Cistanche: Echinakozid által kiváltott nitrogén-oxid termelés az endothel sejtekben: Az androgénreceptor szerepe és a PI3K-Akt útvonal

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU, dANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU és XIN LIU

Bevezetés

CistancheHoffmg. Az Et Link az Orobanchaceae család egyik nemzetségébe tartozó évelő parazita gyógynövény. HerbaCistanche, a száraCistanche deserticolaY. c . MA ésCistanche tubulosa(Schenk) R. Weight, tonizáló szerként használták veseelégtelenség, impotencia, kóros leukorrhoea és időskori székrekedés kezelésére (1), aminek oka androgénszerű vagy nemi hormonokat szabályozó hatása lehet (2).Echinakozid(EcH; c35H46O20;

molekulatömeg: 786,73; 1. ábra), a Herba szárából izolált fenil-etanol-glikozidok (PhG) egyike.Cistanche, és számos biológiai tulajdonsággal rendelkezik, beleértve az antioxidáns, öregedésgátló, gyulladásgátló, májvédő és neuroprotektív hatásokat (3). A modern farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a Herba különböző összetevőiCistanche, beleértve az EcH-t, az akteozidot, a kankanózt, a kankanosid F-et és a cisztanozid F-et, érrelaxáns hatást mutatnak (4).

Az endotélium az érrendszer kritikus szabályozója, a nitrogén-monoxid (NO) pedig az endothelsejtek által kibocsátott fontos relaxációs faktor. A simaizomsejtekbe diffundálva a NO aktiválja a guanilát-ciklázt, növeli a ciklikus guanozin-monofoszfát (cGMP) szintjét, majd aktiválja a cGMP-függő protein kinázokat (PKG-ket), hogy elősegítse a simaizom relaxációját (5). Korábban kimutatták, hogy az EcH 350-400 µM-os koncentrációban közvetlenül hat a vaszkuláris simaizomra, és gátolja a hipoxia által kiváltott proliferációt patkány pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben (6), míg a 30-300 µM EcH akut érrelaxációt okozott az endotéliumban. ép gyűrűk koncentrációfüggő módon, és fokozott cGMP-termelés a corpus cavernosum simaizomjában a fenilefrin által összehúzott aortagyűrűkben (7). A NO-cGMP-PKG-BKca csatornák megnyitásával a simaizomsejtekben a 100 vagy 300 µM EcH elnyomta a noradrenalin által kiváltott összehúzódást patkányok pulmonalis artériáiban, különösen az endotéliumtól mentes gyűrűkben (8). Az endoteliális sejtek a szív- és érrendszeri funkciók kulcsfontosságú szabályozói, és számos esetben azt találták, hogy az endothel-függő relaxáció az endotéliumból felszabaduló transzferálható anyagnak, például NO-nak köszönhető (9). Azonban az EcH által indukált NO termelés felfelé irányuló molekuláris mechanizmusa vaszkuláris endoteliális sejtekben további vizsgálatokat igényel.

A vaszkuláris endotéliumban az NO képződését elsősorban az endoteliális NO-szintáz (eNOS) közvetíti. Számos csoport kimutatta, hogy a foszfatidilinozitol 3- kináz (PI3K) útvonal aktiválja a szerin treonin protein kináz B-t (Akt), amely közvetlen eNOS foszforilációt okoz a szerin 1177-nél (Ser1177) (10). Az androgénreceptor (AR) az s3 nukleáris receptor alcsalád tagja, amely kanonikusan módosítja a génexpressziót. Az AR sejtmembrán caveolákba történő lokalizációja részt vesz

az endothelsejtek működésének vagy génexpressziójának nem genomiális szabályozása a c-Src/PI3K/Akt kaszkád beindításával, ami végső soron eNOS foszforilációt és NO termelést eredményez (11). Humán aorta endothel sejtjeiben a tesztoszteronról beszámoltak arról, hogy aktiválja a PI3K/Akt jelátvitelt, és gyorsan NO termelést indukál az AR és a PI3K p85 alegységének a szív- és érrendszerben való közvetlen kölcsönhatása miatt (12). Beszámoltak arról, hogy az EcH súlyosbítja a hormonhiánnyal kapcsolatos tüneteket, és androgénszerű hatásait a tesztoszteron helyett az AR-hez való kompetitív kötődése miatt fejti ki (2). Ezért jelen tanulmány azt feltételezte, hogy a PI3K/Akt útvonal az EcH által indukált AR-függő eNOS foszforiláción keresztül részt vehet a NO termelésben. Jelen tanulmány célja az EcH alábbi hatásainak értékelése volt: i) NO termelés és eNOS foszforiláció indukciója; ii) az AR részvétele az eNOS foszforilációjában; és iii) a PI3K/Akt útvonal aktiválása humán köldökvénás endothel sejtekben (HUVEcs), amely egy jól ismert kísérleti modell az endothelsejtek funkcióinak és angiogenezisének szabályozására (13).

