A krónikus vesebetegség növeli az agyi mikrovérzések számát egérben és emberben

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Wei Ling Lau1,2 & Ane CF Nunes 1 & Vitaly Vasilevko3 & David Floriolli4 & Long Lertpanit 1 & Javad Savoj 1 & Maria Bangash 1 & Zhihui Yao 1,5 & Krunal Shah6 & Sameen Naqvi 1 & Annlia Paganini-Hill6 & Nosratola D. Vaziri 1 és David H Cribbs3 és Mark Fisher6,7

Beérkezett: 2018. augusztus 25. /Átdolgozva: 2019. január 28. /Elfogadva: 2019. február 22. /Online közzététel: 2019. május 4.

# A szerző(k) 2019

Cistancheenyhíthetivesebetegség

Absztrakt

Az agy mikrovérzése megnövekszikkrónikusvesebetegség(CKD) és jelenlétük növeli a kognitív hanyatlás és a stroke kockázatát. Vizsgáltuk a CKD és az agyi mikrovérzések (a mikrovérzések neuropatológiai szubsztrátja) közötti kölcsönhatást egér- és sejtkultúra-modellekben, és vizsgáltuk a mikrovérzések terjedésének előrehaladását az emberi agy sorozatos képalkotásán. Egérvizsgálatok: Két CKD-modellt vizsgáltak: adenin-indukált tubulointerstitialis nephritist és sebészi 5/6 nephrectómiát. Sejttenyésztési vizsgálatok: A bEnd.3 egér agy endothel sejtjeit konfluenciáig növesztettük, és az egyrétegű integritást 5-15 százalékos humán urémiás szérummal vagy növekvő karbamidkoncentrációval való érintkezés után mértük. Humán vizsgálatok: Az agyi mikrovérzések előrehaladását a kontroll, a dialízis előtti CKD és a dializált betegek sorozatos MRI-jén értékelték. Az 5/6-os nephrectómiás modellben a mikrovérzések 2-2-szeresére növekedtek a krónikus vesebetegségben szenvedő egerekben, függetlenül a magasabb vérnyomástól. Az IgG festődés megnövekedett CKD állatokban, ami összhangban van a vér-agy gát megnövekedett permeabilitásával. A bEnd.3 sejtek urémiás szérummal vagy emelkedett karbamiddal történő inkubálása a transzendothel elektromos ellenállásának dózisfüggő csökkenését okozta. A megnövekedett karbamid aktin citoszkeleton elváltozásokat és csökkent claudin-5 expressziót okozott. Humán alanyoknál a mikrovérzések prevalenciája 50 százalék volt mindkét CKD-s csoportban, szemben a 10 százalékkal az azonos korú kontrollokban. A dializált kohorszban több betegnél emelkedett meg a mikrovérzések száma az MR-vizsgálat során 1,5 év után. A CKD megzavarja a vér-agy gátat, és növeli az agyi mikrovérzéseket egerekben, illetve a mikrovérzéseket emberben. A megemelkedett karbamid megváltoztatja az aktin citoszkeletont és a szoros kapcsolódási pontokat a tenyésztett endothel sejtekben, ami arra utal, hogy ez a mechanizmus (legalábbis részben) megmagyarázza az állat- és emberkísérletekben megfigyelt mikro- és mikrovérzéseket.

Kulcsszavak Krónikus vesebetegség. Mikrovérzések. Egér modell. Endothel sejtkultúra. BrainMRI

enyhíteni akrónikusvesebetegséggelcistanche

Bevezetés

Az utóbbi évek egyik legjelentősebb stroke-neurológiai felfedezése akrónikusvesebetegséghogy olyan hatást fejtsenek ki, amely jóval túlmutat az olyan hagyományos rizikófaktorokon, mint a magas vérnyomás és a cukorbetegség [10, 11]. Tekintettel az agyi mikrovérzések és a kognitív károsodások magas prevalenciájára (körülbelül 50 százalék) az előrehaladott CKD-ben szenvedő betegeknél [2–4, 6, 7], ez az összefüggés további vizsgálatot érdemel.

