Vita

Kifejlesztettünk egy kvantitatív, valós idejű technikát az SNCA sejtről sejtre történő átvitelének tanulmányozására.C. elegans. A modell a synucleinopathia számos kulcsfontosságú jellemzőjét mutatja, beleértve az SNCA aggregátumok progresszív felhalmozódását,idegi degeneráció,viselkedési hiányosságok, éscsökkentett élettartam. Mind a genetikai, mind afarmakológiai manipulációkaz állatok között erős összefüggést mutattak kiöregedési ráták, transzcelluláris SNCA transzmisszió és neurodegeneratív fenotípusok, és hasonlóképpen különféle manipulációköregedésgátló hatásoklassíthatja ezen események előrehaladását.A synucleinopathia öregedéstől függő progressziójaa fehérje degradáció csökkenése kíséri.Öregedésgátló kezelésekhelyreállíthatja a fehérjelebontást közvetítő rendszereket. Ezenkívül a lizoszómális funkció helyreállítása enyhítette az aggregátumok terjedését és az ezzel járó neurodegenerációt ezekben az öregedési modellekben. A BiFC széles körben használtfluoreszcencia technika, amelyet sikeresen alkalmaztak a fehérje-fehérje kölcsönhatások és a fehérje dimerizáció és/vagy oligomerizáció értékelésére élő sejtekben.7 A V1S-SV2 BiFC párról kimutattákfluoreszkálnak az SNCA dimerizációja/oligomerizációja során, amikor ezek a fehérjék emlőssejtekben együtt expresszálódnak.7 Egy korábbi tanulmányban17 V1S és SV2 egyikét expresszáló neuroblasztóma sejtvonalak létrehozásával kimutattuk, hogy az SNCA fehérjék sejtről sejtre történő átvitele és az átvitt fehérjék koaggregációja aAz endogén SNCA BiFC segítségével vizualizálhatófluoreszcenciae sejtek együtttenyésztése során.

Üdvözöljük a Shop for Getting Herbs Cistanche Öregedésgátló kezeléshez

Ingyenes szállítás és globális kiszállítás.

A BiFC rendszer egyik fontos technikai kérdése az egyes fehérjék sejttípus-specifikus expressziójának ellenőrzése.Bár az SNCA transzgenikus expressziójának kvantitatív elemzése az egyes sejttípusokban technikailag nem kivitelezhető, számos adatunk van, amelyek alátámasztják azt az érvet, hogy az SNCA kizárólagcsak a tervezett sejttípusokban fejeződik ki. Először is, DsRedkudarcoka rákot csak flipben észlelik-21 neuronok, egyáltalán nem a garat izomsejtekben. Másodszor, az SNCA immunfluoreszcens festése egy nagyon specifikus és érzékeny antitesttel specifikusan kimutatta ennek a fehérjének az expresszióját a kívánt sejtben.típusok. Harmadszor, ugyanaz a BiFC-pár kifejezése a férgekbena ... valdyn-1mutáció jeleififierősen csökkentette a BiFC-tfluoreszcencia jel, ami azt jelzi, hogy a BiFC generálásafluoresendocitózist igényel. Ez arra utal, hogy a BiFC jel nem a BiFC pár koexpressziójából származik ugyanazon sejttípusokban, hanem a fehérjék intercelluláris átviteléből származik.

új genetikai modulátorok azonosítására szolgáló rendszer. Ezenkívül a C. elegans garatának jellegzetes szerkezete lehetővé teszi a synucleinopathia átvitelében bekövetkezett változások kényelmes azonosítását a genetikai és kismolekulájú módosítók nagy léptékű szűrése során.

Az öregedés hatásaiaz „átvitel” folyamatai, nem pedig maga az aggregáció, a cikk fő témája. Szeretnénk most világossá tenni, hogy nem próbálunk azzal érvelni, hogy az öregedés és a lizoszómális diszfunkció csak az aggregátumok átvitelét befolyásolja anélkül, hogy magát a sejt-autonóm aggregációt befolyásolná. BiFC rendszerünk kiváló rendszer az átviteli esemény számszerűsítésére, de nem a hívás-autonóm aggregáció figyelésére tervezték. Korábbi tanulmányok, 25-27 beleértve a sajátunkat is,28 a lizoszómális diszfunkciónak a sejt-autonóm SNCA-aggregáció kiürülésében gyakorolt ​​hatásaival foglalkoznak. Ugyanakkor arra is szeretnénk rámutatni, hogy nincs végleges bizonyíték arra, hogy ezek a vizsgálatok csak a sejt-autonóm aggregációt figyelték volna meg, kizárva a transzcelluláris aggregátum transzmisszió és amplifikáció hatásait. Szeretnénk hangsúlyozni azt is, hogy az aggregáció kezdeményezése abszolút feltétele az aggregált átvitelnek. Valójában megmutatjuk, hogy az alapszintű sejtautonóm aggregáció spontán módon történik még egyetlen transzgenikus állatokban is (8F. ábra).

