A BMAL{0}}dependens vázizom és vese keresztbeszéd látszólagos hiánya egereknél

NÖVÉNYI KÉSZÍTMÉNY A KRÓNIKUS VESEBETEGSÉG

Kulcsszavak: cirkadián óra gének; vesefunkció; integratív élettan

1. Bevezetés

A cirkadián ritmusok a legtöbb élettani folyamatban kiemelkedőek. Ezeknek a ritmusoknak a szabályozását részben egy központi óra közvetíti, amely az agy szuprachiasmatikus magjában található, de a perifériás cirkadián órák is befolyásolják a fiziológiás működés ritmusát [1]. A molekuláris óra egy transzkripciós-transzlációs visszacsatoló hurokból áll. Röviden, az aril-szénhidrogén-receptor-nukleáris-transzlokátor-szerű fehérje (ARNTL; vagy BMAL1) és a cirkadián lokomotoros kimeneti ciklusok kaput (CLOCK) pozitívan szabályozzák a Period és a Cryptochrome gének transzkripcióját; a Period (PER) és a Cryptochrome (CRY) fehérjék visszacsatolják és gátolják a BMAL1/CLOCK aktivitását (lásd [2,3]). A cirkadián által szabályozott folyamatok megzavarása számos patológiával jár, beleértve a szív- és érrendszeri és a vesebetegségeket [4,5]. A célzott cirkadián zavart követően a különböző szervrendszerek közötti átbeszélés a mai napig nem teljesen ismert. Ez a tanulmány a BMAL1 óra fehérje vázizomzatban való törlésére és az óra megszakításának a vesére gyakorolt ​​lehetséges következményeire összpontosít.

A vázizom-specifikus BMAL1-indukálható kiütéses (iMS-BMAL1 KO) egérmodellről korábban leírták, hogy az öregedés során tapasztaltakhoz hasonló tulajdonságokkal rendelkezik. Ezek az egerek megváltozott járást, csökkent mobilitást, izomgyengeséget és csökkent glükózfelvételt mutatnak [6,7]. A vesebetegség az öregedés szinonimája, mivel a vesebetegségek gyakorisága az életkorral együtt növekszik [8]. Az iMS-BMAL1 KO egerek másik jellemzője, hogy fokozott inak meszesedést mutatnak [6]. A vesék szerepe a sav-bázis egyensúlyban és az ásványi anyagok homeosztázisában közvetlenül összekapcsolja a csontok egészségét a vesebetegséggel. Következésképpen azt feltételeztük, hogy az iMS-BMAL1 KO egerek potenciálisan a vesebetegség modelljei lehetnek.

Ennek a vizsgálatnak a célja annak meghatározása volt, hogy a vázizomzat óra működésének megzavarása vezet-e veseműködési zavarhoz. A BMAL1 deléciója a vázizomzatban a gyulladásos markerek növekedését okozza a vesében. Úgy tűnik azonban, hogy az iMS-BMAL1 KO nem befolyásolja sem a vesefunkciót, sem a vese szövettanát. Ezek az adatok azt sugallják, hogy a vázizomban bekövetkező órazavar következménye a vese minimális változásához vezet a vizsgált körülmények között.

2. Anyagok és módszerek

Állatok. A tanulmányban használt egérmodellt floxed 8-as exon BMAL1 egerekkel [9] állítottuk elő, amelyeket vázizom-specifikus Cre-rekombináz egerekkel (humán csontváz aktin–Cre) kereszteztek. A Cre-t tamoxifen (napraforgómagolajban 15%-os etanolban készült) injekcióval aktiválták 5 héttel a vizsgálat előtt (2 mg/nap; 5 nap ip.), hogy létrehozzák az iMS BMAL1 KO-t. Kontrollként vivőanyaggal (15% etanol napraforgómagolajban) injektált Cre+ egereket használtunk. A hím szűz fiatal egereket 17-19 hetes, az idős egereket 13-14 hónapos korban vizsgálták. Valamennyi kísérletet a National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals végezte, és a Floridai Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága és az Észak-Floridai/Dél-Georgia Veteránok Adminisztráció Intézményi Állatgondozási és -használati bizottsága jóváhagyta és felügyelte. Az egereket hőmérséklet- (20-26 ◦C) és páratartalom-szabályozott, 12:12 órás világos-sötét ciklusú szobákban tartottuk. Az egerek ad libitum hozzáférést kaptak vízhez és standard 18%-os fehérje rágcsálótáphoz (2918-as szám, Harlan Teklad/Envigo, Madison, WI, USA), hacsak másként nem jelezzük.