Az agyi mikrovérzések a mágneses rezonancia képalkotással (MRI) kimutatható hemosiderin-vas kis gócok, amelyekről úgy gondolják, hogy a mögöttes agyi mikrovérzéseket tükrözik [12, 13], és mind a vérzéses, mind az ischaemiás stroke fokozott kockázatát jelzik [9, 14]. Specifikus MRI-szekvenciák (gradiens visszhang és hajlam-súlyozott képalkotás) mutatják a jelvesztés ezen fókuszterületeit az agyi parenchymában, legfeljebb 10 mm-rel [12, 15]. Az agyi mikrovérzések korfüggőek, előfordulási gyakoriságuk 65 éves korig megközelíti a 20 százalékot [16]. Az életkor mellett a magas vérnyomás és az agyi amiloid angiopátia a legjobban leírt kockázati tényezők a mikrovérzések kialakulásában [13, 17]. A késői stádiumú CKD-ben a mikrovérzések a lakosság 50 százalékában fordulnak elő [2–4].

Ezzel párhuzamosan a kognitív károsodás gyakrabban fordul elő, és alacsonyabb szinten súlyosabb isvesefunkció[18], 30-70 százalékos prevalenciát érve el a krónikus dializált betegek körében [6, 7]. Egy 338 hemodializált, 55 éves és idősebb, koruk szerinti kontrollcsoporttal végzett keresztmetszeti elemzés szerint a dializált betegek 34 százaléka szenvedett súlyos kognitív károsodást, szemben a kontrollok 12 százalékával [6]. A dializált kohorsz további 35 százalékának volt mérsékelt kognitív károsodása [6].

Számos, nem krónikus vesebetegségben szenvedő csoportokban végzett tanulmány kimutatta, hogy szoros összefüggés van az agyi mikrovérzések és a hanyatló kognitív funkciók között [19–22]. Epidemiológiai adatok alátámasztják az MRI mikrovérzéses terhelés és a kognitív diszfunkció együttes fennállását végstádiumú vesebetegségben (ESRD) szenvedő betegeknél [8, 23]. Ezen túlmenően egy 28, sorozatos agyi MRI-vel végzett krónikus dializált betegről szóló jelentés összefüggést mutatott ki az új mikrovérzések és a mini mentális állapotvizsgálat (MMSE) pontszámának csökkenése között [4]. Ezen túlmenően, az ESRD-betegeknél az ischaemiás és hemorrhagiás stroke előfordulási aránya 3--4-szer magasabb, mint az általános populációban [5]. A kiinduláskor stroke-mentes japán hemodializált betegek egy csoportjában az agyi mikrovérzések jelenléte független előrejelzője volt az intracerebrális vérzésnek egy 5-éves követési időszakban [9].

Itt egereken és CKD betegeken végzett vizsgálatok eredményeit közöljük. Megnövekedett agyi mikrovérzéseket találtunk CKD egerekben, és leírjuk a károsodott endothel szoros junctiót és az aktin citoszkeleton károsodását, mint a mikrovérzés kialakulásának lehetséges mechanizmusait a CKD-környezetben. Nem CKD-ben szenvedő, dialízis előtti és krónikus hemodializált egyénekből származó sorozatos agyi MRI retrospektív elemzése megerősítette, hogy az ESRD jelentős kockázati tényező a mikrovérzéses teher előrehaladása szempontjából.

