Absztrakt:A Vitis amurensis gyökereiről beszámoltak arról, hogy a melanogenezis és a tirozináz gátló aktivitás értékelése révén bőrfehérítést okozhatnak. Ebben a vizsgálatban a V. amurensis gyökereit használták fel a fehérítő összetevők gyors kiválasztására LC-Q-TOF-MS és tirozináz gátló vizsgálat segítségével, és az extrakciós folyamat optimalizálására bőrfehérítő funkcionális anyagként a válaszfelület módszerével. Az eredmények azt mutatták, hogy a V. amurensis gyökerei két sztilbén oligomer, az ε-vinifera (1) és a B-vitamin (2) tirozináz gátló hatást mutattak, amint azt az LC-Q-TOF-MS bioassay-vel párosította. A bőrfehérítő összetevők optimális extrakciós körülményeit (66 százalékos metanol-koncentráció, 140 ml oldószertérfogat és 100 perc extrakciós idő) 6,20 százalékos kitermeléssel és 87,27 százalékos tirozináz-gátló aktivitással határoztuk meg. Az egyes tényezők és a megfelelő válasz közötti kapcsolatot Pearson korrelációs elemzése igazolta. Az oldószer térfogata egyértelmű lineáris kapcsolatot mutatott a hozamokkal, és a metanol koncentrációja erős lineáris összefüggést mutatott az 1. és 2. vegyület tirozináz gátló aktivitásával, valamint ezek kombinációjával. Összességében bebizonyosodott, hogy az LC-Q-TOF-MS bioassay-vel kombinálva képes hatékonyan találni új aktív összetevőket, valamint ismert aktív összetevőket; A vitaminok új, természetes potenciális fehérítőszerként javasolhatók.

A vonatkozó tanulmányok szerintCisztancheegy közönséges gyógynövény, amelyet "az életet meghosszabbító csodanövényként" ismernek. Fő összetevője azcisztanozid, melynek különféle hatásai vannak, mint plantioxidáns, gyulladáscsökkentő, ésaz immunrendszer működésének elősegítése. A mechanizmus a cistanche ésbőrfehérítésa cistanche antioxidáns hatásában rejlikglikozidok. Az emberi bőrben a melanint a tirozin oxidációja katalizáljatirozináz, az oxidációs reakcióhoz pedig oxigén részvétele szükséges, így a szervezetben lévő oxigénmentes gyökök a melanintermelést befolyásoló fontos tényezővé válnak. A Cistanche tartalmazcisztanozid, amely antioxidáns és képes csökkenteni a szabad gyökök képződését a szervezetben, így gátolja a melanin termelődését.

Kattintson a közelemben eladott Cistanche elemre

További információért:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Kulcsszavak:Vitis amurensis; LC-Q-TOF-MS tirozináz gátló vizsgálattal kapcsolva; válaszfelület módszertana; Pearson-féle korreláció

1. Bemutatkozás

A melanin felelős az emlősök bőrének és szőrének színéért, és védi a bőrt az ultraibolya sugaraktól, de a túlzott melanintermelés és a melanin felhalmozódása a bőrben hiperpigmentációs bőrelváltozásokat okoz, mint például szeplők, melasma, öregségi foltok, ephelidek és időskori lentigines. A tirozináz, amely réztartalmú oxidáz enzimként ismert, döntő szerepet játszik a melanin bioszintézisében. Az enzim két egymást követő oxidációs reakciót katalizált: az első lépésben az L-tirozint 3,4-dihidroxi-L-fenilalaninná (L-DOPA) hidroxilálják, a második lépést pedig az L-DOPA oxidációját. dopakinon. A dopakinon egy nagyon reaktív anyag, amely spontán polimerizálódva melanint termel [1–3]. Ennélfogva a tirozináz inhibitorok alkalmazhatók hiperpigmentációval kapcsolatos bőrbetegségek kezelésére és bőrfehérítő szerekként.

A Vitis amurensis vadon termő szőlőfajtát elsősorban Ázsiában (Koreában, Kínában és Japánban) terjesztik. A teljesen érett gyümölcsöket nyersen fogyasztják, és bőséges tápanyagokat, például szacharózt, glükózt, fehérjét és vitaminokat tartalmaznak, így bor, gyümölcslé, zselé és lekvár alapanyagaként használják őket. Ezenkívül a leveleit salátákban használják [4]. Gyökereit és szárát hagyományos orvoslásként használták rák, neuralgikus fájdalmak és hasi fájdalom kezelésére [5,6]. Gyökerei sztilbénekből (egyik fő alkotórész), procianidinekből, flflavonoidokból, triterpenoidokból és más fenolos vegyületekből állnak. Eddig a gyökér kémiai összetételét kellő részletességgel tanulmányozták. Különösen különböző sztilbén oligomerekről számoltak be, beleértve a rezveratrolt, amurenzin A-t, A-vitamint, (plusz)-ε-viniferát, amurenzineket C–M, ampelopsin A-t, D-t és ampelopsin E-t [6]. A gyökér metanolos kivonata anti-melanogén hatást fejt ki a melanocita stimuláló hormon által kiváltott melanogenezis ellen a B16F10 sejtekben és a 3,4-dihidroxifenilalanin (L-DOPA) gomba tirozinázon keresztül történő oxidációja ellen [7]. Ezenkívül a V. amurensis kivonatok és aktív vegyületeik antioxidáns, gyulladáscsökkentő, neuroprotektív és daganatellenes hatást fejtenek ki [7–10].