AA GlcNAc öregedésgátló hatásaDAF{0}}függetlennek írták le.12 Ez azt jelzi, hogy a GlcNAc nem azáltal menti meg a daf-16 fenotípust, hogy közvetlenül befolyásolja a DAF-16 útvonalat, hanem független öregedési útvonalakon keresztül. Az általunk bemutatott adatok arra utalnak, hogy az SNCA transzmissziót nem egy meghatározott öregedési folyamat szabályozza, hanem az általános öregedés szabályozza.

Jelenlegi tanulmányunk alapot ad az általános öregedésgátló megközelítések terápiás stratégiák alkalmazásának mérlegeléséhez a PD és a kapcsolódó szinukleinopátiák progressziójának megállítására vagy lassítására. Ezenkívül a lizoszómális funkciót fokozó szerek olyan terápiák jelöltjeinek tekinthetők, amelyek célja e betegségek progressziójának megállítása vagy késleltetése. Ugyanez a megközelítés elméletileg alkalmazható más, életkorral összefüggő neurodegeneratív betegségekre is, amelyek közül sokról azt gondolják, hogy specifikus fehérje-aggregátumok szaporodása révén fejlődik ki. Feltételezve, hogy a különböző fehérje-aggregátumok szaporodása ugyanazt az alapelvet követi, óvatosan feltételezzük, hogy az öregedésgátló és pro-lizoszóma stratégiák általános terápiává fejleszthetők sok neurodegeneratív betegség progressziójának megállítására. Ezt a hipotézist úgy lehet kezelni, hogy a BiFC-alapú állatmodellt más transzmissziós modellekre alkalmazzuk, beleértve a MAPT-et, a poliglutamin fehérjéket és a TARDBP.1-et.

Anyagok és metódusok

Törzsek és fonálférgek tenyésztése Az összes törzset standard eljárásokkal kezeltük, és 20 °C-on Escherichia coli (E. coli) OP50 törzset tartalmazó fonálféreg-tenyésztő táptalajokon (NGM) tenyésztettük.29 Vad típusú Bristol N2 és a mutáns törzsek unc-119(ed3), dyn-1(ky51) és asp-4(ok2693) a Caenorhabditis Genetics Centertől (CGC; University of Minnesota, St. Paul, MN) szerezték be , USA). Az asp{11}}(tm666) mutáns törzset a C. elegans National BioResource Project (NBRP; Tokyo Women's Medical University School of Medicine, Tokió, Japán) biztosította. A daf-2(e1370) és a daf{15}}(mu86) mutáns törzsek nagylelkű ajándékai Kyuhyung Kim professzortól (DGIST, Daegu, Korea).

Plazmid konstrukció a C. elegans számára

A V1S és SV2 templát plazmidok Dr. Pamela McLean (Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA) nagylelkű ajándékai voltak. Egy) Pmyo-2::EGFP A myo-2 promotert (Pmyo-2) vad típusú N2 férgekből nyert genomi DNS-ből PCR-amplifikáltuk.

Egy HindIII helyet tartalmazó szensz primert (50 -GACAAGCTTGGGGTTTTGTGCTGTG GACGTT-30) és egy BamHI helyet tartalmazó antiszensz primert (50 - GACGGATCCTTCTGTGTCTGACGATCGAGG-30) használtunk. A Pmyo-2::EGFP-t úgy hoztuk létre, hogy a PCR-terméket a pFX_EGFPT-vektor HindIII- és BamHI-helyeibe illesztjük.30 Kettő) Pmyo-2::SNCA(Myc) Egy érzék A SalI helyet tartalmazó primer, az 50 - AGCGTCGACGC CACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30 és egy antiszensz primer, amely myc címkeszekvenciát és BglII helyet, 50 - AGCA GATCTCTACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCG1 GCTTCAGGTC{{GTAGCamp} pcDNA3.1 MycHis SNCA vektorból nyert címkézett humán SNCA.28 A Pmyo-2::EGFP EGFP fragmentumát a PCR-amplifikált Myc-címkézett humán SNCA fragmentum helyettesíti a Pmyo-2::SNCA létrehozása érdekében. (Myc). Három) Pmyo-2::V1S Szensz primer, amely SalI helyet (50 - AGCGTCGACGC CACCATGGTGAGCAAGGCCGAGG-30) és BglII helyet tartalmazó antiszensz primert (50 -AGCAGATCTTTAGGCTT CAGGTTCGTAGTC{-30) tartalmaz. 25}}-t használták a V1S erősítésére. Ezenkívül a Pmyo-2::EGFP EGFP-fragmensét a PCR-amplifikált V1S-fragmens helyettesítette a Pmyo-2::V1S létrehozásához. Négy) Pmyo-2::V1Q25 Egy claI helyet tartalmazó szensz primer, 50 - TAAGCAATCGA TATGGCGACCCTGGAAAAGCTG-30, és egy antiszensz primer, amely claI helyet tartalmaz, 50 -TGCTTAATCGATAGGTCGGTGTC 38}} használtuk a Q25 erősítésére. Ezután a Pmyo-2::V1S humán SNCA-fragmensét lecserélték a PCR-amplifikált Q25-fragmensre, hogy létrehozzák a Pmyo-2::V1Q25-öt. Négy) Pflflp-21::SV2 A pFX_EGFPT EGFP-fragmensét a PCR-amplifikált SV2-fragmenssel helyettesítettük, hogy SV2-vektort hozzunk létre.

