.

Tanulmányi jóváhagyás

A tanulmányt a Stanford University Medical School és az UCSF Medical Center etikai bizottsága is jóváhagyta. Minden felnőtt beteg és a nem felnőtt betegek szülei/gondviselői írásos beleegyezését adtak a kutatásban való részvételhez, teljes mértékben betartva a Helsinki Nyilatkozatot. A jelentett klinikai és kutatási tevékenységek összhangban vannak az Isztambuli Nyilatkozat alapelveivel, amint azt a Szervkereskedelemről és a transzplantációs turizmusról szóló Isztambuli Nyilatkozat vázolja.

A CSITANCHE HATÁSAI: AZ IMUNITÁS JAVÍTÁSA

Eredmények

A kiindulási klinikai és demográfiai változókat mind a 150 KTx AR, bAR, BKVN és STA fenotípusú recipiens esetében az 1. táblázat tartalmazza.

A CRM gén expressziójának relatív abundanciája és korrelációja az egérsejt üledékben

Relatív bőség. A vizelet üledékekben a CRM gén transzkriptumainak relatív mennyiségének meghatározásához a ciklusküszöb (Ct) értékeket használtuk a bőség mérőszámaként. Minél alacsonyabb a Ct érték, annál nagyobb a bősége a CRM gének között. A 11 CRM gén közül a BASP1 volt a legnagyobb mennyiségben előforduló transzkriptum a vizeletsejtek üledékében. A BASP1-et a TAP1, PSMB9 és ISG20 követte, mint a 4 leggyakrabban előforduló transzkriptumot. Az LCK és a CD6 a CRM génkészletben a vizeletüledékekben a legkevésbé előforduló transzkriptumok közé tartozott. Mivel a Ct-értékek a legalacsonyabb, 14-es Ct-értéktől a legmagasabb, 20-as Ct-értékig terjedtek, 64-szeres különbség volt a BASP1 és CD6 gén transzkriptumai között, és a CD6 volt a legkevésbé előforduló transzkriptum.

2. ábra: CRM gének relatív bősége és korrelációja a vizeletben, valamint a CRM gének expressziója a vesetranszplantáció különböző klinikai fenotípusaiban. A. Pearson korrelációs mátrix, amely 11 CRM gén közötti korrelációt mutat be a húgyúti sejtüledékekben való expressziójukban. A négyzet mérete vizuálisan jelzi a korreláció erősségét. B. Hőtérkép fenotípusonként felügyelt klaszterezéssel, amely bemutatja a CRM gének relatív expresszióját AR-ban, bAR-ban, BKVN-ben és STA-ban. C. Violin diagramok, amelyek a CRM gének eloszlását ábrázolják AR, bar, BKVN és STA vizelet sejtpelletben. � azt jelzi, hogy az AR vs STA szignifikáns volt többszöri összehasonlítás után. A # azt jelzi, hogy a bAR vs STA szignifikáns volt többszöri összehasonlítás után. További statisztikák a 2. táblázatban találhatók.

A génexpresszió összefüggése a CRM gének között.

Ezt követően értékeltük a génexpresszió korrelációját 11 CRM gén között. A korreláció a nagyon gyengetől (r=-0.17 a CXCL9 és NKG7 és r=-0.10 CXCL10 és RUNX3 esetén) a nagyon erősig (r=0.77 az INPP5D és a TAP1 esetében), és a ugyanaz az érték CD6 és LCK esetén). Bár a CXCL9 és a CXCL10 a kemokinek ugyanabba az osztályába tartoznak, a génexpressziós korreláció közöttük csak mérsékelt volt (r=0.46). A korrelációs mátrix grafikus bemutatása a 2A. ábrán látható. A felügyelt klaszterezéssel előállított hőtérkép a CRM gének génexpressziós értékeinek jelentős növekedését mutatja AR-ban, bAR-ban és BKVN-ben az STA fenotípushoz képest (2B. ábra).