Az LC-MS bioassay-vel kombinálva egyidejűleg igazolhatja a természetes termékek összetevőinek kémiai profilját és biológiai aktivitását, extrakció és izolálás nélkül. Ezért a közelmúltban a természetes termékekben található bioaktív vegyületek hatékony és gyors azonosítására használták [11–13].

Az optimalizálás olyan folyamat, amely lehetővé teszi a kísérleti rendszerek vagy termékek maximális hatékonyságát. A válaszfelület módszertana (RSM), a többváltozós elemzés, az empirikus modelleken alapuló matematikai és statisztikai technikákat alkalmazó kísérletek tervezése, valamint a kísérleti tervezés és az eredmények közötti összefüggés polinomiális függvényként történő kifejezése néhány olyan technika, amely ideális optimalizálási feltételeket biztosít maximális hatékonysággal. Az RSM egy pontos és hatékony optimalizálási módszer, amelyet széles körben használnak különböző területeken, beleértve az élelmiszer-feldolgozást, a kémiát, a biológiát és a mezőgazdaságot [14–16]. Az elmúlt évtizedekben megnőtt az érdeklődés a gyógyszerek, kozmetikumok és a természetes termékeket tartalmazó funkcionális élelmiszerek iránt; következésképpen mind a tudományos körökben, mind az iparban folyamatos kutatás folyik az ilyen termékek kifejlesztésére [17,18]. E vizsgálatok első lépése a bioaktív összetevő természetes termékekből történő kinyerése. Jelenleg, mivel számos tényező, mint például az extrakciós idő, a hőmérséklet, a folyadék-szilárdanyag arány és az oldószer térfogata befolyásolta az extrahált összetevőket, optimalizálni kell a bioaktív összetevők maximális kivonását.

Tudomásunk szerint a V. amurensis gyökérkivonatainak tirozináz gátló összetevőiről és optimalizálásáról ritkán számoltak be [5,19]. Ennek a vizsgálatnak ezért az volt a célja, hogy a V. amurensis gyökereiből gyorsan előállítsa a tirozináz inhibitort LC-Q-TOF-MS és tirozináz gátló vizsgálat segítségével, valamint hogy optimalizálja az extrakciós körülményeket a V. amurensis gyökereinek bőrfehérítő szerként való felhasználásának szélesítése érdekében. az RSM által.

2. Eredmények és megbeszélés

2.1. LC-QTOF MS V. amurensis gyökérkivonatát alkalmazva tirozináz gátló vizsgálattal kapcsolva

A V. amurensis gyökér 80 százalékos MeOH-kivonata jelentős tirozináz-gátló aktivitást mutatott (80,7 ± 0,8 százalék 50 µg/ml-nél, S1 táblázat). A V. amurensis gyökér tirozináz gátló vegyületek izolálás nélküli azonosítására LC-QTOF-MS vizsgálatot végeztünk tirozináz gátló vizsgálattal párosítva. A V. amurensis gyökérkivonat kémiai profilját az első futtatásban kaptuk meg (S1 ábra), és a bioaktív vegyületeket a második futtatástól számított 30 másodpercenként gyűjtött frakciók tirozináz gátló vizsgálatával azonosították (1. ábra). A tömegkromatogramon két csúcs volt 19 és 22 perc között, amelyeknek szignifikáns tirozináz-gátló aktivitást jósoltak, és szerkezetüket kémiai profilozással (1. táblázat) sztilbén-dimerként (1) és sztilbén-tetramerként (2) azonosították (1. táblázat).

2.2. A V. amurensis gyökér tirozináz gátló összetevőinek azonosítása

Először az EtOAc frakcióból izoláltunk két olyan összetevőt, amelyek várhatóan tirozináz gátló hatással rendelkeznek, és értékeltük bioaktivitásukat. Az izolált 1. és 2. vegyület szerkezetét rendre ε-vinifera (1) [20,21] és B-vitamin (-vinifera, 2) [21–23] néven azonosítottuk 1H-NMR, 13C-NMR, és ESI-MS (2. ábra, S2 és S3 ábra, valamint S2 táblázat). A tirozináz gátló vizsgálatban az 1., 2. vegyület és a kojsav IC50 értéke 3,51, 10,74 és 27,09 µM volt. Mindkét vegyület nagyobb tirozináz gátló hatást mutatott, mint a pozitív kontroll, a kojsav, amely az ismert bőrfehérítő összetevő (1. táblázat és S4. ábra). Korábbi tanulmányok szerint az ε-vinifera (1) tirozináz gátló hatású [23]; a B-vitamint (2) azonban először a mi vizsgálatunkban azonosították.