Mód

Egérkísérletek

Kísérleti állatok és kezelési csoportok

Két CKD egérmodellt vizsgáltunk. (1) Adenin tubulointersticiális nephritis modell: A Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 10–12 hetes hím C57BL/6J egereit 0,2% adenint tartalmazó étrenddel etettük 18 napon keresztül, hogy krónikus intersticiális nephropathiát váltsunk ki. 2 hétig visszatért a rendszeres étkezésre, majd 1 hétig ismét ki volt téve adenin diétának a CKD fenntartásához (1a. ábra). A kontroll egereket rendszeres táplálkozáson tartottuk. (2) 5/6 nefrektómia modell: 10 hetes hím C57BL/6J egereken kétlépcsős műtétet hajtottak végre a Jackson Laboratories-ban, amely során bal oldali részleges nefrektómiát, majd 1 héttel később jobb oldali totális nefrektómiát végeztek. Az állatokat 1 héttel azután szállították a laborba

második műtét. Ezt a két modellt használták a magas vérnyomás hatásának meghatározására; A magas vérnyomás az 5/6-os nephrectomia modell ismertetőjele, míg az adenin-CKD nem magas vérnyomású [24].

A CKD állatokat randomizáltuk lipopoliszacharid (LPS) vagy LPS injekciók nélkül. (A kísérleti vizsgálatok során megállapítottuk, hogy az urémia hosszabb időtartamára van szükség ahhoz, hogy a spontán mikrovérzések nagyobb terhét észleljék a nem kezelt CKD állatokban; az adenin diétán lévő egerek a kezdeti 18 napon túl csak 10 napig tartanak. az expozíció 3.0 ± 0,4 mikrovérzés volt cm2-enként.)

Öt héttel a kezdeti CKD-indukció után és a kontrollokban egyenértékű korban az egerek intraperitoneális (ip) LPS-injekciót kaptak (Salmonella enterica szerotípus, Typhimurium, L{{0}}MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) agyi mikrovérzés kiváltására. Az LPS-t három dózisban, 1 mg/kg-ban adták be 0, 6 és 24 órában [25]. Az LPS-kezelt egereket szubkután sóoldat-injekciókkal hidratáltuk naponta kétszer-háromszor 3 napig az LPS-kezelés után. A vérnyomást (BP) 2 nappal az LPS injekció beadása előtt mértük farokmandzsetta pletizmográfiával (CODA-S2 többcsatornás, Kent Scientific). Minden kísérletet jóváhagyott a Kaliforniai Egyetem, Irvine Institutional Animal Care and Use Committee.

Szövetgyűjtés és vérkémia

Az egereket 1 héttel az LPS injekció beadása után, vagy a nem kezelt állatokban ezzel egyenértékű életkorban szívpunkcióval, inhalációs izoflurán érzéstelenítéssel végzett kivéreztetéssel elaltatták. Kanülként 26-mérőtűt használtunk a bal kamrába, és jéghideg PBS-oldatot alkalmaztunk 7-8 ml/perc áramlási sebességgel. Után

perfúzió 5 percig, a bal agyféltekét azonnal lefagyasztottuk Western blot céljából. A jobb agyféltekét és mindkét vesét egy éjszakán át fixáltuk 4 százalékos paraformaldehidben, majd hideg PBS-ben tároltuk a metszés előtt. A szérumot aliquot részekre osztották a vérkémiai vizsgálatokhoz. A vér karbamid-nitrogénjét (BUN) a BioAssay Systems (Hayward, CA) kolorimetriás kittel mértük. A szérum kreatinint kapilláris elektroforézissel mérték az O'Brien Kidney Research Core Centerben (UT Southwestern, Dallas, TX).

Mikrovérzések kimutatása

Az agyakat 1,5 százalékos agarózba helyeztük, és vibratommal metszettek, hogy koronális metszeteket (40 μm) hozzunk létre. Minden 5. metszetben poroszkék festést végeztünk a mikrovérzések kimutatására [26]. A poroszkék festést frissen készített 5%-os kálium-hexaciano-ferrát-trihidráttal és 10%-os sósavval végeztük. Húsz perccel később a metszeteket vízzel leöblítettük, és nukleáris gyorsvörös színnel ellenfestettük, dehidratáltuk, és fedőlemezzel lefedtük. A mikrovérzéseket 20-szoros nagyítással azonosítottuk, mivel három injekcióval számolva lilás-kék lerakódásokat adtak be 0, 6 és 24 óránál. Az LPS injekciók után 3 napig szubkután sóoldattal hidratáltunk. A farok vérnyomását (BP) az LPS injekció beadása előtt mértük. Az egereket 1 héttel az LPS injekció beadása után leöltük. b Reprezentatív H&E festett vesemetszetek, amelyek adenin által kiváltott tubulointerstitialis sérülést mutató CKD egereket (jobb oldali panel) összehasonlítva a CTL-állat normál veséjével (bal oldal), 20-szoros nagyítás. Skála=100 μm