uCRM génexpresszió vizelet üledékekben biopsziával megerősített AR és BKVN esetén

CRMgének génexpressziója AR-ban és bAR-ban. Ezt követően mind a 11 CRM gén génexpresszióját értékeltük AR, bAR, BKVN és STA relatív expressziójára vonatkozóan. Az elemzés eredményeinek összefoglalása a 2. táblázatban és a 2C. ábrán látható. A 11 gén közül 10 szignifikánsan megnövekedett az AR vizeletüledékekben, összehasonlítva az STA-ból származó vizeletüledékekkel. Azonban csak öt CRM gén (Cd6, Cxcll0, Cxd9, Nkg7 és Psmb9) volt szignifikánsan felszabályozott a bAR mintákban az STA-hoz képest, és expressziójuk a bAR csoportban viszonylag alacsonyabb volt, mint a Banff fokozatú AR csoportban, ami rávilágít arra, hogy az uCRM gének tükrözik az allograft Eig 2C gyulladásos terhét.

2. táblázat: CRM gének génexpressziós szintjei a különböző fenotípusokban

A CRMgének génexpressziója a BKVN-ben. A CD6, CXCL10, CXCL9, LCK, NKG7 és PSMB9 expressziója eltérően szabályozott volt a BKVN-ben szenvedő betegek vizeletmintáiban, összehasonlítva az STA betegek mintáival. A BKVN és STA minták között statisztikailag eltérő génexpressziós értékekkel rendelkező hat gén közül csak az NKG7 expressziója volt lényegesen alacsonyabb a BKVN vizeletben.

A vizelet CRM (uCRM) génexpressziós pontszámának meghatározása a vesetranszplantátum kilökődésének azonosítására

Mivel a CRM génkészlet expressziója nem volt homogén a transzplantációs fenotípusok között, és jelentős fiziológiai átbeszélés volt a különböző gének között (S1 ábra), nemlineáris felügyelt módszereket alkalmaztunk a fenotípusok további megkülönböztetésére és osztályozására. A t-SNE-n keresztül felügyelt klaszterezést végeztünk az uCRM gének és a fenotípusok közötti kapcsolatok meghatározására. A 3A. ábra a t-SNE diagramot mutatja, jelezve, hogy a 11 CRM gén szinte teljesen el tudja különíteni az AR-t az STA mintáktól. A VSURF modell, amely a Random Forests fontossági pontszámaitól függ, megállapította, hogy a PSMB9 és a CXCL10 a két legfontosabb gén a STA-ból származó AR kielégítésében. A 3B. ábra e két gén jelentőségét mutatja be. A génsúlyok fontossági görbéje azt jelzi, hogy ha a 2 gén közül bármelyiket kizárjuk a modellből, akkor a modell pontatlanságának körülbelül 20 százalékos csökkenését jelenti. Ez a két gén majdnem olyan nagy pontossággal tudta osztályozni az AR-t a STA-val szemben, mint az 1l génmodell, 93,6 százalékos érzékenységgel és 97,6 százalékos specificitással. E két gén génexpressziós küszöbét egy döntési fa osztályozó határozta meg, és e két gén log-skálás értékeit a 3C. ábra mutatja. A 28-as küszöb a CXCL10 esetében és a 3 a PSMB9 esetében helyesen osztályozta az 86/88 AR és STA eseteket 97,7 százalékos teljes pontossággal. Nevezetesen, a bAR minták az AR és STA fenotípusok közé estek, ami arra utal, hogy e két gén gradációja az allograft gyulladás mértékében.