Anyagok és mód

Vegyszerek és reagensek.Az EcH-t (tisztaság, 92,5 százalék) az Országos Élelmiszer- és Gyógyszerellenőrzési Intézet nemzeti gyógyszerreferencia-szabványaitól szereztük be. A p-Akt (Ser473; kat. sz. ab8805), Akt (kat. sz. ab81283), p-eNOS (Ser1177; kat. sz. ab184154) és eNOS (kat. sz. ab76198) elleni antitesteket az Abcam cégtől vásároltuk. A nilutamid és az IcI 182780 inhibitorait a Sigma-Aldrich cégtől szereztük be; Merck KGaA. Az L-NAME-t az Adamas-Beta, Ltd.-től, a wortmannint pedig a Pribolab-tól vásárolták.

Sejt kultúra és kábítószer kezelés.A HUVEcs-eket a Sciencell Research Laboratories Inc.-től szereztük be, és endotélsejt-tápközegben (EcM; Sciencell Research Laboratories) tenyésztették 5% (v/v) magzati szarvasmarha-szérummal (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) és 1% endotélsejttel. növekedési kiegészítő (EKGS) 37 ˚C-on (5 százalék CO2 és 95 százalék páratartalom) (14). Az összefolyás elérésekor a sejteket tripszinnel emésztettük, és 1% FBS-t és 1% EcGS-t tartalmazó EcM-be szélesztettük. Minden kísérlethez a HUVEcs-eket 1x104/ml koncentrációban szélesztettük, és az összefolyás eléréséig növesztettük. Az EcH-val vagy más stimulátorokkal végzett kezelés előtt a sejteket fenolvörös-mentes EcM-ben inkubáltuk FBS és EcGS nélkül 6 órán keresztül, hogy indukálják.

növekedési leállás. A gátló kísérletekben a HUVEc-eket 30 percig előinkubáltuk különböző antagonistákkal vagy inhibitorokkal, beleértve 10 µM nilutamidet, 10 µM IcI 182780-at, 0,5 mM L-NAME-t vagy 5 µM wortmannint, ECH-val vagy anélkül, 37 °C-on. Minden csoportban, beleértve a kontrollt is, dMSO-t használtunk oldószerként egyenlő, 0,001%-os koncentrációban.

mérése intracelluláris NEM gyártás.

A citoszol NO-koncentráció relatív változásait HUVEcs-ben a DAF-FM (Cayman Chemical Company) fluoreszcens NO-szondával követték nyomon, amint arról korábban beszámoltunk (12). Röviden, a sejteket 5 µM DAF-FM diacetáttal töltöttük 20 percig 37 °C-on egy fekete mikrotiterlemezre, és többször öblítettük PBS-sel (pH 7,4). A fluoreszcenciát 495, illetve 515 nm-es gerjesztési és emissziós hullámhosszon határoztuk meg fluoreszcens mikrolemez-leolvasóval (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) és egy kompakt inverz mikroszkóppal (Nikon eclipse Ts2R; Nikon Corporation).

Nyugati folt elemzés.Amint arról korábban beszámoltunk (15), a sejtek összefolyó egyrétegű rétegeit kétszer mostuk jéghideg PBS-ben, és RIPA pufferrel lizáltuk (P0013d; Beyotime Institute of Biotechnology). A felülúszó fehérjekoncentrációját a bicinkoninsav vizsgálati módszerrel (16) mértük. Ezt követően sávonként 30 µg fehérjét töltöttünk fel, 10%-os poliakrilamid gélekkel elválasztottuk és polivinilidén-difluorid membránokra vittük át. A membránokat 5%-os fölözött tejjel blokkoltuk 1 órán át 25°C-on. Az Akt (1:1,000 hígítás), p-Akt (1:500 hígítás), eNOS (1:2,000 hígítás) vagy p-eNOS (1) elleni monoklonális antitestekkel végzett inkubáció után :1,000 hígítás) 4 ˚C-on egy éjszakán át, a membránokat TBST-vel (0,1% Tween-20 tartalommal) mostuk négyszer, mosásonként ~15 percig 25 ˚C-on. Ezt követően a membránokat torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel (1:5, 000 hígítás; egér elleni antitest, kat. sz. A0216, vagy anti-nyúl antitest, kat. sz. A0208, Beyotime Institute) inkubáltuk. biotechnológia) 1 órán át 25 ˚C-on, és egy fokozott kemilumineszcencia készlettel (kat. sz. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.) detektáltuk. A sávok intenzitását az Image J gélelemző szoftver 1.8-as verziójával határoztuk meg.{43}} (National Institutes of Health).