A SpeI helyet tartalmazó szensz primert (50 -AGCACTAGTGCCACCATGGATG TATTCATGAAAGG-30) és egy BglII helyet tartalmazó antiszensz primert (50 -AGCAGATCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC CG-30) használtuk. A flip-21 promotert (Pflflp-21) PCR-amplifikáltuk az N2 genomiális DNS-ből, és az SV2 vektor KpnI és SalI helyeire szubklónoztuk a Pflflp-21::SV2 létrehozásához. Egy KpnI helyet tartalmazó szensz primert (50 - AGCGGTACCAACTAGGTCCAGTGACCGAAAG-30 és egy SalI helyet tartalmazó antiszensz primert (50 -AGCGTCGACGCCAC CATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30) használtak az flp{{15}amplfifikációra. } promóter. Öt) Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed A DsRed-et garat neuronális markerként együtt expresszáló SV2 vektor létrehozásához a Pflflp{20}}-t szubklónoztuk a pFX{ KpnI és SalI helyeire {21}}DsRedxT vector30 és neve Pflflp-21::DsRed. Az SV2 és a DsRed együttes expresszióját az flflp-21 promoter alatt úgy érték el, hogy az SV2 és a DsRed közé intercisztronikus régiót (ICR) helyeztek, amelyet N2-ből PCR-amplifikáltunk.31 Az SV2 fragmentumot fúzióval fuzionáltattuk az ICR régióval. PCR32 és szubklónozva a Pflflp-21::DsRed-be a Pflflp-21::SV2-ICR DsRed létrehozásához. A PCR reakcióban egy SalI helyet (50 -AGCGTC GACGCCACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30) és egy ICR-rel átfedő régiót tartalmazó antiszensz primert, 50 -CGATCATTTTGGAGATTACTTGTACAGCTTGTCC{38}} használtunk. az SV2 számára. Az ICR régiót egy szensz primerrel amplifikáltuk, amely egy átfedő régiót tartalmazott az SV2-vel, a 50 -GGACGAGCTGTACAAGTAATCTCCAAAAT CATCG-30, és egy antiszensz primerrel, amely egy SpeI helyet tartalmazott 50 - AGCACTAGTTACCCTGTAATAATATATTAAAC-3

BiFC transzgénikus férgek létrehozása

Pmyo-2::V1S és Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed plazmidokat injektáltunk a késői L4-stádiumú N2 férgek ivarmirigyeibe egy pRF4 szelekciós markerrel. amely egy mutáns kollagén gént, a rol- 6(su1006), 33-at expresszálja, hogy létrehozzon egy kettős transzgenikus vonalat, amely kifejezi a BiFC párt. A BiFC negatív kontrolljaként a Pmyo-2::V1S-t önmagában injektálták az N2 férgekbe pRF4-gyel, és a Pflflp-21::SV2-ICR DsRed-et egyedül az unc{{18} }}(ed3) mutáns férgek szelekciós markerrel, a pCFJ151, amely az unc-119(C) gént expresszálja.34 A Pmyo-2::V1 plazmidot azért hoztuk létre, hogy a BiFC részleges szekvenciát csak bejuttatással fejezze ki. a stopkodon közvetlenül az SNCA kódoló szekvencia előtt a Pmyo-2::V1S-ben egy Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit segítségével (Stratagene, 200521). A Pmyo-2::V1 és Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed plazmidokat ezután koinjektáltuk N2-be pRF4-gyel. A Pmyo-2::V1Q25 plazmidot úgy hoztuk létre, hogy a huntingtin 1. exonját 25 glutaminszakasszal expresszálja úgy, hogy az SNCA-t a Q25 fragmentumra cseréljük a Pmyo-2:: V1S-ben. A Pmyo-2::V1Q25 és Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed plazmidokat ezután koinjektáltuk N2-be pRF4-gyel. Ezenkívül a Pflflp-21::DsRed-et N2-be fecskendezték pRF4-gyel, hogy kontrollálják az általános fehérje-túlexpresszió hatásait az idegsejtekben. A bevitt plazmidok kromoszómális integrációjához az injektált vonalakat UV-sugárzásnak tesszük ki. UV besugárzás után minden egyes integrált vonalat négyszer kereszteztünk N2-vel. A Pmyo-2::V1S-t és a Pflflp{60}}::SV2-ICR-DsRed-et hordozó kettős transzgenikus vonalakat egy integrált Pmyo-2::V1S vonal és egy integrált vonal párosításával hoztuk létre. Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed vonal. Ezen transzgenikus férgek mindegyike görgős fenotípust és DsRed expressziót mutatott

fluoreszcencia a garat neuronjaiban.

