A Cistanche-ból származó akteozid javítja a glükokortikoidok által kiváltott csontritkulást a PI3K/AKT/mTOR útvonal aktiválásával

Absztrakt

Célkitűzés

A glükokortikoidokat széles körben használják a klinikai gyakorlatban; azonban mellékhatásokat okozhatnak, mint plcsontritkulás. ActeozidA Cistanche-ból származó (ACT)-t számos betegség leküzdésére használták. A vizsgálatot az ACT glükokortikoidok által kiváltott hatásosságának értékelésére végeztékcsontritkulás(GIOP) és annak lehetséges mechanizmusa.

Mód
A dexametazont (Dex) intramuszkulárisan injektálták az indukáláshozcsontritkuláspatkánymodellben, és az ACT-t szájon át adták. Az ACT-t in vivo kiegészítették Dex-stimulációvalosteoblastosMC3T3-E1 cellák. RT-qPCR-t végeztünk az mRNS szintjének értékelésérecsontképződés(Runx2, CoL1A1) és csontreszorpció (OPG és RANKL). Kereskedelmi ELISA készletet alkalmaztunk a szérum OC és CTX szint meghatározására. Western blotot végeztünk a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal fehérjeszintjének felmérésére. CCK-8 vizsgálatot és áramlási citometriát végeztünk az oszteoblasztok életképességének és apoptózisának felmérésére.

Kattintson ide, és szerezze be a Cistanche Acteoside-ot a Dex-stimulált osteoblastic kezelésére

Eredmények
Az ACT csökkentette a Dex által kiváltott csontmikroszerkezet-romlást, növelte az OC szérumszintjét és csökkentette a CTX szintjét (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and elősegítette az apoptózist; ezt a hatást azonban nagymértékben gyengítette az ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Következtetés
ACT fromCistancheoszteoprotektív hatást fejthet ki a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal aktiválásával a Dex által kiváltott csontritkulás enyhítésére.

Kulcsszavak:Acteozid Cistancheglükokortikoidok által kiváltottcsontritkulás

Bevezetés
Az oszteoporózis (OP) egy generalizált csontrendszeri betegség, amelyet alacsony csonttömeg, a csontszövet mikroszerkezetének pusztulása és a csontháztartás egyensúlyának felborulása jellemez [1]. Az OP évente több mint 8,9 millió törést okoz, és az oszteoporózisos törések csaknem 3 másodpercenként fordulnak elő, és élethosszig tartó rokkantsághoz vagy halálhoz vezetnek [2]. A glükokortikoidokat (GC) általában nem fertőző jellegű gyulladásos betegségek (például asztma és gyulladásos bélbetegség), valamint autoimmun állapotok kezelésére alkalmazzák [3]. A hosszú távú GC-használat azonban az OP esetek több mint 30 százalékában és az osteonecrosis esetek több mint 10 százalékában hajlamosít [4]. A GC-k közvetlenül gátolják az oszteoblasztok proliferációját és differenciálódását [5], csökkentik az érést és aktivitást, valamint az oszteoblasztok apoptózisát indukálják, ami viszont glükokortikoidok által kiváltott oszteoporózis (GIOP) kialakulásához vezet [6]. Ráadásul egyre több bizonyíték utal arra, hogy az osteoblast diszfunkció a csontvesztés fő oka. Ezért úgy tűnik, hogy az osteoblastok számának és funkciójának növelése az OP, különösen a GIOP megelőzésének fő stratégiája.

A gyógynövényes gyógyszereket, különösen a természetes vegyületeken alapulókat évezredek óta alkalmazzák különféle betegségek kezelésére [7]. A Cistanche a kínai gyógyszerkönyvben feljegyzett értékes gyógynövény, amely a Hszincsiangi Ujgur Autonóm Régió déli részén nő, és sivatagi ginzengként ismert [8]. A Cistanche-nak bizonyítottan számos hatása van, például immunerősítő, vesevédő, öregedésgátló, antioxidáns, gyulladásgátló és neuroprotektív hatása [9].ActeozidAz (ACT) egy fenil-etanolos glükozid Cistanche-ban, amelynek biológiai hatásai vannak, például gátolja a neuronális apoptózist [10], enyhíti a májkárosodást [11], gyulladásgátló [12], antioxidáns [13]. , a cukorbetegség [14] és az elhízás [15] megelőzése, valamint az ízületi porc degenerációja [16]. Ezenkívül számos tanulmány beszámolt az ACT farmakokinetikájáról, és megerősítette, hogy a terápiás hatás akkor is fennáll, ha az orális felhasználás mindössze 0,12 százalék. Az ACT in vivo aktív metabolitokkal rendelkező prodrugnak tekinthető [17].