Kicsi zavaró (si) RNS készítmény és transzfekció.A hosszú, kétszálú RNS-eket az AR és az ösztrogénreceptor (ER) cél-mRNS-e szintetizálta az I. táblázatban bemutatott szekvenciákkal. Az siRNS leütés feltételei a HUVEC-ek transzfektálását foglalták magukban 70 százalékos konfluencia mellett, nem antimikrobiális szerben fenntartva. 60 mm-es kollagénnel bevont tenyésztőedényekben. Az 5 nM AR-siRNS vagy 10 nM ER-siRNS Lipofectamine 3000 reagenssel (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) történő transzfekcióját külön-külön, a gyártó előírásai szerint végeztük. A transzfekció hatékonyságát reverz transzkripciós kvantitatív-PcR analízissel (RT-qPcR) értékeltük, amint azt korábban közöltük (17). A termociklusos körülmények a következők voltak: 10 perc 95°C-on; 40 ciklus 95 °C-on 5 másodpercig és 60 °C-on 1 percig, és olvadási görbe 95 °C-on 15 másodpercig, 60 °C-on 1 percig és 95 °C-on 15 másodpercig; minden mintához három független biológiai ismétlést végeztünk. A következő kísérleteket 48 órával a transzfekció után végeztük. A primer párokat a Primer Premier v5.0 szoftverrel (PREMIER Biosoft) terveztük a következő szekvenciákkal: AR előre, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' és fordított, 5'-GAcTTGTAGAGAGAcAGGGTAGA-3'; ER előre, 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' és hátrafelé, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; és GAPdH előre, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' és hátrafelé, 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

Statisztikai elemzés.Az összes adatot átlag ± standard deviációként adjuk meg. A csoportok közötti statisztikai összehasonlításokat Kruskal-Wallis teszttel vagy kétirányú ANOVA-val és Tukey post hoc teszttel végeztük el többszörös összehasonlításhoz. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Eredmények

ECH indukálja NEM Termelés és eNOSfoszforiláció.Amint a 2A és B ábrán látható, az 1 µM ECH szignifikánsan növelte az intracelluláris NO termelést HUVEcs-ben a negatív kontroll sejtekhez képest, míg az EcH stimuláló hatása a kontroll szintre gyengült az L-NAME-vel végzett előkezelés hatására. Az optimális koncentráció elérése érdekében az eNOS foszforilációját 60 perccel az EcH-val való kezelés után teszteltük.

{{0}}, 0.01, 0.1, 1 és 10 µM. Az eredmények azt mutatták, hogy az EcH 0,01-10 µM koncentrációban koncentrációfüggő módon szignifikánsan indukálhatja az eNOS foszforilációját a Ser 1177-nél, a maximális eNOS foszforilációt pedig 10 µM EcH indukciónál figyeltük meg (2c. és d. ábra). Továbbá az eNOS foszforilációját a Ser1177-en Western blot analízissel vizsgáltuk 0, 5, 15, 30, 60 és 120 perccel az 1 µM EcH-val történő inkubálás után. Megfigyelték, hogy az eNOS foszforilációját az EcH gyorsan kiváltotta 5 percnél, és tovább növekedett 30 perces inkubációig (2E és F ábra). Ezt követően az EcH kezelés ellenére az eNOS foszforiláció relatív nagysága stabil maradt 30 perctől kezdve; ezért az EcH nem befolyásolta a teljes eNOS expressziót (2c. és E. ábra).