Címkézetlen SNCA-modellek előállítása A Pmyo-2::SNCA és Pflflp-21::SNCA plazmidokat úgy tervezték, hogy az SNCA-t csak úgy expresszálják, hogy egy stopkodont közvetlenül az SNCA kódoló szekvencia után iktattak be QuikChange Site-Directed Mutagenesis segítségével. Készlet. Negatív kontrollként a Pmyo-2::SNCA-t önmagában injektáltuk N2 férgekbe pRF4-gyel. Pmyo-2::SNCA és Pflflp-21:: SNCA plazmidokat pRF4-gyel koinjektáltunk késői L4-stádiumú N2 férgek ivarmirigyeibe. Ezen férgek mindegyike görgős fenotípust mutatott, és mindegyik genotípusból 3 reprezentatív vonalat használtunk a kísérletekhez. Az öregedéssel kapcsolatos BiFC-modellek előállítása Pmyo-2::V1S és Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed plazmidokat injektáltak a késői L4-stádiumú daf ivarmirigyeibe -2(e1370) és daf-16 (mu86) mutáns férgek a pRF4-gyel. Az öregedéssel kapcsolatos BiFC-modellek kontrolljaként a Pmyo-2::V1S vagy Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed önmagában injektált a késői L{{30} ivarmirigyeibe. }stádiumú N2 és daf-16(mu86) mutáns férgek pRF4-gyel. Miután a bejuttatott plazmidokat tartalmazó több transzgenikus vonalat megkaptuk, minden mutáns háttérben 3 reprezentatív vonalat használtunk a kísérletekhez.

hlh-30p::hlh-30 transzgénikus vonalak generálása

A hlh-30p::hlh-30::gfp-t expresszáló plazmidot Dr. Malene Hansen (Sanford-Burnham Medical Research Institute, CA, USA) nagylelkű ajándékként kapta. A hlh-30p::hlh-30 plazmidot úgy tervezték meg, hogy a GFP-t kódoló szekvencia elé stopkodont vigyen be egy QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit segítségével a GFP expresszió gátlására. Kontrollként minden Pmyo-2::V1S vagy Pflflp-21::SV2-ICRDsRed és hlh-30p::hlh-30 együtt került a késői L4-stádiumú N2 férgek ivarmirigyei pRF4-gyel. A Pmyo-2::V1S, Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed és hlh-30p::hlh-30 plazmidokat együtt injektáltuk a késői L4-stádiumú daf-16(mu86) mutáns férgek ivarmirigyei pRF4-gyel. A lizoszómális diszfunkció elemzéséhez asp-4(ok2693) és asp-1(tm666) mutáns férgeket használtak, amelyekben a lizoszomális enzim katepszin génje inaktiválva van. A Pmyo-2::V1S és Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed plazmidokat pRF4-gyel együtt injektáltuk a késői L4-stádiumú mutáns férgek ivarmirigyeibe. Miután megkaptuk a bejuttatott plazmidokat tartalmazó transzgenikus vonalakat, minden genotípusból 3 reprezentatív vonalat használtunk a kísérletekhez.

Immunfluoreszcens mikroszkóp

A férgek immunfluoreszcens festéséhez a vad típusú N2-t és a transzgenikus férgeket összegyűjtöttük, M9 pufferrel (22 mM KH2PO4, 22 mM Na2HPO4, 85 mM NaCl, 1 mM MgSO4) mostuk, majd 4 százalékos paraformaldehiddel (MRWB-ben) előzetesen rögzítettük. 80 mM KCl, 20 mM NaCl, 1{{60}} mM EGTA, 5 mM spermidin [Sigma-Aldrich, S0266], 50 százalékos metanol). A kutikula réteg merevségének csökkentése érdekében a férgeket folyékony nitrogén alkalmazásával több fagyasztási/olvadási ciklusnak vetettük alá, majd 4 C-on 2 órán át keverés közben inkubáltuk. Mivel a redukciós és oxidációs lépések növelik a féreg permeabilitását, a férgeket Tris-Triton pufferrel mostuk (100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Triton X-100 [Bio-Rad laboratories Inc., 161–161). 0407], 1 mM EDTA), és 1% b-merkapto-etanollal (Sigma-Aldrich, M7522) Tris-Triton pufferben szobahőmérsékleten (RT) 2 órán át inkubáltuk. Ezt követően a férgeket kollagenáz oldatban (100 egység IV típusú kollagenáz [Worthington Biochemical Co., LS004188] 100 mM Tris-HCl-ben, pH 7,4, 1 mM CaCl2, 0,1% Triton X{50}} rotációval inkubáltuk. 4 órán át szobahőmérsékleten. Ezután a férgeket 0,3% H2O2-val kiegészített Tris-Triton pufferben (Sigma-Aldrich, H1009) 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Blokkoló pufferben (0,1% szarvasmarha szérumalbumin [BSA; Sigma-Aldrich, A7906], 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA foszfátpufferes sóoldatban [PBS; GenDEPOT, CAP{69}}] végzett inkubálás után ]), a férgeket 274 mAb10 monoklonális antitesttel inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on primer antitest oldatban (1% BSA, 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA PBS-ben). Másnap a férgeket blokkoló pufferrel mostuk, és rodaminvörös X-konjugált kecske anti-egér IgG-vel (1:100; Jackson Immunoresearch Laboratories, 115-295-166) 2 órán át inkubáltuk. A férgeket ezután blokkoló pufferrel mostuk, és Antifade reagensbe (Invitrogen, P36930) helyeztük. A mintákat Olympus FV1000 konfokális lézer-pásztázó mikroszkóppal (Olympus, Tokió, Japán) elemeztük.