független megfigyelők, majd kiszámították az átlagot. A megfigyelt pozitívan festett metszetekről fotómikroszkóppal (Nikon Eclipse, Japán) készítettünk felvételeket csoportonként három állaton, hogy kiszámítsuk a mikrovérzés területét. A teljes diaképeket beszkennelték, és a National Institutes of Health (www.imagej.nih.gov/ij/) ingyenes ImageJ szoftverét (10.2-es verzió) használták.

kiszámítja a teljes agyfelületet. A mikrovérzések számát az állatonkénti teljes agyfelületre normalizáltuk.

Western blottolás

A fehérjeanalízishez szükséges agyféltekéket a szövetgyűjtés időpontjában lefagyasztottuk, és jéghideg I. szövetkivonó reagensben (Thermo Fisher Scientific) homogenizáltuk, amelyet proteázgátló koktéllal (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) egészítettünk ki. A fehérjekoncentrációt BCA protein assay kittel (Thermo Fisher Scientific) mértük. Az SDS-PAGE gélelektroforézist mintánként 100 ug fehérjével végeztük. A fehérjéket PVDF membránokra vittük át, majd blokkoltuk

1 óra 5 százalék zsírmentes száraz sovány tejben, amelyet TBS-T pufferben (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl és 0,1% Tween-20) ​​készítünk, és a claudint megcélzó elsődleges antitestekkel inkubáljuk. -5 (1:200 hígítás, Sigma-Aldrich SAB4502981), occludin (1:200 hígítás, Invitrogen 711500, Thermo Fisher Scientific) és GAPDH belső kontrollra normalizálva (1:10 hígítás,{19}}, Abcam, Cambridge, MA) 5 százalékos zsírmentes tejben TBS-T egy éjszakán át 4 fokon. A blotokat ezután a megfelelő anti-nyúl vagy anti-egér másodlagos antitestekkel inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. TBS-T-vel történő mosás után a sávokat a Luminescent Image Analyzer LAS-3000 (Fujifilm Life Science, Stamford, CT) segítségével detektáltuk.

Immunhisztokémia

A vér-agy gát (BBB) ​​szivárgásának kimutatására a metszeteket biotinilált anti-egér IgG másodlagos antitesttel inkubáltuk 1:100 arányban 1 órán át szobahőmérsékleten (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). PBS-sel történő mosást követően a metszeteket 30 percig inkubáltuk avidin-biotin-peroxidáz komplexszel (Vector Laboratories) 1:200 hígításban. A festést 3',3'-diaminobenzidin (DAB, Vector Laboratories) kromogén felhasználásával fejlesztettük ki. Az IgG-vel megfestett terület százalékos arányát ImageJ szoftverrel elemeztük nem LPS CTL és CKD agyban. A pozitív IgG festődés küszöbét úgy választottuk ki, hogy manuálisan kiértékeltük egy kontrollállat IgG festődését, majd ezt a küszöböt az összes érintett állat esetében azonos szinten tartottuk [27].

A Cistanche deserticola megelőzi a vesebetegséget

Sejttenyésztési kísérletek

Agy endothel sejtkultúra és szérumkezelés

Az immortalizált egér bEnd.3 sejteket az American Type Culture Collection-től (ATCC, Manassas, VA) vásároltuk. Az endoteliális sejt fenotípusát a von Willebrand faktor immunfestésével igazoltuk.