AR közvetíti ECH-indukált NEM Termelés és eNOSAz AR-siRNS-1 és az ER -siRNS-2 interferáló hatásai voltak a legsikeresebbek az AR és ER expressziójának gátlásában HUVEcs-ben jelen tanulmányban (3. ábra). Ezt követően egy antagonistát az AR funkciógátlási analízishez és siRNS-t az AR funkcióvesztés elemzéséhez alkalmaztunk, hogy értékeljük az AR szerepét az EcH által kiváltott eNOS aktivációban és NO termelésben. Amint a 4A. ábra mutatja, az 1 µM ECH szignifikánsan növelte a NO-termelést HUVEcs-ben (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH aktiválja az PI3K/Akt útvonalat.Ebben a tanulmányban az Akt foszforilációt a Ser473-on teszteltük 60 perccel az EcH inkubáció után 0, 0 koncentrációkban.01, 0.1 1 és 10 uM. Az eredmények azt mutatták, hogy az EcH (0.{10}} µM) szignifikánsan indukálhatja az Akt foszforilációját. A p-Akt relatív expressziós szintje 1 és 10 µM EcH kezelésnél érte el a csúcsot (5A. és B. ábra). Továbbá az Akt foszforilációját Western blot analízissel vizsgáltuk 0, 5, 15, 30, 60 és 120 perccel, miután 1 µM EcH-t adtunk a HUVEc tenyészetekhez. Amint az 5c. és d. ábrán látható, az EcH gyorsan növelte az Akt-foszforilációt 5 perces inkubáció után, és a p-Akt maximális fehérjeszintjét 60 percnél figyelték meg. Ezzel szemben az EcH nem befolyásolta a teljes Akt expressziót (5A. és c. ábra). Ezen túlmenően, a PI3K útvonal eNOS foszforilációra kifejtett potenciális hatásának vizsgálata érdekében a HUVEcs-eket az EcH alkalmazása előtt PI3K gátló wortmanninnal előkezeltük. Azt találták, hogy a wortmannin az EcH-indukált NO-termelést az alapszintre csökkenti (5E. ábra). Hasonló jelenséget figyeltek meg fluoreszcens mikroszkóppal az EcH-indukált DAF-FM fluoreszcencia vizsgálatakor (5F. ábra). Ezenkívül a wortmannin képes lehet a gyors eNOS foszforiláció megszüntetésére HUVEcs-ben (5G és H ábra). A fent említett eredmények azt sugallják, hogy az EcH aktiválhatja az eNOS foszforilációját és a NO termelést a PI3K/Akt útvonalon keresztül.

Vita

Az EcH egy Herbából izolált természetes vegyületCistanche, különféle farmakológiai tulajdonságokkal. Korábban kimutatták, hogy az EcH endothel-függő vaszkuláris relaxációs hatást fejtett ki NO-cGMP-PKG-BKca csatornák megnyitásával az erek simaizomsejtjeiben (7,8). A jelenlegi eredmények bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy az ECH az eNOS AR-függő aktivációját fejtette ki NO-termelés indukálására, a PI3K/Akt jelátviteli útvonal részvételével az ér endothel sejtjeiben.

Az érfal legbelső rétegeként az endotélium gyorsan érzékeli és reagál a véráramlás változásaira, ami viszont jelátvitelt eredményez a mögöttes simaizomsejtek felé az értónus szabályozása érdekében (18). Széles körben beszámoltak arról, hogy számos endoteliális eredetű értágító vegyület létezik, a legprototípusosabb anyaggal.NO, amely az eNOS endoteliális izoformájából képződik, ami foszforilációt eredményez (19). Normál körülmények között az eNOS inaktív marad, amikor a caveolinhoz kötődik, és az endothelben a következő események sorozatával aktiválódiksejtek: i) az eNOS disszociál a caveolinról-1 és asszociálódik a ca2 plusz /caM-mel; ii) a hősokk-fehérje (HSP)90 elősegíti az eNOS-tdimerizáció és előnyben részesíti a sztérikus formációt az Akt toborzásához; és iii) a kalcineurin defoszforilálja a Thr495-öt, hogy megerősítse az aktiválási állapotot (20). Jelen vizsgálatban az NO termelés szignifikánsan megnövekedett az 1 µM ECH-val kezelt HUVEC-ekben. Ez a jelenség hasonló volt a korábbi eredményekhez, ahol az EcH növelte az NO felszabadulását és serkentette a cGMP szintézisét patkány mellkasi aortagyűrűkben (7). Ezenkívül két foszforilációs hely, a Ser1177 és a Thr495 különösen fontosnak tűnik az eNOS aktivitás szabályozásában (20), és a jelen tanulmány kimutatta, hogy az EcH koncentrációfüggő módon indukálta akut eNOS foszforilációt a Ser1177-en. Emellett az eNOS fehérjeszintekre gyakorolt ​​hatásokhoz kapcsolódó ingerek főként az eNOS mRNS stabilitását határozzák meg, és ha az ingert hosszabb ideig fenntartjuk, az eNOS mRNS transzkripciója a mitogén által aktivált protein kinázon és a nukleáris κB faktoron keresztül történik (20). Összességében ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy az eNOS aktiválása a Ser1177-nél felelős az EcH által indukált NO szintézisért.