Élő férgek fluoreszcens mikroszkópja

A férgeket 10 mM nátrium-aziddal immobilizáltuk M9 pufferben, és fedőlemezzel fedtük le. A férgek képeit Olympus FV1000 konfokális lézer pásztázó mikroszkóppal készítettük.

Western blot

A kifejlett férgeket M9 pufferrel, majd 1% Triton X{2}} tartalmú PBS-sel mostuk. A féregpelletet 1% Triton X{4}}-t, 1% (térf/térf.) proteázgátló koktélt (Sigma-Aldrich, P8340) tartalmazó PBS-ben ultrahanggal kezeltük, és centrifugáltuk, hogy megkapjuk a Tritonban oldható anyagot (felülúszót). ) és -oldhatatlan (pellet) frakciók. A fehérjekoncentrációt BCA fehérjevizsgálattal (Pierce Biotechnology, 23223 és 23224) mértük. A fehérjemintákat (3 mg az SNCA expressziós teszthez, 50 mg a poliubiquitin fehérjék kimutatásához és 20 mg (V1S, V1SCSV2 vonalak) és 40 mg (SV2 vonalak) az SNCA eltérő oldhatóságához) 12 százalékos SDS-PAGE gélekre töltöttünk. A Western blottoláshoz használt elsődleges antitestek a monoklonális anti-SNCA antitest, a 274 mAb (1:1500) és a Syn-1 (1:1500; BD BioScience, 610787), valamint az anti-ubiquitin antitest (1:3,{) voltak. {35}}; Abcam, ab7254). A kemilumineszcenciás detektálást a LAS-3000 lumineszcencia képanalizátor (Fujifilm, Tokió, Japán) és az Amersham imager 600 (Ge Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA), valamint a Multi Gauge (v3.0) szoftver (Fujifilm) segítségével végeztük. , Tokió, Japán).

Dot blotting

Mindegyik törzs kifejlett férgeit M9 pufferrel, majd 1% Triton X{2}}-ot tartalmazó PBS-sel mostuk. A féregpelletet 1% Triton X-100-t és 1% (térfogat/térfogat) proteázgátló koktélt tartalmazó PBS-ben ultrahanggal kezeltük. A fehérjemintákat (500 ng) nitrocellulóz membránokra töltöttük, majd szárítottuk és blokkoló oldatban inkubáltuk. A dot blottoláshoz használt elsődleges antitestek a 274 mAb monoklonális anti-SNCA antitestek és a Syn-O2,13 voltak, amelyek közül az utóbbi specifikus az SNCA aggregátumokra. A kemilumineszcenciás detektálást a LAS-3000 lumineszcencia képanalizátor és az Amersham imager 600, valamint a Multi Gauge (v3.0) szoftver segítségével végeztük.

Öregedésgátló szeres kezelés

N-acetil-glükózamint (GlcNAc) (Sigma-Aldrich, A8625) desztillált vízben 1 M-re oldjuk törzsoldatként. A törzsoldatot LB folyékony tápközeggel (Sigma-Aldrich, L3022) hígítottuk. Az egyes transzgenikus vonalak L4-stádiumú férgeit 10 mM GlcNAc végső koncentrációt tartalmazó NGM lemezekre vittük át. Egyféregű PCR Mindegyik vonalból egy gravid egyetlen gilisztát lizáltunk lízispufferben (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 0,45% NP-40 [IGEPAL; Sigma-Aldrich, I3021], 0,45% Tween 20 [Sigma-Aldrich, P1379]) 0,1 mg/ml proteináz K-val (Sigma Aldrich, P4850). A pufferben lévő egyetlen férget folyékony nitrogén alkalmazásával több fagyasztás-olvasztás ciklusnak vetettük alá, 65 C-on 1 órán át inkubáltuk a genomi DNS felszabadulásához, majd 15 percig 95 C-on melegítettük a proteináz K inaktiválására. Ex TaqTM polimeráz (Takara Biotechnology, RR001A) felhasználásával végeztük Bio-Rad MyCycler PCR Thermal Cycler rendszerben (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA).