Metabolikus ketrec tanulmány. Fiatal hím egerek csoportját (5 kontroll és 5 KS-BMAL1 KO) metabolikus ketrecekben tartották a vizelet összegyűjtése és a táplálék/víz bevitel monitorozása céljából [10]. Por alapú gél diétát (Envigo Teklad Custom Diet), amely 1% agart tartalmazott, elkészítettük, és a metabolikus ketrec gyűjteményében használtuk. Az egerek 3 napot kaptak, hogy alkalmazkodjanak a metabolikus ketrecekhez a begyűjtés megkezdése előtt kontroll diétán ({{10}},25% NaCl; 0,6% K; Envigo 99131). Egy napos kontroll diétával történő rögzítést követően az egereket káliumhiányos étrenddel (0,25% NaCl; 0,0001% K; Envigo 99134) kezelték öt napon keresztül. A vizeletmintákat 12 óránként vettük a nappali és éjszakai időszak végén (Zeitgeber-idő 0 és 12). Feljegyezték a vizeletkibocsátást, a táplálékfelvételt és a vízfelvételt. A vizelet elektrolitkoncentrációját lángfotométerrel (Cole-Parmer Model 2655- 00, Vernon Hills, IL, USA) mértük a gyártó utasításai szerint. Az egereket elaltatták, és a szöveteket a Zeitgeber 6-os időpontban gyűjtöttük össze.

Testösszetétel. A testösszetételt éber fiatal hím egerekben számszerűsítettük a káliumszegény étrend beadása előtt és öt nappal azután. A méréseket Zeitgeber 4–6. időpontban végeztük EchoMRI kvantitatív mágneses rezonancia testösszetétel-analizátorral (Echo Medical Systems, Houston, TX, USA) [11].

Phase Advance Protocol. Idős hím egerek külön csoportját külön-külön elhelyezték ketrecekben, amelyek futókerékkel voltak felszerelve, és ad libitum hozzáférhetett a táplálékhoz (2918, Harlan Teklad) és vízhez. A ketreceket fényvezérelt dobozban tároltuk, állandó légcserével (Actimetrics, Wilmette, IL, USA). A világítási ütemezést 12:12 órás világos-sötét ciklusban tartották, zöld LED (~200 lux) fényforrás használatával. Egy héttel az alapvonal után a sötét ciklus 7 órával előrehaladt, és az egereket ezen az új, 12:12 órás világos-sötét ciklusrend szerint tartottuk egy hétig. Ezt a folyamatot másodszor is megismételték, hogy 14-órás fáziselőrelépést hozzanak létre. Az egereket a 2. Zeitbeger időpontban 2-3 fős csoportokban elaltatták, és 7-10 nappal a fázis előrehaladásának második hete után gyűjtöttük össze a szöveteket.

Rekombinációs specifitás. A Bmal1 rekombináció specifitásának megerősítésére PCR-t végeztünk 40 ng vázizom genomi DNS és primerek felhasználásával a rekombinált és nem rekombinált allélokhoz. (fwd primer: ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG, rev primer: CTGACCAACTTGCTAACAATTA, rekombinációs primer: CTCCTAACTTG GTTTTTGTCTGT). A floxed Bmal1 allél forward és reverse primerei 431-bp terméket eredményeznek. A második előremenő primert (50 -CTCCTAACTTGGTTTTTGTCTGT-30) alkalmazták a rekombinált termék kimutatására, amely 572 bp-nál mutat sávot. A PCR reakciótermékeket 1,7%-os agaróz gélen futtattuk, és egy genomi sáv és egy rekombináció-specifikus sáv azonosítása megerősítette, hogy minden tamoxifennel kezelt állat szövetspecifikus KO volt, amint azt korábban leírtuk [7,12].

