Gyulladáscsökkentő alapelvek a Pinus Taiwanensis Hayata tűiből és In Silico tanulmányok potenciális öregedésgátló hatásaikról

Absztrakt:Pinusa tű tea nagyon népszerű a keleti országokban, például Japánban, Oroszországban, Koreában és Kínában. A fenyőtű tea állítólag jelentősöregedésgátló hatás,de ezt eddig egyetlen egyértelmű bizonyíték sem támasztotta alá. A jelen tanulmányban tizenöt le nem írt vegyület (1–5), valamint hetvenkét ismert vegyületet tisztítottak és jellemeztek a metanolos kivonatok bioaktív frakciójából.P. taiwanensistűket.

A legjobb öregedésgátló gyógynövények Cistanche termékek

A legtöbb izolátumot megvizsgáltákgyulladásgátló bioaktivitáscelluláris neutrofil modellel és hat vegyülettel (45, 47, 48, 49, 50, és51) kiállított aszignifikáns gátlása a szuperoxid anion képződésébenés elasztáz felszabadulás IC50 értékkel 3,3-tól± 0.9–8.3± 0.8 µM. Ezekgyulladáscsökkentő összetevőkdokkoló számítástechnikának vetették alá, hogy értékeljék a ghrelin receptorhoz való kötődési affinitását, amely fontos szerepet játszott az anyagcsere szabályozásában.öregedésgátló hatások. Vegyületek49, 50, és51 hidrogénkötések és különböző típusú kölcsönhatások révén stabil komplexet képez a ghrelin receptorral.

1. Bemutatkozás

Pinusnemzetség (Pinaceae), amely több mint 100 fajból áll, és főként az északi féltekén elterjedt, általában örökzöld fák, míg néhány cserje.1]. A fenyőfa könnyű, és gyakran használják bútorokhoz. A tűlevelek fenyőhajtásokra gyakorolt ​​különféle farmakológiai hatásait azonban feljegyezték a hagyományos kínai orvoslás ősi könyvei. A "The Divine Husbandman's Herbal Foundation Canon" című könyvben a fenyőtűk elősegítették a haj növekedését, meghosszabbították az élettartamot és oltották a szomjat. A "Taiping Shenghui Fang"-ban feljegyezték, hogy a fenyőtűket alkohollal meg lehet főzni, és öregedésgátló hatást mutattak. Manapság a fenyőtűket teaként dolgozzák fel, és népszerűek Ázsiában. Koreában az alkotórészei aP. densifloratű tea, valamint annakaz antioxidáns és antibakteriális bioaktivitást alaposan vizsgálták [2,3]. A múlt század eleje óta több mint hétszáz vegyületet azonosítottakPinus tűk. A legtöbb közölt irodalom az illóolajhoz kapcsolódikP. densiflflora[4,5], P. halepensis[6,7], P. nigra[4,8], ésP. sylvestris[4,9]. A jellemzett komponensekPinusA tűk többnyire benzenoidok, diterpenoidok, flavonoidok, lignánok, monoterpenoidok és szeszkviterpenoidok.10]. A tűkP. densifloraésP. morrisonicolaantioxidáns bioaktivitásukról számoltak be [11–14]. Ezenkívül a tűk etil-acetátos kivonataP. morrisonicolagátolta a NO fehérje és mRNS expresszióját ésiNOS az LPS-indukált RAW 264.7 makrofágokban, amelyek jelentős gyulladásgátló bioaktivitást mutatnak [13]. A szuperkritikus folyadék kivonatP. densifloratűk gátló hatást mutattak az LPS-indukált NO-termelésre azáltal, hogy csökkentették az expressziótiNOS, valamint az IL-6 és IL-1 expressziójának csökkentése valamint a STAT1 és STAT3 fehérjék aktiválása makrofágokban LPS által kiváltott [15]. Az etanolos kivonatP. thunbergiiA tűk jelentős gyulladáscsökkentő hatást mutattak a makrofágokban, és elnyomták az arachidonsav által kiváltott fülödémát és gátolta a mieloperoxidáz enzimaktivitást.16]. Sőt, az erjesztettP. morrisonicolaA tűk kiváló antioxidáns és gyulladásgátló bioaktivitásukat mutatták az NF-κB jelátviteli útvonal [17]. 