Összességében az eredmények a tirozináz gátló vizsgálattal és a B-vitaminnal kombinált LC-MS előrejelzett adataival korrelálva (2) új tirozináz-inhibitor potenciált mutatnak. Ezenkívül molekuláris dokkolási vizsgálatokat végeztek a két sztilbén oligomer jelentős tirozináz gátló aktivitásának alátámasztására. Amint az 1. táblázatban látható, az 1. és 2. vegyület magasabb dokkolási pontszámot mutatott, mint a pozitív kontroll, a kojinsav, összhangban kísérleti adatainkkal. A vegyületek dokkolási eredményei azonban ellentétesek a kísérleti eredményeinkkel. Az 1. és 2. vegyület kölcsönhatási módjait a 3. ábra írja le. Az 1. vegyület 4 hidrogénkötést, 2 hidrofób kölcsönhatást és 1 pi-lonpár kölcsönhatást, a 2. vegyület pedig 11 hidrogénkötést, 7 hidrofób kölcsönhatást, 1 van der Waals kölcsönhatást hozott létre. , és 3 pi-lone pár kölcsönhatás. Ennek eredményeként bebizonyosodott, hogy a vegyületek beépíthetők a célfehérje aktív helyébe, és olyan katalitikus aminosav-maradékokhoz köthetők, amelyek gátolhatják a tirozináz aktivitást. Ezenkívül az ε-vinifera (1) kompetitív inhibitora, amely ugyanahhoz a helyhez kötődik, mint az L-DOPA a tirozinázhoz [23]. Megfigyelték, hogy a B-vitamin (2) ugyanahhoz a helyhez kötődik, mint az ε-vinifera (1), ami megerősítette, hogy a B-vitamin (2) egy új kompetitív inhibitor.

2.3. A V. amurensis gyökér extrakciójának optimalizálása RSM segítségével

A V. amurensis gyökereinek bőrfehérítő funkcionális anyagként való hasznosítása érdekében a Box-Behnken tervezés (BBD) optimális extrakciós körülményeket alakított ki az extrakciós hozam és a tirozináz gátló aktivitás maximalizálása érdekében. A független válaszok, mint például az extrakciós hozam, a tirozináz gátló aktivitás, az 1. vegyület mennyisége, a 2. vegyület mennyisége és az 1. és 2. vegyület összegének hatása a három független változóra (extrakciós idő, MeOH/víz koncentráció és oldószer térfogata), mértük (2. táblázat). A változók tartománya az extrakciós idő (40, 70 és 100 perc), a MeOH-koncentráció (40, 70 és 100 százalék), valamint az oldószer térfogata ( 35, 87,5 és 140 ml) egy előzetes egyfaktoros kísérlet alapján (az adatokat nem mutatjuk be). A tervezett kísérletekből kapott értékeket a változók közötti korrelációk polinomjaiban fejeztük ki regressziós elemzéssel (S4–S13 táblázatok és S5 ábra). Az egyes reakciók egyedi optimalizálása (3. táblázat) eredményeként a hozam 100.00 perccel extrahálva 6,21 százalékot jelent, MeOH 64,78%, 140.{42} } ml. A tirozináz gátló aktivitást ( százalék ) 65,22 perccel, MeOH 100.00% , 140.00 ml körülményekkel extraháltuk, és az előrejelzések szerint 90,37 százalékos értéket mutat. Az 1. vegyület mennyisége 65,74 percnél, MeOH 100.00 %, 35,00 ml 37,45 µg/mg, a 2. vegyület mennyisége pedig 70,00 percnél, MeOH 70,00 % és 92,24 ml-t 86,77 µg/mg-nak jósoltak. Ezenkívül az 1. és 2. vegyület össztartalma várhatóan 108,10 µg/mg maximális értéket mutatott, ha 75,20 perces, 100,00%-os metanollal és 35,00 ml-es körülmények között extraháltuk. Az optimalizált körülményeken alapuló kísérletek 6,19 ± 0,36 százalékot, tirozináz gátló aktivitást 91,72 ± 3,48 százalékot, az 1. vegyület tartalma 36,54 ± 1,78 µg/mg, a 2. vegyület tartalma 85,74 ± 16,57 µg és 8 µg/m vegyület },10 ± 19,11 µg/mg értéket kaptunk, és az egyes változókra adott egyéni válaszok 5 százalék vagy kevesebb eltérést mutattak az elméletileg előre jelzett értékektől. Az extrakciós hozam és a tirozináz gátló aktivitás maximalizálása érdekében többszörös válaszoptimalizálást végeztünk (3. táblázat). Az optimalizált körülmények a következők voltak: extrakciós idő, 100 perc; MeOH koncentráció, 66,38%; és az oldószer térfogata 140 ml. Ezeket a körülményeket alkalmazva a hozamot 5,95 ± 1,13 százaléknak, a tirozináz gátló aktivitást pedig 85,93 ± 1,57 százaléknak határoztuk meg; ezek az értékek hasonlóak voltak az előre jelzett értékekhez, 6,20 és 87,25 százalék. Ezenkívül az egyes változók és a megfelelő válasz közötti korrelációt Pearson-féle korreláció segítségével elemeztük (4. táblázat). Az extrakciós hozam egyértelmű lineáris kapcsolatot mutatott az extrakciós idő és a MeOH-koncentráció között, és negatív lineáris kapcsolatot mutatott az 1. vegyület mennyiségével. Ezenkívül a tirozináz gátló aktivitás erős lineáris kapcsolatot mutatott a 2. vegyület mennyisége és az összeg mennyisége között. Ezért a V. amurensis gyökér tirozináz gátló aktivitása arányos volt az 1. és 2. vegyülettel, de erősebb lineáris kapcsolatot mutatott a 2. vegyület mennyiségével, mint az 1. vegyület.