Az uCRM pontszám osztályozási teljesítményének feltárására AR, határesetben lévő AR és STA esetekben egy döntési fa osztályozót készítettek (4A. ábra). A döntési fa minden fenotípusra meghatározta az optimális uCRM pontszám küszöbértéket. 4-nél nagyobb pontszám, helyesen osztályozott 44/49 AR eset; 33/35 STA esetből 1,8-nál kisebb pontszámot helyesen osztályozott.14/23 határeset e két küszöb között volt. Az uCRM pontszámok fenotípus szerinti megoszlását a 4B. ábra mutatja. Az átlagos uCRM pontszámok (SEM) az AR, a bAR és az STA esetében 8,195 (0,631), 3,265 (0,412{{21) }}), illetve 1,404 (0,162), és minden összehasonlítás szignifikáns volt többszörös összehasonlítás korrekciója után. Az uCRM-pontszám nagy pontossággal tudta megkülönböztetni az AR-t és az STA-t – 3,63-as küszöbnél az érzékenység és a specificitás 95,35, illetve 97,78 százalék volt (Eig 4C. Az AR és a bAR és STA kombinációjának megkülönböztetésekor az uCRM pontszám megmaradt nagy pontosság ugyanazon a küszöb mellett, az érzékenység és a specificitás 87,10 százalék, illetve 97,78 százalék volt (S2A ábra).

A BKVN minták bevonásakor a bAR és a BKVN (S2BFig) kivételével minden fenotípus szignifikánsan különbözött egymástól a többszöri összehasonlítás korrekciója után. Az AR és a bAR, STA és BKVN kombinációjának megkülönböztetésekor az uCRM pontszám továbbra is magas, de alacsonyabb pontosságú volt. Ugyanezt a 3,63-as küszöbértéket alkalmazva az érzékenység és a specificitás 76,92 százalék, illetve 97,78 százalék volt (S2CFig).

A ComScore korrelál az AR-specifikus biopsziás szövettani elváltozásokkal. Nevezetesen, az uCRM-pontszám STA-ról bAR-ra AR-ra történő növelésének tendenciája azt sugallta, hogy az uCRM-pontszám képes kimutatni a gyulladás klinikailag releváns gradációit. Ennek megfelelően értékeltük, hogy az uCRM-pontszám összefüggésben áll-e az azonos betegből származó, egyidejűleg gyűjtött illesztett biopsziákban megfigyelt szövettani AR-elváltozások mértékével. Amint az 5A. és 5B. ábrán látható, az uCRM-pontszámok korreláltak a tubulitis(t) és az interstitialis gyulladás(i)biopsziás pontszámaival az AR(R=0.5479, P-ben).<0.0001 and="" r="0.4420,"><0.0001 for="" the="" ucrm="" score="" regarding="" t="" and="" ii,="" respectively).="" there="" was="" no="" correlation="" between="" the="" ucrm="" score="" and="" measures="" of="" tubular="" atrophy="" (ta),glomerulosclerosis="" (gs),mesangial="" matrix="" (mm),="" intimal="" proliferation="" (cv),="" medial="" arteriolar="" hyaline="" (ah),="" tubular="" vacuolization(tv),="" arteritis="" (v),="" or="" acute="" glomerulitis="">

A CSITANCHE HATÁSAI: FÁRADTSÁG ELLENI

Vita

Sürgősen szükség van a transzplantációs gyógyászatban megbízható és nem invazív monitorozó eszközök kifejlesztésére, amelyek segíthetnek a transzplantációs klinikusoknak előre jelezni az allograft sérülésének kockázatát, előnyösen az allograft károsodásának megállapítása előtt. Míg számos transzkripciós biomarkert társítottak az AR-hez, a legtöbb tanulmány alapvetően egy egyedi vagy egyetlen transzkripciós faktorra összpontosított, és nem tükrözi az allograft kilökődés biológiai folyamatának teljes molekuláris komplexitását [11,38]. Ezen túlmenően, bár az immunmediált allograft-sérülések diagnosztizálásának jelenlegi aranystandardja az allograft biopszia, jól ismert, hogy az eljárásnak kulcsfontosságú korlátai vannak a gyakori hibás mintavételezés, a magas költségek és az ismétlődés kivitelezhetetlensége tekintetében. szűrés a technika invazív jellege miatt.