A ghrelin egy peptid hormon, amely huszonnyolc aminosavból áll, és eredetileg a gyomorban fedezték fel.18,19]. Ez a növekedési hormon szekretagóg (GHSR) endogén liganduma, amely a -ágazat az A osztályú GPCR-ekben (G Protein Coupled Receptors) [18,19]. A ghrelin az egyetlen peptidhormon, amely éhséget okoz, hogy fokozza az étvágyat [20]. Számos tanulmány utal arra, hogy a ghrelin fontos szerepet játszik az anyagcsere, az energiaegyensúly, a memória, a szív- és érrendszeri és a gyomor-bélrendszeri funkciók szabályozásában az emberi szervezetben.21–23]. A ghrelin az emberi szervezet különböző fiziológiai és patofiziológiai mechanizmusaiban is részt vesz, például az öregedésben.24,25], és összefügghet a gyulladáscsökkentő aktivitással [26,27]. 2014-ben csoportunk először azonosította a Chin-shin oolong teában az egyedülálló acilezett flflavonoid tetraglikozidokat, a teaghrelineket, és kimutatták, hogy elősegítik a növekedési hormon (GH) felszabadulását.28]. Két másik hasonló vegyületet tisztítottak meg Shy-jih-chuen oolong teában, és igazolták bioaktivitásukat a ghrelin receptoron.29]. A négy teaghrelin ugyanazon a szabályozási úton váltott ki éhséget, mint a ghrelin. Nem korlátozódva a teára, a teaghrelinekhez hasonló szerkezetű vagy bioaktivitású vegyületeket is feltártakPolygonum multiflflorum(Hes houwu) [30], Ginkgo biloba[31], Morus alba[32], ésCistanche tubulosa [33]. Ezek az eredmények támogatnak bennünket abban, hogy természetes öregedésgátló alapelveket keressünk a gyulladáscsökkentő hatással rendelkező tea ghrelin-szerű vegyületek kiszűrésével. A sejtmodellekben a növekedési hormon felszabadulásban való közvetlen elősegítés mellett egyes potenciális vegyületek molekuláris modellezése hatékonyabb lenne a lehetséges jelöltek feltárásában.34]. A farmakológiai hipotézisek kidolgozására és értékelésére számítási módszereket alkalmaztak. A molekuláris dokkolás az egyik leggyakrabban használt technika, és nagy pontossággal előrevetíti a ligandum aktív zsebhez való kötődésének konformációját és affinitását [35,36]. A dokkoló módszerek hatékonyan keresik a nagy dimenziós tereket a lehetséges interakciók érdekében, és olyan pontozási függvényt használnak, amely megfelelően rangsorolja a jelölteket [37]. 

2018-ban három vegyületet tisztítottak meg a tűkbőlP. morrisonicolaés jelentős érrelaxáns aktivitást mutatott, és ezen összetevők közül egy tea ghrelin-szerű szerkezettel rendelkezik [38]. Tajvanon,P. taiwanensisa tűket általában szárítják és sütik, majd híres bioaktivitásuk miatt teaként dolgozzák fel.P. taiwanensisA Hayata az egyik őshonos és endemikus faj Tajvanon. Tajvani vörösfenyőnek vagy huangshani fenyőnek is nevezik. Két tű van egy 8-11 cm hosszú, kissé merev és egyenes facsontban, és az egész szigeten nő az alacsonytól a magasig, és gyakran tiszta erdőt alkot.39]. Előzetes vizsgálat során a metanolos kivonatok etil-acetátos rétegétP. taiwanensistűk szignifikáns gátlást mutattak a szuperoxid anionok képződésében és az elasztáz felszabadulásban az IC-vel50 0 értékei.8± {{0}}.2 és 1.0± 0.1 µg/ml, illetve (S1 táblázat). Ezért jelen tanulmányban a bioaktív összetevőkP. taiwanensisA tűket vizsgáltuk, és a tisztított vegyületek gyulladáscsökkentő hatását értékeltük bioaktivitás sejtes neutrofil modellen. Ezenkívül az izolátumok aP. taiwanensisgyulladásgátló bioaktivitással rendelkező tűket dokkoló számítástechnikának ésa ghrelin receptorral való kölcsönhatásukat vizsgálták.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Általános kísérleti eljárások