3. Anyagok és módszerek

3.1. Általános kísérleti eljárások

A közepes nyomású folyadékkromatográfiát (MPLC) Biotage Isolera (Biotage AB, Uppsala, Svédország) alkalmazásával végeztük. Az egyik rendszer nagy teljesítményű flash kromatográfiás (HPFC) pumpával, változtatható kettős hullámhosszú detektorral és kollektorral van felszerelve. Az NMR-spektrumokat Bruker SPECTROSPIN 300 MHz spektrométerrel vettük fel (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA). A metanol-d4 NMR oldószert a Cambridge Isotope Laboratories, Inc.-től vásároltuk. A kromatográfiás minőségű acetonitrilt (ACN), vizet és metanolt (MeOH) a ThermoFisher Scientific Korea Ltd.-től (Szöul, Koreai Köztársaság) vásároltuk. Az L-tirozint, a gomba tirozinázt, a kojsavat és a hangyasavat a Sigma–Aldrich Co-tól (St. Louis, MO, USA) vásároltuk.

3.2. Növényi anyag

A V. amurensis gyökerét a koreai Gyeongbukból szereztük be, és az Omniherbtől (Daegu, Koreai Köztársaság) is vásároltuk. Dr. Prof. Ki Yong Lee azonosította őket, a Koreai Egyetem Gyógyszerészeti Főiskolájáról. Az utalványmintát (KUP-HD071) letétbe helyezték a Koreai Egyetem Gyógyszerészeti Főiskolai Karának Farmakognóziai Laboratóriumában.

3.3. LC-Q-TOF tömegspektrometria

Az LC-t egy Agilent 1260 sorozat (Agilent, Santa Clara, CA, USA) segítségével végeztük, amely bináris szivattyút, online gáztalanítót, automatikus mintavevőt, termosztatikusan vezérelt oszloprekeszt és fotodiódasoros detektort tartalmazott. A kromatográfiás elválasztást Shiseido CapCell PAK C18 oszlopon (5 µm, 4,6 mm, ID × 15{8}} nm) végeztük. A mozgó fázis vízből (A oldószer) és ACN-ből (B oldószer) állt, mindkettő 0,1% hangyasavat tartalmazott. A gradiens feltételei a következők voltak: 0–5 perc, 10 százalék B, 5–30 perc, és lineárisan növeljük B 10-ről 90 százalékra. A társsebességet 0,6 ml/perc értékre állítottuk be; A mintákból 5 µl-t, illetve 20 µl-t injektáltunk be LC-Q-TOF-MS analízishez, illetve LC-Q-TOF-MS-t tirozináz inhibitor vizsgálathoz. A tömegspektrometriát Agilent 6530 Q-TOF tömegspektrométerrel (Agilent, Santa Clara, CA, USA) végeztük, elektropermet ionizációs (ESI) interfésszel negatív módban. Az m/z 50–1000 tömegtartomány adatait centroid módban gyűjtöttük. A tömegparaméterek a következők voltak: kapilláris feszültség, 4000 V; porlasztónyomás, 40 psi; töredékfeszültség, 175 V; skimmer feszültség, 65 V; szárítógáz hőmérséklete, 325 ◦C; szárítógáz társsebessége, 12,0 l/perc; ütközési energia 10, 20, 30 és 40 eV. Az adatgyűjtési paraméterek beállítását és adatfeldolgozását LC-MS/MS Data Acquisition segítségével hajtottuk végre 6530 sorozatú Q-TOF (verzió B.05.00) használatával (MassHunter Workstation szoftver, Agilent, Santa Clara, CA, USA).