Számos jelentés kimutatta, milyen értékes a vesetranszplantált betegek vizeletmintáiban az AR-t előrejelző különböző biomarkerek tanulmányozása [20-22]. Az immuneffektor molekulák és transzkriptumok, például a granzyme B. CXCL10.CXCL9.IFN-y és a CXCR3 megnövekedett vizeletszintje. kimutatták, hogy erősen kapcsolódnak az AR-hez, és bizonyos esetekben még előre megjósolják az AR megjelenését [19,24, 39-43]. Kihasználva a csoportunk által a közelmúltban közölt adatokat [2Z, 29,44], amelyek a génexpresszió közös kilökődési modulját mutatják allograft biopsziákban AR során, függetlenül a szöveti szerv típusától, ennek a tanulmánynak az volt a fő célja, hogy megvizsgálja, vajon az értékelés A vesetranszplantált betegek vizeletében lévő CRM értéke ideális non-invazív biomarker lehet az AR megjelenésének előrejelzésére.

Míg az egyes CRM-géneket és géntermékeket egyenként értékelték, ez az első jelentés a CRM-gének kollektív, non-invazív felhasználásáról a KTx-ben előforduló AR előrejelzésében. Például a vizelet CXCL9 mRNS-ét és fehérjét, valamint a CXCL10 mRNS-t korábban multicentrikus vizsgálatokban értékelték az AR [13,45,46] diagnosztizálására. A vesebiopsziákban a PSMB9 transzkriptumokat korábban szintén összefüggésbe hozták a graft minőségével és az akut kilökődés előrejelzésével. 47].

Elemeztük a KTx-betegek vizeletüledékeinek génexpressziós adatait a CRM-transzkriptumok relatív bőségére és a CRMgének közötti expressziójuk korrelációjára vonatkozóan (2A ábra). A korábban közölt tanulmányunkkal összhangban, amely a szöveti vese- és tüdőallograft minták CRM-pontszámát elemezte, a CRMgének fokozott expressziót mutattak AR-ben és más transzplantációs sérülésekben, mint például AR és BKVN (2B és 2C ábra). Ebben a jelentésben erős korrelációt is megfigyeltünk az újonnan kifejlesztett uCRM pontszám és a szövettani gyulladásos pontszámok (vesebiopsziák t és ii pontszáma) között. Mivel ezeknek a CRM-géneknek a többsége szinte kizárólag a beszűrődő immunsejtekben expresszálódik, a CRM-gének fokozott expressziója a vizelet üledékében arra utal, hogy a vesetranszplantált graftsérülésen átesett betegek vizeletében fokozott az infiltráló immunsejtek felszabadulása.

Ezután az egyes CRM-gének egyedi génexpressziós értékeiből számított kombinált pontszámot, a ComScore-t használtuk mérőszámként a vesetranszplantált betegek besorolására akut kilökődésben szenvedő vagy sérülés nélküli betegekbe, és meghatároztuk az AR küszöbét. A tanulmány eredményei azt mutatják, hogy az uCRM assay ereje nem csak az AR-ben szenvedő betegek azonosításában, hanem az allograftban bekövetkező sérülés mértékének számszerűsítésében is, mivel a pontszám az STA-betegek alacsony értékeiről a bAR-betegeknél közepes értékekre nő. és magas értékekre az AR betegeknél, amint azt a tubulitis és az intersticiális gyulladás szövettani pontszámai tükrözik. Úgy gondoljuk, hogy az uCRM-pontszám potenciálisan hasznos lehet a transzplantáció monitorozásában, és kiegészítésként vagy hivatkozási tesztként szolgálhat a biopsziákhoz. Az alacsony uCRM-pontszámmal rendelkező betegek elkerülhetik a szükségtelen protokoll-biopsziákat, míg a magas uCRM-pontszámmal rendelkező betegek sorozatos monitorozást vagy ok-biopsziát igényelhetnek a graft állapotának felméréséhez.