Az ultraibolya (UV) spektrumokat Hitachi U-2001 UV/V spektrométerrel vettük. AAz infravörös (IR) spektrumokat Jasco FT/IR-4100 spektrofotométerrel vizsgáltuk.1H-, 13C-, és a 2D mágneses magrezonancia (NMR) spektrumot Bruker AV-400 készüléken vettük fel.NMR spektrométer. A kémiai eltolódások a következőben jelennek megδ értékek (ppm) tetrametil-szilánnalbelső standardként. AδH ésδC az értékek a jelek kémiai eltolódásaira vonatkoztak,illetőleg. Nagy felbontású elektrospray ionizációs tömegspektrometria (HR-ESI-MS) voltJEOL JMS{0}} spektrométerrel (negatív ion üzemmódban működik).

2.2. Növényi anyag

A tűkP. taiwanensisPuliban, Nantouban, Tajvanon gyűjtötték és azonosítottákSheng-Yang Wang professzor (Chung-Hsing Nemzeti Egyetem Erdészeti Tanszéke,Tajcsung, Tajvan). Az utalványmintát (PCKuo_2016003) a herbarban helyezték elium of Pharmacy School, National Cheng Kung University, Tainan, Tajvan.

2.3. Kivonás és izolálás

2.4. 1–5. spektrális és fizikai adatai

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -Dihidroxi-70 -(4-hidroxi-3-metoxifenil)propán-80 -iloxi]-2-hidroxi-benzoesav (2)Színtelen szirup; [ ]25 D plusz 5,3 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmax(naplóε) 284 (3.59), 253 (3,80) nm; ECD (c 3.51 × 10−4 M, MeOH)λmax(∆ε) 248 ( plusz 1,33), 224 ( plusz 1,03),214( plusz 1,10) nm; IR (tiszta)νmax3425, 2927, 1541, 1384, 1271 cm−1;1Kéz13C-NMR; HRESIMSm/z 349.0936 ([M − H]− C-re számított17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R)-12-Hidroxi-agatsav (3)

Színtelen por; olvadáspont: 263◦C (bomlik); [ ]25 D plusz 30,8 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmax(naplóε) 225 (sh) (3,83) nm; IR (tiszta)νmax3450, 2937, 1648, 1252 cm−1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) δ 0,63 (3H, s, CH3-20), 1,09 (1H, ddd,J = 13,6, 13,6, 3,6 Hz, H-3a), 1,21 (3H, s, CH3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,H-6b), 2,08 (3H, s, CH3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H, dd,J = 9,2, 2,8 Hz, H-12), 4,53 (1H, s, H-17a), 4,91 (1H, s, H-17b), 5,88 (1H, széles s, H{16}});13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 13,5 (CH3-20), 14,9 (CH3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (CH3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (C-19); HRESIMSm/z 349.2024 ([M − H]− C-re számított20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5-Izopropil-3-oxociklohex-1-én-1-karbonsav (4)