Zhang és mtsai. kimutatták az ACT potenciális védőhatását a petefészekeltávolítás által kiváltott csontvesztésre patkányokban [18]. Az ACT modulálja az IGF-1/PI3K/mTOR jelátviteli útvonalat, hogy megakadályozza a csontvesztést cukorbeteg patkányokban [19]. A PI3K/AKT/mTOR útvonalról beszámoltak arról, hogy kritikus szabályozó szerepe van különböző betegségekben, beleértve a GIOP-t is [20]. A Naringin a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal szabályozásával enyhíti a GIOP-t [21]. Ezenkívül ez a jelátviteli útvonal szabályozza az oszteoblasztok differenciálódását [22], a csontképződést [23] és a törések gyógyulását [24]. Nem ismert azonban az ACT potenciális szerepe a GIOP-ban, és hogy a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal modulációja szabályozza-e.

Jelen tanulmány célja az ACT protektív hatásainak megértése volt GIOP patkánymodellben és osteoblasztokban in vitro, valamint a mögöttes molekuláris mechanizmusok tisztázása.

Anyagok és metódusok
Kísérleti állatok
Negyven 8-hetes, 280–340 g tömegű hím Sprague-Dawley (SD) patkányt a Shanghai Laboratory Animal Centertől (CAS, Shanghai, Kína) szereztünk be. A kísérleti állatok gondozási eljárásait a Qiqihar Orvosi Egyetem Harmadik Társult Kórháza Állatetikai Bizottsága által jóváhagyott protokoll szerint végeztük. A vizsgálatot az ARRIVE irányelveivel összhangban végezték. Az állatokat kórokozóktól mentes, 24 ± 2 fokos, 12 órás világos és sötét ciklusú, 50 ± 5 százalékos páratartalmú állati központokban tartottuk, ahol szabad hozzáférést biztosítottak táplálékhoz és vízhez.

GIOP modell építés
7 napos adaptív etetés után a patkányokat véletlenszerűen kontroll- és modellcsoportokra osztották a véletlenszám táblázatos módszerrel, dexametazont (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) hetente kétszer 5 mg/ttkg injekcióval 6 héten keresztül. intramuszkulárisan OP indukálására patkányokban a modellcsoportban [25]. A kontrollcsoport patkányai (n = 10) azonos mennyiségű sóoldatot kaptak. A 6. héten nem figyeltek meg szignifikáns változást a testtömegben a patkányokban mindkét csoportban. Ezt követően a modellcsoportban lévő patkányokat modellcsoportra, ACT alacsony dózisú csoportra (Model plus ACT-L) és ACT nagy dózisú csoportra (Model plus ACT-H) csoportra osztották. Az ACT-t (98 százalékos HPLC) a Baoji Herbest Bio-tech., Ltd.-től (Baoji, Kína) szereztük be, és vizes oldószer-szuszpenzióval kezeltük. 50 mg/ttkg/nap, illetve 100 mg/kg/nap ACT dózist adtak orálisan az alacsony, illetve a nagy dózisú csoportokban (csoportonként 8 patkány) lévő patkányoknak. 8 hétig folytatták. Közülük a minta nagyságát egy korábbi tanulmány alapján számították ki [26]. Figyelembe véve a 0,05-ös kétoldalú szignifikanciaszintet [95 százalékos konfidencia intervallum (= 0,05)], a 80 százalékos teljesítményt és a 0,5-ös hatásméretet, a teljesítményelemzés 6 állatra becsülte a szükséges mintanagyságot csoportonként, feltételezve 30 százalékos csontritkulás releváns hatásszintje. Továbbá 20 százalékos lemorzsolódás mellett csoportonként 8 állatot (összesen 32 patkány) tekintettek ideálisnak.

Patkányszérum minták
8 hét elteltével a patkányokat 10 százalékos klorálhidráttal (400 mg/kg, intraperitoneálisan, Solarbio, Peking Kína) érzéstelenítettük, vért vettünk a hasi aortából, szobahőmérsékleten alvadt, és 3500 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáltuk. A szérumot 1,5 ml-es centrifugacsövekben tároltuk a további felhasználásig.