Ezenkívül egyre több tanulmány igazolta, hogy az AR számos emberi szövetben expresszálódik az endothel sejtekben, ami arra utal, hogy az androgének és analógjaik potenciális szerepet játszanak az AR által közvetített folyamatokon keresztül a humán endothel modulációjában. sejthomeosztázis (21). A nem klasszikus PI3K/Akt útvonalon az AR aktiválhatja a PI3K-t azáltal, hogy közvetlenül kölcsönhatásba lép a p85 PI3K szabályozó alegységgel (22). Jelen tanulmány kimutatta, hogy egy AR antagonista vagy AR siRNS csökkentette az EcH által kiváltott NO termelést és eNOS foszforilációt HUVEcs-ben. Korábban már beszámoltak arról, hogy az ösztrogének indukálják az eNOS foszforilációját és serkentik a NO termelést a klasszikus ER aktiváció révén az endothel sejtekben (23), az ECH beadása pedig jelentősen fokozza az ER expresszióját a méhben (24). Jelen tanulmányban azonban az AR hatása szembetűnőbb volt, mint az ER hatása az EcH által kiváltott eNOS aktivációra és NO termelésre. Ezenkívül megfigyelték, hogy az EcH perceken belül akut NO-termelést okozott az AR-val érintett eNOS-aktiváció révén a HUVEcs-ben, ami összhangban van az endothelsejtek válaszának nem genomi természetével. Az AR a citoplazmában a scaffolding fehérjékhez, köztük a HSP90-hez, a HSP70-hez és a kináz Src-hez kapcsolódik, és a tesztoszteron kezelést követő 5 percen belül a membránba transzportálható az AR komplexből (23). A „célhalászati” stratégia alapján a HSP90-et PhGs-kapcsolt célpontként azonosították, ami azt jelezte, hogy az EcH elősegítheti az AR disszociációját az állványfehérjékről (25). Egy másik tanulmány arra utalt, hogy a hipotalamuszban az EcH kombinálódhat a Met-894 és Val-713 aminosavak AR zsebével, és gátolja a citoplazmatikus AR transzportját a sejtmagba (26). Azonban a mögöttes mechanizmus, amelyen keresztül az EcH közvetíti a citoplazmatikus AR-transzlokációt a membránba, további vizsgálatokat igényel. Ezért további kutatásokra van szükség annak tisztázására, hogy az EcH milyen mechanizmuson keresztül éri el az AR-függő eNOS-aktivációt, és hogyan hozható összefüggésbe a HSP90-hez való kötődéssel vaszkuláris endoteliális sejtekben.

A PI3K/Akt útvonal az egyik legfontosabb jelátviteli kaszkád, amelynek aktiválódását foszfatidil-inozitol-3,4,5-trifoszfát termelése indukálja, amely megköti a Ser/ N-terminális pleckstrin homológia doménjét. Thr kinase Akt. Ez megkönnyíti az Akt felvételét a plazmamembránba (27). A PI3K/Akt útvonal fontos szerepet játszhat az EcH által kiváltott NO-függő relaxáció szabályozásában.