Elismerjük ennek a tanulmánynak számos korlátját, amelyek magukban foglalják (i) a vizsgálat korlátozott mintaszámát, (ii) a transzplantációs sérülés egyéb fenotípusainak hiányát, mint például a krónikus allograft sérülés vagy a gyógyszertoxicitás, és (i) az uCRM pontszám értékelésének hiányát longitudinálisan. mintát nagyobb kohorsz méretben. Ezek az ígéretes eredmények azt sugallják, hogy további, prospektív vizsgálatokra van szükség az uCRM pontszám klinikai környezetben való lehetséges hasznosságának validálásához és teljes körű felméréséhez. Összefoglalva, bemutatunk egy nem invazív, vizelet alapú biomarkert, amelyet egy 11 génből álló közös kilökődési modulból fejlesztettek ki, amely képes azonosítani a transzplantációs sérülést és a kilökődést veseátültetett betegeknél.

A CSITANCHE HATÁSAI: JAVÍTJA MEMÓRIÁT

Hivatkozások

1 Wolfe RA, Ashby VB, Milford EL, Ojo AO, Ettenger RE, Agodoa LY és társai. Az összes dializált beteg, a transzplantációra váró dializált betegek és az első holttest-transzplantációt átvevő betegek halálozásának összehasonlítása. A New England-i orvostudományi folyóirat. 1999; 341(23):1725–30.

2. Laupacis A, Keown P, Pus N, Krueger H, Ferguson B, Wong C és mások. A vesetranszplantáció életminőségének és költséghatékonyságának vizsgálata. Vese nemzetközi. 1996; 50. (1):235–42. PMID: 8807593.

3. Lodhi SA, Lamb KE, Meier-Kriesche HU. A transzplantált betegek hosszú távú eredményeinek javítása: a hosszú távú, betegségspecifikus és multidiszciplináris kutatás indokolása. American Journal of Transplantation: az American Society of Transplantation és az American Society of Transplant Surgeons hivatalos lapja. 2011; 11(10):2264–5.

4. Naesens M, Khatri P, Li L, Sigdel TK, Vitalone MJ, Chen R et al. A vese allograftok progresszív szövettani károsodása a veleszületett és adaptív immunitás gének expressziójával jár. Vese nemzetközi. 2011; 80(12):1364–76.

5. Sigdel TK, Li L, Tran TQ, Khatri P, Naesens M, Sansanwal P és munkatársai. Az immunogén epitópokkal szembeni nem-HLA antitestek előrevetítik a krónikus vese-allograft sérülés kialakulását. Az American Society of Nephrology folyóirata: JASN. 2012; 23(4):750–63.

6. Pape L, Offner G, Ehrich JH, de Boer J, Persijn GG. Vese allograft funkciója azonos donor gyermek és felnőtt recipiens párjaiban. Átültetés. 2004; 77(8):1191–4. PMID: 15114083.

7. Provoost AP, Wolff ED, de Keijzer MH, Molenaar JC. A recipiens méretének hatása a veseműködésre vesetranszplantációt követően. Kísérleti és klinikai vizsgálat. Gyermeksebészet folyóirata. 1984; 19(1):63–7.

8. Moreso F, Lopez M, Vallejos A, Giordani C, Riera L, Fulladosa X és mások. Sorozatos protokoll biopsziák a krónikus transzplantációs nephropathia progressziójának számszerűsítésére stabil vese allograftokban. American Journal of Transplantation: az American Society of Transplantation és az American Society of Transplant Surgeons hivatalos lapja. 2001; 1(1):82–8. PMID: 12095044.

9. Davis ID, Oehlenschlager W, O'Riordan MA, Avner ED. Gyermek vesebiopszia: ezt az eljárást járóbeteg-körülmények között kell elvégezni? Gyermek nefrológia. 1998; 12. (2):96–100. PMID: 9543363.