A sejttenyészeteket magas glükóz tartalmú komplett Dulbecco módosított Eagle táptalajban (DMEM, ATCC 30-2002) inkubáltuk, amely 25 mM glükózt tartalmazott, kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS) és 1% penicillin-sztreptomicinnel. párásított inkubátor 37 fokon 5 százalék CO2 és 95 százalék levegő atmoszférájában. A sejteket az 5. passzázsnál használtuk minden kísérlethez. A sejteket 5 × 106 sűrűségben oltottuk 12-lyukú poliészter Transwell betétekre (0,4 μm pórus, Costar), és a konfluenciát 24–48 óra elteltével értük el. A táptalajt ezután megváltoztattuk, hogy a sejteket különböző koncentrációjú FBS, humán normál szérum (HNS) vagy urémiás szérum (CKD) hatásának tegyük ki a dializált betegekből. A TEER leolvasásokat az EVOM2 volt/ohm mérővel (World Precision Instruments, Sarasota, FL) mértük, lyukonként három helyen, hogy átlagot kapjunk. A kísérletek 21 napig folytatódtak, és a táptalajt 3-4 naponta frissítettük. Az NHS és az urémiás szérum korábban bankolt mintákból származott, amelyeket IRB jóváhagyása és tájékozott beleegyezés után kaptunk.

Karbamid sejttenyésztési kísérletek

A karbamid (a CKD-ben leggyakrabban visszatartott toxin) hatásának vizsgálatára a bEnd.3 sejteket magas glükóztartalmú DMEM-ben, 10 százalékos FBS-sel vagy 42 vagy 72 mg/dl (70 vagy 120 μm) karbamiddal kiegészített tápközegben inkubáltuk. Sigma- Aldrich). Ezek a karbamidkoncentrációk megközelítik a hemodialízis előtti és utáni értékeket, amelyeket általában az ESRD-betegeknél találnak, és klinikailag relevánsnak tekinthetők [28]. Az 24-órás inkubációs periódus végén megmértük a TEER-t, a sejteket összegyűjtöttük és feldolgoztuk Western blot analízishez. Az aktin citoszkeleton megjelenítéséhez a bEnd.3 sejteket üveg fedőlemezeken növesztjük, és 24 órán át a fenti karbamid koncentrációknak tesszük ki, 10 percig fixáltuk hűtött 4%-os formalin/PBS-ben, majd immunfluoreszcens festést végeztünk az Actistain 488 fluoreszcens festéssel. phalloidin DAPI nukleáris festéssel (katalógusszám: PHDG1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO). Csoportonként három példányt készítettünk, és tárgyonként három képkockát készítettünk ImageJ szoftverrel, hogy kiszámítsuk a falloidin festődés területét, amely a DAPI területre normalizált.

Western blottolás

A karbamidkísérletekből származó bEnd.3 sejteket ülepítettük, majd proteáz inhibitor koktéllal (Roche Applied Science) kiegészített Tissue Extraction Reagent I-ben (Thermo Fisher Scientific) lizáltuk. A fehérjekoncentrációt BCA fehérjevizsgálati kittel mértük, és a Western blottingot a fent leírtak szerint végeztük claudin -5 (1:500 hígítás) és occludin (1:500 hígítás) GAPDH belső kontrollra normalizált (1:20 hígítás) segítségével. ,000). A Western-blotokat legalább háromszor megismételtük minden mintánál.

Humán tanulmányok

Retrospektív agyi MRI diagram áttekintése

A Kaliforniai Egyetem-Irvine Orvosi Központban 2008. január 1. és 2014. december 31. között az elektronikus egészségügyi feljegyzéseket a Honest Broker rendszerrel és az UCReX-szel (University of California Research Exchange) vizsgálták át az IRB jóváhagyása után. A dialízis előtti krónikus vesebetegségben szenvedő betegeket (n =8) és krónikus hemodializált betegeket (n =9) azonosítottak, akiknél legalább két agyi MRI-vizsgálatot végeztek különböző időpontokban (a kezdetben azonosított 10 hemodializált beteg közül 1-et eltávolítottak a a végső elemzés a radiológiai PACS rendszerben hiányzó képek miatt). A normál veseműködésű kontrollokat (n=10) manuálisan illesztettük a hemodializált CKD-s betegekhez nem és életkor szerint ± 5 év.