A jelen tanulmány kimutatta, hogy az EcH által kiváltott NO termelés szignifikánsan csökkent, amikor a sejteket a PI3K inhibitor wortmanninnal inkubáltuk. Egy korábbi jelentés kimutatta, hogy 15 mg/kg EcH aktiválta a PI3K/Akt jelátviteli útvonalat az 5-fluorouracillal elnyomott csontvelősejtekben (28). Jelen tanulmányban a PI3K inhibitorok szignifikánsan csökkentették az EcH által kiváltott eNOS foszforilációt a Ser1177-nél. Ezenkívül az Akt aktivitását túlnyomórészt upstream szabályozó utak szabályozták, különösen a PI3K-függő foszforiláció a Ser473-nál (20). Jelen tanulmányban az EcH dózisfüggő módon Akt-foszforilációt indukált a Ser473-on; hasonlóképpen egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy az 5, 10 vagy 20 µM EcH dózisfüggő módon szívvédő hatást fejt ki az anoxia/reperfúziós kezelés ellen a p-Akt és az SLc8A3 potenciálisan felszabályozásával (29). Az Akt gén transzkripciós szabályozása nagyrészt ismeretlen (30); ezért jelen tanulmány az EcH Akt-ra gyakorolt ​​poszttranszkripciós szabályozó hatásaira összpontosított. A fenti megállapításokat figyelembe véve arra a következtetésre jutottunk, hogy az EcH alkalmazása HUVEcs-re a PI3K/Akt útvonal aktiválódásához vezethet, amely foszforilálja az eNOS-t, és ezt követően növeli az NO termelést.

Összefoglalva, az EcH egy természetes termék, amelyet főleg a Herbából izolálnakCistanche.Az endoteliális sejtekben az EcH által kiváltott NO termelés mögött meghúzódó lehetséges mechanizmus a következőket foglalhatja magában (6. ábra): i) Az EcH az AR funkcionális ligandumaként működik, amely a sejtmembrán barlangjaiban lokalizálódik; ii) a PI3K kötődik az Akt hidrofób doménjéhez a Ser473-on, és elősegíti az Akt sejtmembránba való felvételét; iii) a PI3K/Akt kaszkádok felvétele AR-függő eNOS foszforilációt vált ki; és iv) az NO képződését az eNOS közvetíti az endoteliális sejtekben. Az a megfigyelés, hogy az EcH NO termelést indukál az eNOS AR-függő foszforilációján keresztül a PI3K/Akt útvonal bevonásával, hozzájárulhat az EcH érrelaxáns hatásának további megértéséhez. Továbbá, az endothel eredetű NO útvonalakat célzó EcH nem genomiális hatások következménye lehet. Ezért a jelen tanulmány segíthet feltárni azokat a mechanizmusokat, amelyeken keresztül az EcH kifejti farmakológiai hatásait a szív- és érrendszeri betegségek megelőzésére.

Köszönetnyilvánítás

Nem alkalmazható.

Finanszírozás

A jelen tanulmányt a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány támogatta (81503333-as támogatási szám).

Elérhetőség nak,-nek adat és anyagokat

A jelen tanulmány során generált és elemzett adatsorok ésszerű kérésre elérhetők a megfelelő szerzőtől.

Szerzői' hozzájárulások

Az LG és az XL tervezte és tervezte a kísérleteket. dL és YZ végezte a kísérleteket. WZ és JG elemezte az adatokat. LG készítette a kéziratot. XL átnézte és szerkesztette a kéziratot. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végső kéziratot.

1202 GUet al: ECINAKOZID NITRIC OXID TERMELÉST INDUKÁL AR-FÜGGETLEN PI3K/AKT ÚTVONALAL

Etika jóváhagyás és beleegyezés nak nek részt venni

Nem alkalmazható.

Beteg beleegyezés számára kiadvány

Nem alkalmazható.

Versengő érdekeit

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek egymással versengő érdekeik.