10. Roedder S, Sigdel T, Salomonis N, Hsieh S, Dai H, Bastard O és mások. A kSORT vizsgálat a vesetranszplantált betegek kimutatására, akiknél nagy az akut kilökődés kockázata: a multicentrikus AART vizsgálat eredményei. PLoS gyógyszer. 2014; 11(11):e1001759.

11. Sarwal M, Chua MS, Kambham N, Hsieh SC, Satterwhite T, Masek M és munkatársai. A DNS microarray profilozással azonosított akut vese allograft kilökődés molekuláris heterogenitása. A New England Journal of Medicine. 2003; 349(2):125–38.

12. Sigdel TK, Sarwal MM. A közelmúltban elért előrelépések a biomarkerek felfedezésében a proteo micsokkal végzett szilárd szervátültetésben. Szakértői áttekintés a proteomikáról. 2011; 8(6):705–15. https://doi.org/10.1586/epr.11.66 PMID: 22087656.

13. Suthanthiran M, Schwartz JE, Ding R, Abecassis M, Dadhania D, Samstein B és mások. Vizelet-sejt mRNS profil és akut sejtkilökődés vese allograftokban. A New England-i orvostudományi folyóirat. 2013; 369 (1):20–31.

14. Sigdel TK, Gao Y, He J, Wang A, Nicora CD, Fillmore TL és mások. Az emberi vizelet proteom bányászata a vesetranszplantációs sérülés megfigyelésére. Vese nemzetközi. 2016; 89(6):1244–52. https://doi.org/10.1016/j. kötött.2015.12.049 PMID: 27165815.

15. Sigdel TK, Ng YW, Lee S, Nicora CD, Qian WJ, Smith RD és társai. Perturbációk a vizelet exoszómájában transzplantátum kilökődésében. Határok az orvostudományban. 2014; 1:57.

16. Yang JY, Sarwal MM. Transzplantációs genetika és genomika. Nature Reviews Genetics. 2017; 18(5):309–26.

17. Loupy A, Lefaucheur C, Vernerey D, Chang J, Hidalgo LG, Beuscart T és mások. Molekuláris mikroszkópos stratégia a korai antitest-mediált vese allograft kilökődés kockázati rétegződésének javítására. Az American Society of Nephrology folyóirata: JASN. 2014; 25(10):2267–77. Epub 2014/04/05.

18. Sigdel TK, Vitalone MJ, Tran TQ, Dai H, Hsieh SC, Salvatierra O és munkatársai. Gyors, nem invazív vizsgálat a vesetranszplantációs sérülés kimutatására. Átültetés. 2013; 96(1):97–101. PMID: 23756769.

19. Hauser IA, Spiegler S, Kiss E, Gauer S, Sichler O, Scheuermann EH és társai. Az IFN-gamma (MIG) által kiváltott vizelet monokin által okozott akut vese allograft kilökődés előrejelzése. Az American Society of Nephrology folyóirata: JASN. 2005; 16(6):1849–58.

20. Hu H, Kwun J, Aizenstein BD, Knechtle SJ. Akut és krónikus sérülések noninvazív kimutatása humán vesetranszplantációban a vizeletben lévő többszörös citokin/kemokin szintjének emelkedésével. Átültetés. 2009; 87(12):1814–20. PMID: 19543058.

21. Jackson JA, Kim EJ, Begley B, Cheeseman J, Harden T, Perez SD és mások. A CXCL9 és CXCL10 vizeletkemokinek a vese allograft kilökődésének és a BK vírusfertőzésnek nem invazív markerei. American Journal of Transplantation: az American Society of Transplantation és az American Society of Transplant Surgeons hivatalos lapja. 2011; 11(10):2228–34.

22. Schaub S, Nickerson P, Rush D, Mayr M, Hess C, Golian M és társai. A vizelet CXCL9 és CXCL10 szintje korrelál a szubklinikai tubulitis mértékével. American Journal of Transplantation: az American Society of Transplantation és az American Society of Transplant Surgeons hivatalos lapja. 2009; 9 (6):1347–53.