Az agyi mikrovérzések MRI vizsgálata

A mikrovérzéseket egy kezelő neuroradiológus (DF) megszámolta, és idővel előrehaladását elemezte. Az agyi MRI-t T2*-súlyozott és fogékonyság-súlyozott képalkotással (SWI) és FLAIR-képekkel (fluid-attenuated inversion recovery) végeztük 1,5T és 3T MRI szkennereken. Az SWI-szekvenciák rétegvastagságát 2 mm-nél végeztük, a rétegek közötti intervallum 0 volt. A mikrovérzéseket 2-mm axiális SWI alapján számoltuk. FLAIR az volt,

3 mm-es szeletvastagságnál fehérállományi elváltozások kimutatására hozták létre, szintén 0 közötti rétegközi intervallummal.

Statisztikai analízis

A Grubbs-teszttel (extreme studentized deviate method, http://graphpad.com/quick calls/grubbs1/) végzett szűrés során nem voltak kiugró adatok. Az egerek és az emberek csoportjai közötti különbségeket chi-négyzet (Fisher-féle egzakt) teszttel hasonlítottuk össze a kategorikus változókra és t-próbákkal, valamint ANOVA-val a folytonos változókra. A folyamatos adatokat átlag ± SEM formában adjuk meg. Az egéradatokhoz Kruskal–Wallis nem-paraméteres és egyirányú ANOVA-t is elvégeztünk Tukey HSD-teszttel. Kétirányú ANOVA-t (CKD-igen/nem és LPS-igen/nem) alkalmaztunk a CKD interakció tesztelésére. A csoportok közötti különbségeket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha P < 0,05.="" az="" ábrákat="" graphpad="" prism="" 4="" szoftverrel="" (graphpad="" software,="" san="" diego="" ca)="" állítottuk="">

Eredmények

Túlélés LPS kezeléssel

Az LPS-sel kezelt CKD egerek túlélési aránya 80 százalék volt. Csak azok az egerek éltek túl 1 hétig az LPS-kezelés után

szerepel a végső elemzésekben. A többi csoportban minden egér túlélte a kísérlet végéig.

CKD Jelentősen megnövekedett agyi mikrovérzések

Terhelés LPS kezelés után

Az adenin-indukált és 5/6-os nefrektómiás CKD-ben szenvedő állatok szignifikánsan emelkedett vér karbamid-nitrogén (BUN) és szérum kreatinin értékeket mutattak a CTL állatokhoz képest (1. táblázat). A farok vérnyomása szignifikánsan magasabb volt a nefrektómiás CKD állatokban, mint a CTL és adenin CKD állatokban (1. táblázat); azonban a mikrovérzések száma a két CKD-csoportban hasonló volt. A H&E festés megerősítette az adenin által kiváltott tubulointerstitialis sérülést a CKD egerek veséjében (1b. ábra).

Az átlagos agyi mikrovérzés terhelés 2.{1}} ± 0,5/cm2 volt nem LPS CTL egerekben, és 2-2.{8}}-szeresére nőtt a nem LPS CKD állatokban (adenin- CKD egerek 4,5 ± 0,9 per cm2;

nephrectomy-CKD egerek 4,2±1,1/cm2) (1. táblázat; 2a. ábra). A nem LPS csoportokban a mikrovérzések növekedése szignifikáns volt az adenin-CKD esetében a CTL-hez képest, de nem a nephrectomia-CKD esetében. Az LPS-kezelés a CTL és a CKD állatokban azonos mértékben növelte a mikrovérzés képződését