Csont ásványi sűrűség felmérése
A csont ásványi sűrűségét (BMD) egy DAX kisállat-csont denzitométerrel (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, Kína) használtuk. Röviden, a patkányokat fekvő helyzetbe, a hátsó végtagokat pedig kifelé helyeztük el. A patkányok jobb combcsontját a gyártó utasításai szerint átvizsgáltuk, és feljegyeztük a BMD értékeket [27].

Csontmorfológiai elemzés
A kísérlet végén a patkányokat felesleges klorálhidrát intraperitoneális injekciójával leölték, és a combcsontokat 70 százalékos etanolban rögzítették. Ezt követően VivaCT 40 μCT rendszerrel a korábbi vizsgálatban leírtak szerint a csonttérfogat/teljes térfogat (BV/TV), a csont trabekuláris szám (Tb.N), a csont trabekuláris vastagsága (Tb.Tn) és a csont trabekuláris elválasztása alapján szkenneléseket végeztünk. (Tb.Sp) vizsgálták [28]. Eutanázia céljából az SD patkányokat a csontmorfológiai elemzés után 10%-os klorálhidrát (350 mg/kg) intraperitoneális injekciójával elaltattuk.

Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA)
Kereskedelmi ELISA kiteket használtunk az oszteokalcin (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) és a C-terminális telopeptid (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) szintjének kimutatására patkányok szérumában. Röviden, a reagenseket 18-25 fokon eltávolítottuk, hogy kiegyensúlyozzuk és előkészítsük az oldatot a mosáshoz és a standard munkához. Enzimlemezek A lemezeket standard, vak- és mintaüregekkel helyeztük el. Körülbelül 100 μL mintahígító oldatot adtunk a lyukakba, 90 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd 60 percig 37 °C-on biotinilált antitesttel helyettesítettük. Mosás után hozzáadtuk az enzimkötő munkaoldatot, és 30 percig inkubáltuk. Hozzáadtuk a szubsztrát oldatot (90 μL), és fénytől védve 15 percig inkubáltuk. Amikor a kék gradiens megjelent a standard lyukakban, 50 μl terminációs oldatot adtunk hozzá, és elemeztük az OD450 változását.

Reverz transzkripciós kvantitatív valós idejű PCR (RT-qPCR)
Patkányok és ACT-kezelt MC3T3-E1 sejtek szérumához TRlzol LS reagenst adtunk, majd a teljes RNS-t szobahőmérsékleten végzett inkubálással, majd kloroform hozzáadásával extraháltuk. Az RNS koncentrációját és tisztaságát Nanodrop ND-1000 spektrofotométerben A260/280 abszorbancia mérésével igazoltuk. A SuperScript II reverz transzkriptáz készletet használtuk az RNS cDNS-vé történő reverz transzkripciójához. Ezt követően cDNS-t alkalmaztunk templátként, primert adtunk hozzá, és a SYBR-Green PCR master mix kit-et összekevertük és ddH2O-val egészítettük ki 20 μL-ig, majd a PCR amplifikációs reakciót az Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR segítségével végeztük. rendszer (ABI, CA, USA). A GAPDH-t belső referenciaként használtuk a normalizáláshoz, és a relatív expressziós szinteket 2-ΔΔCt módszerrel számítottuk ki, és három párhuzamosban végeztük el. A Runt-hoz kapcsolódó transzkripciós faktor 2 (Runx2), az I. típusú kollagén (CoL1A1), a nukleáris faktor-κB ligandum (RANKL), az osterix és az oszteoprotegerin (OPG) primerszekvenciáját az 1. táblázat mutatja be.