23. Segerer S, Cui Y, Eitner F, Goodpaster T, Hudkins KL, Mack M és társai. Kemokinek és kemokin receptorok expressziója az emberi vesetranszplantátum kilökődése során. Amerikai vesebetegségek folyóirata: a National Kidney Foundation hivatalos lapja. 2001; 37(3):518–31. PMID: 11228176.

24. Tatapudi RR, Muthukumar T, Dadhania D, Ding R, Li B, Sharma VK és társai. A vese allograft gyulladás nem invazív kimutatása IP-10 és CXCR3 mRNS mérésével vizeletben. Vese nemzetközi. 2004; 65(6):2390–7.

25. Menon MC, Murphy B, Heeger PS. A biomarkerek mozgatása a vesetranszplantáció klinikai megvalósítása felé. JASN. 2017.

26. Naesens M, Anglicheau D. Precision Transplant Medicine: Biomarkers to the Rescue. JASN. 2017.

27. Khatri P, Roedder S, Kimura N, De Visser K, Morgan AA, Gong Y és mások. A több szervre kiterjedő akut kilökődésre szolgáló közös kilökődési modul (CRM) új terápiás szereket azonosít a szervátültetésre. A kísérleti orvostudomány folyóirata. 2013; 210(11):2205–21.

28. Sigdel TK, Bestard O, Tran TQ, Hsieh SC, Roedder S, Damm I és társai. Számítógépes génexpressziós pontszám a vese-allograftok immunkárosodásának előrejelzéséhez. PloS one. 2015; 10(9):e0138133.

29. Secrets A, Yang JYC, Vanaudenaerde BM, Sigdel TK, Liberto JM, Damm I, et al. A közös kilökődési modul tüdőtranszplantáció utáni krónikus kilökődésben. PloS one. 2018; 13(10):e0205107. Epub 2018/10/06.

30. Sis B, Mengel M, Haas M, Colvin RB, Halloran PF, Racusen LC és mások. Banff '09 találkozó jelentése: antitest-mediált graftromlás és Banff munkacsoportok végrehajtása. American Journal of Transplantation: az American Society of Transplantation és az American Society of Transplant Surgeons hivatalos lapja. 2010; 10(3):464–71.

31. Solez K, Colvin RB, Racusen LC, Haas M, Sis B, Mengel M és társai. A vese allograft patológiájának Banff 07 osztályozása: frissítések és jövőbeli irányok. American Journal of Transplantation: az American Society of Transplantation és az American Society of Transplant Surgeons hivatalos lapja. 2008; 8 (4):753–60.

32. Sarwal MM, Ettenger RB, Dharnidharka V, Benfield M, Mathias R, Portale A és társai. A szteroidok teljes elkerülése hatékony és biztonságos a veseátültetett gyermekeknél: egy többközpontú randomizált vizsgálat, hároméves követéssel. American Journal of Transplantation: az American Society of Transplantation és az American Society of Transplant Surgeons hivatalos lapja. 2012; 12(10):2719–29.

33. Racusen LC. Az allograft diszfunkció Banff-séma és differenciáldiagnózisa. Transzplantációs eljárások. 2004; 36(3):753–4.

34. Jianghua C, Wenqing X, Huiping W, Juan J, Jianyong W, Qiang H. C4d mint a humorális kilökődés szignifikáns prediktora veseallograftokban. Klinikai transzplantáció. 2005; 19(6):785–91.

35. Crespo M, Pascual M, Tolkoff-Rubin N, Mauiyyedi S, Collins AB, Fitzpatrick D és munkatársai. Akut humorális kilökődés vese allograft recipienseknél: I. Incidencia, szerológia és klinikai jellemzők. Átültetés. 2001; 71. (5):652–8. PMID: 11292296.

36. Keslar KS, Lin M, Zmijewska AA, Sigdel TK, Tran TQ, Ma L et al. A noninvazív génexpressziós profilozás szabványosított protokolljának többközpontú értékelése. AJT. 2013.