3.4. LC-Q-TOF-MS tirozináz gátló vizsgálattal kapcsolva

Az LC-Q-TOF-MS-t tirozináz gátló vizsgálattal összekapcsolva az előző vizsgálatban [24] megállapított módszerrel végeztük. Röviden, a vizsgálat két menetben zajlott. Az első futtatásban a minta kémiai profilját LC-Q-TOF-MS segítségével határoztuk meg. A következő futtatásban az eluátumot, miután a megadott LC-Q-TOF körülmények között áthaladt az LC rendszeren, 30 másodpercenként 96-lyuklemezekre gyűjtöttük. Az összegyűjtött frakciók tirozináz gátló aktivitását tirozináz gátló vizsgálattal értékeltük.

3.5. Tirozináz gátló vegyületek izolálása V. amurensis gyökérből

Az LC-Q-TOF-MS és a tirozináz gátló vizsgálattal összekapcsolt tirozináz gátló vegyületek izolálásához a V. amurensis gyökerét (301 kg) háromszor extraháltuk 80 százalékos oldattal. MeOH 6 0 percig szobahőmérsékleten ultrahangos kezeléssel. Az extrahált oldószert leszűrjük és bepároljuk, így 215,7 g nyers extraktumot kapunk, amelyet vízben szuszpendálunk, majd n-hexán, etil-acetát (EtOAc) és n-BuOH elegyével egymás után megosztjuk. Az EtOAc-frakciót (25,85 g) szilikagél oszlopkromatográfiának vetettük alá n-hexán:EtOAc gradiens körülmények között (20:1 -> 0:1), így hét frakciót (E1-E7) kaptunk. Az E4 frakciót MPLC és 100 g SNAP KP-Sil, szilikagél kazetta és diklór-metán:MeOH segítségével választottuk el gradiens körülmények között (97:3 → 0:100), így hét alfrakciót kaptunk (E4–1–E4–7). . A 2. vegyületet (417,0 mg) az E4-5-ből kaptuk. Az E4–4 alfrakciót újrakromatografáltuk MPLC-n SNAP 25 g Ultra, szilikagél kazetta és kloroform:MeOH:H2O elegyével gradiens körülmények között (50:4:1 → 15:4:1), így hét frakciót kaptunk ( E4–4–1–E4–4–7). Az 1. vegyületet (396,0 mg) az E4-4-5-ből kaptuk, amelyet egyetlen foltként figyeltünk meg vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) lemezen.

3.6. Tirozináz gátló vizsgálat

A tirozináz gátló aktivitást egy korábban leírt módszerrel, enyhe módosítással értékelték [25]. A két mikroliter mintát és 50 µL 0,1 U/µL gomba tirozinázt 96-lyukú lemezeken kezeltük, és 37 ◦C-on inkubáltuk. 15 perc elteltével 50 µl 1 mM L-tirozint adtunk hozzá, majd 37 ◦C-on 15 percig reagáltattuk. A képződött dopakrom mennyiségét 495 nm-en mértük Spectra Max 19{{20}} mikrolemez-leolvasóval (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). A tirozináz gátló aktivitást a következő egyenlettel számítottuk ki: tirozináz gátlás ( százalék )=[1 − (S − S0)/(C − C0)] × 100, ahol S a minta, a tirozináz és az L abszorbanciája - tirozin; S0 a minta és az L-tirozin abszorbanciája; C a tirozináz és L-tirozin abszorbanciája, C0 pedig az L-tirozin abszorbanciája. Pozitív kontrollként Kojic savat, egy ismert tirozináz inhibitort alkalmaztunk. Az IC50 értékeket GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) segítségével számítottuk ki.

3.7. Molekuláris dokkolási tanulmányok

A molekuláris dokkolást SYBYL-X 2.1.1 szoftverrel (Tripos Ltd., St. Louis, MO, USA) hajtottuk végre PPO3 kristályszerkezettel, amely az Agaricus bisporusból származó tirozináz (Protein Data Bank (PDB) ID: 2Y9W). A célfehérje összes vízmolekuláját eltávolítottuk, és a ligandum-előállítást a SYBYL-X 2.1.1 "fertőtlenítő" előkészítési protokolljával végeztük. A fehérje-ligandum affinitást a Tripos erőtérrel számítottuk ki, és összpontszámként fejeztük ki. A fehérje-ligandum komplexből származó ligandum dokkolt helyzetét a Discovery Studio 2017 R2 Client programban (Biovia Co., San Diego, CA, USA) tettük láthatóvá.