Hivatkozások

1. Kínai Gyógyszerkönyvi bizottság:CistancheHerba. In: Pharmacopoeia of the People's Repulic of China 1. chin. Med. Sci. Press, Peking, 135. o., 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X és Zhang X: Echinacoside ésCistanche tubulosa(Schenk)Az R. wight az ivarmirigy tengely által szabályozott szteroidogén enzimeken keresztül javítja a biszfenol A által kiváltott here- és spermakárosodást patkányokban. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, dong Y, Zhang B és Ma X: Echinacoside, egy felbecsülhetetlen természetes termék a neurológiai és egyéb rendellenességek kezelésében. 23. molekula: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S és Muraoka O: Phenylethanoid oligoglycosids and acylated oligosugars with vazorelaxáns aktivitásCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal cK, Katsuki S és Murad F: A nitrogén-monoxid aktiválja a guanilát-ciklázt és növeli a guanozin 3':5'-ciklusos monofoszfát szintjét különböző szövetkészítményekben. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wuren TN, Lu dX, Zhou Y és Ge RL: Az echinacoside antiproliferatív hatása patkány pulmonalis artéria simaizomsejtjein hipoxia alatt. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ és Tu PF: Az echinacoside NO-cGMP útvonalon keresztül endothelium-függő relaxációt vált ki patkány aortagyűrűiben. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wuren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y és Ge RL: Az echinacoside indukálja a patkány tüdőartéria érrelaxációját a NO-cGMP-PKG- megnyitásával BKca csatornák és az intracelluláris ca2 plus szint csökkentése. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y és Higashi Y: Az endothelium-független értágulat értékelése: A módszertantól a klinikai szempontokig. J Hypertens 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, chen J, Khan FU, chen X, Xu J és származéka humán köldökvéna endothel sejtjein az oxidatív stressz által kiváltott sérülések ellen: Az antioxidáció és a PI3k/Akt/eNOS/NO jelátviteli útvonalak bevonása. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y és Okabe T: Src kinase-mediates androgen receptor-dependent non-genomic activation of signaling cascade leading to endothelialis nitrogén-oxid synthase . Biochem Bioph Res commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y és Okabe T: Endoteliális nitrogén-monoxid-szintáz androgénreceptor-függő aktivációja vaszkuláris endoteliális sejtekben: A foszfatidil-inozitol szerepe {{3} }kináz/Akt útvonal.Endocrinology 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F és Reno F: NO-dependens proliferation and migration induced by vitamin d in HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X és Xu X: Az uncoupling protein 2 túlzott expressziója gátolja a humán köldökvéna endothel sejtjeinek magas glükóz által kiváltott apoptózisát. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z és Bing S: Az Icariin késlelteti a homocisztein által kiváltott endothel sejtes öregedést, beleértve a PI3K/AKT-eNOS jelátviteli útvonal aktiválását. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ és Klenk dc: Fehérje mérése bicinkoninsav segítségével. Anal Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H és Liu X: Triterpenoid biosynthesis and the transkripciós válasz által kiváltott nitrogén-monoxid in merged fermentingGanoderma lucidum. Process Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellinsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY és Gutterman dd: Endothel-eredetű hiperpolarizáció és koszorúér-vazodilatáció: az epoxi-ikozatriénsavak, a hidrogén-peroxid és a réscsatlakozások sokrétű és integrált szerepe. Microcirculation 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK és Gutterman dd: a kommunikáció kulcsfontosságú: Az intercelluláris jelátvitel mechanizmusai értágulatban. J cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, Fromy B és debret R: Nitrogén-monoxid által közvetített értágulathoz vezető endothelium mikrokörnyezet-érzékelés: Az idegi és biomechanikai jelek áttekintése. Nitrogén-monoxid 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, carreno dV, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS és Smith GJ: Androgén receptor humán endotélsejtekben. J Endocrinol 224: 131-137, 2015.

22. deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H és Gui YT: Az androgének nem genomiális hatását az androgénreceptor-kereskedelem gyors foszforilációja és szabályozása közvetíti. Cell Physiol Biochem 43: 223-236, 2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP és Ghedini Pc: Az ösztrogénreceptorok által közvetített PI3K/Akt útvonal aktiválása ösztrogén-indukált a cGMP jelátvitel vaszkuláris aktiválása. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z és Li P: Antiosteoporotic activity of echinacoside in ovariectomized patkányok. Fitomedicina 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y és Tu PF: A farmakológiai célpontok azonosítása és a fenil-etanol-glikozidok hatékonyságának elemzéseCistanchesA Herba a „célhalászati” stratégián alapul. álla Tradit Gyógynövényes drogok 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM és Zhang X: Az echinacoside növeli a spermiumok mennyiségét patkányokban azáltal, hogy megcélozza a hipotalamusz androgén receptorát. Sci Rep 8: 3839-3850, 2018.

27. coffer PJ, Jin J és Woodgett JR: Protein kinase B (c-Akt): A foszfatidil-inozitol 3- kináz aktiválásának többfunkciós közvetítője. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y és Qian J: Az echinakozid javítja a hematopoietikus funkciót 5-FU által kiváltott mieloszuppressziós egerekben. Life Sci 123: 86-92, 2015.

29. chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W és Zhou H: Az echinacoside védő hatásai az anoxia/reperfúziós károsodás ellen H9c2 sejtekben a p-AKT és SLc8A3 felszabályozásán keresztül. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P és Su Y: Az Akt kritikus szerepe a kardiovaszkuláris működésben. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.