Színtelen táblás kristály; olvadáspont: 235◦C (bomlik); [ ]25 D plusz 28,6 (c 0.3, MeOH); UV (MeOH)λmax(naplóε) 237 (sh) (3,40) nm; IR (tiszta)νmax3456, 2925, 1635, 1395 cm-1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) 0,88 (3H, d,J = 6,8 Hz, CH3-9), 0.98 (3H, d, J = 6,8 Hz, CH3-10), 1.84 (1H, m, H-4a), 2,02 (1H, m, H-4b), 2,09 (1H, m, H-5), 2,31 (1H, hept,J = 6,8 Hz, H-8), 2,50 (1H, dddd,J = 19,2, 9,2, 4,8, 2,4 Hz, H-6a), 2,70 (1H, dddd,J = 19,2, 5,2, 5,2, 1,2 Hz, H-6b), 6,32 (1H, dd,J = 2,4, 1,2 Hz, H-2);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (C-6), 27,1 (C-8), 53,7 (C-5), 128,7 (C-2), 160,6 (C-1), 174,8 (C-7), 205,7 (C-3); HRESIMSm/z 181.0855 ([M − H]− C-re számított10H13O3, 181.0865).

2.4.5. Sztiraxinolsav (5)

Színtelen szirup; UV (MeOH)λmax(naplóε) 308 (2,89), 237 (sh) (3,37), 222 (sh) (3,70) nm;IR (tiszta)νmax3421, 2926, 1572, 1395, 1268 cm-1;1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) 1,82 (2H, tt,J {{0}},0, 6,8 Hz, H-8), 2,61 (2H, t,J {{0}},0 Hz, H-7), 3,56 (2H, t,J = 6,8 Hz, H-9), 3,83 (3H, s, OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-4), 7,31 (1H, d,J = 2,4 Hz, H-6);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ 32,7 (C-7), 35,6 (C-8), 56,6 (OCH3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (C-6), 131,9 (C-5), 149,2 (C-3), 150,7 (C-2), 176,2 (C-10); HRESIMSm/z 225.0767 ([M − H]−C-re számított11H13O5, 225.0763).

2.5. Gyulladásgátló bioaktivitás vizsgálat

2.5.1. Humán neutrofil készítmény

A vizsgálatot a Chang Gung Memorial Hospital (IRB No. 201800369A3) intézményi felülvizsgálati bizottságának jóváhagyásával végezték. Vérmintákat vettek egészséges emberi donoroktól (20-30 évesek), és a neutrofileket izolálták és tisztították a korábban leírt protokollok szerint [40]. 

2.5.2. Szuperoxid anion generáció

Mérés A szuperoxid-anion képződés mérésére szolgáló vizsgálat a ferricitokróm SOD által gátolható redukcióján alapult.c a korábban leírtak szerint [40].

2.5.3. Elasztáz felszabadulási vizsgálat

Az azurofil granulátumok degranulációját az elasztáz felszabadulás mérésével határoztuk meg a korábban leírtak szerint [40]. 

2.5.4. Statisztikai elemzés Az eredményeket átlagban fejezzük ki± az átlag standard hibája (SEM). Az 50 százalékos gátló koncentráció kiszámítása (IC50) PHARM/PCS v.4.2 szoftverrel történt. Statisztikai összehasonlításokat végeztünk a csoportok között a Student-féle módszerrelt-teszt. Értékeip < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. Molekuláris dokkolási tanulmány

Ain silicoAz értékelést az AutoDock Vina szoftveren végeztük [41]. A ghrelin receptor kristályszerkezetét jellemezték [42], és a . A PDB fájlt a Protein Databank-ból töltötték le (PDB ID: 6KO5). A ligandumok 3D-s szerkezetét a Chem3D programmal szerkesztettük meg. Elvégezték a hidrogén-kiegészítést, a fehérjeatomok Gasteiger-töltésének mérését és a ligandumok rugalmas torzióinak kiválasztását. az AutodockTools (ADT 1.5.6 verzió) által. A rács mérete 18,5 Å volt× 18.5 Å × 18,5 Å és egy rácsközéppontot (x, y és z, rendre): 9,7, -19,2, 14,6 határoztunk meg. A kötési affinitási energiát dokkolási pontszámként adtuk meg, és kcal/mol egységben adtuk meg. A legjobb interakciónak csak a legtöbb pontot szerző pózt tekintették. A legjobb dokkolási interakciók megjelenítését a Biovia Discovery Studio 2020 kliensben elemezték [43].