Western-blot analízis
1% proteáz inhibitort tartalmazó RIPA lizátumot adtunk a sejtekhez, és az egyes csoportokból az összes fehérjét összegyűjtöttük a sejtek lízise után 5 percig 4 °C-on rázva. BCA vizsgálati készletet alkalmaztunk a fehérjék koncentrációjának mennyiségi meghatározására az egyes csoportokban. Ezt követően a fehérjemintákat 10%-os nátrium-dodecil-szulfát (SDS) pufferrel azonos térfogatban összekevertük, és 95 fokos vízfürdőben 5 percig forraltuk a fehérjedenaturáció érdekében. 12%-os SDS-poliakrilamid függőleges gélt készítettünk, és a gél megszilárdulása után 30 ug fehérjét vettünk a 120 mA-es 90 perces gélelektroforézises elválasztáshoz. A fehérjét ezután a PVDF membránra vittük 90 V-on 120 percig. 5%-os szarvasmarha szérumalbuminnal való lezárás után a PVDF membránt a marker és a célfehérje sáv molekulatömege alapján levágtuk, és a megfelelő elsődleges antitesttel inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on. A p-AKT, p-mTOR és p-PI3K elleni nyúl poliklonális antitesteket 1:1000 arányban hígítottuk (Proteintech, Wuhan, Kína). A TBST-t 30 percig mostuk, és a megfelelő torma-peroxidázzal jelölt másodlagos antitesttel szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk. A blotot fokozott kemilumineszcenciás reagensekkel tettük láthatóvá. A fehérjesávok sűrűségét az Image J segítségével határoztuk meg. A GAPDH-t kontrollként alkalmaztuk a relatív fehérjeszintek kiszámításához.

Sejttenyésztés és csoportosítás
Az MC3T3-E1 egér pre-osteoblasztokat a Chinese Tissue Culture Collections-től (CTCC, Kína) vásároltuk, és 10% magzati szarvasmarha szérumot és 100 U/ml penicillint és 100 mg/ml sztreptomicint tartalmazó -MEM-ben tenyésztettük. párásított inkubátor 37 fokon és 5 százalékos CO2-on. A csontdifferenciáló tenyészethez oszteogén indukciós tápközeget állítottunk elő 10 mM- -glicerofoszfát és 50 mg/ml aszkorbinsav (Sigma-Aldrich) -MEM-mel való összekeverésével, majd hozzáadtuk az MC3T3-E1 sejtekhez, hogy indukálják. megkülönböztetésük. A tápközeget 3 nap múlva cseréltük. 14 napos tenyészeteket használtunk az alkalikus foszfatáz (ALP) életképességének megállapítására. Ezenkívül a sejteket PI3K gátló LY294002-vel (10 μM) 30 percig előkezeltük, majd Dex-szel és ACT-vel kezeltük.

Sejtéletképességi vizsgálat
A Cell Counting Kit-8 (CCK-8) vizsgálatot az ACT-vel kezelt oszteoblasztok életképességének felmérésére végezték el. Az MC3T3-E1 sejteket 96 lyukú lemezekre oltottuk be 5 × 103 sejt/lyuk mennyiségben. Korábbi tanulmányok [29] alapján 1 μM Dex-mennyiséget vettek figyelembe, és az ACT gradiens koncentrációival (10-8, 10-7, 10-6 és 10-5 M) együtt inkubáltuk. A tenyésztő táptalajt a 96-lyuklemezeken a keverőközeg és a CCK-8 reagens 10:1 arányú hozzáadása után cseréltük ki. 1 órán át 37 °C-on történő további inkubálás után értékeltük az OD450 változását.

Osteoblast apoptózis számának kimutatása
A különböző kezeléseknek alávetett MC3T3-E1 sejteket EDTA-mentes tripszinnel emésztettük, és centrifugálással összegyűjtöttük. Egyszeres kötőpufferrel történő mosás után 5 μL Annexin V-FITC-t adtunk hozzá, és szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk, kiegészítve 5 µl PI-vel, és átengedtük egy 200-hálós nejlonhálón. A mintákat FACScan áramlási citometriai rendszerrel elemeztük.

ALP aktivitási vizsgálat
Az MC3T3-E1 sejteket 24-lyuklemezekre oltottuk be, majd vakolás után ACT-t és Dex-et adtunk hozzá. A sejttenyésztő tápközeget oszteogén differenciáló táptalajra cseréltük a tenyésztéshez. A sejtek sejtlízisoldattal (P0012J, Beyotime Biotechnology) végzett lízise után a felülúszót centrifugálással összegyűjtöttük, és a standard görbét ábrázoltuk. ALP készletet (P0132S, Beyotime Biotechnology) használtunk az ALP aktivitás értékelésére, és kiszámítottuk az OD450 értéket.

Statisztikai analízis
Három független kísérlet három párhuzamos elvégzése után az adatokat GraphPad Prism 6.{1}} szoftverrel elemeztük, és átlag ± standard deviációban fejeztük ki. ANOVA-t alkalmaztunk a több csoport közötti statisztikai különbségek összehasonlítására. A P-érték < 0,05 statisztikailag eltérőnek tekinthető.