37. Montojo J, Zuberi K, Rodriguez H, Bader GD, Morris Q. GeneMANIA: Gyors génhálózat építés és funkció előrejelzése a Cytoscape számára. F1000Kutatás. 2014; 3:153.

38. Der SD, Zhou A, Williams BR, Silverman RH. Interferon alfa, béta vagy gamma által eltérően szabályozott gének azonosítása oligonukleotid tömbök segítségével. Proceedings of the National Academy of Sciences of Amerikai Egyesült Államok. 1998; 95(26):15623–8.

39. Hartono C, Muthukumar T, Suthanthiran M. A vese allograftok akut kilökődésének noninvazív diagnosztikája. A szervátültetés jelenlegi véleménye. 2010; 15. (1):35–41. https://doi.org/10.1097/MOT. 0b013e3283342728 PMID: 19935064.

40. Lazzeri E, Rotondi M, Mazzinghi B, Lasagni L, Buonamano A, Rosati A és mások. Magas CXCL10 expresszió kilökött vesékben és a transzplantáció előtti szérum CXCL10 prediktív szerepe az akut kilökődésben és a krónikus allograft nefropátiában. Átültetés. 2005; 79(9):1215–20. PMID: 15880073.

41. Matz M, Beyer J, Wunsch D, Mashreghi MF, Seiler M, Pratschke J és munkatársai. A vesetranszplantáció utáni korai, transzplantáció utáni vizelet IP-10 expressziója előrevetíti a graft rövid és hosszú távú működését. Vese nemzetközi. 2006; 69(9):1683–90.

42. Simon T, Opelz G, Wiesel M, Ott RC, Susal C. Sorozatos perifériás vér perforin és granzyme B génexpressziós mérések akut kilökődés előrejelzésére vesegraft recipienseknél. American Journal of Transplantation: az American Society of Transplantation és az American Society of Transplant Surgeons hivatalos lapja. 2003; 3(9):1121–7. PMID: 12919092.

43. Yannaraki M, Rebibou JM, Ducloux D, Saas P, Duperrier A, Felix S és mások. Vizelet citotoxikus molekuláris markerek nem invazív diagnózishoz akut vesetranszplantációs kilökődésben. Transplant international: a European Society for Organ Transplantation hivatalos lapja. 2006; 19(9):759–68. https://doi.org/10. 1111/j.{8}}.2006.00351.x PMID: 16918537.

44. Yang JYC, Verleden SE, Zarinsefat A, Vanaudenaerde BM, Vos R, Verleden GM és társai. A Bronchoalveoláris öblítésből származó sejtmentes DNS és CXCL10 előrejelzi a tüdőtranszplantáció túlélését. J Clin Med. 2019; 8. (2) bekezdése alapján. Epub 2019.02.20.

45. Faddoul G, Nadkarni GN, Bridges ND, Goebel J, Hricik DE, Formica R et al. A biomarkerek elemzése a transzplantáció utáni első 2 éven belül és az 5-évi veseátültetés eredményei: a szervátültetésben végzett klinikai vizsgálatok eredményei-17. Átültetés. 2018; 102(4):673–80. Epub 2017/12/01.

46. ​​Hricik DE, Nickerson P, Formica RN, Poggio ED, Rush D, Newell KA és társai. A vizelet CXCL9 többközpontú validálása a vesetranszplantációs sérülés kockázati rétegező biomarkereként. American Journal of Transplantation: az American Society of Transplantation és az American Society of Transplant Surgeons hivatalos lapja. 2013; 13(10):2634–44. Epub 2013.08.24.

47. Kotsch K, Kunert K, Merk V, Reutzel-Selke A, Pascher A, Fritzsche F, et al. A nulla órás vesebiopsziák új markerei jelzik a graft minőségét és klinikai kimenetelét. Átültetés. 2010; 90(9):958–65. Epub 2010.09.23. PMID: 20859252.