PCR-restrikciós fragmens hossz polimorfizmus genotipizálás

Mindegyik vonalból 5 Gravid férget lizáltunk a lízispufferben 0,1 mg/ml proteináz K-val. A pufferben lévő férgeket folyékony nitrogén alkalmazásával több fagyasztás-felengedési ciklusnak vetettük alá, majd 65 C-on 1 órán át inkubáltuk. felszabadítja a genomiális DNS-t, majd 95 °C-on 15 percig melegítjük, hogy inaktiválja a proteináz K-t. A PCR végrehajtása után a PCR-termékeket NcoI enzimmel (New England Biolabs Inc., R3193S) emésztjük 37 C-on egy éjszakán át, majd elektroforetizáljuk a restrikció kimutatására. fragmenthossz polimorfizmus.

Kvantitatív PCR (qPCR)

A kifejlett transzgenikus férgeket összegyűjtöttük és M9 pufferben mostuk. A pufferben lévő férgeket ultrahanggal kezeltük, és a mintákat folyékony nitrogén alkalmazásával több fagyasztás-olvadás ciklusnak vetettük alá. Az RNS-t Trizol Reagent (Invitrogen, 15596-026) segítségével extraháltuk, és az RNeasy mini kit (Qiagen, 74106) segítségével tisztítottuk. Mindegyik cDNS-t 500 ng teljes RNS-ből szintetizáltuk az iScript cDNS-szintézis készlet (Bio-Rad Laboratories Inc., 170–8891) segítségével. A valós idejű PCR-hez a célgéneket és a specifikus primereket SYBR Premix Ex Taq II-vel (Takara Biotechnology, RR081A) kevertük 96-lyuklemezeken. A korábban más csoportok által tervezett specifikus primereket használtuk.14 A DNS-termékeket a 7500 Real-Time PCR rendszerrel (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) elemeztük. A célgének relatív mRNS-szintjét normalizáltuk, hogy működjenek-1.

A dyn-1 mutáns hősokkos kezelése

A kettős transzgenikus férgeket (Pmyo-2::V1S C Pflflp-21::SV2-ICR DsRed) dyn-1(ky51) mutáns férgekkel párosították.20 Felnőtt a kettős transzgenikus vonal anyaférgeit, dyn-1(ky51) mutációval vagy anélkül, E. coli OP50-et tartalmazó NGM lemezeken tenyésztettük 4 órán át 20 C-on, hogy tojásokat rakjunk, majd eltávolítjuk. Az egyes törzsek L4-stádiumában lévő szinkronizált utódférgeket 30 C-on tenyésztettük megfigyelésre.

Garatpumpálás elemzése

A garat pumpálását 1 percig szobahőmérsékleten számoltuk fluoreszcens mikroszkóp segítségével. Vad típusú N2-t, mutánsokat és transzgenikus férgeket elemeztünk. Az adatokat PPM-ben (pumpa per perc) fejeztük ki.

Élettartam vizsgálat

A kifejlett anyaférgek által lerakott tojásokat az L4 lárvaállapotig szinkronban neveltük E. coli OP50-nel oltott NGM lemezeken 20 C-on. Az L4-stádiumú férgeket 100 mM 5- tartalmú NGM lemezekre vittük át. flfluoro-20 -dezoxiuridint (Sigma-Aldrich, F0503), hogy megakadályozzák az utódnemzést. Az élő vagy elpusztult férgek számát egy vagy 2 naponként rögzítettük. Azokat a férgeket, amelyek felszakadtak, beásták vagy lekúsztak a lemezekről, cenzúrázták, de az élettartam-elemzésben cenzúrázott állatokként szerepeltek. A túlélési adatokat az OASIS (élettartam-vizsgálatok túlélési elemzésére szolgáló online alkalmazás) segítségével elemeztük.

Statisztikai analízis

Minden kísérletet vakkódolva végeztünk, és legalább háromszor megismételtük. Az ábrákon szereplő értékeket átlagban fejeztük ki. A különbségeket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha a P értékek § < SEM. 0.05. A grafikonokat Prism 5 szoftverrel (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA) készítettem. Az értékeket egyutas ANOVA-val hasonlítottuk össze a Tukey posthoc teszttel, InStat (3.05-ös verzió) szoftverrel (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA).

Rövidítések

ACTB aktin, b

AD Alzheimer-kór

Ab amiloid b

ALS amiotrófiás laterális szklerózis

BiFC bimolekuláris fluoreszcencia komplementáció

GlcNAc N-acetil-glükózamin

PD Parkinson-kór

Az esetleges összeférhetetlenség feltárása

Lehetséges összeférhetetlenséget nem tártak fel.

Finanszírozás

Ezt a munkát a Nemzeti Kutatási Alapítvány (NRF) támogatása támogatta, amelyet a koreai kormány (MEST) finanszírozott (NRF-2015R1A2A1A10052540, NRF-2015R1A2A1A15053661), valamint a Koreai Egészségügyi Technológiai K+F Projekt, az Egészségügyi Minisztérium. & Welfare, Koreai Köztársaság (HI14C0093), valamint a Konkuk Egyetem 2014. évi KU Brain Pool Programja.