3.8. Kísérleti tervezés és statisztikai elemzés

A maximális tirozináz gátló aktivitású összetevők V. amurensis gyökérből való extrahálásához optimalizált feltételeket hoztak létre a BBD segítségével három változóval és három szinttel (MINITAB Release 14.12.{2}} Statistical Software). Az előzetes egytényezős kísérleti eredmények alapján kiválasztottam a független változókat, köztük az extrakciós időt (X1), a MeOH- és vízkoncentrációt (X2), valamint a folyadéktérfogatot (X3), illetve ezek változóit (S3 táblázat). Az RSM változóit három szinten kódoltuk: −1, 0 és 1. Összességében 15 kísérletet terveztünk, amelyekből 3 ismétlés állt a tervezés középpontjában (2. táblázat). Független válaszként a hozamot (százalék), a tirozináz gátló aktivitást (százalék), az (1) vegyület mennyiségét (µg/mg) és a (2) vegyület mennyiségét (µg/mg) mértük. A kivonat tirozináz gátló hatását 50 µg/ml koncentrációban értékeltük. Az egyes válaszokat a következő másodrendű polinomiális egyenlet fejezi ki:

ahol R jelöli a választ; 1, 2 és 3 a lineáris együtthatók; 12, 23 és 13 a három változó közötti kölcsönhatási együtthatók; és 11, 22 és 33 a másodfokú együtthatók.
Továbbá Pearson-féle korrelációs elemzést végeztünk annak megállapítására, hogy van-e lineáris kapcsolat az egyes változók és válaszok között. A Pearson-féle korrelációs együttható erős lineáris összefüggést mutat {{0}}.7 és 1.0 között, egyértelmű lineáris kapcsolat a 0.3 és 0.7 között, gyenge lineáris kapcsolat a {{10}.1 és 0.3 között, és nincs vagy elhanyagolható lineáris kapcsolat a 0.0 és 0.1 között. A pozitív és negatív korrelációt attól függően fejezzük ki, hogy a Pearson-féle korrelációs együttható pozitív vagy negatív.

3.9. Az 1. és 2. tirozináz-gátló vegyületek kvantitatív elemzése

Az egyes 1. és 2. vegyület mennyiségét a tervezett 15 kísérleti körülmény alkalmazásával nyert kivonatokban a kalibrációs görbék segítségével mértük (2. táblázat). Az 1. és 2. vegyület kalibrációs görbéit az UV-kromatogram görbe alatti terület felhasználásával határoztuk meg (33{7}} nm 0,1–1000 µg/ml, illetve 7,81–1000 µg/ml koncentrációnál). Az LC-t Waters 2695 LC rendszerrel (Waters, Santa Clara, CA, USA) végeztük, ugyanazokkal a feltételekkel, mint az Anyagok és módszerek, LC-Q-TOF tömegspektrometriában részletezett LC rendszerben.

4. Konklúziók

A V. amurensis gyökereinek ε-viniferint (1) és B-vitamint (2) bőrfehérítő összetevőként jellemeztük LC-Q-TOF-MS, tirozináz gátló teszttel párosítva. Ebben a vizsgálatban először a B-vitamint (2) azonosították tirozináz-gátló vegyületként, és az ε-vinifera (1) és a B-vitamin (2) nagyobb tirozináz-gátló hatást mutatott, mint a pozitív kontroll, a kojinsav. A maximális tirozináz gátló hatást és a V. amurensis gyökerek hozamát biztosító optimalizálási feltételeket az extrakciós idő (100 perc), a MeOH koncentráció (66,38%) és a folyadéktérfogat (140 ml) felhasználásával határoztuk meg. Az eredmény jó egyezést mutatott a kísérleti és az előre jelzett értékek között. Következésképpen az LC-Q-TOF-MS bioassay-vel párosítva bebizonyította, hogy hatékonyan találhat új aktív összetevőket, valamint ismert aktív összetevőket, a B-vitamint (2), amely új, természetes potenciális fehérítőszerként javasolható.