Immunhisztokémia. Az inhalációs izofluránnal történő érzéstelenítés után a jobb veséket összegyűjtöttük, és azonnal keresztirányban kettévágtuk, majd perjodát-lizin -2% paraformaldehidben tároltuk körülbelül 48 órán át 4 ◦ C-on. A folyadékot ezután PBS-re cseréltük, hogy előkészítsük a feldolgozásra. Az egyes állatok vesemintáját paraffinba ágyaztuk, és 4-mikrométer vastag metszeteket vágtunk, és üveglemezekre rögzítettük. A metszeteket vagy hematoxilinnel és eozinnal, vagy 3,30 -diaminobenzidin kromogén szubsztráttal (Vector) festettük meg, hogy megcélozzuk a BMAL1-et (D2L7G Cell Signaling; 1:3000; RRID: AB_2728705, Danvers, MA, EGYESÜLT ÁLLAMOK). A metszeteket fénymikroszkóppal figyeltük meg (Nikon E600 Nikon DXM1200F digitális kamerával, Melville, New York, NY, USA). Csoportazonosítókminden tárgylemezről eltávolítottuk, és a BMAL1 expresszióját megvizsgáltuk, vagy a tárgylemezeket tubulussérülésre pontoztuk a következő kritériumok alapján: a tubulus nekrózis jeleit mutató tubulusok százalékos aránya, az ecsetszegély hiánya, a tubuláris tágulás és a fehérje öntött képződés.

torma-peroxidázzal konjugált anti-nyúl másodlagos antitesttel inkubáltuk. További 30 perces TBS-T-vel végzett mosás után a detektálást SignalFire ECL reagenssel (Cell Signaling Technology) végeztük 30 másodperces expozíciós idővel a képalkotáshoz. A denzitometriát Fidzsi-szigeteken végeztük, és a fehérjebőséget Ponceau-festéssel normalizáltuk.

Multiplex immunoassays. Idős hím egerek veséjének fél veséjéből kortikális és velős régiókat metszettek ki. A szövetet 300 µl (kéreg) vagy 250 µL (medulla) pufferben (1% proteáz-foszfatáz inhibitor koktél (Thermo Scientific) 1% 1 M etilén-diamin-tetraecetsav, 0,1% Tween 20 in phosphate-ban homogenizáltuk. pufferolt sóoldat). Az egyes minták fehérjekoncentrációját BCA-val (Pierce, Thermo Scientific) határoztuk meg. A homogenizátumokat a kiválasztott analitokhoz két párhuzamosban mértük kereskedelmi forgalomban lévő multiplex immunoassay kitekkel (cat#'s MCYTOMAG-70K, MBNMAG-41K és MKI1MAG-94K; EMD MilliporeSigma) MILLIPLEX® készüléken. Analyzer 3.1 xPONENT System (Luminex 200, Austin, TX, USA) adatelemzéssel a MILLIPLEX Analyst szoftveren keresztül. Az átlagos intraassay CV-k voltak<5% and the average inter-assay CVs were <15%. The data were converted from pg/mL to pg/mg, using the previously determined protein concentrations. 