Hivatkozások

[1] Brundin P, Melki R., Kopito R. Prion-like transfer of protein aggregates in neurodegenerative betegségek. Nat Rev Mol Cell Biol 2010; 11:301-7; PMID:20308987;http://dx.doi.org/10.1038/nrm2873

[2] Lee SJ, Desplats P, Sigurdson C, Tsigelny I, Masliah E. Nem prionfehérje-aggregátumok sejt-sejt átvitele. Nat Rev Neurol 2010; 6:702-6; PMID:21045796; http://dx.doi.org/10.1038/nrneurol.2010.145

[3] Jucker M, Walker LC. Patogén fehérje-aggregátumok önszaporodása neurodegeneratív betegségekben. Természet 2013; 501:45-51; PMID:24005412;http://dx.doi.org/10.1038/nature12481

[4] Bae EJ, Lee HJ, Rockenstein E, Ho DH, Park EB, Yang NY, Des plats P, Masliah E, Lee SJ. Az extracelluláris a-synuclein antitest által támogatott kiürülése megakadályozza a sejt-sejt aggregátum átvitelt. J Neurosci 2012; 32:13454-69; PMID:23015436; http://dx.doi.org/ 10.1523/JNEUROSCI.{11}}.2012

[5] Tran HT, Chung CH, Iba M, Zhang B, Trojanowski JQ, Luk KC, Lee VM. Az alfa-synuclein immunterápia blokkolja a hibásan hajtogatott a-synuclein felvételét és sablonos terjedését és a neurodegenerációt. Cell Rep 2014; 7:2054-65; PMID:24931606; http://dx.doi.org/10.1016/j. sejt rep.2014.05.033

[6] Lee HJ, Bae EJ, Lee SJ. Az extracelluláris a-synuclein egy új és döntő tényező a Lewy-testbetegségekben. Nat Rev Neurol 2014; 10:92-8; PMID:24468877;http://dx.doi.org/10.1038/nrneurol.2013.275

[7] Outeiro TF, Putcha P, Tetzlaff JE, Spoelgen R, Koker M, Carvalho F, Hyman BT, McLean PJ. Toxikus oligomer a-synuclein fajok kialakulása élő sejtekben. PLoS One 2008; 3:e1867; PMID:18382657; http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0001867

[8] McKay JP, Raizen DM, Gottschalk A, Schafer WR, Avery L. enni-2 és enni-18 szükséges a nikotinos neurotranszmisszióhoz a Caenorhabditis elegans garatban. Genetika 2004; 166:161-9; PMID:15020415; http://dx.doi. org/10.1534/genetics.166.1.161

[9] Rogers C, Reale V, Kim K, Chatwin H, Li C, Evans P, de Bono M. A Caenorhabditis elegans társadalmi táplálásának gátlása az NPR FMRFamiddal kapcsolatos peptidaktivációjával-1. Nat Neurosci 2003; 6:1178-85; PMID:14555955;http://dx.doi.org/10.1038/nn1140

[10] Lee HJ, Bae EJ, Jang A, Ho DH, Cho ED, Suk JE, Yun YM, Lee SJ. Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatok a-synucleinre faj- és multimer állapotspecifitásokkal. J Neurosci Methods 2011; 199:249-57; PMID:21658411; http://dx.doi.org/10.1016/j. Németh.2011.05.020

[11] Kenyon C, Chang J, Gensch E, Rudner A, Tabtiang R. A C. elegans mutáns, amely kétszer annyi ideig él, mint a vad típus. Nature 1993; 366:461-4; PMID:8247153;http://dx.doi.org/10.1038/366461a0

[12] Denzel MS, Storm NJ, Gutschmidt A, Baddi R, Hinze Y, Jarosch E, Sommer T, Hoppe T, Antebi A. A hexózamin útvonal metabolitjai fokozzák a fehérje minőségi kontrollját és meghosszabbítják az életet. Cell 2014; 156:1167-78; PMID:24630720; http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.061

[13] Vaikath NN, Majbour NK, Paleologou KE, Ardah MT, van Dam E, van de Berg WD, Forrest SL, Parkkinen L, Gai WP, Hattori N és mások. Új konformáció-specifikus monoklonális antitestek előállítása és jellemzése a-synuclein patológiához. Neuro biol Dis 2015; 79:81-99; PMID:25937088; http://dx.doi.org/ 10.1016/j.nbd.2015.04.009

[14] Lapierre LR, De Magalhaes Filho CD, McQuary PR, Chu CC, Visvikis O, Chang JT, Gelino S, Ong B, Davis AE, Irazoqui JE és mások. A TFEB ortológ HLH-30 szabályozza az autofágiát és modulálja a hosszú élettartamot a Caenorhabditis elegansban. Nat Commun 2013; 4:2267; PMID:23925298