Kiegészítő anyagok: Az alábbiak elérhetők online, S1 ábra: MS kromatogram negatív ionizációs módban (A); V. amurensis gyökerek kivonatának UV-kromatogramja 280 nm-en (B), S2. ábra: Az 1. vegyület 1H- és 13C-NMR spektruma (300 és 75 MHz, CD3OD), S3. ábra: A vegyület 1H- és 13C-NMR spektruma 2 (300 és 75 MHz, CD3OD), S4 ábra: Szigmoid görbe és IC50 pozitív kontroll, 1. és 2. vegyület, S5 ábra: Válaszfelület és kontúr diagramok, amelyek az extrakciós paraméterek hatását mutatják (X1: extrakciós idő, perc; X2: MeOH koncentráció, százalék; X3: oldószer térfogata, ml). (A) hozam; (B) tirozináz gátló aktivitás; (C) 1. vegyület; (D) 2 vegyület; (E) az 1. és 2. vegyület összege, S1 táblázat. V. amurensis gyökérkivonatainak tirozináz gátló hatása, S2 táblázat: Az 1. és 2. vegyület 1H- és 13C NMR adatai CD3OD-ban (δ ppm-ben), S3 táblázat: Független változók és szintek a válaszfelület módszertanához, S4 táblázat: Becsült regresszió hozam koefficiense, S5 táblázat: A hozam varianciaanalízise, ​​S6 táblázat: tirozináz gátló aktivitás becsült regressziós együtthatója, S7 táblázat: tirozináz gátló aktivitás varianciaanalízise, ​​S8 táblázat: 1. vegyület becsült regressziós együtthatója, S9 táblázat: variancia az 1. vegyületre, S10 táblázat: A 2. vegyület becsült regressziós együtthatója, S11 táblázat. Varianciaanalízis a 2. vegyületre, S12 táblázat: Becsült regressziós együttható az 1. és 2. vegyület összegére, S13. táblázat: Varianciaanalízis az 1. és 2. vegyület összegére.
A szerző hozzájárulásai: Konceptualizálás, KYL; módszertan, K.-EO, HS és KYL; szoftver, K.-EO és HS; validálás, HS; formális elemzés, K.-EO és HS; vizsgálat, K.-EO, HS, MKL és KYL; adatkezelés, K.-EO, HS, BP és KYL; írás – eredeti tervezet előkészítése, K.-EO és HS; írás – áttekintés és szerkesztés, HS, MKL, BP és KYL; felügyelet, MKL, BP és KYL Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát.
Finanszírozás: Ezt a kutatást a Koreai Nemzeti Kutatási Alapítvány (NRF-2017R1A2B4003403 és NRF-2019R1A6A1A03031807) és a Korea Health Technology K+F projekt támogatása támogatta, amelyet a Koreai Kormány finanszírozott. Intézet (KHIDI), amelyet a Koreai Köztársaság Egészségügyi és Jóléti Minisztériuma finanszíroz (HF20C0038).
Adatelérhetőségi nyilatkozat: A jelen tanulmányban bemutatott adatok a kiegészítő anyagban érhetők el.
Összeférhetetlenség:A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.
Minta elérhetősége: Nem elérhető

Hivatkozások

1. Ranjbar, S.; Shahvaran, PS; Edraki, N.; Khoshneviszadeh, M.; Darroudi, M.; Sarrafifi, Y.; Hamzehloueian, M.; Khoshneviszadeh, M. 1, 2, 3-Triazolhoz kapcsolt 5-benzilidén (tio) barbiturátok, mint új tirozináz inhibitorok és szabad gyökfogók. Boltív. Pharm. 2020, 353, 2000058. [CrossRef] [PubMed]

2. Chang, T.-S.; Ding, H.-Y.; Lin, H.-C. A 6, 7, 40 -trihidroxi-izoflavon azonosítása erős tirozináz inhibitorként. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005, 69, 1999–2001. [CrossRef] [PubMed]

3. Miyazawa, M.; Oshima, T.; Koshio, K.; Itsuzaki, Y.; Anzai, J. Tirozináz inhibitor fekete rizskorpából. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 6953–6956. [CrossRef]

4. Chen, Q.; Diao, L.; Song, H.; Zhu, X. Vitis amurensis Rupr: A kémia és farmakológia áttekintése. Fitomedicina 2018, 49, 111–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Jin, K.-S.; Ó, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW A Vitis amurensis gyökérből izolált betulinsav gátolja az 3-izobutil-1- metilxantin által kiváltott melanogenezist a MEK/ERK és PI3K/Akt útvonalak szabályozásán keresztül B16F10 sejtekben. Food Chem. Toxicol. 2014, 68, 38–43. [CrossRef]

6. Kim, H.; Thuong, PT; Ngoc, TM; Lee, I.; Hung, ND; Bae, K. A Vitis amurensis leveléből és szárából származó oligosztilbének antioxidáns és lipoxigenáz gátló hatása. J. Ethnopharmacol. 2009, 125, 304–309. [CrossRef]

7. Jin, K.-S.; Ó, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis A Ruprecht gyökér gátolta a melanocita stimuláló hormon által kiváltott melanogenezist B16F10 sejtekben. Nutr. Res. Gyakorlat. 2014, 8, 509–515. [CrossRef]

8. Jang, MH; Piao, XL; Kim, HY; Cho, EJ; Baek, SH; Kwon, SW; Park, JH. A Vitis amurensisből származó resveratrol oligomerek gyengítik az amiloid által kiváltott oxidatív stresszt a PC12 sejtekben. Biol. Pharm. Bika. 2007, 30, 1130–1134. [CrossRef]

9. Lee, E.-O.; Lee, H.-J.; Hwang, H.-S.; Ahn, K.-S.; Chae, C.; Kang, K.-S.; Lu, J.; Kim, S.-H. A Lewis tüdőrák növekedésének hatékony gátlása a Vitis amurensis gyökereiből származó hexanol A-val apoptotikus és anti-angiogén aktivitásokon keresztül. Karcinogén 2006, 27, 2059–2069. [CrossRef]

10. Bak, M.-J.; Truong, VL; Kang, H.-S.; Jun, M.; Jeong, W.-S. Vadszőlő (Vitis amurensis) magjából származó procianidinek gyulladásgátló hatása LPS-indukált RAW 264.7 sejtekben. oxid. Med. Sejt. Longev. 2013, 2013. [CrossRef]