Vese mitokondriumok izolálása és respirometria. Friss vesekéreg szövetet boncoltunk ki egerekből a fázis előrehaladását követően. A mitokondriumokat a Mitochondria Isolation Kit for Tissue (#ab110169; Abcam, Waltham, MA, USA) segítségével izoláltuk a gyártó utasításait követve. A mitokondriális készítmény fehérjekoncentrációját BCA Protein Assay Kit (Pierce, Thermo Scientific) segítségével határoztuk meg. Az izolátum mitokondriális légzését két párhuzamosban határoztuk meg egy korábban kalibrált, 37 ◦C-on tartott xilográf kamrában (Oroboros O2K; Oroboros Instruments, Innsbruck, Ausztria), amely légzési puffert (MiR05; 0) tartalmazott. mM EGTA, 3 mM MgCl2·6H2O, 60 mM laktobionsav, 20 mM taurin, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-szacharóz g/l BSA lényegében zsírsavmentes, pH 7,1) [13]. A légzési puffer oxigénkoncentrációját a levegőtelítettség (~200 µM) és 50 µM között tartottuk. Az oxigénfogyasztási sebességet (OCR; ρmol O2/s/mg mitokondriális fehérje) a következő szubsztrát-leválasztó-inhibitor-titrálási (SUIT) protokoll segítségével mértük (a zárójelben szereplő reagensek koncentrációja a kamrákon belül végleges): (1) LEAK (L) ) a légzést NADH-kapcsolt szubsztrátokkal (5 mM), piruváttal (5 mM), maláttal (2 mM) és glutamáttal (10 mM) végzett TCA-ciklus stimulálása után értékeltük, hogy támogassuk az elektronáramlást az elektrontranszportrendszer (ETS; E) komplexen (CI) keresztül. ); (2) az oxidatív foszforilációt (OXPHOS; P) adenozin-difoszfáttal (ADP; 2,5 mM) stimuláltuk, és PCI-ként regisztráltuk; (3) szukcinát (10 mM) hozzáadása támogatott konvergens elektronáramlást az ETS I. és II. komplexein keresztül (PCI+II); (4) a mitokondriális készítmény minőségét a mitokondriális külső membrán integritásának tesztelésével, citokróm c (10 µM) hozzáadásával értékeltük; (5) a szétkapcsoló karbonil-cianid 4-(trifluor-metoxi)-fenil-hidrazont (FCCP; 0,5 µl-es lépésekben 0,1 mM törzsoldat) lépésenként titráltuk, amíg el nem érte a maximális független légzést, és maximális ETS-kapacitásként (ECI+) rögzítettük. II); (6) a rotenon (0,5 µM) hozzáadása gátolta az ETS I komplexét, és a fennmaradó OCR-t a komplex II szubsztrát (ECII) által támogatott maximális ETS kapacitásként rögzítettük; (7) Az antimycin A (2,5 µM) hozzáadása gátolta az ETS III-as komplexét és ezáltal az összes elektrontranszportot a IV-es komplexhez, és a fennmaradó OCR-t reziduális, nem mitokondriális oxigénfogyasztásként (ROX) rögzítettük, és kivontuk az összes előző OCR-ből. ; (8) az oxigénfogyasztást ezután ismét stimuláltuk N,N,N0,N0 -tetrametil-p-fenilén-diamin-dihidroklorid (TMPD; 0,5 mM; aszkorbát (2 mM) jelenlétében, hogy elkerüljük az ellenőrizetlen önoxidációt TMPD) mesterséges szubsztrátként a citokróm c csökkentésére; (9) A kémiai háttéroxidációs sebességet TMPD/aszkorbát jelenlétében a komplex IV inhibitor nátrium-azid (100 mM) hozzáadásával határoztuk meg, és kivontuk az előző fluxusból, ami a citokróm c oxidáz aktivitásának (ECIV) maximális kapacitását eredményezte. Az oxigénfogyasztási adatokat a DatLab vs. 7.4 (Oroboros Instruments) segítségével gyűjtöttük és elemeztük. A fluxusszabályozási arányokat (FCR) az oxigénfogyasztásként számítottuk ki bármely adott légzési állapotban a maximális ETS kapacitáshoz (ECI+II) viszonyítva.

Áramlási citometria. A tüdőszövetet megemésztettük, és áramlási citometriás analízist végeztünk a korábban leírtak szerint [14].

Statisztikai elemzések. A grafikus adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. A négy csoport közötti különbségek elemzésére kétutas ANOVA-t használtunk, lehetőség szerint ismételt mérésekkel. Sidak többszörös összehasonlítási tesztjét használták az egércsoportok és a kezelt csoportok összehasonlítására. A két csoport összehasonlítására Student-féle t-próbát használtunk. Az elemzést GraphPad Prism 9.2-es verziójú szoftverrel (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) végeztük.

A statisztikai szignifikancia meghatározása: p < 0,05.

Wecistanche támogató szolgáltatása:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950