[15] Vilchez D, Morantte I, Liu Z, Douglas PM, Merkwirth C, Rodrigues AP, Manning G, Dillin A. Az RPN-6 meghatározza a C. elegans élettartamát proteotoxikus stressz körülmények között. Természet 2012; 489:263-8; PMID:22922647;http://dx.doi.org/10.1038/nature11315

[16] Hansen C, Angot E, Bergstrom AL, Steiner JA, Pieri L, Paul G, Outeiro TF, Melki R, Kallunki P, Fog K, et al. Az a-synuclein az egér agyából az átültetett dopaminerg neuronokba terjed, és tenyésztett emberi sejtekben aggregációt vet fel. J Clin Invest 2011; 121:715-25; PMID:21245577;http://dx.doi.org/10.1172/JCI43366

[17] Bae EJ, Yang NY, Song M, Lee CS, Lee JS, Jung BC, Lee HJ, Kim S, Masliah E, Sardi SP és mások. A glükocerebrozidáz kimerülése fokozza az a-synuklein sejt-sejt átvitelét. Nat Commun 2014; 5:4755; PMID:25156829; http://dx.doi.org/10.1038/ncomms5755

[18] Lee HJ, Suk JE, Bae EJ, Lee JH, Paik SR, Lee SJ. Szerelésfüggő endocitózis és az extracelluláris a-synuclein kiürülése. Int J Biochem Cell Biol 2008; 40:1835-49; PMID:18291704; http://dx.doi.org/ 10.1016/j.biocel.2008.01.017

[19] Desplats P, Lee HJ, Bae EJ, Patrick C, Rockenstein E, Crews L, Spen cer B, Masliah E, Lee SJ. Zárványképződés és neuronális sejthalál az a-synuclein neuron-neuron átvitele révén. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106:13010-5; PMID:19651612; http://dx.doi. org/10.1073/pnas.0903691106

[20] Clark SG, Shurland DL, Meyerowitz EM, Bargmann CI, van der Bliek AM. A dinamin GTPáz mutáció gyors és reverzibilis hőmérséklet-indukálható mozgási rendellenességet okoz C. elegansban. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:10438-43; PMID:9294229; http://dx.doi.org/ 10.1073/pnas.94.19.10438

[21] Lee HJ, Cho ED, Lee KW, Kim JH, Cho SG, Lee SJ. Az autofágikus kudarc elősegíti az a-synuclein exocitózisát és sejtközi transzferét. Exp Mol Med 2013; 45:e22; PMID:23661100; http://dx.doi.org/ 10.1038/emm.2013.45

[22] Syntichaki P, Xu K, Driscoll M, Tavernarakis N. Specifikus aszpartil és calpain proteázok szükségesek a C. elegans neurodegenerációjához. Természet 2002; 419:939-44; PMID:12410314; http://dx.doi.org/ 10.1038/nature01108

[23] Sardiello M, Palmieri M, di Ronza A, Medina DL, Valenza M, Gennarino VA, Di Malta C, Donaudy F, Embrione V, Polishchuk RS és mások. A lizoszómális biogenezist és működést szabályozó génhálózat. Tudomány 2009; 325:473-7; PMID:19556463

[24] Grove CA, De Masi F, Barrasa MI, Newburger DE, Alkema MJ, Bulyk ML, Walhout AJ. Egy többparaméteres hálózat kiterjedt eltérést mutat a C. elegans bHLH transzkripciós faktorai között. Cell 2009; 138:314-27; PMID:19632181; http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2009.04.058

[25] Klucken J, Poehler AM, Ebrahimi-Fakhari D, Schneider J, Nuber S, Rockenstein E, Schlotzer-Schrehardt U, Hyman BT, McLean PJ, Masliah E és társai. Az alfa-synuclein aggregáció egy bafilomicin A 1-érzékeny autofágia útvonalat foglal magában. Autofágia 2012; 8:754-66; PMID:22647715; http://dx.doi.org/10.4161/auto.19371

[26] Yu WH, Dorado B, Figueroa HY, Wang L, Planel E, Cookson MR, Clark LN, Duff KE. A metabolikus aktivitás határozza meg a patológiás oligomer a-synuclein makro-autofág clearance-ének hatékonyságát. Am J Pathol 2009; 175:736-47; PMID:19628769; http://dx.doi.org/10.2353/ ajpath.2009.080928

[27] Kilpatrick K, Zeng Y, Hancock T, Segatori L. A TFEB genetikai és kémiai aktiválása mediálja az aggregált a-synuclein clearance-ét. PloS one 2015; 10:e0120819; PMID:25790376; http://dx.doi.org/ 10.1371/journal.pone.0120819

[28] Lee HJ, Khoshaghideh F, Patel S, Lee SJ. Az a-synuclein oligomer intermedierek kiürülése a lizoszómális degradációs útvonalon keresztül. J Neurosci 2004; 24:1888-96; PMID:14985429; http://dx.doi.org/ 10.1523/JNEUROSCI.{8}}.2004