11. Shin, H.; Chung, H.; Park, B.; Lee, KY Polygonum aviculare antioxidáns összetevőinek azonosítása LC-MS segítségével, DPPH vizsgálattal párosítva. Nat. Prod. Sci. 2016, 22, 64–69. [CrossRef]

12. Park, S.; Shin, H.; Park, Y.; Choi, I.; Park, B.; Lee, KY Catalpa ovata NO termelést gátló összetevőinek jellemzése LC-MS segítségével, sejtalapú vizsgálattal párosítva. Bioorg. Chem. 2018, 80, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

13. Ingkaninan, K.; De Best, C.; Van Der Heijden, R.; Hofte, A.; Karabatak, B.; Irth, H.; Tjaden, U.; Van der Greef, J.; Verpoorte, R. Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia on-line csatolt UV, tömegspektrometriás és biokémiai detektálással természetes termékekből származó acetilkolinészteráz inhibitorok azonosítására. J. Chromatogr. 2000, 872, 61–73. [CrossRef]

14. Bezerra, MA; Santelli, RE; Oliveira, EP; Villar, LS; Escaleira, LA Válaszfelületi módszertan (RSM), mint az optimalizálási eszköz az analitikai kémiában. Talánta 2008, 76, 965–977. [CrossRef] [PubMed]

15. Witek-Krowiak, A.; Chojnacka, K.; Podstawczyk, D.; Dawiec, A.; Pokomeda, K. Válaszfelületi módszertan és mesterséges neurális hálózati módszerek alkalmazása a bioszorpciós folyamatok modellezésében és optimalizálásában. Bioresour. Technol. 2014, 160, 150–160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo, PW; Brereton, RG Kísérleti tervezés I. Szűrés. Trendek elemzője. Chem. 1996, 15, 26–31. [CrossRef]

17. Wang, Y.; Zhao, L.; Zhang, R.; Yang, X.; Sun, Y.; Shi, L.; Xue, P. Ultrahanggal segített extrakció optimalizálása válaszfelületi módszertan, antioxidáns kapacitás és antocianinok tirozináz gátló aktivitása alapján vörös rizskorpából. Food Sci. Nutr. 2020, 8, 921–932. [CrossRef]

18. Weremfo, A.; Adulley, F.; Adarkwah-Yiadom, M. A fenolvegyületek mikrohullámmal segített extrakciójának és az avokádó (Persea americana Mill.) magvak antioxidáns aktivitásának egyidejű optimalizálása válaszfelületi módszertan használatával. J. Anal. Methods Chem. 2020, 2020, 7541927. [CrossRef]

19. Ko, J.; Choi, J.; Bae, SK; Kim, J.; Yoon, KD Öt oligosztilbén elválasztása V itis amurensis-ből fick-rate gradiens nagy teljesítményű ellenáramú kromatográfiával. J. Sep. Sci. 2013, 36, 3860–3865. [CrossRef]

20. Wang, K.-T.; Chen, L.-G.; Tseng, S.-H.; Huang, J.-S.; Hsieh, M.-S.; Wang, C.-C. A rezveratrol és a Vitis thunbergii var. taiwaniana lipopoliszacharidok által kiváltott ízületi gyulladás ellen. J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 3649–3656. [CrossRef]

21. Hu, J.; Lin, T.; Xu, J.; Ding, R.; Wang, G.; Shen, R.; Zhang, Y.-W.; Chen, H. A Vitis thunbergii var. Taiwaniana szabályozza az APP-hoz kapcsolódó útvonalat. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2016, 26, 505–511. [CrossRef] [PubMed]

22. Oshima, Y.; Kamijou, A.; Ohizumi, Y.; Niwa, M.; Ito, J.; Hisamichi, K.; Takeshita, M. Új oligostilbének a Vitis coignetiae-ből. Tetrahedron 1995, 51, 11979–11986. [CrossRef]

23. Anna Malinowska, M.; Billet, K.; Drouet, S.; Munsch, T.; Unlubayir, M.; Tungmunnithum, D.; Giglioli-Guivarc'h, N.; Hano, C.; Lanoue, A. Szőlőnád-kivonatok, mint többfunkciós fiatalító kozmetikai összetevők: Sirtuin aktivitás, tirozináz-gátlás és biohasznosulási potenciál értékelése. Molecules 2020, 25, 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. Yang, HH; Ó, K.-E.; Jo, YH; Ahn, JH; Liu, Q.; Turk, A.; Jang, JY; Hwang, BY; Lee, KY; Lee, MK A Humulus japonicus légi részeiből származó tirozináz gátló összetevők jellemzése LC-MS/MS csatolt online assay segítségével. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 509–515. [CrossRef] [PubMed]

25. Liu, Q.; Kim, C.; Jo, YH; Kim, SB; Hwang, BY; Lee, MK Resveratrol származékok, mint melanogenezis inhibitorok szintézise és biológiai értékelése. Molecules 2015, 20, 16933–16945. [CrossRef] [PubMed]

További információ: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501